专题13 基因工程（3大串讲+3大题型）（复习讲义）（黑吉辽蒙专用）2026年高考生物二轮复习讲练测

专题13 基因工程 ( 目录 第一部分 知识网络构建 思维导航，融会贯通 第二部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第三部分 核心知识串讲 核心串讲 串讲1 基因工程的基本工具 串讲2 基因工程的基本操作程序 串讲3 蛋白质工程 能力进阶 能力1限制酶的选择策略 能力2 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的对比 能力3 PCR技术难点突破 第四部分 分层精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程的基本工具 题型02 基因工程的基本操作程序 题型03 基因工程和蛋白质工程的应用 B组· 增分能力练 第五部分 真题 实战进阶 对标高考，感悟考法 ) 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程的基本工具  （2024辽宁卷）非选择题： DNA的粗提取及鉴定 1.情境化：以合成生物学、mRNA疫苗、基因编辑为背景，考查载体构建、导入方法、检测分层。 2.探究化：强化完整实验链，从引物设计→PCR扩增→载体构建→转化筛选全流程设空，强调变量控制与结果分析。 3.区域适配：结合东北粮食安全（如转基因玉米/大豆育种）、生态修复情境，设计区域特色应用题。 4.规范导向：严控超纲前沿，聚焦考纲限定核心步骤，表达载体组成（启动子/终止子/标记基因）为必考点。 基因工程的基本操作程序 （2025辽宁卷）非选择题： 基因表达载体的构建  目的基因的检测与鉴定  PCR扩增的原理与过程 （2024辽宁卷）选择题： PCR扩增的原理与过程  电泳鉴定 （2024辽宁卷）非选择题： 基因表达载体的构建  目的基因的检测与鉴定  筛选、获取合适的目的基因 （2023辽宁卷）选择题：   基因表达载体的构建 （2023辽宁卷）非选择题：   PCR扩增的原理与过程 基因工程和蛋白质工程的应用 （2024辽宁卷）非选择题： 蛋白质工程原理及操作流程 （2023辽宁卷）非选择题： 蛋白质工程原理及操作流程 新风向演练 1．【新情境·基因工程的方法生产相关疫苗】（2025·黑龙江高三·模拟）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（ ） A．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点 B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定等 C．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 D．PCR扩增R基因时，微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前均须进行灭菌处理 2.【新考法·基因编辑技术】（2025·大连模拟）癌症复杂难治，但基因编辑技术为癌症的治疗带来了新思路。基因编辑技术即在基因组水平上对DNA分子的碱基序列进行定位与修改。我国科学家利用诱导逆转技术可使肝癌细胞向正常细胞逆转。下列叙述错误的是（ ） A．诱导逆转技术致力于研究逆转突变的原癌基因或抑癌基因 B．基因编辑技术可将DNA序列串联起来，从而导致基因重组 C．与正常细胞相比，癌细胞的端粒可能不会随分裂而缩短 D．基因编辑技术有助于癌症的治疗，但也可能出现社会伦理问题 3.【新载体·引物PCR扩增】（2025·大庆模拟）为在大肠杆菌中表达人的胰岛素基因，将胰岛素基因（目的基因）插入质粒，构建重组质粒，并导入大肠杆菌。为鉴定大肠杆菌中是否含有正确插入胰岛素基因的重组质粒，设计引物进行PCR扩增（引物1~4结合位置如图所示，表示引物方向），所用模板、引物和结果下表。下列分析错误的是（    ） 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 模板 引物对 引物1、2 引物3、4 引物2、3 引物1、4 扩增产物 无 有 有 有 无 无 无 有 A．图中的酶处理与PCR中的酶不同，但形成的化学键相同 B．在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C．①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同 D．②④⑧离心管中的都是胰岛素基因正向插入的重组质粒 4.【新载体·科学实验】（2025·辽宁模拟）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（　　） A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解 B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变 C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×（220-2）个引物 核心串讲1 基因工程的基本工具 类别 具体类型 作用 限制酶 如EcoRⅠ、BamHⅠ 1.识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 2.使每条链中特定部位的磷酸二酯键断裂 3.产生黏性末端或平末端 DNA连接酶 1.E·coliDNA连接酶 2.T₄ DNA连接酶 1.连接两个DNA片段的磷酸二酯键 2.E·coliDNA 连接酶：只能连接黏性末端 3.T₄DNA连接酶：可连接黏性末端和平末端 载体 1.质粒（最常用） 2.λ噬菌体衍生物 3. 动植物病毒 必备条件： 1.有一个至多个限制酶切割位点 2.能在受体细胞中自我复制或整合到染色体 DNA 上同步复制 3.有标记基因（如抗生素抗性基因），便于筛选 4.对受体细胞无害 【易错易混】 1. 限制酶切割的是磷酸二酯键，而非氢键 2. 不同限制酶可能产生相同的黏性末端（同尾酶） 3. DNA 聚合酶需模板链，连接单个脱氧核苷酸；DNA 连接酶连接 DNA 片段，无需模板两者都不催化氢键形成 4. 质粒≠载体：载体包含质粒，质粒是常用载体 【典例1】科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 核心串讲2 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 方法1：从基因文库中获取 基因组文库：包含一种生物的全部基因 cDNA文库：包含一种生物的部分基因（由mRNA反转录而来） 方法2：PCR技术扩增 原理：DNA半保留复制 ；条件：模板DNA、引物、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、dNTP；过程：变性→退火→延伸 方法3：人工合成（基因较小、核苷酸序列已知） 二、基因表达载体的构建（核心步骤） 构建基因表达载体的目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，并能够表达和发挥作用。 1.基因表达载体的组成 2.基因表达载体的构建过程 【易错警示】 提醒:若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况,即目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接,需筛选出重组质粒。 三、将目的基因导入受体细胞 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，适用于双子叶和裸子植物）、基因枪法、花粉管通道法 动物细胞：显微注射技术（最常用，将基因表达载体注射到受精卵中） 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理，使细胞处于能吸收周围DNA的状态） 4、 目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 【典例1】番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。下图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述不正确的是（    ）      A．基因工程中常用的工具酶有限制酶，DNA连接酶 B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C．应用BamHI和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接 D．能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 核心串讲2 蛋白质工程 一、基本原理 （1） 天然蛋白质合成的过程 ①原理：按照中心法则进行。 ②过程：基因→表达(转录和翻译)→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。 （2）蛋白质工程的基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【典例1】蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发产品，如速效胰岛素、酶制剂、微生物农药，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（    ） A．天然蛋白是生物在长期进化过程中形成的，能满足特定物种和人类的需要 B．生产速效胰岛素过程改变了相应基因，也改变了胰岛素的氨基酸种类和数量 C．生产耐高温T4溶菌酶与二硫键的形成有关，需要用到基因的定点突变技术 D．生产微生物农药可直接改造a，或者直接由b开始经过①－c－②过程来实现 能力1 限制酶的选择策略 1．根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 2．根据质粒的特点选择限制酶(如图) 3．根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 【易错提醒】 若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 【典例1】为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。下图表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是（　　） A．为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段应当选择的限制酶是EcoRI和BamHI B．PCR扩增时目的基因时先要将温度上升到90℃以上，使DNA变性 C．有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活目的基因的表达 D．终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA片段 能力2 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的对比 解题步骤​ 关键知识依据与规范作答​ 1. 审题定位，明确考查层面​ 涉及DNA→mRNA的过程为转录，相关元件为启动子、终止子。 涉及mRNA→蛋白质的过程为翻译，相关元件为起始密码子、终止密码子。 2. 分析化学本质（核心区分点）​ DNA层面：启动子、终止子（本质为DNA片段）。 mRNA层面：起始密码子、终止密码子（本质为mRNA上的特定三联体密码子）。 3. 判断具体位置与功能​ 启动子：位于基因转录起始位点上游，功能是提供RNA聚合酶识别结合位点，启动转录。 终止子：位于基因编码区下游，功能是提供转录终止信号。 起始密码子：位于mRNA5'端（通常是AUG），功能是作为翻译起点，并编码氨基酸（甲硫氨酸）。 终止密码子：位于mRNA3'端（UAA、UAG、UGA），功能是作为翻译终点，不编码任何氨基酸。 【典例1】VHL基因的一个碱基发生突变，使其编码区中某CCA（编码脯氨酸）变成CCG（编码脯氨酸），导致合成的mRNA变短，引发VHL综合征。该突变（    ） A．改变了DNA序列中嘧啶的数目 B．没有体现密码子的简并性 C．影响了VHL基因的转录起始 D．改变了VHL基因表达的蛋白序列 能力3 PCR技术难点突破 1．概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2．条件 DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA两条母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 Taq DNA聚合酶 催化合成DNA子链 与两条母链结合的2种引物 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 3．PCR原理：DNA的半保留复制。 4．扩增过程 变性 温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 5.PCR技术拓展 （1）逆转录PCR(简称RT-PCR): 是从mRNA获得cDNA(互补DNA)并进行扩增的一种实验技术。进行逆转录PCR的步骤： （2） 实时荧光定量PCR(简称qPCR): 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ①qPCR试剂盒：通常都应该含有检测者mRNA、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Taq Man探针、引物、dNTP、Mg²+等。这种qPCR检测具有特异性和高灵敏性的特点，主要与试剂盒中的引物、Taq Man探针有关。 ②Taq Man探针：是qPCR技术中的一种常用探针，是一小段可与靶DNA序列互补的脱氧核苷酸单链。 a.结构 b.荧光原理：当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R,R发出荧光信号，能被相应仪器检测到。 ④结果：每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可测得Ct值，如图所示(Ct值表示达到荧光阈值所经历的循环次数，该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。 （3）PCR定点突变技术 1．原理：通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。 2．类型 （1）大引物PCR:该技术需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 （2）重叠延伸PCR:该技术需要使用四条引物。引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 因此，分别利用引物1和引物2,引物3和引物4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 【典例1】反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键 B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C．过程③需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链 D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 【典例2】科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用Nco I和Sac I双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法错误的是（    ） A．PCR扩增融合基因时，在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列 B．据图可知，融合基因3RBD的长度为2686bp C．泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近 D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性 01基因工程的基本工具 1．（2025·辽宁大连·模拟预测）限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．T4 DNA连接酶只能连接黏性末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来所以也能剪切自身的DNA 2.（2026·吉林长春·模拟）图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Sau3A Ⅰ三种限制酶识别序列和切割位点，下列相关叙述错误的是(　　) A．获取该目的基因可采用EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 进行酶切 B．图2所示的三种限制酶使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 C．可以用Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端 D．能被Sau3A Ⅰ切割的序列不一定能被BamH Ⅰ切割 3.（2026·辽宁·模拟）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 4（2026·辽宁·模拟）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 02 基因工程的基本操作程序 1．（2025·辽宁沈阳·模拟）乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列分析不合理的是（　　） A．转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B．可以利用PCR技术筛选含有L-PG 基因的受体细胞 C．基因表达载体质粒除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等 D．标记基因Ampr即可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 2.（2025·辽宁·模拟）为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。下图表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是（　　） A．为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段应当选择的限制酶是EcoRI和BamHI B．PCR扩增时目的基因时先要将温度上升到90℃以上，使DNA变性 C．有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活目的基因的表达 D．终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA片段 3.（2025·黑龙江·模拟）研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因，再与pBI121质粒载体结合，导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如下图，下列相关叙述错误的是（　　） 注：图中 Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ为限制酶 A．①②过程均需使用DNA连接酶，②过程是基因工程的核心步骤 B．与只用Ⅰ相比，用Ⅰ和Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．只要检测出玉米细胞中含有融合基因，就说明抗蚜虫玉米培育成功 D．在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，不一定是成功导入重组载体的细胞 03 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2025·辽宁·模拟）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 2.（2025·黑龙江·模拟）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（    ） A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞 B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 3.（2025·黑龙江·模拟）蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（    ） A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 1．（2025高三·辽宁·开学考试）科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 2．（2025高三·哈尔滨·开学考试）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，其工作原理如图所示。下列有关说法错误的是（    ） A．Cas9蛋白的作用相当于限制酶 B．复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合 C．将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法 D．利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中 3．（2025高三·辽宁·模拟）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展栽培马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。结合下图分析，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ EcoRⅠ XbaⅠ A．PCR扩增S基因时，需要模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等 B．为保证S基因正确插入载体中，需对其上游引物的5′端添加碱基序列5′-GAATTC-3′ C．用含重组Ti质粒的农杆菌侵染栽培马铃薯后，利用抗性基因2筛选成功转化的细胞 D．将已转化的马铃薯与普通栽培马铃薯种植在寒冷条件下可检验S基因是否发挥作用 4．（2025高三·大庆·模拟）DMD基因结构改变会造成表达的D蛋白异常从而导致假肥大肌营养不良（DMD）。一对表型正常的夫妇，生育了一个正常的女儿和一个患DMD的儿子。为研究DMD基因结构改变的原因，研究人员通过PCR技术对该家庭成员进行了相应的基因检测，所用的引物和扩增产物的电泳结果如图。假设DMD在男性中发病率为p，下列分析错误的是（　　） A．推测DMD基因和HS6S12基因位于X染色体上 B．DMD形成过程中可能发生了染色体的结构变异 C．女儿是否携带DMD致病基因可用引物组合④PCR检出 D．女儿婚后生育一个患有DMD疾病子代的概率是（p+1）/4 6．（2025高三·辽宁·模拟）密码子偏好性是指在蛋白质合成过程中，不同生物对某些密码子的使用频率表现出明显的倾向性。例如，在大肠杆菌中，70%的亮氨酸由密码子CUA编码；原核生物与真核生物偏好的起始密码子编码序列分别是GTG、ATG等。下列叙述错误的是（    ） A．通过基因工程将某基因导入受体细胞后表达量不高的原因可能是因为密码子的偏好性 B．若要将某细菌的基因导入酿酒酵母，在扩增其基因时，可将其中一个引物的5′-端序列GTG改为ATG C．为满足大肠杆菌的密码子偏好性，可以通过基因改造改变基因的碱基序列 D．为满足生物的密码子偏好性而改造后的基因转录出的mRNA分子数量大幅下降 7．（2025高三·吉林·模拟）科研人员为培育转基因大豆，构建了含特定功能元件的基因表达载体（左图为载体部分结构，右图为限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点），LB/RB是T-DNA的边界序列，Kanr为卡那霉素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，下列说法正确的是（    ） A．经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列相同 B．用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，扩增产物特异性越低 C．用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4种 D．应选择含有氨苄青霉素的培养基去筛选成功转化的大豆细胞 9．（2025高三·大庆·模拟） γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ）      A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 10．（2025·高三哈尔滨·模拟）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 11．（2025·哈尔滨·模拟）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 12．（2025·高三吉林·模拟）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 13．（2025·高三吉林·模拟）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 (1)质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是_____和_____。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG (2)细胞X是一种贴壁细胞，可用_____（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是_____。 (3)将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有_____作用，且随导入时间推移，增殖速率_____。 (4)siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将_____导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的_____对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：_____。 14．（2026·高三辽宁·模拟）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 1．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 2．（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 3．（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 4．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 5．（2024·吉林·高考真题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______和______。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 6．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： (1)上述过程属于_____工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶     ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶     ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。    (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。    (5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题13 基因工程 ( 目录 第一部分 知识网络构建 思维导航，融会贯通 第二部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第三部分 核心知识串讲 核心串讲 串讲1 基因工程的基本工具 串讲2 基因工程的基本操作程序 串讲3 蛋白质工程 能力进阶 能力1限制酶的选择策略 能力2 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的对比 能力3 PCR技术难点突破 第四部分 分层精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程的基本工具 题型02 基因工程的基本操作程序 题型03 基因工程和蛋白质工程的应用 B组· 增分能力练 第五部分 真题 实战进阶 对标高考，感悟考法 ) 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程的基本工具  （2024辽宁卷）非选择题： DNA的粗提取及鉴定 1.情境化：以合成生物学、mRNA疫苗、基因编辑为背景，考查载体构建、导入方法、检测分层。 2.探究化：强化完整实验链，从引物设计→PCR扩增→载体构建→转化筛选全流程设空，强调变量控制与结果分析。 3.区域适配：结合东北粮食安全（如转基因玉米/大豆育种）、生态修复情境，设计区域特色应用题。 4.规范导向：严控超纲前沿，聚焦考纲限定核心步骤，表达载体组成（启动子/终止子/标记基因）为必考点。 基因工程的基本操作程序 （2025辽宁卷）非选择题： 基因表达载体的构建  目的基因的检测与鉴定  PCR扩增的原理与过程 （2024辽宁卷）选择题： PCR扩增的原理与过程  电泳鉴定 （2024辽宁卷）非选择题： 基因表达载体的构建  目的基因的检测与鉴定  筛选、获取合适的目的基因 （2023辽宁卷）选择题：   基因表达载体的构建 （2023辽宁卷）非选择题：   PCR扩增的原理与过程 基因工程和蛋白质工程的应用 （2024辽宁卷）非选择题： 蛋白质工程原理及操作流程 （2023辽宁卷）非选择题： 蛋白质工程原理及操作流程 新风向演练 1．【新情境·基因工程的方法生产相关疫苗】（2025·黑龙江高三·模拟）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（ ） A．构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点 B．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定等 C．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 D．PCR扩增R基因时，微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前均须进行灭菌处理 【答案】C 【详解】A、用HindIII将质粒2000bp切割后形成了200bp、400bp和1400bp共3个片段，说明HindIII在重组质粒上有3个酶切位点，而用HindIII和BamHl将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2000=420×2+560+200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有6个酶切位点，因此BamHI在重组质粒上有6-3=3个酶切位点，A正确； B、不同生物的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，B正确； C、图甲获得重组质粒过程，需要逆转录、形成双链cDNA分子以及R蛋白基因与质粒的重组，所以至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，C错误； D、PCR扩增R基因时，微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前均须进行灭菌处理，D正确。 故选C。 2.【新考法·基因编辑技术】（2025·大连模拟）癌症复杂难治，但基因编辑技术为癌症的治疗带来了新思路。基因编辑技术即在基因组水平上对DNA分子的碱基序列进行定位与修改。我国科学家利用诱导逆转技术可使肝癌细胞向正常细胞逆转。下列叙述错误的是（ ） A．诱导逆转技术致力于研究逆转突变的原癌基因或抑癌基因 B．基因编辑技术可将DNA序列串联起来，从而导致基因重组 C．与正常细胞相比，癌细胞的端粒可能不会随分裂而缩短 D．基因编辑技术有助于癌症的治疗，但也可能出现社会伦理问题 【答案】B 【详解】A、细胞癌变的根本原因是原癌基因或抑癌基因的突变，因此诱导逆转技术致力于研究逆转突变的原癌基因或抑癌基因，A正确； B、基因编辑技术即在基因组水平上对DNA分子的碱基序列进行定位与修改，基因编辑技术可将DNA序列串联起来，从而导致基因突变，B错误； C、癌细胞能不断修复缩短的端粒DNA序列，可以无限增殖，正常细胞的端粒随着细胞分裂次数的增加会逐渐变短。与正常细胞相比，癌细胞的端粒可能不会随分裂而缩短，C正确； D、基因编辑技术有助于癌症的治疗，但也可能出现社会伦理问题，因此科学家在使用时需要严守规则，D正确。 故选B。 3.【新载体·引物PCR扩增】（2025·大庆模拟）为在大肠杆菌中表达人的胰岛素基因，将胰岛素基因（目的基因）插入质粒，构建重组质粒，并导入大肠杆菌。为鉴定大肠杆菌中是否含有正确插入胰岛素基因的重组质粒，设计引物进行PCR扩增（引物1~4结合位置如图所示，表示引物方向），所用模板、引物和结果下表。下列分析错误的是（    ） 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 模板 引物对 引物1、2 引物3、4 引物2、3 引物1、4 扩增产物 无 有 有 有 无 无 无 有 A．图中的酶处理与PCR中的酶不同，但形成的化学键相同 B．在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C．①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同 D．②④⑧离心管中的都是胰岛素基因正向插入的重组质粒 【答案】D 【解析】图中的酶处理（DNA连接酶）与PCR中的酶（Taq酶）不同，但形成的化学键相同，均涉及磷酸二酯键，A正确；在PCR反应过程中，复性阶段发生引物与两条模板DNA结合，B正确；①无扩增产物，因质粒P0无胰岛素基因，⑥无扩增产物，可能因胰岛素基因反向插入质粒P0，故①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同，C正确；引物1和引物2扩增出的是胰岛素基因，故②离心管中的PX无法确定胰岛素基因是否被正向插入。引物3和引物4含与P0互补的碱基序列，无法确定④离心管中的PX中胰岛素基因是否被正向插入。P0含与引物4互补的碱基序列，胰岛素基因含与引物1互补的碱基序列，可确定⑧离心管中的PX是胰岛素基因正向插入的重组质粒，因为反向插入应该无扩增产物出现，D错误。 4.【新载体·科学实验】（2025·辽宁模拟）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（　　） A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解 B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变 C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×（220-2）个引物 【答案】B 【解析】A、将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA 主要存在于上清液中，应取上清液进行后续操作，而不是沉淀物，A 错误； B、在 DNA 鉴定实验中，在沸水浴条件下，DNA 与二苯胺反应呈现蓝色，此过程中 DNA 双螺旋结构被破坏；在 PCR 扩增过程中，高温变性使 DNA 双螺旋结构解开，B 正确； C、核酸染料是在制备凝胶时加入到凝胶中的，而不是在凝胶载样缓冲液中加入，C 错误； D、PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则。一个双链DNA分子经过n次循环后得到2ⁿ个DNA分子，需要的引物数量为（2ⁿ⁺¹ - 2）×a个（因为最初的2个DNA分子各有2条模板链，不需要引物）。n-1次循环共需引物（2ⁿ - 2）×a，第n次循环共需引物a2n个，D错误。 故选B。 核心串讲1 基因工程的基本工具 类别 具体类型 作用 限制酶 如EcoRⅠ、BamHⅠ 1.识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 2.使每条链中特定部位的磷酸二酯键断裂 3.产生黏性末端或平末端 DNA连接酶 1.E·coliDNA连接酶 2.T₄ DNA连接酶 1.连接两个DNA片段的磷酸二酯键 2.E·coliDNA 连接酶：只能连接黏性末端 3.T₄DNA连接酶：可连接黏性末端和平末端 载体 1.质粒（最常用） 2.λ噬菌体衍生物 3. 动植物病毒 必备条件： 1.有一个至多个限制酶切割位点 2.能在受体细胞中自我复制或整合到染色体 DNA 上同步复制 3.有标记基因（如抗生素抗性基因），便于筛选 4.对受体细胞无害 【易错易混】 1. 限制酶切割的是磷酸二酯键，而非氢键 2. 不同限制酶可能产生相同的黏性末端（同尾酶） 3. DNA 聚合酶需模板链，连接单个脱氧核苷酸；DNA 连接酶连接 DNA 片段，无需模板两者都不催化氢键形成 4. 质粒≠载体：载体包含质粒，质粒是常用载体 【典例1】科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 【答案】B 【详解】A、改造人胰岛素基因是依据 “植物偏好密码子”，密码子改变但编码的氨基酸不变（密码子的简并性），因此表达产物的氨基酸序列与天然胰岛素完全相同，A 错误； B、质粒1含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，质粒2含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，用这两种酶切割质粒1和质粒2，可将 “启动子 + 胰岛素基因” 连接到质粒2上构建质粒3（保证黏性末端匹配），B 正确； C、基因表达载体含 “潮霉素抗性基因”（筛选标记），因此应使用含潮霉素的培养基筛选；卡那霉素抗性基因在质粒2上，未整合到最终载体中，C错误； D、农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上，借助植物细胞的复制系统完成复制，无需额外添加复制原点，D错误。 核心串讲2 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 方法1：从基因文库中获取 基因组文库：包含一种生物的全部基因 cDNA文库：包含一种生物的部分基因（由mRNA反转录而来） 方法2：PCR技术扩增 原理：DNA半保留复制 ；条件：模板DNA、引物、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、dNTP；过程：变性→退火→延伸 方法3：人工合成（基因较小、核苷酸序列已知） 二、基因表达载体的构建（核心步骤） 构建基因表达载体的目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，并能够表达和发挥作用。 1.基因表达载体的组成 2.基因表达载体的构建过程 【易错警示】 提醒:若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况,即目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接,需筛选出重组质粒。 三、将目的基因导入受体细胞 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，适用于双子叶和裸子植物）、基因枪法、花粉管通道法 动物细胞：显微注射技术（最常用，将基因表达载体注射到受精卵中） 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理，使细胞处于能吸收周围DNA的状态） 4、 目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 【典例1】番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。下图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述不正确的是（    ）      A．基因工程中常用的工具酶有限制酶，DNA连接酶 B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C．应用BamHI和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接 D．能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 【答案】D 【详解】A、基因工程中常用的工具酶有限制酶，DNA连接酶，质粒属于基因工程中的常见工具，A正确； B、启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确； C、为了防止目的基因和质粒自连或反接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确； D、导入了重组DNA的细胞具有四环素抗性，但仅导入了质粒等情况下细胞也具有四环素抗性，故能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不一定含有AFPs基因，D错误。 故选D。 核心串讲2 蛋白质工程 一、基本原理 （1） 天然蛋白质合成的过程 ①原理：按照中心法则进行。 ②过程：基因→表达(转录和翻译)→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。 （2）蛋白质工程的基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【典例1】蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发产品，如速效胰岛素、酶制剂、微生物农药，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（    ） A．天然蛋白是生物在长期进化过程中形成的，能满足特定物种和人类的需要 B．生产速效胰岛素过程改变了相应基因，也改变了胰岛素的氨基酸种类和数量 C．生产耐高温T4溶菌酶与二硫键的形成有关，需要用到基因的定点突变技术 D．生产微生物农药可直接改造a，或者直接由b开始经过①－c－②过程来实现 【答案】C 解析：A、天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定符合人类生产和生活的需求，由此，蛋白质工程迅速崛起，A错误； B、利用蛋白质工程生产速效胰岛素，需合成新的胰岛素基因，改造好的目的基因需要通过基因工程转入受体细胞，因此改变了胰岛素的氨基酸数量，但并未改变氨基酸种类，B错误； C、生产耐高温 T4溶菌酶确实涉及基因定点突变技术 ，通过改造特定基因实现二硫键的形成从而提高耐热性，C正确； D、a是蛋白质，生产微生物农药不可直接改造a，蛋白质工程的流程：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构(a)→推测应有氨基酸序列(b)→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)→转录(①)形成mRNA(c)→翻译(②)获得所需要的蛋白质，D错误。 故选C。 能力1 限制酶的选择策略 1．根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 2．根据质粒的特点选择限制酶(如图) 3．根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 【易错提醒】 若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 【典例1】为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。下图表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是（　　） A．为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段应当选择的限制酶是EcoRI和BamHI B．PCR扩增时目的基因时先要将温度上升到90℃以上，使DNA变性 C．有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活目的基因的表达 D．终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA片段 【答案】C 【解析】A、从图中可以看出切割质粒只能用EcoRI和Sau3AI两种限制酶，但由于Sau3AI会破坏目的基因，所以切割含有目的基因的DNA不能用Sau3AI，但BamHI与Sau3AI切出的黏性末端相同，所以可以用BamHI切割含有目的基因的DNA片段，得到的中间区段DNA片段，在左端为EcoRI切出的黏性末端，右端为BamHI切出的黏性末端，其两端与质粒EcoRI和Sau3AI切出的黏性末端相同，保证了目的基因和质粒正确连接，A正确； B、PCR扩增时，第一步是高温变性，将温度上升到90℃以上，使DNA双链解开成为单链，为后续引物结合等反应做准备，B正确； C、有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达，C错误； D、终止子是一段有特殊序列结构的DNA片段，能使转录在所需要的地方停下来，这是终止子的基本功能，D正确。 故选C。 能力2 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的对比 解题步骤​ 关键知识依据与规范作答​ 1. 审题定位，明确考查层面​ 涉及DNA→mRNA的过程为转录，相关元件为启动子、终止子。 涉及mRNA→蛋白质的过程为翻译，相关元件为起始密码子、终止密码子。 2. 分析化学本质（核心区分点）​ DNA层面：启动子、终止子（本质为DNA片段）。 mRNA层面：起始密码子、终止密码子（本质为mRNA上的特定三联体密码子）。 3. 判断具体位置与功能​ 启动子：位于基因转录起始位点上游，功能是提供RNA聚合酶识别结合位点，启动转录。 终止子：位于基因编码区下游，功能是提供转录终止信号。 起始密码子：位于mRNA5'端（通常是AUG），功能是作为翻译起点，并编码氨基酸（甲硫氨酸）。 终止密码子：位于mRNA3'端（UAA、UAG、UGA），功能是作为翻译终点，不编码任何氨基酸。 【典例1】VHL基因的一个碱基发生突变，使其编码区中某CCA（编码脯氨酸）变成CCG（编码脯氨酸），导致合成的mRNA变短，引发VHL综合征。该突变（    ） A．改变了DNA序列中嘧啶的数目 B．没有体现密码子的简并性 C．影响了VHL基因的转录起始 D．改变了VHL基因表达的蛋白序列 【答案】D 解析: A、该突变将DNA中的CCA变为CCG，原互补链GGT变为GGC，嘧啶数目（T→C）未改变，仅种类变化，A错误； B、突变后CCA（脯氨酸）变为CCG（脯氨酸），不同密码子编码同一氨基酸，体现密码子简并性，B错误； C、转录起始由启动子调控，突变发生在编码区（外显子），不影响转录起始，C错误； D、突变虽未改变脯氨酸，但导致mRNA变短，使翻译提前终止，蛋白序列缩短，D正确。 故选D。 能力3 PCR技术难点突破 1．概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2．条件 DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA两条母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 Taq DNA聚合酶 催化合成DNA子链 与两条母链结合的2种引物 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 3．PCR原理：DNA的半保留复制。 4．扩增过程 变性 温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 5.PCR技术拓展 （1）逆转录PCR(简称RT-PCR): 是从mRNA获得cDNA(互补DNA)并进行扩增的一种实验技术。进行逆转录PCR的步骤： （2） 实时荧光定量PCR(简称qPCR): 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ①qPCR试剂盒：通常都应该含有检测者mRNA、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Taq Man探针、引物、dNTP、Mg²+等。这种qPCR检测具有特异性和高灵敏性的特点，主要与试剂盒中的引物、Taq Man探针有关。 ②Taq Man探针：是qPCR技术中的一种常用探针，是一小段可与靶DNA序列互补的脱氧核苷酸单链。 a.结构 b.荧光原理：当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R,R发出荧光信号，能被相应仪器检测到。 ④结果：每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可测得Ct值，如图所示(Ct值表示达到荧光阈值所经历的循环次数，该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。 （3）PCR定点突变技术 1．原理：通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。 2．类型 （1）大引物PCR:该技术需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 （2）重叠延伸PCR:该技术需要使用四条引物。引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 因此，分别利用引物1和引物2,引物3和引物4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 【典例1】反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键 B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C．过程③需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链 D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 【答案】D 解析：。由图可知，过程①即酶切后，已知序列能环化，说明两端的黏性末端相同，故过程①是用同一种限制酶对未知序列两端进行切割，A正确；过程②即环化，将DNA片段连接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确；过程③为扩增，需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链，C正确；过程③中将温度调至72℃的目的是耐高温的DNA聚合酶，将四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。 【典例2】科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用Nco I和Sac I双酶切处理后电泳，结果如图，其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法错误的是（    ） A．PCR扩增融合基因时，在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列 B．据图可知，融合基因3RBD的长度为2686bp C．泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近 D．从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性 【答案】A 解析:引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，PCR扩增融合基因时，在引物的5'端添加相应限制酶的识别序列，A错误；由图可知pNZ8149-2RBD和pNZ8149-3RBD的碱基对分别为4527bp和5193bp，所以RBD长度为5193-4527=666bp，泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp，所以融合基因3RBD的长度为666+2020=2686bp，B正确；由图可知，泳道2呈现一个条带，其原因是双酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近，C正确；“该实验的目的是“探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性”，可以从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测，从而进一步比较两者的免疫原性，D正确。 01基因工程的基本工具 1．（2025·辽宁大连·模拟预测）限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．T4 DNA连接酶只能连接黏性末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来所以也能剪切自身的DNA 【答案】B 【解析】选B.DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确；T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。 2.（2026·吉林长春·模拟）图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Sau3A Ⅰ三种限制酶识别序列和切割位点，下列相关叙述错误的是(　　) A．获取该目的基因可采用EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 进行酶切 B．图2所示的三种限制酶使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 C．可以用Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端 D．能被Sau3A Ⅰ切割的序列不一定能被BamH Ⅰ切割 【答案】C 【解析】选C。EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点位于目的基因的两侧，获取该目的基因可采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切，A正确；限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，B正确；Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ识别的碱基序列不同，酶切目的基因产生的黏性末端相同，但是目的基因内部含有Sau3A Ⅰ识别的序列，所以不能使用Sau3A Ⅰ切割该DNA来获取目的基因，C错误；Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ识别的碱基序列不同，BamH Ⅰ识别的序列中包含Sau3A Ⅰ识别的序列，但Sau3A Ⅰ识别的序列BamH Ⅰ不一定能识别，所以能被Sau3A Ⅰ切割的序列不一定能被BamH Ⅰ切割，D正确。 3.（2026·辽宁·模拟）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 故选B。 4（2026·辽宁·模拟）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 02 基因工程的基本操作程序 1．（2025·辽宁沈阳·模拟）乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列分析不合理的是（　　） A．转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B．可以利用PCR技术筛选含有L-PG 基因的受体细胞 C．基因表达载体质粒除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等 D．标记基因Ampr即可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 【答案】D 【解析】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存或活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确； B、PCR技术可以扩增特定基因片段，因此可以用来检测受体细胞中是否成功导入了L-PG基因，B正确； C、基因表达载体通常需要包含启动子、终止子等调控元件，以确保目的基因能够正确表达，C正确； D、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，对重组质粒进行初步筛选，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，D错误。 故选D。 2.（2025·辽宁·模拟）为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。下图表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是（　　） A．为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段应当选择的限制酶是EcoRI和BamHI B．PCR扩增时目的基因时先要将温度上升到90℃以上，使DNA变性 C．有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活目的基因的表达 D．终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA片段 【答案】C 解析：A、从图中可以看出切割质粒只能用EcoRI和Sau3AI两种限制酶，但由于Sau3AI会破坏目的基因，所以切割含有目的基因的DNA不能用Sau3AI，但BamHI与Sau3AI切出的黏性末端相同，所以可以用BamHI切割含有目的基因的DNA片段，得到的中间区段DNA片段，在左端为EcoRI切出的黏性末端，右端为BamHI切出的黏性末端，其两端与质粒EcoRI和Sau3AI切出的黏性末端相同，保证了目的基因和质粒正确连接，A正确； B、PCR扩增时，第一步是高温变性，将温度上升到90℃以上，使DNA双链解开成为单链，为后续引物结合等反应做准备，B正确； C、有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达，C错误； D、终止子是一段有特殊序列结构的DNA片段，能使转录在所需要的地方停下来，这是终止子的基本功能，D正确。 故选C。 3.（2025·黑龙江·模拟）研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因，再与pBI121质粒载体结合，导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如下图，下列相关叙述错误的是（　　） 注：图中 Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ为限制酶 A．①②过程均需使用DNA连接酶，②过程是基因工程的核心步骤 B．与只用Ⅰ相比，用Ⅰ和Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．只要检测出玉米细胞中含有融合基因，就说明抗蚜虫玉米培育成功 D．在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，不一定是成功导入重组载体的细胞 【答案】C 【详解】A、①②过程均是涉及DNA的连接，需使用DNA连接酶，②重组载体是基因工程的核心步骤，A正确； B、 K pn Ⅰ和 Xho Ⅰ作用位点不同，用 K pn Ⅰ和 Xho Ⅰ处理融合基因和载体，只有基因方向正确才能形成重组载体，从而保证基因转录方向正确，B正确； C、检测出玉米细胞中含有融合基因，不一定能说明抗蚜虫玉米培育成功，因为融合基因可能不能正常表达，还需作修饰处理，C错误； D、在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，不一定是成功导入重组载体的细胞，因为导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体也能在加入卡那霉素的培养基上存活下来，D错误。 故选C。 03 基因工程和蛋白质工程的应用 1.（2025·辽宁·模拟）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 【答案】D 【详解】A、水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化（不需要再次脱分化）。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误； B、转基因过程中，外源基因（P1基因）插入水稻染色体的位置是随机的（位置效应），不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误； C、水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误； D、题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 故选D。 2.（2025·黑龙江·模拟）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（    ） A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞 B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 【答案】A 【详解】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化前，需要将含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中，此时应先使用Ca2+处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态，A错误； B、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA中，因此紫杉醇合成的相关基因会随T-DNA整合到烟草染色体DNA上，B正确； C、紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌作用，C正确； D、利用转基因技术生产紫杉醇前体，可减少对天然红豆杉的依赖，有利于保护其资源，D正确。 故选A。 3.（2025·黑龙江·模拟）蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（    ） A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 【答案】A 【详解】A、二硫键是连接不同半胱氨酸残基的化学键，属于蛋白质一级结构的一部分。若二硫键断裂，会破坏蛋白质的空间结构，导致其功能丧失，A错误； B、蛋白质的功能依赖其特定的空间结构，若空间结构改变（如高温、强酸强碱导致的变性），其功能通常也会受到影响，B正确； C、乙醇等有机溶剂可破坏蛋白质分子中的氢键，导致其空间结构改变而变性，C正确； D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或合成一种新的蛋白质，因此利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质，D正确。 故选A。 1．（2025高三·辽宁·开学考试）科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 【答案】B 【详解】A、改造人胰岛素基因是依据 “植物偏好密码子”，密码子改变但编码的氨基酸不变（密码子的简并性），因此表达产物的氨基酸序列与天然胰岛素完全相同，A 错误； B、质粒1含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，质粒2含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，用这两种酶切割质粒1和质粒2，可将 “启动子 + 胰岛素基因” 连接到质粒2上构建质粒3（保证黏性末端匹配），B 正确； C、基因表达载体含 “潮霉素抗性基因”（筛选标记），因此应使用含潮霉素的培养基筛选；卡那霉素抗性基因在质粒2上，未整合到最终载体中，C错误； D、农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上，借助植物细胞的复制系统完成复制，无需额外添加复制原点，D错误。 2．（2025高三·哈尔滨·开学考试）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，其工作原理如图所示。下列有关说法错误的是（    ） A．Cas9蛋白的作用相当于限制酶 B．复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合 C．将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法 D．利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中 【答案】C 【详解】A、Cas9蛋白可以切割DNA序列，作用相当于限制酶，A正确； B、由图可知复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合，B正确； C、将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是转化法，C错误； D、由图可知，利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中，D正确。 3．（2025高三·辽宁·模拟）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展栽培马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。结合下图分析，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ EcoRⅠ XbaⅠ A．PCR扩增S基因时，需要模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等 B．为保证S基因正确插入载体中，需对其上游引物的5′端添加碱基序列5′-GAATTC-3′ C．用含重组Ti质粒的农杆菌侵染栽培马铃薯后，利用抗性基因2筛选成功转化的细胞 D．将已转化的马铃薯与普通栽培马铃薯种植在寒冷条件下可检验S基因是否发挥作用 【答案】B 【详解】A、PCR扩增基因的必备条件是：模板（S 基因的 DNA）、引物、4 种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的 DNA 聚合酶（Taq 酶），A正确； B、为保证S基因正确插入载体中，扩增目的基因时，需要在引物的5“端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BglⅡ、EcoRI和XbaⅠ的识别序列，切割载体需从这三种酶里选两种；而S基因内部含有XbaⅠ，这种酶不能用于切割S基因。再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BglⅡ、EcoRI切割载体，同时用BglⅡ和EcoRI切割S基因，才能保证S基因的正向连接(启动子一端)，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'，在下游引物添加的碱基序列是5'-GAATTC-3'，B错误； C、Ti 质粒的T-DNA区域包含抗性基因2（图中抗性基因2位于T-DNA范围内），T-DNA 会转移到植物细胞，因此可利用抗性基因2筛选转化细胞，C正确； D、检验S基因是否发挥抗寒作用，可通过表型鉴定：将已转化（含S基因）和普通马铃薯种植在寒冷条件下，对比两者的抗寒能力，即可验证S基因的功能，D正确。 4．（2025高三·大庆·模拟）DMD基因结构改变会造成表达的D蛋白异常从而导致假肥大肌营养不良（DMD）。一对表型正常的夫妇，生育了一个正常的女儿和一个患DMD的儿子。为研究DMD基因结构改变的原因，研究人员通过PCR技术对该家庭成员进行了相应的基因检测，所用的引物和扩增产物的电泳结果如图。假设DMD在男性中发病率为p，下列分析错误的是（　　） A．推测DMD基因和HS6S12基因位于X染色体上 B．DMD形成过程中可能发生了染色体的结构变异 C．女儿是否携带DMD致病基因可用引物组合④PCR检出 D．女儿婚后生育一个患有DMD疾病子代的概率是（p+1）/4 【答案】D 【详解】A、表型正常的夫妇生育了患DMD的儿子，说明该病为隐性遗传，电泳结果显示，父亲条带与患儿不同，而母亲的条带中有两条与患儿相同，这符合 X 染色体遗传特点，因此 DMD 基因和 HS6S12 基因位于 X 染色体上，A正确； B、正常 DMD 基因仅能被引物组合②、③扩增出条带，而患儿的异常基因还能被引物组合①、④扩增出条带，这说明 DMD 基因区域与 HS6S12 基因区域发生了染色体结构变异，使原本不相邻的序列连接在一起，导致新的引物组合能扩增出产物，B正确； C、引物组合④仅能扩增出异常 X 染色体，女儿的两条 X 染色体，一条来自父亲（父亲正常），一条来自母亲（可能正常 / 异常），若女儿携带致病基因，则用引物④可扩增出条带，若不携带则无，因此可检测女儿是否携带致病基因，C正确； D、母亲为携带者（XAXa），父亲为 XAY，女儿基因型为1/2 XAXA或1/2 XAXa，已知 DMD 在男性中发病率为 p，即人群中 Xa的基因频率为 p，XA为 1-p，若女儿为 XAXA（概率 1/2），与任何男性婚配，子代均不患病，概率为 0，若女儿为 XAXa（概率 1/2），与正常男性（XAY，概率 1-p）婚配，子代患病概率为 1/4（仅儿子 XaY 患病），与患病男性（XaY，概率 p）婚配，子代患病概率为 1/2（女儿 XaXa、儿子 XaY），女儿婚后生育一个患有DMD疾病子代的概率是1/2×[(1−p)×1/4+p×1/2]=（1+p）/8，D错误。 故选D。 6．（2025高三·辽宁·模拟）密码子偏好性是指在蛋白质合成过程中，不同生物对某些密码子的使用频率表现出明显的倾向性。例如，在大肠杆菌中，70%的亮氨酸由密码子CUA编码；原核生物与真核生物偏好的起始密码子编码序列分别是GTG、ATG等。下列叙述错误的是（    ） A．通过基因工程将某基因导入受体细胞后表达量不高的原因可能是因为密码子的偏好性 B．若要将某细菌的基因导入酿酒酵母，在扩增其基因时，可将其中一个引物的5′-端序列GTG改为ATG C．为满足大肠杆菌的密码子偏好性，可以通过基因改造改变基因的碱基序列 D．为满足生物的密码子偏好性而改造后的基因转录出的mRNA分子数量大幅下降 【答案】D 【详解】A、不同生物对某些密码子的使用频率有偏好，如果目的基因的密码子在受体细胞中使用频率低，会导致翻译效率低，甚至无法表达。 所以通过基因工程将某基因导入受体细胞后表达量不高的原因可能是因为密码子的偏好性，A正确； B、原核生物与真核生物偏好的起始密码子序列分别是GTG和ATG。若将某细菌的基因导入酿酒酵母，在扩增目的基因时，将其中一个引物的GTG改为ATG，可以让基因在真核细胞中更高效地起始翻译，B正确； C、为满足大肠杆菌的密码子偏好性，通过基因改造改变基因的碱基序列，使其使用大肠杆菌偏好的密码子，能提高翻译效率，C正确； D、改造基因的密码子偏好性时，是对基因的碱基序列进行同义替换，转录出的mRNA的碱基数量不变，因此mRNA分子数量不会大幅下降，D错误。 故选D。 7．（2025高三·吉林·模拟）科研人员为培育转基因大豆，构建了含特定功能元件的基因表达载体（左图为载体部分结构，右图为限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点），LB/RB是T-DNA的边界序列，Kanr为卡那霉素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，下列说法正确的是（    ） A．经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列相同 B．用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，扩增产物特异性越低 C．用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4种 D．应选择含有氨苄青霉素的培养基去筛选成功转化的大豆细胞 【答案】B 【详解】A、由限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点可知，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'和5'-GTTT-3'，A错误； B、用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，引物与模板的结合特异性越差，非特异性结合增多，扩增产物特异性越低，B正确； C、由限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点可知，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端远远多于4种，C错误； D、Kanr是卡那霉素抗性基因，且位于T-DNA上，因此会进入受体细胞，重组Ti质粒通过农杆菌导入大豆细胞后，应使用含卡那霉素的培养基对受体细胞进行筛选，D错误。 故选B。 9．（2025高三·大庆·模拟） γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ）      A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【答案】A 【详解】 A、图示表明，可以从酿酒酵母S中通过PCR分离得到目的基因gadB，A正确。 B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误； C、E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误； D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用其他酶代替，D错误。 故选A。 10．（2025·高三哈尔滨·模拟）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 【答案】D 【详解】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确； B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确； C、电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确； D、甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。 故选D。 11．（2025·哈尔滨·模拟）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 【答案】B 【详解】A、将T - DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状。那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误； B、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， B正确； C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T - DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中 ，通常情况下，若D基因能表达，那么T - DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T - DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T - DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错误； D、 检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株， D错误。 故选B。 12．（2025·高三吉林·模拟）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 【答案】C 【详解】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误； B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误； C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确； D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。 故选C。 13．（2025·高三吉林·模拟）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 (1)质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是_____和_____。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG (2)细胞X是一种贴壁细胞，可用_____（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是_____。 (3)将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有_____作用，且随导入时间推移，增殖速率_____。 (4)siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将_____导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的_____对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：_____。 【答案】(1) EcoR Ⅰ Xho Ⅰ (2) 液体 使贴壁细胞分散为单个细胞，37℃是胰蛋白酶的最适温度 (3) 促进 增加 (4) 无靶向的siRNA 表达减少 a、提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用； b、提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用） 【详解】（1）需选择质粒甲和质粒乙共有的限制酶切割，保证目的基因和质粒产生相同黏性末端。质粒甲的目的基因两端有EcoRⅠ和Xho Ⅰ的酶切位点（对应质粒乙的酶切位点），因此用EcoRⅠ和Xho Ⅰ。 （2）动物细胞培养使用液体培养基； 胰蛋白酶在 37℃（人体 / 动物细胞适宜温度）下活性高，可分解细胞间的蛋白质，使贴壁细胞分散成单个细胞，便于传代培养。 （3）与空质粒乙组（对照组）相比，重组质粒乙组（含基因 Z）的细胞数量更多，说明基因 Z 的表达对细胞增殖有促进作用；随导入时间推移，两组细胞数量的差距增大，说明增殖速率加快。 （4）①对照组应导入无关序列的 siRNA（或空载体）（排除 siRNA 本身的影响）；该实验通过抑制基因 Z 的表达（siRNA 切割其 mRNA），目的是探究基因 Z 的表达缺失（或抑制表达）对细胞增殖的影响。 ②在分子水平检测基因的表达，可以从转录和翻译水平，可提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用；也可提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用。 14．（2026·高三辽宁·模拟）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ (2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 (3) 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 (4) 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 【详解】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中①是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶1基因序列，④是溶解酶2基因序列。 1．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 2．（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 【答案】B 【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 3．（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 【答案】B 【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误； B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确； C、延伸过程需引物参与，C错误； D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误； 故选B。 4．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 5．（2024·吉林·高考真题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______和______。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】(1) 除去蛋白质杂质 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2) PCR技术扩增 人工合成 (3) RNA聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因转录效率 (4)HygBR (5) F3 R2 (6)D 【详解】（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质。研磨液中的SDS能使蛋白质变性，因此无需担心DNA酶水解DNA。但即使有蛋白质变性剂使蛋白质变性改变其理化性质，仍然有可溶性、不溶性的蛋白质杂志通过沉淀、过滤等物理方式难以去除，因此为了获得较纯的DNA，保证提取的DNA作为PCR模板的品质，需要加入蛋白酶。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 （2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因转录效率。 （4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 （6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。 ABC不符合题意，D符合题意。 故选D。 6．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： (1)上述过程属于_____工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶     ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶     ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。    (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。    (5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 【答案】(1)蛋白质 (2)③ (3)② (4)标记基因 (5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7 (6)逆转录 【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。 （2）PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。 （3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。 （4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。 （5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。 （6）转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 / 学科网（北京）股份有限公司 $