热点题型4 PCR技术在基因工程中的应用-【学霸黑白题】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（人教版）

热点 强花 热点题型4PCR技术在基因工程中的应用 1.(2023·山东烟台期中)RT-PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式 反应相结合的技术。某兴趣小组为该过程设计了相关引物。下列说法错误的是 () 图 GATTA一3 -3 AACTG CAGTT A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+ B.一般情况下，引物A和B的长度越长、C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设 定就越低 C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色 D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而 失效 2.（2023·河南开封期中)为了解转基因烟草对生态环境的影响，研究人员以TMV-cp烟草品种 NC89为实验材料，对转基因烟草外源基因TMV-cp漂移到杂草上的可能性进行了研究。研 究人员随机选取了5株NC89烟草，并在NC89烟草株系及周边随机选取各种杂草，提取 DNA,根据TMV-cp基因设计引物进行PCR扩增，电泳结果如图。下列相关叙述错误的是 M123456789101112131415161718 100bp 250bp A.设置空白对照是为排除实验操作等对结 500 hn 750hn 果的影响 1 kb 2 kb B.电泳结果表明TMW-cp基因在NC89烟草 注：1为阳性对照，2为空白（阴性）对照.3~7为NC89烟草样品 8~18表示杂草样品。 细胞内稳定存在 C.电泳结果表明烟草中TMV-cp基因未漂移至周边杂草 D.将TMV-cp基因转入其他植物时不需要经过安全性评价 3.加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA序列的PCR。加端PCR的引物被设计成除与 模板配对的那一部分以外再加上若干碱基，以便能使扩增产物的末端加上额外的一段DNA。 hIGF-1cDNA编码成熟蛋白的序列两端无起始密码子和终止密码子的对应位置，也没有合适 的限制酶切割位点。实验人员为了在枯草杆菌中表达hIGF-1,应用加端PCR技术对hIGF-1 cDNA进行改造，以期获得含有hIGF-1成熟蛋白79个氨基酸编码序列，并在两端分别带有 PstI和SalI酶切位点的DNA片段。加端PCR技术示意图如下，回答下列问题： 引物3引物4 1 73 3' 5 引物1引物2 (1)进行加端PCR时应选用的引物是 06黑白题生物1选择性必修第三册RJ (2)在目的基因的两端添加限制酶切割位点的目的是 将改造后 的hlGF-1基因导入枯草杆菌的常用方法是用Ca2+处理枯草杆菌，其日的是 ；原核生物作为基因工程的受体细胞的优点有： (答出三，点即可)。 (3)限制酶PstI的识别序列及切割位点为-CTGCAG,请根据该序列写出经PtI切割后产 生的黏性末端 (4)在构建基因表达载体时，使用PstI和SalI两种限制酶切割hIGF-1基因和质粒，而不是 只选择一种限制酶切割hIGF-1基因和质粒，这样做的优点是 (答出两点即可)。 4.(2023·江苏常州期中)某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而 进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。如图1是科研人员利用该病毒S基因和RBD基因， 研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。 相关限制酶识别序列及切割位点： Bgl Il:5-AGTCT-3' Xba I:5-TCTAGA-3 HindⅢ：5'-AAGCT-3 Nde I:5-CATATGA-3 S基因RBD基因 BamH I:5-G'GATCC-3'EcoR I:5-GAATTC-3' PCR 引物1融合 扩增 过 S-RBD 引物2 基因 BglIⅡ 荧光蛋 B.重组pX 工 白基因 系列质粒 一 X质粒 菌落 Xba I 1?培养基B 食启动子 ×12 ·4 HindⅢ 青霉素抗性基因 终止子 5. 46 123 四环素抗性基因 5 培养基A BamH I Nde I 培养基A 46 图1 图2 (1)PCR扩增时，微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原 料 。PCR过程需要特异性引物的原因是 ,PCR的最后一个循环结束后通常还需要在72℃维持7min左右，其目的是 (2)为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，再合成RBD 蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5'端添加的限制酶序列是 在引物2的5'端添加的限制酶序列是 (3)过程B需要的工具酶有 基因表达载体时，复制原点中A一T的比 例较高，有利于 (4)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常可先后用两种抗生素进行原位影印培养（使用 无菌的线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如 图2)。培养基A中应添加 培养基B中应添加 ,含有重组质粒的菌落 是 (填写数字)，根据图中信息，鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导人工程菌在 细菌群体水平上还可以通过观察 0 进阶突破·专项练07实现；取脾脏部分组织制成细胞悬液与骨髓瘤细胞诱导融合，一般采 用的化学诱导剂为聚乙二醇(PEG)。(2)据题图1可知，杂交瘤细胞 需要对甲筛选，因此乙和丙应该是筛选得到的杂交瘤细胞：其中①过 程代表用特定的选择培养基进行筛选，②过程表示将乙细胞接种到 多孔培养板上，进行克隆化培养和抗体阳性检测，之后稀释、培养、再 检测，并多次币复上述操作，就能获得足够数量的能分泌抗cTnI抗 体的细胞，该类细胞的特点是既能大量增殖又能产生特异性强、灵敏 度高的抗cTnI抗体。(3)分析题图2过程可知，两种抗体与检测的 抗原均能结合，但结合部位不同：该检测方法中，酶标抗体与待测抗 原结合，酶催化特定底物反应产生检测产物，可通过测定产物量来判 新待测抗原量。 4.(1)CD47蛋白（或CD47)胰蛋白酶或胶原蛋白（答出一个即可） (2)选择既能大量增殖，又能产生专一（或特异性）抗体(3)抗原 与抗体特异性结合筛选出能产生抗CD47抗体（所需杭体）的杂交 瘤细胞(4)不加单克隆抗体的巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养体系 高于 解析：(1)为获得抗CD47的单克隆抗体，实验前应给模型小鼠注射 CD47蛋白，以刺激机体产生相应的B淋巴细胞。题图1中制备B淋 巴细胞悬液时可采用机械方法或用胰蛋白酶处理。(2)题图1中筛 选1是将融合细胞放在选择性培养基上培养，将既能大量增殖、又能 产生抗体的杂交瘤细胞筛选出来。(3)题图2表示筛选2过程，取一 定稀释倍数的杂交瘤细胞悬液加入或胶原蛋白酶多孔玻璃板中，适 宜条件下培养，然后利用抗原与抗体特异性结合的原理进行抗体检 测。检测阳性反应孔中的细胞还需多次稀释培养并检测，最终将能 产生抗CD47抗体的杂交瘤细胞筛选出来。(4)为研究抗CD47的单 克隆抗体的功能，实验组为单克隆抗体加人巨噬细胞与肿瘤细胞的 共同培养体系，根据单一变量原则，应设置不加单克隆抗体的巨噬细 胞和肿瘤细胞的共培养体系作为对照组。若实验组中被吞噬的肿瘤 细胞所占的比例高于对照组，则可证明上述推测正确。 热点题型4PCR技术在基因工程中的应用 1.B解析：PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲 溶液中一般要添加Mg2+,Mg2+能激活DNA聚合酶，A正确；一般情况 下，引物A和B的长度越长，C和G比例越高，则PCR循环步骤中的 复性温度设定就越高，B错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳 来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色，然后可在紫外灯下检 测出来，C正确：实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引 物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸，D正 确。故选B。 2.D解析：为了排除实验操作等对结果的影响，需要设置空白对照，A 正确；TMV-cp基因在NC89烟草细胞内稳定存在，所以能够在转基因 烟草中提取到TMW-印基因，电泳会出现相应的条带，B正确；8~18 表示杂草样品，都没有出现TMV-cp基因条带，则烟草中TMW-cp基 因没有漂移至周边杂草，C正确；将TMV-cp基因转入其他植物时需 要经过安全性评价，D错误。故选D。 3.(1)引物1和引物4(2)使目的基因经限制酶切割后能产生黏性末 端，以便和质粒相连使枯草杆菌处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态原核生物多为单细胞生物：细胞繁殖速度 快；遗传物质相对较少；易培养；代谢速度快 (3) -CTGCA G- (4)可防止目的基因和质粒反向连接，防止 -G ACGTC- 目的基因、质粒自身环化 解析：(1)加端PCR所选引物应有一部分序列不与模板链配对，结合 题图可知引物1和引物4是加端PCR所用引物。(2)在目的基因的 两端添加限制酶切割位点后，可使用相应的限制酶分别切割目的基 因和质粒，使二者产生相同的黏性末端，以便连接形成重组质粒。先 用Ca2+处理枯草杆菌，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分 选择性必修第三册·RJ 子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。原核生物 多为单细胞生物，其繁殖速度快，遗传物质相对较少，易培养，代谢速 度快，因此常用原核生物作为基因工程的受体细胞。(3)限制酶 PstI的识别序列及切割位点为-CTGCAG-,根据中心轴线可判断， 该酶切割后产生的是黏性末端，见答案所示。(4)在hIGF-1基因的 两端加入不同的限制酶切割位点后，再利用相应的限制酶切割，一般 会产生不同的黏性末端，在利用DNA连接酶连接时，可防止目的基 因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化。 4.(1)缓冲液耐高温的DNA聚合酶一方面引物能与目的基因中特 定的核苷酸序列发生碱基互补配对，另一方面引物能使DNA聚合酶 从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸使子链充分延伸（或获得更多 的完整目的片段)(2)5'-TCTAGA-3'5'-CATATGA-3'(3)限 制酶XbaI、限制酶NdI以及DNA连接酶解旋过程，促进复制过 程(4)青霉素四环素5和6菌落是否具有荧光，有荧光的含 有pX质粒 解析：(1)PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定 的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制，微量离心管 中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料、缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶。PCR过程需要特异性引物的原因：一方面引物能与目的基 因中特定的核苷酸序列发生碱基互补配对，另一方面引物能使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，PCR的最后一个循环结 束后通常还需要在72℃维持7min左右，这样可以使子链充分延伸 (或获得更多的完整目的片段)。(2)为使S-RBD基因能与pX质粒 相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，再合成RBD蛋白，则需 要让S基因与启动子靠近，则PCR过程中，应在引物1的5'端添加限 制酶XbaI的序列5'-TCTAGA-3',在引物2的5'端添加限制酶 NdeI的序列5'-CATATGA-3'。(3)过程B为目的基因表达载体的 构建，需要的工具酶有限制酶XbaI、限制酶NdeI以及DNA连接 酶，基因表达载体的复制原点中A一T的比例较高，有利于解旋过程， 促进复制过程的实现，这是因为A一T之间有2个氢键，而G一C之 间有3个氢键。(4)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常可先后 用两种抗生素进行原位影印培养（使用无菌的线毡布压在培养基A 的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如题图2)。 培养基A中应添加青霉素，培养基B中应添加四环素，能在前者中生 长的大肠杆菌可能是导入了重组质粒和普通质粒的大肠杆菌，而在 构建基因表达载体时，由于四环素的抗性基因被破坏，因而含有重组 质粒的大肠杆菌不具有对四环素的抗性，因此，题图2中含有重组质 粒的菌落是5和6，根据题图中信息，鉴定pX质粒和重组pX质粒是 否导人工程菌，在细菌群体水平上还可以通过观察菌落是否具有荧 光，有荧光的则含有pX质粒，这是因为在构建重组质粒的过程中荧 光蛋白基因受到了破坏。 热点题型5基因工程的操作程序 1.C解析：基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PCR 扩增获取目的基因，A错误；由于载体E只有产生黏性末端的酶切位 点，要使中间载体P接入载体E,同时防止载体E自身环化，需要用 两种限制酶分别切割载体E和中间载体P,据题图可知，中间载体P 和载体E均含有XoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI 酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有Ec0RV识别位点， 并且其切割产生的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然 也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于Xh和I和PstI酶识 别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误；由题图 可知，载体P是中间质粒，不含有表达该目的基因的启动子和终止 子，C正确：受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重 组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。故 选C。 2.A解析：可用抗原一抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表 黑白题30