3.1 重组DNA技术的基本工具(第2课时) 课件 2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 第1节 人教版 选择性必修3 1 高中生物课堂 实验：DNA的粗提取与鉴定 DNA的粗提取与鉴定 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） 1.实验原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 DNA不溶于酒精， 但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 在一定温度下， DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA DNA + 二苯胺 沸水浴 蓝色 DNA的粗提取与鉴定 2.材料用具 （1）材料： 富含DNA的材料(如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等)、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 （2）用具： 烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA 以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 3.方法步骤 （1）通过研磨释放 DNA 称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。 ①研磨的目的： ②研磨时间不宜太长： ③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： ④研磨不宜太用力 DNA的粗提取与鉴定 裂解细胞，释放DNA 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 研磨效果好（有利于充分研磨） 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 3.方法步骤 （2）过滤获取含DNA的上清液 DNA的粗提取与鉴定 可能含有核蛋白、多糖等杂质 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。 过滤能用滤纸代替吗？ 低温放置几分钟的作用： ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌（缓慢）,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 ①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； ②低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。 ③使蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 （3）冷却酒精析出DNA 3.方法步骤 DNA的粗提取与鉴定 （4）DNA的鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂（现配现用）。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 实验组 水浴加热 对照组 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关 3.方法步骤 DNA的粗提取与鉴定 沸水浴时烧杯中水的液面应高于试管中溶液的液面，否则试管中会受热不均匀，影响实验结果。 4.结果分析 DNA的粗提取与鉴定 鉴定结果不明显的可能原因： ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变色，影响鉴定效果。 1.怎么确认实验提取出来的是DNA所含杂质较少？若鉴定结果呈现蓝色比 较浅，说明什么问题？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 4.进一步探究 DNA的粗提取与鉴定 为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因： 操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质； 用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。 因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 5.进一步探究 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA的粗提取与鉴定 5.进一步探究 方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。 方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 插入人胰岛素基因的大肠杆菌 基因工程 刑侦破案 DNA提取的应用： 方法步骤 （视频） 探究·实践·DNA的粗提取与鉴定 四 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 （1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么? XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 （2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义? 提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。 在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，实验原理是利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同来提取的，DNA的溶解度与如图所示曲线的对应点相符合的是(　　) A．a点浓度适合析出DNA B．b点浓度最适合析出DNAC．c点浓度最适合析出DNAD．d点浓度最适合析出DNA B 基础知识提问 1.基因工程的概念？又名？原理？操作水平？优点？ 2.重组DNA技术的基本工具？工具酶？ 3.限制酶的来源？本质？ 作用？作用的化学键？结果？ 4.DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？ 各种类的不同（来源，作用）？ 5.一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端， 断 个磷酸二酯键，需要 个水。 6.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：相同点？不同点（模板，作用过程）？ 7.载体的本质？种类？作为载体需要的条件？ 8.什么是质粒？ 9.DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤 Lavf58.20.100 Lavf57.62.100 $