1.2.2 微生物的选择培养和计数 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

Fermentation Engineering 第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用（二） 微生物的选择培养和计数 想一想 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？ 资料 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。 课堂导入 人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 筛选的原理 思考1：怎样从下图1 菌落中选出抗氨青霉素能力的细菌？ 抗氨青霉素能力的细菌 不抗氨青霉素能力的细菌 图1 图2 加入氨青霉素 向图1所示菌落加入氨青霉素之后，会杀死其中不具备抗氨青霉素能力的细菌，便可筛选出具备抗氨青霉素能力的细菌。 1. 概念 一、选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2. 实例 ②不加碳源的培养基： ①70～80℃的高温： ③不加氮源的培养基： ④加青霉素的培养基： ⑤加高浓度食盐： ⑥加石油为唯一碳源： 分离出耐热菌 分离出酵母菌和霉菌 分离出自养微生物 分离出固氮微生物 分离出金黄色葡萄球菌 分离出分解石油的微生物 一、选择培养基 3. 选择培养基配方的设计 尿素 [CO(NH2)2] 含氨量高，化学性质相对稳定，是重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3- 、NH4+等被植物吸收。 这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氨源。 CO(NH2)2 +H2O 2NH3+CO2 脲酶 一、选择培养基 3. 选择培养基配方的设计 讨论1：如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来，其他营养成分与普通培养基基本相同。 讨论2：如何证明该选择培养基具有选择性？ 配方 KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g 尿素 1.0 g 琼脂 15.0 g 水 1000ml 设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）作为对照，若该选择培养基中生长的菌落数少于基础培养基，则说明它抑制了大量不能利用尿素的杂菌。 6 课堂小测 1、下表所示为某微生物培养基的配方，有关叙述错误的是（ ） A. 依用途划分，该培养基属于选择培养基 B. 该培养基所培养微生物属于异养型，可以是酵母菌或霉菌 C. 本培养基中青霉素充当了微生物生长对特殊营养物质的要求 D. 若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素 C 二、微生物的选择培养 思考2：如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，培养微生物时需要解决哪2个问题？ ①选择培养：获得能分解尿素的细菌的纯培养物； ②计数：对细菌进行计数 思考3：由于土壤细菌的数量庞大，怎么获得所需特定微生物的纯培养物呢？ 要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 方 法 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 （梯度稀释菌液＋涂布平板） 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌 二、微生物的选择培养 1. 土壤取样 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 注 意 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的取样袋中。 二、微生物的选择培养 2. 样品的稀释（梯度稀释菌液） 将10g土样加入盛有 90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 90mL无菌水 1×10 10g 9mL无菌水 1×102 1mL 1mL 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 1mL 1mL 1mL 1mL 二、微生物的选择培养 2. 样品的稀释（梯度稀释菌液） 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 ①测细菌数：一般用104、105、106稀释液进行平板培养。 ②测放线菌数：一般用103、104、105稀释液进行平板培养。 ③测真菌数：一般用102、103、104稀释液进行平板培养。 二、微生物的选择培养 3. 涂布平板 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 1 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 2 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 3 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 4 微量移液器 二、微生物的选择培养 4. 菌落培养与观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 ①各稀释梯度分别涂布 3个平板（重复实验） ②一个未接种菌液的培养基作空白对照。 注 意 空白对照 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 二、微生物的选择培养 a.接种菌液的选择培养基 3次重复实验 b.未接种菌液的选择培养基 a和b验证选择培养基是否被杂菌污染或灭菌彻底 二、微生物的选择培养 a.接种菌液的选择培养基 3次重复实验 c.接种菌液的基础培养基 a和c验证选择培养基是否具有选择作用 二、微生物的选择培养 d.未接种菌液的基础培养基 c和d验证基础培养基是否被杂菌污染或灭菌彻底 c.接种菌液的基础培养基 二、微生物的选择培养 a.接种菌液的选择培养基 3次重复实验 b.未接种菌液的选择培养基 结 果 a：分离得到分解尿素的微生物的单菌落 c：得到多种菌落 b和d：正常情况下无菌落 c.接种菌液的基础培养基 d.未接种菌液的基础培养基 二、微生物的选择培养 4. 菌落培养与观察 如何鉴定你分离得到的细菌能够分解尿素？ 思考 CO(NH2)2 +H2O 2NH3+CO2 脲酶 呈碱性 遇酚红指示剂呈红色 液体培养基： 直接看液体的变色情况 固体培养基： 观察菌落周围是否出现红色环带 红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越 。 强 18 二、微生物的选择培养 5. 结果与分析 案例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 ①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 ②乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板），应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。需舍弃该异常数据后进行计数。 三、微生物的数量测定 1. 稀释涂布平板法 (1)原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 间接计数法 (2)原则： ①一般选择菌落数为 的平板计数。 ②在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 30~300 3 平均值 平行重复原则 减少实验误差 三、微生物的数量测定 1. 稀释涂布平板法 (3)缺点： ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 间接计数法 少 原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 ②统计结果一般用 而不用活菌数来表示。 菌落数 成功统计菌落数目的关键： ①恰当的稀释度 ②涂布是否均匀 三、微生物的数量测定 1. 稀释涂布平板法 间接计数法 (4)计算公式： 平均菌落数 涂布液体积 ×稀释倍数 每克样品中的菌落数= 例1. 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 三、微生物的数量测定 2. 显微镜直接计数 直接计数法 (1)原理： 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板 血细胞计数板 细菌计数板： 血细胞计数板： 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 (2)优点： 快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。 (3)缺点： ①不能区分死菌和活菌，导致统计结果偏 ； 大 ②不适于运动的和个体小的细菌（在显微镜下难以观察） 台盼蓝染色法 大方格 中方格 小方格 1个计数室= 个大方格= 个中方格= 个小方格 1 16 400 16(中格)×25(小格)型 三、微生物的数量测定 2. 显微镜直接计数 24 大方格 中方格 小方格 25(中格)×16(小格)型 三、微生物的数量测定 2. 显微镜直接计数 计算公式＝1个计数室的酵母菌总数÷体积（1×10-4mL ）×稀释倍数 计算公式＝1个计数室的酵母菌总数×104×稀释倍数 25 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 相同点 连续划线 接种环 从最后划线区挑取 分离纯化菌种，获得单菌落 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 稀释度合适的整个平板上 都可找到单菌落 涂布器 梯度稀释+涂布平板 26 课堂小测 2、关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是（ ） A. 培养基应以尿素为唯一氮源，该细菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的 B. 选择菌落数在30~300间的所有平板进行计数，以平均数为实验结果 C. 对10 mL 土样稀释10倍后，取0.1 mL 该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为 18、234、277、254，则该 10 mL 土样中分解尿素的细菌数为2. 55×108个 D. 应该设置对照以排除非测试因素对实验结果的干扰，提高可信度 D 课堂小测 3、土壤中含有能将难溶性磷酸盐转变成植物可以吸收利用的可溶性磷的优良解磷菌株Q。固体培养基中难溶性磷酸盐在菌株Q的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈(如图)，透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)代表微生物溶解难溶性磷酸盐的能力大小。下表是初步筛选出的三种优良解磷菌株。根据实验结果分析，溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是 。 B3-5-6 菌株 透明圈直径(D) 菌落直径(d) M-3-01 18.8 12.3 B3-5-6 20.7 8.0 T-4-01 9.1 6.5 课堂小测 4、为筛选可以高效降解淀粉的微生物，提高“生化”处理的效率，研究人员将厨余垃圾机械处理后，将其加入装有无菌水的锥形瓶中制备厨余垃圾浸出液，然后进行微生物的培养，如图所示。下列叙述错误的是（ ） A. X培养基属于选择培养基，图示接种方法是稀释涂布平板法 B. ①处菌落的周围没有透明圈，可能是一种异养型的杂菌 C. 要获得可以高效降解淀粉的微生物，应挑取⑤处的菌落进行纯培养 D. 对可以分解淀粉的微生物进行扩大培养时，需要用液体培养基并振荡培养 B 课堂小测 5、高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，看到如图2所示情况。下列叙述错误的是（ ） A. 过程①②合称为稀释涂布平板法 B. 甲、乙试管中的液体均为选择培养基 C. Ⅱ号培养基上的接种方法为平板划线法 D. 图2 中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种 B 课堂小测 6、野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，如图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，a、b、c表示操作步骤，d、e为菌落。下列叙述不正确的是（ ） A. 图中①②④为基本培养基，③为完全培养基 B. a操作可增加突变株的数量 C. b的正确操作是用涂布器把菌 液均匀地涂布在②表面 D. 经c过程原位影印及培养后， 可从④中挑取d菌落进行纯化培养 A Lavf57.71.100 Codec by Bilibili XCode Worker v4.8.61(fixed_gap:False) $