专题18 基因工程（2大核心整合+能力进阶）（复习讲义）2026年高考生物二轮复习讲练测

专题18 基因工程 目录 01 析·考情精解 2 02 构·知能架构 3 03 串·核心通络 4 核心整合一 基因工程的基本工具 4 自查探针 4道真题选改判，“探”出薄弱点，“诊”明提分路！ 核心串讲 串讲1 基因工程的三种基本工具 串讲2 DNA的粗提取与鉴定 能力进阶 能力1 与DNA有关的几种酶的比较 核心整合二 基因工程的基本操作程序和应用 6 自查探针 3道真题选改判，“探”出薄弱点，“诊”明提分路！ 核心串讲 串讲1 基因工程的基本操作程序 串讲2 基因工程的应用 串讲3 蛋白质工程 能力进阶 能力1 限制酶与载体的精准选择 能力2 基因表达载体的优化设 能力3 基因工程与其他技术的综合应用 04 破·题型攻坚 11 真题动向 引入科技前沿、农业生产实践等新情境、融合新概念反套路命题！ 命题预测 考向1 基因工程的基本工具 考向2 基因工程的基本操作程序 考向3基因工程的应用 考向4 蛋白质工程 05 拓·素养提升 30 素养链接 情境拓展、长句表达！ 高考预测 5道最新模拟，精准预测素养考向！ 命题轨迹透视 从近三年高考试题来看，考查题型：命题以选择题和非选择题（选修大题为主）结合呈现，选择题单题分值2-3分，非选择题多为8-12分的综合大题，是选修模块的核心考查内容。命题趋势：早期命题侧重基础概念记忆，比如直接考查基因工程的基本工具（限制酶、DNA连接酶、载体）、基本操作步骤等核心定义。近年转向核心考点的深度理解，聚焦三类重点内容：一是工具的细节辨析，如限制酶的切割位点特异性、DNA连接酶与DNA聚合酶的功能差异、载体必备的条件及常见载体（质粒、噬菌体）的特点；二是操作步骤的核心逻辑，重点考查基因表达载体的构建（核心步骤）、目的基因导入不同受体细胞（植物、动物、微生物）的方法差异及适用场景；三是检测与鉴定，围绕分子水平检测（DNA分子杂交、分子杂交、抗原-抗体杂交）和个体水平鉴定（抗虫、抗病等性状验证）的原理、流程及结果分析。 核心素养导向：从单纯考知识记忆转向核心素养的综合考查。生命观念上，通过基因表达载体构建与功能实现的关联，强化结构与功能观及基因控制性状的本质认知；科学思维上，常结合目的基因获取方案设计、受体细胞选择等情境，考查归纳推理与逻辑分析能力；科学探究上，聚焦基因工程相关实验设计与结果分析，考查实验原理应用、操作误差判断及方案优化能力。 高考命题风向 新情境：依托科研前沿与实际应用创设情境，强化知识的实践迁移。常见情境包括：以基因编辑技术（CRISPR-Cas9）治疗遗传病为背景，考查目的基因的获取与导入；结合抗虫转基因作物培育、重组人胰岛素生产等产业应用，设问基因表达载体的构建要点；借助新冠疫苗（mRNA疫苗、重组蛋白疫苗）研发情境，关联基因转录、翻译及载体改造的核心知识，实现“情境载体—知识应用”的深度绑定。 新考法：打破单一知识点割裂考查，转向“技术逻辑+综合应用”的整体考查。一是聚焦技术关联，如将基因工程与细胞工程（植物组织培养、动物核移植）、胚胎工程结合，考查转基因生物培育的完整流程；二是侧重方案设计与分析，要求考生根据具体需求（如培育抗除草剂作物）设计基因工程方案，分析限制酶选择、受体细胞适配性等关键问题；三是强化误差分析，结合实验数据（如目的基因表达量差异）推断操作环节的异常原因，考查科学探究的严谨性。 新角度：跳出“常规技术流程”，关注特殊场景与细节辨析。其一，考查不同生物的技术差异，如对比原核生物（大肠杆菌）与真核生物（酵母菌）作为受体细胞的优势与局限；其二，聚焦技术细节拓展，如分析启动子、终止子的序列功能对目的基因表达的影响，或辨析基因工程中标记基因的选择原则；其三，渗透技术伦理与应用边界，通过转基因生物的安全性讨论，引导考生建立科学的技术观。 考点频次总结 考点 2025年 2024年 2023年 基因工程的基本工具 2025·江苏·T19　 2024·湖南·T5 2024·江西·T12 2023·新课标·T6　 基因工程的基本操作程序 2025·河南·T21　 2025·安徽·T15 2025·黑吉辽蒙·T25 2025·河北·T22 2025·山东·T25　 2024·甘肃·T21 2024·贵州·T21 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20　 基因工程的应用和蛋白质工程 2025·陕晋宁青·T21　 2025·四川·T19　 2025·云南·T21　 2025·甘肃·T21　 2024·河北·T5 2023·广东·T11　 2026命题预测 2026年基因工程命题将紧密围绕技术创新融合、产业应用落地及伦理监管平衡三大核心，聚焦前沿突破与现实议题的结合。具体预测方向如下： 一、技术融合创新类。AI辅助基因编辑成高频考点，可能以Nature报道的AI设计基因编辑器为背景，考查基因编辑工具的优化原理、精度提升机制及实验设计逻辑。此外，桥接重组酶介导的兆碱基级基因组重排技术，或结合CRISPR与重组酶的融合系统，可能出技术探究题，要求分析大尺度基因编辑的突破价值。 二、产业应用实践类。农业领域可能围绕垂直农业基因模块创制早熟高产番茄、基因编辑民猪培育等案例，考查基因编辑在品种改良、粮食安全中的应用，结合载体构建、目的基因筛选等核心知识点。医疗领域大概率聚焦血友病B基因治疗药物上市等案例，考查基因治疗的载体选择、递送机制及临床应用评价。 三、伦理监管与社会影响类。可能以澳大利亚《基因技术修正条例2025》等政策为背景，探讨基因技术产业化中的监管适配性问题。同时，针对AI主导基因编辑研究的伦理边界、基因编辑技术的公平可及性等议题，设计论述题考查科技与伦理的平衡思维。 命题形式将侧重情境化材料分析，强调理论与实践结合，既考查基因编辑原理、载体构建等基础知识点，也注重评估对前沿技术的理解及社会责任感。 核心整合一 基因工程的基本工具 (1)（2025 天津 T6）电泳分离DNA片段时，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶( √ ) (2)（2025 湖南 T2 改编）DNA的粗提取与鉴定可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”(×) (3)（2025 河北 T5 改编）在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA（ √ ） (4)（24年贵州T13改编）不同的限制酶识别的DNA序列不同，但使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(√) 串讲1 基因工程的三种基本工具 基因工程的三种基本工具 限制性内切核酸酶 DNA 连接酶（种类） 载体（特点） 作用：识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 使用方法：一般用相同限制酶切割载体和目的基因 ① E.coli DNA 连接酶② T4 DNA 连接酶 ① 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制② 有一个至多个限制酶切割位点③ 具有特殊的标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选 【易错一笔勾销】 1、误认为限制酶可切割任意DNA序列，或切割单链DNA。实则仅识别特定双链DNA回文序列，切割磷酸二酯键，不切割氢键。 2、混淆二者作用，认为均可连接DNA片段。实则DNA连接酶连接两个DNA片段，DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸连接到已有DNA链上。 3、仅记住载体需有标记基因，忽略需具备复制原点（自主复制）、多个限制酶切点（便于插入目的基因）等关键条件。 串讲2 DNA的粗提取与鉴定 原理 利用 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA，去除其他成分 DNA 性质 DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA 能溶于 2 mol・L⁻¹ 的 NaCl 溶液 鉴定 在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色 步骤 研磨→过滤 (取上清液)→加入体积相等的、预冷的酒精 (体积分数为 95%)，静置 2~3 min→搅拌 (或离心)→取白色丝状物 (或沉淀物)→溶解→鉴定 DNA 【易错一笔勾销】 1、酒精使用易错：必须用预冷的体积分数 95% 酒精，常温酒精会降低 DNA 析出效率，未预冷易导致 DNA 断裂、杂质增多。 2、NaCl 浓度易错：DNA 仅在2 mol·L⁻¹ NaCl中溶解度高，浓度过低会使 DNA 提前析出，过高则无法有效去除杂质。 3、二苯胺鉴定易错：鉴定需沸水浴加热，未加热或温度不足会导致蓝色不明显，易误判为无 DNA。 4、过滤取液易错：过滤时应取上清液，若取沉淀会丢失大量 DNA，直接影响后续提取与鉴定结果。 能力1 与DNA有关的几种酶的比较 能力解读 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 典题示例1.下面是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述不正确的是(　 ) A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性 B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对 C．限制性酶1和酶3剪出的黏性末端相同 D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2 核心整合二 基因工程的基本操作程序和应用 (1)（2025 全国 T11 改编）PCR过程中解开双链的方法是用解旋酶处理（ × ） (2)（2025 甘肃 T21）重组Ti质粒构建完成后，可通过农杆菌转化法将该质粒转入植物细胞（ √ ） (3)(2025 云南T21)构建的基因表达载体除启动子外，还必须有目的基因、终止子、标记基因。(　 √ 　) 串讲1 基因工程的基本操作程序 操作步骤 关键操作细节 核心目的 易错点/难点提醒 目的基因的获取 1. 从基因文库中筛选；2. PCR扩增（需引物、Taq酶、dNTP）；3. 人工合成（适用于短基因、已知序列） 获取完整、可表达的目的基因，为后续操作提供基础 1. PCR需热稳定DNA聚合酶，引物不能互补；2. 基因组文库≠部分基因文库，前者含全部基因 基因表达载体的构建 1. 用相同/互补限制酶切割目的基因和载体；2. DNA连接酶连接（黏性末端用E·coli酶，平末端用T4酶）；3. 构建含启动子、终止子、标记基因的重组载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在、自主复制，且能表达和发挥作用 1. 核心步骤，直接决定实验成败；2. 需避免质粒自连、目的基因反向连接（可采用双酶切） 将目的基因导入受体细胞 1. 植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；2. 动物：显微注射法；3. 微生物：Ca²⁺处理使细胞处于感受态 让目的基因进入受体细胞，完成扩增和后续表达的前提 1. 导入成功≠目的基因表达；2. 不同受体细胞选择对应方法，感受态细胞需新鲜制备 目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平：DNA分子杂交（检测导入）、分子杂交（检测转录）、抗原-抗体杂交（检测翻译）；2. 个体水平：性状观察、抗逆性检测等 确认目的基因是否成功导入、转录和表达，筛选出符合要求的受体细胞/个体 1. 三步分子检测层层递进，缺一不可；2. 个体水平鉴定是最终验证手段，需排除干扰性状 【易错一笔勾销】 1、双酶切可避免质粒自连、目的基因反向连接，连接酶只连磷酸二酯键，不连接碱基对。 2、导入受体细胞≠目的基因表达，不同受体细胞方法不同，感受态细胞需新鲜制备。 3、混淆分子水平三步检测，DNA杂交测导入、分子杂交测转录，抗原-抗体杂交测翻译。 串讲2 基因工程的应用 应用领域 核心原理 优势/注意事项 植物基因工程 将目的基因（如Bt毒蛋白基因、抗除草剂基因）导入植物细胞，使其稳定表达，获得优良性状 优势：提高产量、减少农药使用；注意：避免基因污染，关注食品安全与生态影响 动物基因工程 将目的基因导入动物受精卵或体细胞，培育转基因个体，或通过基因编辑修复缺陷基因 优势：生产药用蛋白效率高、治疗遗传性疾病；注意：伦理争议，需严格控制实验规范 微生物基因工程 改造微生物基因组，使其实表达目的基因，或赋予其降解特定物质、合成特定产物的能力 优势：繁殖快、成本低、易培养；注意：防止工程菌泄露，避免破坏自然微生物群落 基因治疗与诊断 利用基因编辑技术修复缺陷基因，或通过核酸分子杂交、PCR技术检测特定基因 优势：精准治疗遗传病、检测灵敏度高；注意：基因编辑的伦理边界，避免脱靶效应 【易错一笔勾销】 1、误将抗虫棉的抗虫性状归为细胞质遗传，忽略基因污染风险，混淆抗虫与抗逆基因的作用。 2、混淆乳腺生物反应器与体细胞核移植的原理，误认为导入基因就一定能稳定表达。 3、忽视工程菌泄露对生态的影响，误将转基因微生物的产物直接用于医疗而不提纯。 4、混淆基因治疗与基因诊断的区别，忽略基因编辑的脱靶效应和伦理边界问题。 串讲3 蛋白质工程 核心内容/操作 关键原理 与基因工程的差异/注意事项 核心目标 改造现有蛋白质，或合成自然界不存在的新型蛋白质，满足特定需求 基因决定蛋白质的氨基酸序列，通过修饰基因来改变蛋白质结构与功能 基因工程：“从基因到蛋白质”（定向表达）；蛋白质工程：“从蛋白质到基因”（反向设计） 基本操作步骤 预期蛋白质功能→设计氨基酸序列→推测基因序列→改造/合成基因→表达验证 遵循中心法则逆推，利用基因修饰、合成技术，实现蛋白质结构的定向改造 步骤比基因工程多“蛋白质结构设计、基因序列推测”，核心是基因的定向改造 关键难点 蛋白质空间结构预测困难、改造后可能丧失活性、基因修饰精准度要求高 蛋白质结构与功能高度相关，氨基酸序列的微小改变可能导致功能异常 难点集中在“设计环节”，需结合生物信息学技术，实验验证难度高于基因工程 【易错一笔勾销】 1、误将蛋白质工程等同于基因工程，忽略其“从蛋白质到基因”的反向设计核心，混淆二者操作顺序。 2、误认为仅替换单个氨基酸就可优化功能，忽视氨基酸序列与蛋白质空间结构、活性的关联。 3、混淆DNA连接酶与DNA聚合酶的功能，误将平末端连接效率等同于黏性末端，忽略T4连接酶的特殊性。 4、仅关注蛋白质结构改造，忽视改造后蛋白质的活性检测，误判“改造成功”的标准。 能力1 限制酶与载体的精准选择 1、载体的精准选择 实验场景 首选载体 核心依据 关键提醒 微生物表达（如大肠杆菌产胰岛素） 质粒 繁殖快、多拷贝、易培养，可快速扩增目的基因 需选用表达型质粒，含强启动子，保证目的基因高效表达 植物转基因（如抗虫棉培育） Ti质粒（农杆菌介导） 农杆菌可侵染植物细胞，T-DNA能转移并整合到植物基因组 仅适用于双子叶植物和裸子植物，单子叶植物需改用基因枪法 动物转基因（如乳腺生物反应器） 动物病毒载体 侵染动物细胞效率高，可将目的基因整合到动物基因组 需提前改造病毒，去除致病基因，避免对受体细胞造成损伤 基因治疗（人体细胞修饰） 腺病毒/逆转录病毒载体 能高效侵染人体细胞，实现目的基因稳定导入 逆转录病毒可整合入基因组，需防范插入突变风险 2、单酶切与双酶切的核心对比 切割方式 优点 缺点 适用场景 单酶切 操作简单，无需考虑酶的兼容性 质粒自连率高，目的基因易反向连接，筛选难度大 初步构建、对目的基因连接方向无要求的实验 双酶切 彻底避免质粒自连，保证目的基因定向连接，筛选简便 操作复杂，需保证两种酶的缓冲液、反应温度兼容 精准构建、目的基因表达效率要求高的实验 典题示例1（2025·云南昆明·模拟预测）以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列有关叙述正确的是（    ） A．切割产生①片段的限制酶识别序列由5个碱基对构成 B．限制酶只存在于原核生物，作用的化学键为磷酸二酯键和氢键 C．上述能进行连接的两个黏性片段，其连接后形成的DNA分子是 D．两个③片段只能被E.coli DNA连接酶催化连接形成重组DNA 能力2 基因表达载体的优化设计 优化维度 具体优化策略 核心优化目的 易错点/注意事项 启动子优化 1. 选择与受体细胞匹配的启动子（原核→乳糖操纵子启动子，真核→CMV启动子）；2. 选用强启动子，增强转录效率；3. 添加增强子，提升启动子活性 确保目的基因在受体细胞中高效、特异性转录，避免启动子不兼容导致的表达沉默 勿混淆原核与真核启动子，启动子与目的基因的距离需合理，否则影响转录效率 终止子优化 1. 选择适配受体细胞的终止子；2. 避免终止子缺失或序列异常；3. 添加poly(A)尾（真核载体），稳定mRNA 保证转录精准终止，防止出现异常长度的mRNA，减少对目的基因表达的干扰 原核载体无需添加poly(A)尾，终止子序列突变会导致转录通读，影响表达产物 目的基因优化 1. 优化密码子偏好性（适配受体细胞的密码子使用频率）；2. 去除内含子（原核载体）；3. 添加信号肽序列（分泌型蛋白表达） 提升目的基因的翻译效率，确保表达产物正确折叠、定位，减少异常蛋白产生 原核细胞无法剪切内含子，密码子优化需兼顾整体序列，不可仅替换单个密码子 标记基因优化 1. 选择筛选效率高的标记基因（如荧光基因、抗性基因）；2. 避免标记基因与目的基因相互干扰；3. 采用双标记基因，提升筛选准确性 快速、精准筛选出含重组载体的受体细胞，排除空质粒和未导入载体的细胞 抗性基因需与筛选培养基匹配，双标记基因需避免酶切位点重叠，防止被破坏 典题示例1（2025·广东汕尾·一模）研究表明，COX-2基因与肿瘤细胞的迁移有关，科研人员通过构建COX-2基因表达载体（如图），用于进一步研究COX-2基因表达产物对肿瘤细胞迁移的作用机制。图中1链为转录的模板链，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶识别序列，LacZ基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。下列说法正确的是（    ） A．通过PCR扩增COX-2基因片段，需要加入引物A和引物D B．为构建COX-2表达载体，需在与1链结合的引物的5'端添加BamHⅠ识别序列 C．在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落 D．在含X-gal培养基中长出的蓝色菌落含重组质粒 能力3基因工程与其他技术的综合应用 综合应用场景 结合的核心技术 具体操作与核心逻辑 易错点/注意事项 转基因动植物培育 基因工程 + 胚胎工程（动物）/ 植物组织培养（植物） 先通过基因工程获得含目的基因的细胞，再利用胚胎工程（显微注射→胚胎移植）或植物组织培养，培育完整转基因个体，实现优良性状稳定遗传 动物转基因需导入受精卵，植物转基因后需脱分化、再分化，避免未分化细胞导入导致培育失败 药用蛋白高效生产 基因工程 + 蛋白质工程 + 微生物发酵工程 通过蛋白质工程设计优化药用蛋白结构，基因工程构建重组载体导入微生物，利用发酵工程大规模培养，提升蛋白产量与活性 需匹配微生物密码子偏好性，发酵条件需适配工程菌生长，避免蛋白折叠异常 遗传病精准治疗 基因工程 + 基因编辑技术 + 细胞工程 利用基因编辑技术修复缺陷基因，通过基因工程构建重组载体，结合细胞工程培养健康细胞，再移植回患者体内，实现精准治疗 关注基因编辑脱靶效应，避免编辑正常基因，严格遵循伦理规范，防止细胞移植排斥 抗逆作物培育 基因工程 + 植物细胞工程 + 诱变育种 通过诱变育种获得潜在抗逆突变体，基因工程导入抗逆基因，结合植物组织培养快速繁殖，筛选出抗逆性强的优良品种 诱变育种需筛选优良突变体，基因导入后需验证抗逆性状稳定性，避免基因污染 生态环境治理 基因工程 + 微生物工程 + 细胞工程 通过基因工程改造微生物，赋予其降解污染物的能力，利用微生物工程大规模培养工程菌，结合细胞固定化技术，提升污染治理效率 防止工程菌泄露破坏生态平衡，需优化工程菌的存活能力，避免污染物降解产生有毒副产物 典题示例1（2025·山东青岛·二模）微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢产物萜类物质。下列说法错误的是（　　） A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质 B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因 C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达 D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性 1．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 命题解读 新情境：本题以基因工程核心技术 —— 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳为真实实验情境，精准对接分子生物学研究与基因工程应用的实际场景。题干给出含特定限制酶切位点（2 个EcoRⅠ、1 个SacⅠ、1 个BamHⅠ，且BamHⅠ 位于两EcoRⅠ 正中间）的质粒 P，结合单酶切、双酶切产物的凝胶电泳条带图谱，创设 “从酶切位点分布→酶切产物片段数量与大小→电泳条带特征→反推酶切组合” 的完整实验分析情境。该情境打破课本孤立知识点考查模式，将限制酶作用特点、DNA 电泳原理、质粒结构特性等知识，融入基因工程载体构建与验证的科研实践场景中，让考生感受到分子生物学技术在基因操作中的应用价值，凸显知识的实用性与科学性。 新角度：本题是科学思维与实验探究能力的综合测评题，突破传统 “直接考查酶切位点数量或电泳原理” 的考法，采用逆向推理 + 图文信息综合分析的创新考查模式。 考查逻辑推理能力：要求考生基于 “环状质粒单酶切 / 双酶切的片段数量规律”（单切点单酶切得 1 条带、双切点单酶切得 2 条带；双酶切片段数为两酶切点总数），结合电泳条带数与迁移位置，反推泳道②③④对应的单酶切类型、泳道⑤⑥⑦对应的双酶切组合，而非直接记忆结论。考查知识综合应用能力：整合基因工程（限制酶特性、质粒结构）、分子生物学技术（琼脂糖凝胶电泳原理、DNA 迁移速率与片段大小关系）、实验分析（单 / 双酶切结果预测与验证） 三大模块知识，需考生构建知识网络，交叉判断各选项，契合高考 “综合性考查” 趋势。落实核心素养：通过实验结果分析，考查 “科学思维”（逻辑推理、证据意识）与 “科学探究”（实验结果解读、方案验证）素养，引导考生建立 “技术原理 — 实验操作 — 结果分析” 的完整科研思维，落实生物学核心素养培养目标。 2．（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 命题解读 新情境：本题以水稻抗白叶枯病基因工程育种为真实科研情境，紧扣我国粮食安全与作物抗病育种的重大需求，以含抗病基因D的重组Ti质粒为载体，依托农杆菌转化法、愈伤组织培养、转基因植株筛选等完整转基因技术流程，将基因表达载体构建、启动子功能、植物组织培养、转基因鉴定等知识，融入作物分子育种的生产实践场景。情境贴近现代农业生物技术应用，打破教材单一实验流程的呈现方式，让考生体会基因工程在抗病育种中的实际价值，凸显生物学知识服务农业生产的实用性，引导考生关注生物技术对粮食安全的重要意义。 新考法：本题突破传统基因工程“识记步骤”的考查方式，聚焦核心元件功能辨析与逻辑推理，是对生命观念、科学思维、社会责任的综合测评，不直接考查启动子定义，而是通过U6启动子、标记基因、目的基因的位置关系，判断不同生物中启动子的特异性与表达驱动能力，强调启动子具有物种/细胞类型特异性，考查对基因表达调控本质的理解，同时围绕转基因筛选、再生植株鉴定等关键环节设置选项，要求考生结合标记基因位置、T-DNA转移特点、植物组织培养过程进行推理判断，考查实验分析与严谨推理能力，且整合基因工程、基因表达、植物细胞工程、作物育种四大模块知识，需跨模块联动分析，符合高考“综合性、应用性”命题趋势，侧重考查知识网络构建与真实问题解决能力。 3．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 命题解读 新情境：本题以β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的蓝白斑筛选为核心，创设人源干扰素基因在大肠杆菌中高效表达的基因工程实验情境，贴合微生物基因工程的科研与生产实际。题干明确质粒K的标记基因功能、X-gal显色原理，围绕目的基因导入、转化效率、筛选鉴定等关键环节设置问题，将质粒载体结构、转化操作、标记基因筛选、质粒自身环化等知识点，融入重组蛋白高效表达的真实实验场景，既还原了基因工程中“筛选-鉴定”的核心流程，又体现了生物技术在医药领域（干扰素生产）的应用价值，让考生感受基因工程技术的实际应用，打破教材抽象知识点的局限，凸显实验情境的真实性与实用性。 新考法：本题突破传统“识记标记基因功能、转化操作步骤”的考查模式，聚焦基因工程筛选环节的逻辑严谨性与实验细节分析，是对科学思维、实验探究核心素养的综合测评，不直接考查基础概念，而是围绕蓝白斑筛选的原理、转化效率影响因素、质粒自身环化的影响、筛选结果的严谨判断等核心问题设置选项，要求考生结合标记基因的双重作用（筛选转化子、鉴定重组质粒），分析不同实验条件下菌落颜色与菌株类型的对应关系，推理实验结果异常的原因，考查实验分析、逻辑推理与严谨论证的能力，同时整合微生物转化、质粒载体特性、标记基因筛选、目的基因表达鉴定等知识，强调“筛选≠鉴定”的核心逻辑，引导考生建立严谨的实验思维，符合高考“聚焦能力、凸显素养”的命题趋势，侧重考查知识应用与真实实验问题解决能力。 4．（2025·海南·高考真题）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 (1)质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是_____和_____。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG (2)细胞X是一种贴壁细胞，可用_____（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是_____。 (3)将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有_____作用，且随导入时间推移，增殖速率_____。 (4)siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将_____导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的_____对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：_____。 命题解读 新情境：本题以绵羊羊毛长度调控为核心，创设探究基因Z对绵羊毛囊细胞增殖影响的科研情境，贴合畜牧养殖中优良品种培育的实际需求。题干围绕基因工程载体构建、动物细胞培养、siRNA干扰技术等核心技术，整合限制酶选择、贴壁细胞培养特点、实验设计与结果分析、分子水平检测等关键内容，将基因工程、细胞工程、基因表达调控等知识，融入羊毛长度调控的科研探究场景，既还原了“基因功能探究”的完整实验流程，又体现了生物技术在畜禽育种中的应用价值，打破教材中不同技术模块孤立呈现的局限，让考生体会生物学知识在解决实际生产问题中的作用，凸显情境的真实性、探究性和应用性。 新考法：本题以探究基因功能为核心，采用“填空+实验设计+结果分析”的题型，突破传统单一知识点识记的考查模式，聚焦实验探究能力与综合应用能力的测评，是对科学思维、科学探究核心素养的集中考查。题目不直接考查基础概念，而是结合限制酶识别序列选择重组质粒构建的酶，结合贴壁细胞特性分析培养条件与传代处理的理由，同时通过实验结果曲线分析基因对细胞增殖的影响，还引入siRNA干扰技术设计对照实验、设计分子水平检测思路，整合基因工程、动物细胞工程、基因表达调控等多模块知识，既考查考生对具体技术细节的掌握，又考查实验设计的严谨性、结果分析的逻辑性和实验思路的设计能力，贴合高考“聚焦探究、凸显素养”的命题趋势，侧重考查知识的综合应用与真实科研问题的解决能力，引导考生建立“提出问题—设计实验—分析结果—得出结论”的完整探究思维。 5．（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。 (1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌_____的功能，导致该细胞器不能产生ATP。 (2)获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株 ①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。 ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。 已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向_____。 ③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。 (3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择_____。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的_____。 在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供_____，大肠杆菌为酵母菌提供_____，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：_____。 命题解读 新情境：本题以线粒体起源的内共生假说为核心科研背景，创设“构建大肠杆菌与专性厌氧酵母共生体”的实验情境，贴合细胞起源研究的前沿科研方向。题干围绕基因敲除、重组质粒构建、细胞融合、选择培养等核心技术，整合细胞器功能、限制酶应用、膜融合原理、互利共生关系等知识点，将细胞结构与功能、基因工程、细胞工程等知识，融入内共生假说的验证实验中，既还原了“假说-演绎”的科研思维流程，又体现了生物技术在进化理论验证中的应用价值，打破教材中进化理论与生物技术模块孤立呈现的局限，让考生体会生物学前沿研究的探究过程，凸显情境的科学性、探究性和前沿性。 新考法：本题以假说验证为核心，采用“填空+绘图+实验分析”的综合题型，突破传统“识记内共生假说内容、基因工程步骤”的考查模式，聚焦科研思维与综合应用能力的测评，是对生命观念、科学思维、科学探究核心素养的集中考查。题目不直接考查基础概念，而是结合基因敲除技术分析细胞器功能，结合引物设计与限制酶位点特点判断引物位置及方向，结合细胞融合原理分析膜融合试剂与融合部位，结合共生关系分析营养物质交换及选择培养基的设计逻辑，整合细胞结构、基因工程、细胞工程、进化理论等多模块知识，既考查考生对具体技术细节和科研逻辑的掌握，又考查绘图能力、实验分析能力和逻辑推理能力，贴合高考“聚焦前沿、凸显素养”的命题趋势，侧重考查知识的综合应用与前沿科研问题的解决能力，引导考生建立“假说验证—实验设计—结果分析”的严谨科研思维。 6．（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 7．（2025·全国卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题： (1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是________，而PCR过程中解开双链的方法是________。 (2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有________。 (3)该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：________；②无扩增产物，原因是________；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是________。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果________。 8．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是______（答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有______（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 9．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是______。将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是______。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是______，随后在含______和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______。 10．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 考向1 基因工程的基本工具 1．（2025·浙江·一模）粪便无创DNA检测技术通过分析粪便中脱落肠道细胞的DNA来评估肠癌发病风险，具有无创便捷、灵敏度高等优点。该检测需采集粪便样本，进行DNA提取、扩增等过程。下列叙述正确的是（　　） A．提取DNA时，研磨液经过滤、离心后取上清液，再加入冷酒精 B．随着PCR反应进行，DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸数量逐步减少 C．因粪便中的DNA均源于肠壁脱落细胞，因此该技术的灵敏度高 D．若检测发现原癌基因并未突变，则可判断该检测者未得肠癌 2．（2025·四川·一模）大量研究表明，蛋白激酶 SOS2 响应盐胁迫应答，该酶由 SOS2 基因编码。为研究其机制，研究者将质粒 pART27 与 SOS2 基因结合后形成重组质粒。在构建过程中，研究者分别使用“单酶切”和“双酶切”切割质粒与含 SOS2 基因的 DNA 片段（如图），酶切产物用 DNA 连接酶连接。在只考虑产物两两结合的情况下，下列叙述错误的是（    ） A．“单酶切”组的产物中含有 SOS2 基因与 SOS2 基因的连接物 B．SOS2 基因与 pART27 的正向连接物只能来自“双酶切”组 C．pART27 与 pART27 的连接物是“单酶切”组的最大产物 D．“单酶切”组连接物的种类较“双酶切”组的连接物多 3．大肠杆菌经溶菌酶和去垢剂SDS（一端亲水、一端疏水的两性小分子）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA，通过电泳可对质粒DNA进行鉴定。下列说法错误的是（　　） A．提取质粒时溶菌酶和SDS能破坏细胞壁和细胞膜，释放DNA B．提取质粒时将95%冷酒精加入上清液中，可使质粒DNA析出 C．电泳时载样缓冲液中的指示剂能与DNA结合，指示DNA位置 D．电泳时与加样孔距离相同的条带所含DNA分子大小可能不同 4．（2025·山东日照·三模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性。拟核DNA分子因无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列叙述正确的是（　　） A．实验中可将细菌置于无菌水中使其裂解，释放DNA分子 B．也可通过调节温度来替代调节pH使DNA先变性再复性 C．实验中可在上清液中加入2mol/L的NaCl溶液析出质粒 D．电泳分离质粒时，条带迁移速率由质粒大小和构象决定 5．（2025·湖北武汉·模拟预测）PM是一种致病真菌，其致病性可能与SKN7基因有关。科研人员将SKN7基因与pMD18-T载体进行拼接后导入受体菌，以便研究SKN7基因的功能。在SKN7基因扩增过程中Taq酶会在序列3’端额外加入一个碱基A，选用限制酶甲（三种限制酶的酶切位点如图所示）对pMD18-T载体进行酶切，使用末端转移酶处理，在切口处加入一个碱基T，用乙酶就能将SKN7基因与载体连接起来，操作过程如图所示，下列叙述正确的是（　　） A．构建重组质粒过程中所用到的甲酶为EcoRV，乙酶为DNA连接酶 B．上述方法构建重组质粒的过程中，可能会导致SKN7基因或载体的自身环化 C．在含氨苄青霉素和X-Gal的培养基上培养受体菌，含重组质粒的菌落呈蓝色 D．正确连接的重组质粒可被甲酶酶切，而反向连接的重组质粒不可被甲酶酶切 考向2 基因工程的基本操作程序 6．（2025·湖北孝感·一模）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。利用PCR技术扩增干扰素基因，可用于干扰素的规模化生产。下列有关叙述正确的是（　　） A．为使PCR产物能被限制酶切割，可在引物的5'端添加识别序列 B．在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补 C．PCR体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶 D．PCR扩增干扰素基因时，子链的延伸方向是3'→5' 7．（2025·广东汕尾·一模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，其工作原理如图所示。下列有关说法错误的是（    ） A．Cas9蛋白的作用相当于限制酶 B．复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合 C．将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法 D．利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中 8．（2025·云南红河·一模）科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 9．（2025·湖南湘潭·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞形态和功能等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。回答下列问题： 注：BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ为限制酶，tsr为硫链丝菌素抗性基因，ori为复制原点。 (1)图中①过程需要使用___________酶，该过程得到的DNA片段___________（填“含有”或“不含有”）启动子序列。 (2)过程②一般使用___________（填限制酶）构建基因表达载体。为了实现目的基因与质粒成功连接，需要对PCR的引物进行改造，具体的做法是___________。 (3)双酶切基因与质粒pET-28a（+）长度为170bp的片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，上述两种质粒经HindⅢ切割后片段长度如表所示（每种片段各1个）。由此判定基因长度为___________，该基因上有___________个HindⅢ切割位点，依据是___________。 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindⅢ酶切片段 1000bp、2550bp 1050bp、2500bp、150bp 10．（2025·四川泸州·二模）虾青素是雨生红球藻产物，具有抗氧化和提高免疫力等特点，但并非其基本生命活动必需的产物。某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因工程改造酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素产业化生产。请回答下列问题: (1)图中质粒还缺少的必备元件是______。为使基因 crtZ 片段能正确连接到图中质粒，应选用限制酶______来处理质粒。 (2)将重组质粒导入大肠杆菌后，需在含氨苄青霉素的培养基上筛选，目的是______；再从阳性大肠杆菌中提取重组质粒，导入URA3基因缺失的酿酒酵母，应在______的培养基上筛选工程酵母。 (3)虾青素的部分代谢途径如下图所示，通过基因编辑技术将crtZ基因定向整合到酿酒酵母染色体上的ERG3基因中，该方法可避免因______（生理过程）导致的目的基因丢失，提高遗传稳定性；同时能进一步提高虾青素产量，原因是______。 考向3基因工程的应用 11．（2025·四川泸州·一模）研究人员利用花粉管通道法将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因Cry导入某玉米品系，通过室内和田间试验证实其对玉米螟具有较高的抗虫性，下列叙述不合理的是（　　） A．花粉管通道法无需使用载体就能直接将Cry基因导入受体细胞 B．从室内鉴定抗虫到田间调查抗虫性的做法，符合风险防控的要求 C．为防止转基因玉米Cry基因传播到野生近缘种，需将其隔离种植 D．长期大面积单一种植抗虫玉米，玉米螟种群中抗性基因频率会上升 12．（2025·浙江杭州·模拟预测）基因工程技术在迅猛发展，为人类的生产生活带来很多便利，但同时也带来了一些安全性问题，下列说法正确的是（　　） A．乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与药用蛋白启动子重组后导入动物的受精卵中 B．将外源生长素基因导入鲤鱼中可提高鲤鱼的生长速度 C．通过基因组编辑技术可以设计完美试管婴儿 D．研究转基因农作物时，可采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染 13．（2025·河南·模拟预测）CASGEVYTM基因疗法利用CRISPR系统引导RNA定位特定DNA序列并通过Cas9酶进行定点切割，实现对基因的编辑。如图为利用基因疗法治疗镰状细胞病的过程，叙述正确的是（    ） A．CRISPR系统引导RNA定位BCL11A基因时碱基互补配对方式是A-U、U-A、C-G、G-C B．Cas9酶具有核酸内切酶功能，定点切割BCL11A基因时作用部位是磷酸二酯键和氢键 C．基因编辑胎儿血红蛋白编码基因后，细胞启动DNA修复过程，可能需要DNA连接酶 D．CASGEVYTM基因疗法能高效、精确地对基因进行修改，但需要多次进行才能保证治疗效果 14．（2025·河北·一模）副猪格拉瑟菌(GPS)是定植于猪上呼吸道的一种病原菌，其细胞膜上的寡肽渗透酶(OppA)具有良好的免疫原性。为增加OppA 基因表达量，研究人员利用质粒和外源片段、强启动子构建了可以高表达OppA的GPS菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA 基因如图所示。请回答下列问题： (1)构建OppA 基因过表达载体时，选择 Hind Ⅲ进行酶切___________(填“合适”或“不合适”)，理由是___________。结合图分析，应该选择___________这两种限制酶切割质粒。 (2)已知OppA 基因的甲链为编码链(与模板链互补的DNA链)，图中OppA 基因的转录方向是___________(填“从左往右”或“从右往左”)。据图分析，利用PCR 扩增OppA基因时所需的引物组合是___________。 (3)为便于与质粒连接，需对引物进行特殊处理，在其中一种引物的5'端需添加___________识别序列和强启动子，另一种引物的5'端需添加___________识别序列。已知OppA 基因甲链的碱基序列为5'-TTACAGCGCTCC-3'，强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3'，请写出OppA 基因上游引物的15个碱基序列：5'-_________-3'。 (4)为了筛选出正确串联了强启动子、OppA 基因的重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型b和d加入的抗生素分别是___________、___________，得到 M、N、O三类菌落，其生长状况如下表所示(+表示生长，一表示不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是___________(填“M”“N”或“O”)类。 平板类型 菌落类型 M N O a．无抗生素 + + + b． 一 + + c．氨苄青霉素 一 + 一 d． 一 + 一 15．（2025·浙江嘉兴·一模）水稻是我国第一大粮食作物。随着生物技术的发展，水稻育种进入精准设计时代，回答下列问题。 (1)单倍体育种助力水稻育种。取水稻花药离体培养，获愈伤组织，调节培养基的营养和______，愈伤组织经生芽和______过程后发育为单倍体幼苗，这一途径称之为器官发生途径。单倍体幼苗经秋水仙素处理，可获得纯合二倍体水稻。也可对单倍体愈伤组织用______酶处理，获得相应的原生质体，再将同种原生质体进行______，获得纯合二倍体水稻细胞。 (2)基因工程培育特色水稻。将花青素合成基因拼接到T-DNA上，再用______法将基因导入水稻细胞，培育出紫米水稻。对水稻中镉吸收相关基因进行______处理，可培育低镉水稻。 (3)基因工程改良水稻抗性。为提高对除草剂的抗性，先从______获得抗除草剂基因的序列，再利用基因编辑技术改变基因特定位点的______，使该基因表达产物的空间结构发生改变，这种设计和改造蛋白质的技术称为______工程。编辑后的水稻可能与近缘杂草经杂交发生______，产生“超级杂草”，所以应对其进行风险评估。 考向4 蛋白质工程 16．（2025·浙江·一模）科学家利用蛋白质工程研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，赖脯胰岛素经皮下注射后易吸收、起效快。下列相关叙述错误的是（　　） A．赖脯胰岛素在受体工程菌的核糖体上合成 B．通过蛋白质工程获取赖脯胰岛素的过程是④⑤⑥①②③ C．必须先合成天然胰岛素基因，再定点突变获得赖脯胰岛素基因 D．物质a是mRNA，物质b是多肽链，二者序列对应关系由密码子决定 17．（2025·四川德阳·一模）“逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是（　　） A．生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B．从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C．氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D．该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 18．（25-26高三上·陕西西安·月考）水蛭素具有较好的抗凝血活性，临床上用来防治血栓。工业上常利用微生物发酵工程生产水蛭素，其中利用酵母菌和大肠杆菌生产的比较如表所示。下列叙述正确的是（　　） 微生物受体 酵母菌 大肠杆菌 生产特点 周期较长，目的基因转录和翻译正常但效率低，肽链折叠正确率较高 周期较短，目的基因转录和翻译正常且效率高，肽链折叠正确率较低 A．一般会用显微注射法将水蛭素相关基因导入酵母菌和大肠杆菌 B．水蛭素相关基因在酵母菌和大肠杆菌中表达时的场所完全不同 C．在构建基因表达载体时，可将酵母菌或大肠杆菌内的启动子与水蛭素相关基因连接 D．可直接对肽链的氨基酸序列进行改造，以提高蛋白质的品质，这属于蛋白质工程 19．（25-26高三上·四川·开学考试）已知某水生动物体内存在一种酶X，由363个氨基酸构成。科学家利用蛋白质工程技术将X中的133位的苏氨酸变为丝氨酸，将254位的精氨酸变为甘氨酸，改变后的蛋白质X不仅仅具有原来X的催化功能还额外具有了转运蛋白的活性。下列相关说法正确的是（    ） A．蛋白质工程生产的蛋白质是自然界本来就存在 B．改造该酶的实质是要改造控制该酶合成的基因 C．可以利用PCR技术从该水生动物基因组中扩增出所需目的基因 D．蛋白质工程也可以对蛋白质直接进行改造，操作时不需要构建基因表达载体 20．（2025·黑龙江大庆·模拟预测）t-PA蛋白能降解血栓，但其促进血栓溶解的特异性不高。经研究发现，若将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。 (1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是________，除上述方法外获得t-PA基因的途径还有________（答出1种即可）。 (2)以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为________。这种对现有蛋白质进行改造的过程必须通过________来实现。t-PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，图中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是_______。 (3)据图分析，需选用限制酶_________切开质粒pCLY11，才能保证质粒与t-PA改良基因高效连接。与单酶切相比双酶切的优点是________。 (4)将重组质粒转入受体细胞大肠杆菌前，一般先使其处于一种________状态。经过培养、筛选获得的转基因菌株在特定培养基中菌落颜色为_________。 一、情境拓展·科技前沿（2024-2025热点聚焦） 1. 人工智能辅助基因编辑工具的精准设计突破 基因编辑技术的迭代升级始终是基因工程的核心热点，而人工智能与CRISPR-Cas系统的结合实现了突破性进展。2025年7月，《自然》杂志发表研究成果，科研团队通过大规模挖掘26太碱基的组装基因组和宏基因组，构建了包含100多万个CRISPR操纵子的数据集，利用大型语言模型训练设计出可编程基因编辑器，成功实现人类基因组的精准编辑。这类人工智能设计的编辑器，部分活性和特异性优于传统的SpCas9，且与天然序列差异达400个突变位点，其中Open CRISPR-1编辑器还可兼容碱基编辑，为基因编辑工具的定制化开发提供了全新路径，也打破了天然CRISPR系统的进化限制。 2. 个性化基因编辑治疗的临床里程碑突破 2024-2025年，基因治疗从罕见病向常见病跨越，个性化基因编辑治疗实现历史性突破。2025年5月，美国费城儿童医院与宾夕法尼亚大学医学团队，成功为一名6个月大的CPS1基因突变婴儿实施全球首例个性化CRISPR碱基编辑治疗，通过脂质纳米颗粒将定制编辑工具递送至肝脏，纠正缺陷酶，治疗后患者无严重副作用，蛋白质饮食耐受性显著增强，氮清除药物需求减少。此外，2024年底至2025年，多项针对性基因编辑疗法取得临床突破，包括治疗镰状细胞病的BEAM-101、治疗输血依赖性β地中海贫血的CS-101，均展现出优异的治疗效果，推动基因治疗从实验室走向规模化临床应用。 3. 新型基因编辑策略与递送系统的创新升级 2024-2025年间，基因编辑策略和递送技术的创新的突破，解决了传统技术的核心瓶颈。2025年11月，Broad研究所提出PERT新型基因编辑策略，利用先导编辑技术将人体内冗余的天然tRNA改造成抑制性tRNA，有望用单一治疗方案纠正多种无义突变引发的遗传病。同时，递送系统持续优化，优化后的脂质纳米颗粒配方可显著提高核糖核蛋白（RNPs）的递送效率，细胞穿透肽的应用进一步增强了递送效果，而“AAVLINK”策略则实现了超过11kb长致病基因的分段递送与精准重组，为肌肉疾病、癫痫等疾病的治疗提供了新方案。 4. 基因编辑与CAR-T细胞治疗的融合革新 作为基因工程与细胞治疗的交叉热点，CAR-T细胞治疗在2024-2025年借助基因编辑技术实现效能升级。传统CAR-T治疗存在T细胞耗竭、持久性不足、细胞因子毒性等问题，而CRISPR-Cas9、碱基编辑等技术的应用，可精准优化CAR-T细胞的基因序列，增强其肿瘤杀伤能力、降低毒性并延长体内存活时间。此外，基因编辑技术还助力解决CAR-T治疗的制造难题，推动自体CAR-T向通用型CAR-T发展，降低治疗成本，同时拓展其在实体肿瘤治疗中的应用，为癌症免疫治疗提供了更高效、更安全的新路径。 5. 基因治疗监管批准与产业化进程加速 2024-2025年，全球基因治疗领域监管批准迎来爆发期，标志着技术进入成熟商业化阶段。2025年11月，美国FDA批准诺华Itvisma基因替代疗法，用于治疗2岁及以上SMN1基因突变的脊髓性肌萎缩症患者，成为首个覆盖该广泛患者群体的疗法；同年12月，FDA批准针对Wiskott-Aldrich综合征的Waskyra基因疗法，填补了该疾病的治疗空白。中国在基因治疗领域同样表现突出，2024年有23家公司的基因疗法获得IND批准，复旦大学团队实现全球首个耳聋基因治疗临床试验成功，正序生物完成全球首个APOC3基因编辑治疗高血脂的临床案例，推动我国基因治疗产业跻身世界前沿。 二、新情境探究、结合教材分析以及长句作答 1．（结合教材）分析并回答下列问题： (1)基因工程中，构建基因表达载体时，将目的基因插入Ti质粒的T-DNA区域的原因是_____________________________________________________ _____________________________________________________。 (2)PCR技术扩增目的基因时，需要加入引物的原因是_____________________________________________________ ______________________________________________________。 (3)基因工程中，目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，而导入动物细胞常用显微注射法，原因是_____________________________________________________ ____________________________________________________。 2．（长句作答类）基因编辑技术（CRISPR/Cas9）可精准编辑生物体内的特定基因，其核心组件包括Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA），gRNA可特异性结合靶基因序列，引导Cas9切割靶基因，进而实现基因的敲除、插入等修饰。回答下列问题： (1)Cas9核酸酶的作用是_________________________ _____________________________________________________，判断的依据是_____________________________________________________ _____________________________________________________。 (2)gRNA能特异性结合靶基因的原因是_____________________________________________________ _____________________________________________________，这一过程遵循_____________________________________________________ _____________________________________________________。 3、（长句作答）分析并回答下列问题： (1)基因工程中，目的基因成功导入受体细胞后，还需要进行目的基因的检测与鉴定，其中检测目的基因是否转录出mRNA的方法是_________________________________________________。 (2)基因表达载体中，启动子的作用是______________________________________________________。 (3)将目的基因导入微生物细胞时，常用Ca²⁺处理微生物细胞，使细胞处于感受态，其目的是_____________________________________________________ _____________________________________________________；若目的基因导入后未表达，可能的原因是_____________________________________________________ _____________________________________________________。 4．（新情境）科学家利用基因工程技术培育抗虫转基因棉花，其核心过程是将Bt毒蛋白基因（可控制合成Bt毒蛋白，对棉铃虫等害虫有毒性）导入棉花细胞，培育出抗虫棉品系。研究人员对转基因棉花和普通棉花的抗虫性进行检测，结果如下表所示（虫食率越低，抗虫性越强）： 棉花品系 虫食率（%） Bt毒蛋白含量（μg/g） 普通棉花 38.6 0 转基因棉花品系A 4.2 12.7 转基因棉花品系B 8.9 7.3 回答下列问题： (1)构建含Bt毒蛋白基因的基因表达载体时，除了目的基因和Ti质粒外，还需要加入的组件有_________________________________________________。 (2)转基因棉花品系A的抗虫性强于品系B的原因是______________________________________________________ _____________________________________________________。 (3)若要进一步提高转基因棉花的抗虫性，可采取的措施有_____________________________________________________ _____________________________________________________（答出两点） 1．（2025·陕西西安·一模）科研人员将增强型启动子连接在水稻高产基因(Os)基因上游，构建超表达载体，并将其导入水稻中，研究该基因表达对产量的影响。下图为利用农杆菌转化法获得Os基因超表达水稻的过程。 (1)农杆菌转化愈伤组织时，用含___________的选择培养基筛选，通过组织培养技术获得Os基因过表达水稻。过程Ⅰ用的酶为___________，该过程需要的原料为___________。 (2)利用双酶切法将Os基因插入质粒，若在基因上游加入SpeI的酶切位点，下游应加入___________的酶切位点。扩增该基因所需的引物F和R应选用下列引物组合为___________。 ①5′-…CTTGGATGAT-3′    ②5′-…TAAGTTGTCT-3′ ③5′-…ATTCAACAGA-3′    ④5′-…TCTGTTGAAT-3′ (3)科研人员将Os基因过表达水稻(①组)、OS基因敲除水稻(②组)以及野生型(③组)三组水稻进行一系列实验，定期测量相关数据，记录于下表： 组别 N吸收、运输和利用率 光合速率 产量 ① +++ +++ ++++++ ② + + + ③ ++ ++ +++ 注：“+”的数目代表程度或数量变化。 为研究Os基因对N吸收、运输和利用率的影响，将三组幼苗进行低氮培养。实验前三组幼苗均需进行氮饥饿处理，其目的是___________。据表中数据，Os基因表达量与植株N的吸收、运输呈___________(填“正”或“负”)相关，这些N为水稻的暗反应所需___________(至少填三种物质)的合成提供原料。 2．（2025·江苏南京·二模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在_________酶的作用下先合cDNA。选择cDNA而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是_________。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是________。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是_______，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加_________限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有_______（答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品________最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是______。 (4)将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为________，检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为________。天然的干扰素在体外保存相当困难，为了生产出耐储存干扰素，科学家可通过蛋白质工程对干扰素进行改造，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→_________→_________→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。 3．（2025·湖北襄阳·三模）阅读材料，完成下列要求。 M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： (1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是____，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的____断开。 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_______。 (3)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的____淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_____。 4．（2025·山东淄博·三模）荧光素酶互补实验可用于研究两种蛋白质的相互作用。荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光。科研人员利用该技术探究植物中的ERF114蛋白能否与MYB8蛋白相互作用，过程如下图。 (1)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两末端有至少15bp的相同序列，这些相同序列通过设计引物、经PCR获得。图1中为保证基因正向连接在质粒上，PCR的引物中应有______种相同的15bp序列，这些序列应构建在相应引物的______（填“5′端”“3′端”）。 (2)以构建重组载体ERF114-Nluc为例，将PCR获得的ERF114、NLuc及线性化质粒混合并加入三种酶，50℃条件下共同孵育1h可完成连接，原理见图2。图中过程③和过程④分别加入的酶是______、______。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术的优点是______（答出1点即可）。 (3)将构建正确的ERF114-Nluc、MYB8-CLuc、NLuc、CLuc、T-NLuc及p53-CLuc等6种重组载体分别导入农杆菌，将不同农杆菌组合注射到烟草叶片中，24h后将荧光素底物喷洒到叶片上，结果如图3。若ERF114能与MYB8相互作用，则______（填图中数字）区域会发出荧光。该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是______。 5．（2025·江西九江·三模）黄瓜花叶病毒是寄主范围最多的植物病毒之一，对多种重要经济作物的生存造成威胁。研究发现，由该病毒C基因表达出的C蛋白是病毒合成和释放的关键成分，将C基因敲除后，单株烟草病毒侵染性大大降低。为提高烟草等经济作物产量，科研人员利用PCR技术大量扩增出C基因，并将C基因导入Ti质粒中，通过农杆菌转化法获得能表达C基因反义RNA（能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链）的转基因抗病毒烟草。回答以下问题。 注：图1中a~e表示不同的引物；图2为Ti质粒，T-DNA的左、右边界见图，其中EcoRI和XhoI是两种限制酶且切割后形成的黏性末端不互补。 (1)一般来说，设计的引物序列越短，其特异性越_________（填“强”或“弱”）。据图可知扩增完整的C基因，应选择图1中的引物_________。若任意使用图1中涉及的所有引物，通过PCR技术可扩增出_________种等长的DNA片段。 (2)该实验利用反义RNA介导基因沉默，主要抑制病毒C基因表达中的_________过程。结合图2，为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，应在左侧引物的5’端设计添加_________酶切位点。 (3)重组质粒构建完成后需进行琼脂糖凝胶电泳实验验证，为保证电泳结果的准确性，对该环状质粒电泳时需分为无酶切组和单酶切组，结果发现无酶切组的电泳速率慢于酶切组，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其_______有关。 (4)为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，还需进行个体水平检测，请简述实验思路________。 学科网(北京)股份有限公司1 学科网(北京)股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题18 基因工程 目录 01 析·考情精解 2 02 构·知能架构 3 03 串·核心通络 4 核心整合一 基因工程的基本工具 4 自查探针 4道真题选改判，“探”出薄弱点，“诊”明提分路！ 核心串讲 串讲1 基因工程的三种基本工具 串讲2 DNA的粗提取与鉴定 能力进阶 能力1 与DNA有关的几种酶的比较 核心整合二 基因工程的基本操作程序和应用 6 自查探针 3道真题选改判，“探”出薄弱点，“诊”明提分路！ 核心串讲 串讲1 基因工程的基本操作程序 串讲2 基因工程的应用 串讲3 蛋白质工程 能力进阶 能力1 限制酶与载体的精准选择 能力2 基因表达载体的优化设 能力3 基因工程与其他技术的综合应用 04 破·题型攻坚 12 真题动向 引入科技前沿、农业生产实践等新情境、融合新概念反套路命题！ 命题预测 考向1 基因工程的基本工具 考向2 基因工程的基本操作程序 考向3基因工程的应用 考向4 蛋白质工程 05 拓·素养提升 47 素养链接 情境拓展、长句表达！ 高考预测 5道最新模拟，精准预测素养考向！ 命题轨迹透视 从近三年高考试题来看，考查题型：命题以选择题和非选择题（选修大题为主）结合呈现，选择题单题分值2-3分，非选择题多为8-12分的综合大题，是选修模块的核心考查内容。命题趋势：早期命题侧重基础概念记忆，比如直接考查基因工程的基本工具（限制酶、DNA连接酶、载体）、基本操作步骤等核心定义。近年转向核心考点的深度理解，聚焦三类重点内容：一是工具的细节辨析，如限制酶的切割位点特异性、DNA连接酶与DNA聚合酶的功能差异、载体必备的条件及常见载体（质粒、噬菌体）的特点；二是操作步骤的核心逻辑，重点考查基因表达载体的构建（核心步骤）、目的基因导入不同受体细胞（植物、动物、微生物）的方法差异及适用场景；三是检测与鉴定，围绕分子水平检测（DNA分子杂交、分子杂交、抗原-抗体杂交）和个体水平鉴定（抗虫、抗病等性状验证）的原理、流程及结果分析。 核心素养导向：从单纯考知识记忆转向核心素养的综合考查。生命观念上，通过基因表达载体构建与功能实现的关联，强化结构与功能观及基因控制性状的本质认知；科学思维上，常结合目的基因获取方案设计、受体细胞选择等情境，考查归纳推理与逻辑分析能力；科学探究上，聚焦基因工程相关实验设计与结果分析，考查实验原理应用、操作误差判断及方案优化能力。 高考命题风向 新情境：依托科研前沿与实际应用创设情境，强化知识的实践迁移。常见情境包括：以基因编辑技术（CRISPR-Cas9）治疗遗传病为背景，考查目的基因的获取与导入；结合抗虫转基因作物培育、重组人胰岛素生产等产业应用，设问基因表达载体的构建要点；借助新冠疫苗（mRNA疫苗、重组蛋白疫苗）研发情境，关联基因转录、翻译及载体改造的核心知识，实现“情境载体—知识应用”的深度绑定。 新考法：打破单一知识点割裂考查，转向“技术逻辑+综合应用”的整体考查。一是聚焦技术关联，如将基因工程与细胞工程（植物组织培养、动物核移植）、胚胎工程结合，考查转基因生物培育的完整流程；二是侧重方案设计与分析，要求考生根据具体需求（如培育抗除草剂作物）设计基因工程方案，分析限制酶选择、受体细胞适配性等关键问题；三是强化误差分析，结合实验数据（如目的基因表达量差异）推断操作环节的异常原因，考查科学探究的严谨性。 新角度：跳出“常规技术流程”，关注特殊场景与细节辨析。其一，考查不同生物的技术差异，如对比原核生物（大肠杆菌）与真核生物（酵母菌）作为受体细胞的优势与局限；其二，聚焦技术细节拓展，如分析启动子、终止子的序列功能对目的基因表达的影响，或辨析基因工程中标记基因的选择原则；其三，渗透技术伦理与应用边界，通过转基因生物的安全性讨论，引导考生建立科学的技术观。 考点频次总结 考点 2025年 2024年 2023年 基因工程的基本工具 2025·江苏·T19　 2024·湖南·T5 2024·江西·T12 2023·新课标·T6　 基因工程的基本操作程序 2025·河南·T21　 2025·安徽·T15 2025·黑吉辽蒙·T25 2025·河北·T22 2025·山东·T25　 2024·甘肃·T21 2024·贵州·T21 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20　 基因工程的应用和蛋白质工程 2025·陕晋宁青·T21　 2025·四川·T19　 2025·云南·T21　 2025·甘肃·T21　 2024·河北·T5 2023·广东·T11　 2026命题预测 2026年基因工程命题将紧密围绕技术创新融合、产业应用落地及伦理监管平衡三大核心，聚焦前沿突破与现实议题的结合。具体预测方向如下： 一、技术融合创新类。AI辅助基因编辑成高频考点，可能以Nature报道的AI设计基因编辑器为背景，考查基因编辑工具的优化原理、精度提升机制及实验设计逻辑。此外，桥接重组酶介导的兆碱基级基因组重排技术，或结合CRISPR与重组酶的融合系统，可能出技术探究题，要求分析大尺度基因编辑的突破价值。 二、产业应用实践类。农业领域可能围绕垂直农业基因模块创制早熟高产番茄、基因编辑民猪培育等案例，考查基因编辑在品种改良、粮食安全中的应用，结合载体构建、目的基因筛选等核心知识点。医疗领域大概率聚焦血友病B基因治疗药物上市等案例，考查基因治疗的载体选择、递送机制及临床应用评价。 三、伦理监管与社会影响类。可能以澳大利亚《基因技术修正条例2025》等政策为背景，探讨基因技术产业化中的监管适配性问题。同时，针对AI主导基因编辑研究的伦理边界、基因编辑技术的公平可及性等议题，设计论述题考查科技与伦理的平衡思维。 命题形式将侧重情境化材料分析，强调理论与实践结合，既考查基因编辑原理、载体构建等基础知识点，也注重评估对前沿技术的理解及社会责任感。 核心整合一 基因工程的基本工具 (1)（2025 天津 T6）电泳分离DNA片段时，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶( √ ) (2)（2025 湖南 T2 改编）DNA的粗提取与鉴定可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”(×) (3)（2025 河北 T5 改编）在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA（ √ ） (4)（24年贵州T13改编）不同的限制酶识别的DNA序列不同，但使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(√) 串讲1 基因工程的三种基本工具 基因工程的三种基本工具 限制性内切核酸酶 DNA 连接酶（种类） 载体（特点） 作用：识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 使用方法：一般用相同限制酶切割载体和目的基因 ① E.coli DNA 连接酶② T4 DNA 连接酶 ① 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制② 有一个至多个限制酶切割位点③ 具有特殊的标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选 【易错一笔勾销】 1、误认为限制酶可切割任意DNA序列，或切割单链DNA。实则仅识别特定双链DNA回文序列，切割磷酸二酯键，不切割氢键。 2、混淆二者作用，认为均可连接DNA片段。实则DNA连接酶连接两个DNA片段，DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸连接到已有DNA链上。 3、仅记住载体需有标记基因，忽略需具备复制原点（自主复制）、多个限制酶切点（便于插入目的基因）等关键条件。 串讲2 DNA的粗提取与鉴定 原理 利用 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA，去除其他成分 DNA 性质 DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA 能溶于 2 mol・L⁻¹ 的 NaCl 溶液 鉴定 在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色 步骤 研磨→过滤 (取上清液)→加入体积相等的、预冷的酒精 (体积分数为 95%)，静置 2~3 min→搅拌 (或离心)→取白色丝状物 (或沉淀物)→溶解→鉴定 DNA 【易错一笔勾销】 1、酒精使用易错：必须用预冷的体积分数 95% 酒精，常温酒精会降低 DNA 析出效率，未预冷易导致 DNA 断裂、杂质增多。 2、NaCl 浓度易错：DNA 仅在2 mol·L⁻¹ NaCl中溶解度高，浓度过低会使 DNA 提前析出，过高则无法有效去除杂质。 3、二苯胺鉴定易错：鉴定需沸水浴加热，未加热或温度不足会导致蓝色不明显，易误判为无 DNA。 4、过滤取液易错：过滤时应取上清液，若取沉淀会丢失大量 DNA，直接影响后续提取与鉴定结果。 能力1 与DNA有关的几种酶的比较 能力解读 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 典题示例1.下面是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图(箭头表示切点，切出的断面为黏性末端)。下列叙述不正确的是(　 ) A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性 B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对 C．限制性酶1和酶3剪出的黏性末端相同 D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2 【答案】D　 【解析】由图可知，限制酶2和3识别的序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个碱基对，B正确；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均为GATC，C正确；限制酶只能识别特定的DNA序列，且具有专一性，因此三种限制酶均不能识别和切割RNA中的核糖核苷酸序列，A正确，D错误。 核心整合二 基因工程的基本操作程序和应用 (1)（2025 全国 T11 改编）PCR过程中解开双链的方法是用解旋酶处理（ × ） (2)（2025 甘肃 T21）重组Ti质粒构建完成后，可通过农杆菌转化法将该质粒转入植物细胞（ √ ） (3)(2025 云南T21)构建的基因表达载体除启动子外，还必须有目的基因、终止子、标记基因。(　 √ 　) 串讲1 基因工程的基本操作程序 操作步骤 关键操作细节 核心目的 易错点/难点提醒 目的基因的获取 1. 从基因文库中筛选；2. PCR扩增（需引物、Taq酶、dNTP）；3. 人工合成（适用于短基因、已知序列） 获取完整、可表达的目的基因，为后续操作提供基础 1. PCR需热稳定DNA聚合酶，引物不能互补；2. 基因组文库≠部分基因文库，前者含全部基因 基因表达载体的构建 1. 用相同/互补限制酶切割目的基因和载体；2. DNA连接酶连接（黏性末端用E·coli酶，平末端用T4酶）；3. 构建含启动子、终止子、标记基因的重组载体 使目的基因在受体细胞中稳定存在、自主复制，且能表达和发挥作用 1. 核心步骤，直接决定实验成败；2. 需避免质粒自连、目的基因反向连接（可采用双酶切） 将目的基因导入受体细胞 1. 植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；2. 动物：显微注射法；3. 微生物：Ca²⁺处理使细胞处于感受态 让目的基因进入受体细胞，完成扩增和后续表达的前提 1. 导入成功≠目的基因表达；2. 不同受体细胞选择对应方法，感受态细胞需新鲜制备 目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平：DNA分子杂交（检测导入）、分子杂交（检测转录）、抗原-抗体杂交（检测翻译）；2. 个体水平：性状观察、抗逆性检测等 确认目的基因是否成功导入、转录和表达，筛选出符合要求的受体细胞/个体 1. 三步分子检测层层递进，缺一不可；2. 个体水平鉴定是最终验证手段，需排除干扰性状 【易错一笔勾销】 1、双酶切可避免质粒自连、目的基因反向连接，连接酶只连磷酸二酯键，不连接碱基对。 2、导入受体细胞≠目的基因表达，不同受体细胞方法不同，感受态细胞需新鲜制备。 3、混淆分子水平三步检测，DNA杂交测导入、分子杂交测转录，抗原-抗体杂交测翻译。 串讲2 基因工程的应用 应用领域 核心原理 优势/注意事项 植物基因工程 将目的基因（如Bt毒蛋白基因、抗除草剂基因）导入植物细胞，使其稳定表达，获得优良性状 优势：提高产量、减少农药使用；注意：避免基因污染，关注食品安全与生态影响 动物基因工程 将目的基因导入动物受精卵或体细胞，培育转基因个体，或通过基因编辑修复缺陷基因 优势：生产药用蛋白效率高、治疗遗传性疾病；注意：伦理争议，需严格控制实验规范 微生物基因工程 改造微生物基因组，使其实表达目的基因，或赋予其降解特定物质、合成特定产物的能力 优势：繁殖快、成本低、易培养；注意：防止工程菌泄露，避免破坏自然微生物群落 基因治疗与诊断 利用基因编辑技术修复缺陷基因，或通过核酸分子杂交、PCR技术检测特定基因 优势：精准治疗遗传病、检测灵敏度高；注意：基因编辑的伦理边界，避免脱靶效应 【易错一笔勾销】 1、误将抗虫棉的抗虫性状归为细胞质遗传，忽略基因污染风险，混淆抗虫与抗逆基因的作用。 2、混淆乳腺生物反应器与体细胞核移植的原理，误认为导入基因就一定能稳定表达。 3、忽视工程菌泄露对生态的影响，误将转基因微生物的产物直接用于医疗而不提纯。 4、混淆基因治疗与基因诊断的区别，忽略基因编辑的脱靶效应和伦理边界问题。 串讲3 蛋白质工程 核心内容/操作 关键原理 与基因工程的差异/注意事项 核心目标 改造现有蛋白质，或合成自然界不存在的新型蛋白质，满足特定需求 基因决定蛋白质的氨基酸序列，通过修饰基因来改变蛋白质结构与功能 基因工程：“从基因到蛋白质”（定向表达）；蛋白质工程：“从蛋白质到基因”（反向设计） 基本操作步骤 预期蛋白质功能→设计氨基酸序列→推测基因序列→改造/合成基因→表达验证 遵循中心法则逆推，利用基因修饰、合成技术，实现蛋白质结构的定向改造 步骤比基因工程多“蛋白质结构设计、基因序列推测”，核心是基因的定向改造 关键难点 蛋白质空间结构预测困难、改造后可能丧失活性、基因修饰精准度要求高 蛋白质结构与功能高度相关，氨基酸序列的微小改变可能导致功能异常 难点集中在“设计环节”，需结合生物信息学技术，实验验证难度高于基因工程 【易错一笔勾销】 1、误将蛋白质工程等同于基因工程，忽略其“从蛋白质到基因”的反向设计核心，混淆二者操作顺序。 2、误认为仅替换单个氨基酸就可优化功能，忽视氨基酸序列与蛋白质空间结构、活性的关联。 3、混淆DNA连接酶与DNA聚合酶的功能，误将平末端连接效率等同于黏性末端，忽略T4连接酶的特殊性。 4、仅关注蛋白质结构改造，忽视改造后蛋白质的活性检测，误判“改造成功”的标准。 能力1 限制酶与载体的精准选择 1、载体的精准选择 实验场景 首选载体 核心依据 关键提醒 微生物表达（如大肠杆菌产胰岛素） 质粒 繁殖快、多拷贝、易培养，可快速扩增目的基因 需选用表达型质粒，含强启动子，保证目的基因高效表达 植物转基因（如抗虫棉培育） Ti质粒（农杆菌介导） 农杆菌可侵染植物细胞，T-DNA能转移并整合到植物基因组 仅适用于双子叶植物和裸子植物，单子叶植物需改用基因枪法 动物转基因（如乳腺生物反应器） 动物病毒载体 侵染动物细胞效率高，可将目的基因整合到动物基因组 需提前改造病毒，去除致病基因，避免对受体细胞造成损伤 基因治疗（人体细胞修饰） 腺病毒/逆转录病毒载体 能高效侵染人体细胞，实现目的基因稳定导入 逆转录病毒可整合入基因组，需防范插入突变风险 2、单酶切与双酶切的核心对比 切割方式 优点 缺点 适用场景 单酶切 操作简单，无需考虑酶的兼容性 质粒自连率高，目的基因易反向连接，筛选难度大 初步构建、对目的基因连接方向无要求的实验 双酶切 彻底避免质粒自连，保证目的基因定向连接，筛选简便 操作复杂，需保证两种酶的缓冲液、反应温度兼容 精准构建、目的基因表达效率要求高的实验 典题示例1（2025·云南昆明·模拟预测）以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列有关叙述正确的是（    ） A．切割产生①片段的限制酶识别序列由5个碱基对构成 B．限制酶只存在于原核生物，作用的化学键为磷酸二酯键和氢键 C．上述能进行连接的两个黏性片段，其连接后形成的DNA分子是 D．两个③片段只能被E.coli DNA连接酶催化连接形成重组DNA 【答案】C 【分析】限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】A、图中①④是同一种限制酶切割形成的，切割产生①片段的限制酶，识别的碱基序列为-CTGCAG-，由6个碱基对构成，A错误； B、限制酶主要是从原核细胞中分离纯化出来的，作用的化学键为磷酸二酯键，B错误； C、图中①④具有相同的黏性末端，可被DNA连接酶连接形成的DNA分子是 ，C正确； D、两个③片段属于平末端，只能被T4 DNA连接酶催化连接形成重组 DNA，D错误。 故选C。 能力2 基因表达载体的优化设计 优化维度 具体优化策略 核心优化目的 易错点/注意事项 启动子优化 1. 选择与受体细胞匹配的启动子（原核→乳糖操纵子启动子，真核→CMV启动子）；2. 选用强启动子，增强转录效率；3. 添加增强子，提升启动子活性 确保目的基因在受体细胞中高效、特异性转录，避免启动子不兼容导致的表达沉默 勿混淆原核与真核启动子，启动子与目的基因的距离需合理，否则影响转录效率 终止子优化 1. 选择适配受体细胞的终止子；2. 避免终止子缺失或序列异常；3. 添加poly(A)尾（真核载体），稳定mRNA 保证转录精准终止，防止出现异常长度的mRNA，减少对目的基因表达的干扰 原核载体无需添加poly(A)尾，终止子序列突变会导致转录通读，影响表达产物 目的基因优化 1. 优化密码子偏好性（适配受体细胞的密码子使用频率）；2. 去除内含子（原核载体）；3. 添加信号肽序列（分泌型蛋白表达） 提升目的基因的翻译效率，确保表达产物正确折叠、定位，减少异常蛋白产生 原核细胞无法剪切内含子，密码子优化需兼顾整体序列，不可仅替换单个密码子 标记基因优化 1. 选择筛选效率高的标记基因（如荧光基因、抗性基因）；2. 避免标记基因与目的基因相互干扰；3. 采用双标记基因，提升筛选准确性 快速、精准筛选出含重组载体的受体细胞，排除空质粒和未导入载体的细胞 抗性基因需与筛选培养基匹配，双标记基因需避免酶切位点重叠，防止被破坏 典题示例1（2025·广东汕尾·一模）研究表明，COX-2基因与肿瘤细胞的迁移有关，科研人员通过构建COX-2基因表达载体（如图），用于进一步研究COX-2基因表达产物对肿瘤细胞迁移的作用机制。图中1链为转录的模板链，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶识别序列，LacZ基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。下列说法正确的是（    ） A．通过PCR扩增COX-2基因片段，需要加入引物A和引物D B．为构建COX-2表达载体，需在与1链结合的引物的5'端添加BamHⅠ识别序列 C．在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落 D．在含X-gal培养基中长出的蓝色菌落含重组质粒 【答案】B 【详解】A、已知COX-2基因的1链为转录的模板链，根据PCR扩增引物的设计原则，引物需要与模板链的两端互补。由图可以看出，引物C与1链的3'端互补，引物B与2链的3'端互补，DNA聚合酶是从引物的3''端进行延伸的，所以应该选择引物B和C扩增COX-2基因，A错误； B、使基因准确插入质粒，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。DNA聚合酶是从引物的3'端开始延伸DNA链的，在5'端添加序列不影响DNA链的延伸，同时可以利用限制酶对引物和质粒进行切割，以便后续连接。从质粒的结构（有BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点）以及实验目的来看，与1链结合的引物的5'端需添加限制酶BamHⅠ，与2链结合的引物的5'端需添加限制酶SacⅠ的识别序列，B正确； C、在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落，也可能是空载质粒，C错误； D、根据题意，在含X-gal培养基中长出的白色菌落含重组质粒，D错误。 故选B。 能力3基因工程与其他技术的综合应用 综合应用场景 结合的核心技术 具体操作与核心逻辑 易错点/注意事项 转基因动植物培育 基因工程 + 胚胎工程（动物）/ 植物组织培养（植物） 先通过基因工程获得含目的基因的细胞，再利用胚胎工程（显微注射→胚胎移植）或植物组织培养，培育完整转基因个体，实现优良性状稳定遗传 动物转基因需导入受精卵，植物转基因后需脱分化、再分化，避免未分化细胞导入导致培育失败 药用蛋白高效生产 基因工程 + 蛋白质工程 + 微生物发酵工程 通过蛋白质工程设计优化药用蛋白结构，基因工程构建重组载体导入微生物，利用发酵工程大规模培养，提升蛋白产量与活性 需匹配微生物密码子偏好性，发酵条件需适配工程菌生长，避免蛋白折叠异常 遗传病精准治疗 基因工程 + 基因编辑技术 + 细胞工程 利用基因编辑技术修复缺陷基因，通过基因工程构建重组载体，结合细胞工程培养健康细胞，再移植回患者体内，实现精准治疗 关注基因编辑脱靶效应，避免编辑正常基因，严格遵循伦理规范，防止细胞移植排斥 抗逆作物培育 基因工程 + 植物细胞工程 + 诱变育种 通过诱变育种获得潜在抗逆突变体，基因工程导入抗逆基因，结合植物组织培养快速繁殖，筛选出抗逆性强的优良品种 诱变育种需筛选优良突变体，基因导入后需验证抗逆性状稳定性，避免基因污染 生态环境治理 基因工程 + 微生物工程 + 细胞工程 通过基因工程改造微生物，赋予其降解污染物的能力，利用微生物工程大规模培养工程菌，结合细胞固定化技术，提升污染治理效率 防止工程菌泄露破坏生态平衡，需优化工程菌的存活能力，避免污染物降解产生有毒副产物 典题示例1（2025·山东青岛·二模）微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢产物萜类物质。下列说法错误的是（　　） A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质 B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因 C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达 D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性 【答案】A 【分析】1.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 3.目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、毕赤酵母生产的萜类物质是次生代谢物，不是酵母生长所必需的物质，A错误； B、某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因，B正确； C、去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达，避免了非必需基因对目的基因表达的干扰，C正确。 D、大肠杆菌为原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行修饰加工，所以以大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性，D正确。 故选A。 1．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 命题解读 新情境：本题以基因工程核心技术 —— 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳为真实实验情境，精准对接分子生物学研究与基因工程应用的实际场景。题干给出含特定限制酶切位点（2 个EcoRⅠ、1 个SacⅠ、1 个BamHⅠ，且BamHⅠ 位于两EcoRⅠ 正中间）的质粒 P，结合单酶切、双酶切产物的凝胶电泳条带图谱，创设 “从酶切位点分布→酶切产物片段数量与大小→电泳条带特征→反推酶切组合” 的完整实验分析情境。该情境打破课本孤立知识点考查模式，将限制酶作用特点、DNA 电泳原理、质粒结构特性等知识，融入基因工程载体构建与验证的科研实践场景中，让考生感受到分子生物学技术在基因操作中的应用价值，凸显知识的实用性与科学性。 新角度：本题是科学思维与实验探究能力的综合测评题，突破传统 “直接考查酶切位点数量或电泳原理” 的考法，采用逆向推理 + 图文信息综合分析的创新考查模式。 考查逻辑推理能力：要求考生基于 “环状质粒单酶切 / 双酶切的片段数量规律”（单切点单酶切得 1 条带、双切点单酶切得 2 条带；双酶切片段数为两酶切点总数），结合电泳条带数与迁移位置，反推泳道②③④对应的单酶切类型、泳道⑤⑥⑦对应的双酶切组合，而非直接记忆结论。考查知识综合应用能力：整合基因工程（限制酶特性、质粒结构）、分子生物学技术（琼脂糖凝胶电泳原理、DNA 迁移速率与片段大小关系）、实验分析（单 / 双酶切结果预测与验证） 三大模块知识，需考生构建知识网络，交叉判断各选项，契合高考 “综合性考查” 趋势。落实核心素养：通过实验结果分析，考查 “科学思维”（逻辑推理、证据意识）与 “科学探究”（实验结果解读、方案验证）素养，引导考生建立 “技术原理 — 实验操作 — 结果分析” 的完整科研思维，落实生物学核心素养培养目标。 【答案】C 【详解】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误； B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误； C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确； D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。 故选C。 2．（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 命题解读 新情境：本题以水稻抗白叶枯病基因工程育种为真实科研情境，紧扣我国粮食安全与作物抗病育种的重大需求，以含抗病基因D的重组Ti质粒为载体，依托农杆菌转化法、愈伤组织培养、转基因植株筛选等完整转基因技术流程，将基因表达载体构建、启动子功能、植物组织培养、转基因鉴定等知识，融入作物分子育种的生产实践场景。情境贴近现代农业生物技术应用，打破教材单一实验流程的呈现方式，让考生体会基因工程在抗病育种中的实际价值，凸显生物学知识服务农业生产的实用性，引导考生关注生物技术对粮食安全的重要意义。 新考法：本题突破传统基因工程“识记步骤”的考查方式，聚焦核心元件功能辨析与逻辑推理，是对生命观念、科学思维、社会责任的综合测评，不直接考查启动子定义，而是通过U6启动子、标记基因、目的基因的位置关系，判断不同生物中启动子的特异性与表达驱动能力，强调启动子具有物种/细胞类型特异性，考查对基因表达调控本质的理解，同时围绕转基因筛选、再生植株鉴定等关键环节设置选项，要求考生结合标记基因位置、T-DNA转移特点、植物组织培养过程进行推理判断，考查实验分析与严谨推理能力，且整合基因工程、基因表达、植物细胞工程、作物育种四大模块知识，需跨模块联动分析，符合高考“综合性、应用性”命题趋势，侧重考查知识网络构建与真实问题解决能力。 【答案】B 【详解】A、将T - DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状。那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误； B、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， B正确； C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T - DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中 ，通常情况下，若D基因能表达，那么T - DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T - DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T - DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错误； D、 检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株， D错误。 故选B。 3．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 命题解读 新情境：本题以β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的蓝白斑筛选为核心，创设人源干扰素基因在大肠杆菌中高效表达的基因工程实验情境，贴合微生物基因工程的科研与生产实际。题干明确质粒K的标记基因功能、X-gal显色原理，围绕目的基因导入、转化效率、筛选鉴定等关键环节设置问题，将质粒载体结构、转化操作、标记基因筛选、质粒自身环化等知识点，融入重组蛋白高效表达的真实实验场景，既还原了基因工程中“筛选-鉴定”的核心流程，又体现了生物技术在医药领域（干扰素生产）的应用价值，让考生感受基因工程技术的实际应用，打破教材抽象知识点的局限，凸显实验情境的真实性与实用性。 新考法：本题突破传统“识记标记基因功能、转化操作步骤”的考查模式，聚焦基因工程筛选环节的逻辑严谨性与实验细节分析，是对科学思维、实验探究核心素养的综合测评，不直接考查基础概念，而是围绕蓝白斑筛选的原理、转化效率影响因素、质粒自身环化的影响、筛选结果的严谨判断等核心问题设置选项，要求考生结合标记基因的双重作用（筛选转化子、鉴定重组质粒），分析不同实验条件下菌落颜色与菌株类型的对应关系，推理实验结果异常的原因，考查实验分析、逻辑推理与严谨论证的能力，同时整合微生物转化、质粒载体特性、标记基因筛选、目的基因表达鉴定等知识，强调“筛选≠鉴定”的核心逻辑，引导考生建立严谨的实验思维，符合高考“聚焦能力、凸显素养”的命题趋势，侧重考查知识应用与真实实验问题解决能力。 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确； B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确； C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。 故选C。 4．（2025·海南·高考真题）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 (1)质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是_____和_____。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG (2)细胞X是一种贴壁细胞，可用_____（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是_____。 (3)将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有_____作用，且随导入时间推移，增殖速率_____。 (4)siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将_____导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的_____对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：_____。 命题解读 新情境：本题以绵羊羊毛长度调控为核心，创设探究基因Z对绵羊毛囊细胞增殖影响的科研情境，贴合畜牧养殖中优良品种培育的实际需求。题干围绕基因工程载体构建、动物细胞培养、siRNA干扰技术等核心技术，整合限制酶选择、贴壁细胞培养特点、实验设计与结果分析、分子水平检测等关键内容，将基因工程、细胞工程、基因表达调控等知识，融入羊毛长度调控的科研探究场景，既还原了“基因功能探究”的完整实验流程，又体现了生物技术在畜禽育种中的应用价值，打破教材中不同技术模块孤立呈现的局限，让考生体会生物学知识在解决实际生产问题中的作用，凸显情境的真实性、探究性和应用性。 新考法：本题以探究基因功能为核心，采用“填空+实验设计+结果分析”的题型，突破传统单一知识点识记的考查模式，聚焦实验探究能力与综合应用能力的测评，是对科学思维、科学探究核心素养的集中考查。题目不直接考查基础概念，而是结合限制酶识别序列选择重组质粒构建的酶，结合贴壁细胞特性分析培养条件与传代处理的理由，同时通过实验结果曲线分析基因对细胞增殖的影响，还引入siRNA干扰技术设计对照实验、设计分子水平检测思路，整合基因工程、动物细胞工程、基因表达调控等多模块知识，既考查考生对具体技术细节的掌握，又考查实验设计的严谨性、结果分析的逻辑性和实验思路的设计能力，贴合高考“聚焦探究、凸显素养”的命题趋势，侧重考查知识的综合应用与真实科研问题的解决能力，引导考生建立“提出问题—设计实验—分析结果—得出结论”的完整探究思维。 【答案】(1) EcoR Ⅰ Xho Ⅰ (2) 液体 使贴壁细胞分散为单个细胞，37℃是胰蛋白酶的最适温度 (3) 促进 增加 (4) 无靶向的siRNA 表达减少 a、提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用； b、提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用） 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）需选择质粒甲和质粒乙共有的限制酶切割，保证目的基因和质粒产生相同黏性末端。质粒甲的目的基因两端有EcoRⅠ和Xho Ⅰ的酶切位点（对应质粒乙的酶切位点），因此用EcoRⅠ和Xho Ⅰ。 （2）动物细胞培养使用液体培养基； 胰蛋白酶在 37℃（人体 / 动物细胞适宜温度）下活性高，可分解细胞间的蛋白质，使贴壁细胞分散成单个细胞，便于传代培养。 （3）与空质粒乙组（对照组）相比，重组质粒乙组（含基因 Z）的细胞数量更多，说明基因 Z 的表达对细胞增殖有促进作用；随导入时间推移，两组细胞数量的差距增大，说明增殖速率加快。 （4）①对照组应导入无关序列的 siRNA（或空载体）（排除 siRNA 本身的影响）；该实验通过抑制基因 Z 的表达（siRNA 切割其 mRNA），目的是探究基因 Z 的表达缺失（或抑制表达）对细胞增殖的影响。 ②在分子水平检测基因的表达，可以从转录和翻译水平，可提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用；也可提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用。 5．（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。 (1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌_____的功能，导致该细胞器不能产生ATP。 (2)获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株 ①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。 ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。 已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向_____。 ③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。 (3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择_____。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的_____。 在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供_____，大肠杆菌为酵母菌提供_____，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是：_____。 命题解读 新情境：本题以线粒体起源的内共生假说为核心科研背景，创设“构建大肠杆菌与专性厌氧酵母共生体”的实验情境，贴合细胞起源研究的前沿科研方向。题干围绕基因敲除、重组质粒构建、细胞融合、选择培养等核心技术，整合细胞器功能、限制酶应用、膜融合原理、互利共生关系等知识点，将细胞结构与功能、基因工程、细胞工程等知识，融入内共生假说的验证实验中，既还原了“假说-演绎”的科研思维流程，又体现了生物技术在进化理论验证中的应用价值，打破教材中进化理论与生物技术模块孤立呈现的局限，让考生体会生物学前沿研究的探究过程，凸显情境的科学性、探究性和前沿性。 新考法：本题以假说验证为核心，采用“填空+绘图+实验分析”的综合题型，突破传统“识记内共生假说内容、基因工程步骤”的考查模式，聚焦科研思维与综合应用能力的测评，是对生命观念、科学思维、科学探究核心素养的集中考查。题目不直接考查基础概念，而是结合基因敲除技术分析细胞器功能，结合引物设计与限制酶位点特点判断引物位置及方向，结合细胞融合原理分析膜融合试剂与融合部位，结合共生关系分析营养物质交换及选择培养基的设计逻辑，整合细胞结构、基因工程、细胞工程、进化理论等多模块知识，既考查考生对具体技术细节和科研逻辑的掌握，又考查绘图能力、实验分析能力和逻辑推理能力，贴合高考“聚焦前沿、凸显素养”的命题趋势，侧重考查知识的综合应用与前沿科研问题的解决能力，引导考生建立“假说验证—实验设计—结果分析”的严谨科研思维。 【答案】(1)线粒体 (2) (3) PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH） 细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜） 维生素B1 ATP 葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）线粒体是有氧呼吸产生ATP的主要场所，要获得专性厌氧呼吸的酵母菌株，利用基因敲除技术破坏酵母菌线粒体的功能，就能导致该细胞器不能产生ATP。 （2）要使质粒1线性化，且能与扩增后的基因X经酶切、连接重组为质粒2，引物P3和P4应分别位于质粒1的两端，且方向相反（因为PCR扩增时引物是从5’到3’方向延伸的，这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoR Ⅰ和Not Ⅰ识别序列，与基因X两端的酶切位点匹配）。位置及方向如图：。 （3）促进膜融合的化学试剂通常选择PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）。大肠杆菌细胞壁外层为脂质双分子层膜结构，融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）。 在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上，酵母菌可进行代谢为大肠杆菌提供维生素B1，大肠杆菌能分泌ATP，为酵母菌提供ATP，表明二者建立了互利共生关系。不能用葡萄糖为碳源筛选融合菌株，原因是葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活，二者都能在以葡萄糖为碳源的培养基上都能生长，无法区分出只有二者互利共生才能生长的融合菌株。 6．（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ (2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 (3) 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 (4) 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 【分析】1、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成等。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中①是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶1基因序列，④是溶解酶2基因序列。 7．（2025·全国卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题： (1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是________，而PCR过程中解开双链的方法是________。 (2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有________。 (3)该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：________；②无扩增产物，原因是________；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是________。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果________。 【答案】(1) 解旋酶 高温变性 (2)引物、脱氧核苷三磷酸 (3) 作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染） P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 (4)提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性 【分析】PCR（聚合酶链式反应）技术扩增基因的原理是DNA 半保留复制 。 在适宜的温度、引物、DNA 聚合酶、脱氧核苷酸等条件下，以目的基因的两条链为模板，按照碱基互补配对原则（A - T、G - C 配对），通过变性（高温使 DNA 双链解开）、退火（低温使引物与模板结合）、延伸（中温下 DNA 聚合酶催化脱氧核苷酸连接到引物上延伸成新链 ）三个步骤循环往复，实现目的基因的大量扩增，每一轮循环后 DNA 分子数量呈指数增长 。 【详解】（1）在细胞中，DNA 复制时解开双链的酶是解旋酶。而在 PCR 过程中，是通过高温变性（加热至 90 - 95℃）的方法使 DNA 双链解开。 （2）PCR 过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和 dNTP（脱氧核苷三磷酸）。引物用于引导 DNA 聚合酶合成新的 DNA 链，dNTP 脱去两分子磷酸，产生dAMP，进而为合成新的 DNA 链提供原料。 （3）实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③以Px为模板，引物1和引物2扩增出的是含目的基因的 DNA 片段；⑤以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段 DNA 片段；⑥以Px为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的 DNA 片段。 （4）实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系（作为对照），在适宜条件下，加入酶X的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。 预期结果：含有酶X的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。 8．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是______（答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有______（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 【答案】(1) 终止子（复制原点） P1 和 P3 782 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失 (2) 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测 【分析】1基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminator等，这是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。 【详解】（1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。 将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：缺失分泌到细胞外的信号，重组菌没有将蛋白A释放到细胞外；基因A未表达；基因A丢失。 （2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。 ②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 9．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是______。将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是______。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是______，随后在含______和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______。 【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释 (2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 (4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 10．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 考向1 基因工程的基本工具 1．（2025·浙江·一模）粪便无创DNA检测技术通过分析粪便中脱落肠道细胞的DNA来评估肠癌发病风险，具有无创便捷、灵敏度高等优点。该检测需采集粪便样本，进行DNA提取、扩增等过程。下列叙述正确的是（　　） A．提取DNA时，研磨液经过滤、离心后取上清液，再加入冷酒精 B．随着PCR反应进行，DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸数量逐步减少 C．因粪便中的DNA均源于肠壁脱落细胞，因此该技术的灵敏度高 D．若检测发现原癌基因并未突变，则可判断该检测者未得肠癌 【答案】A 【详解】A、提取DNA时，需裂解细胞释放DNA，离心后细胞碎片等杂质沉淀，DNA存在于上清液中，加入冷酒精可使DNA析出，A正确； B、PCR反应中，脱氧核苷酸和引物会被消耗而减少，但耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）在反应中不会被分解，其活性可能随高温循环逐渐降低，但数量不会“逐步减少”，B错误； C、粪便中的DNA不仅来自肠壁脱落细胞，还可能包含肠道微生物或食物残留的DNA，C错误； D、癌症发生是多个基因突变（如原癌基因和抑癌基因）共同作用的结果，仅原癌基因未突变不能排除癌症可能，D错误。 故选A。 2．（2025·四川·一模）大量研究表明，蛋白激酶 SOS2 响应盐胁迫应答，该酶由 SOS2 基因编码。为研究其机制，研究者将质粒 pART27 与 SOS2 基因结合后形成重组质粒。在构建过程中，研究者分别使用“单酶切”和“双酶切”切割质粒与含 SOS2 基因的 DNA 片段（如图），酶切产物用 DNA 连接酶连接。在只考虑产物两两结合的情况下，下列叙述错误的是（    ） A．“单酶切”组的产物中含有 SOS2 基因与 SOS2 基因的连接物 B．SOS2 基因与 pART27 的正向连接物只能来自“双酶切”组 C．pART27 与 pART27 的连接物是“单酶切”组的最大产物 D．“单酶切”组连接物的种类较“双酶切”组的连接物多 【答案】B 【详解】A、SOS2基因自身连接是“单酶切”的产物之一，A正确； B、不管是“单酶切法”还是“双酶切法”，均可使SOS2基因与质粒正向（正确）连接，B错误； C、质粒的相对分子量大于目的基因，故pART27与pART27的连接物是“单酶切”组的最大产物，C正确； D、单酶切可能造成目的基因反向连接或者目的基因自连或质粒自连，所以“单酶切”组形成的两两结合产物的种类多于“双酶切”组形成的两两连接物种类，D正确。 故选B。 3．大肠杆菌经溶菌酶和去垢剂SDS（一端亲水、一端疏水的两性小分子）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA，通过电泳可对质粒DNA进行鉴定。下列说法错误的是（　　） A．提取质粒时溶菌酶和SDS能破坏细胞壁和细胞膜，释放DNA B．提取质粒时将95%冷酒精加入上清液中，可使质粒DNA析出 C．电泳时载样缓冲液中的指示剂能与DNA结合，指示DNA位置 D．电泳时与加样孔距离相同的条带所含DNA分子大小可能不同 【答案】C 【详解】A、题干信息：大肠杆菌经溶菌酶和去垢剂SDS（一端亲水、一端疏水的两性小分子）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中；可见提取质粒时溶菌酶和SDS能破坏细胞壁和细胞膜，释放DNA，A正确； B、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；提取质粒时将95%冷酒精加入上清液中，可使质粒DNA析出，B正确； C、电泳时载样缓冲液中的指示剂迁移速率比DNA快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源，C错误； D、DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，移动速率与分子大小和构象有关；电泳时与加样孔距离相同的条带所含DNA分子大小可能不同，D正确。 故选C。 4．（2025·山东日照·三模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性。拟核DNA分子因无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列叙述正确的是（　　） A．实验中可将细菌置于无菌水中使其裂解，释放DNA分子 B．也可通过调节温度来替代调节pH使DNA先变性再复性 C．实验中可在上清液中加入2mol/L的NaCl溶液析出质粒 D．电泳分离质粒时，条带迁移速率由质粒大小和构象决定 【答案】D 【详解】A、细菌有细胞壁的保护，加入适量无菌水不能使细菌裂解，通常采用加入溶菌酶等方法使细菌裂解，A错误； B、DNA的变性和复性可通过高温（如PCR）实现，但题干中调节pH的作用还包括裂解细胞，而温度调节无法替代此功能，B错误； C、析出质粒需加入冷酒精以降低DNA溶解度，而非高浓度NaCl（2mol/L NaCl反而会提高DNA溶解度），C错误； D、电泳时，DNA迁移速率与分子大小和构象（如超螺旋、线状、开环）有关，超螺旋质粒迁移最快，D正确。 故选D。 5．（2025·湖北武汉·模拟预测）PM是一种致病真菌，其致病性可能与SKN7基因有关。科研人员将SKN7基因与pMD18-T载体进行拼接后导入受体菌，以便研究SKN7基因的功能。在SKN7基因扩增过程中Taq酶会在序列3’端额外加入一个碱基A，选用限制酶甲（三种限制酶的酶切位点如图所示）对pMD18-T载体进行酶切，使用末端转移酶处理，在切口处加入一个碱基T，用乙酶就能将SKN7基因与载体连接起来，操作过程如图所示，下列叙述正确的是（　　） A．构建重组质粒过程中所用到的甲酶为EcoRV，乙酶为DNA连接酶 B．上述方法构建重组质粒的过程中，可能会导致SKN7基因或载体的自身环化 C．在含氨苄青霉素和X-Gal的培养基上培养受体菌，含重组质粒的菌落呈蓝色 D．正确连接的重组质粒可被甲酶酶切，而反向连接的重组质粒不可被甲酶酶切 【答案】A 【分析】基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】A、依据题干信息，选用限制酶甲对pMD18-T载体进行酶切，使用末端转移酶处理，在切口处加入一个碱基T，结合图示可知，限制酶产生的末端是平末端，应为EcoRⅤ，乙酶就能将SKN7基因与载体连接起来，说明乙酶为DNA连接酶，A正确； B、据图，质粒和SKN7产生的末端不同，所以不易导致SKN7基因或载体发生自身环化，B错误； C、当lac-Z基因被破坏时，重组质粒不会编码相应的酶分解X-Gal进而产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，所以在含氨苄青霉素和X-Gal的培养基上培养受体菌，含重组质粒的菌落呈现的是白色，C错误； D、由于EcoRⅤ产生的末端为平末端，缺乏定向性，所以正确连接的重组质粒可被甲酶酶切，而反向连接的重组质粒也可被甲酶酶切，D错误。 故选A。 考向2 基因工程的基本操作程序 6．（2025·湖北孝感·一模）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。利用PCR技术扩增干扰素基因，可用于干扰素的规模化生产。下列有关叙述正确的是（　　） A．为使PCR产物能被限制酶切割，可在引物的5'端添加识别序列 B．在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补 C．PCR体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶 D．PCR扩增干扰素基因时，子链的延伸方向是3'→5' 【答案】A 【详解】A、在引物的5'端添加限制酶识别序列，可使PCR产物两端带有特定酶切位点，便于后续与载体连接，A正确； B、两种引物应分别与模板DNA两条链的3'端互补配对，引物之间无需碱基序列互补，否则会导致非特异性结合，B错误； C、PCR通过高温（90-95℃）使DNA变性解链，无需解旋酶；催化子链合成的是耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶），C错误； D、DNA聚合酶催化子链合成时，只能沿5'→3'方向延伸，D错误。 故选A。 7．（2025·广东汕尾·一模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，其工作原理如图所示。下列有关说法错误的是（    ） A．Cas9蛋白的作用相当于限制酶 B．复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合 C．将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法 D．利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中 【答案】C 【详解】A、Cas9蛋白可以切割DNA序列，作用相当于限制酶，A正确； B、由图可知复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合，B正确； C、将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是转化法，C错误； D、由图可知，利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中，D正确。 故选C。 8．（2025·云南红河·一模）科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 【答案】B 【详解】A、改造人胰岛素基因是依据 “植物偏好密码子”，密码子改变但编码的氨基酸不变（密码子的简并性），因此表达产物的氨基酸序列与天然胰岛素完全相同，A 错误； B、质粒1含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，质粒2含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，用这两种酶切割质粒1和质粒2，可将 “启动子 + 胰岛素基因” 连接到质粒2上构建质粒3（保证黏性末端匹配），B 正确； C、基因表达载体含 “潮霉素抗性基因”（筛选标记），因此应使用含潮霉素的培养基筛选；卡那霉素抗性基因不在T-DNA区域，未整合到最终载体中，C错误； D、农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上，借助植物细胞的复制系统完成复制，无需额外添加复制原点，D错误。 故选B。 9．（2025·湖南湘潭·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞形态和功能等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。回答下列问题： 注：BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ为限制酶，tsr为硫链丝菌素抗性基因，ori为复制原点。 (1)图中①过程需要使用___________酶，该过程得到的DNA片段___________（填“含有”或“不含有”）启动子序列。 (2)过程②一般使用___________（填限制酶）构建基因表达载体。为了实现目的基因与质粒成功连接，需要对PCR的引物进行改造，具体的做法是___________。 (3)双酶切基因与质粒pET-28a（+）长度为170bp的片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，上述两种质粒经HindⅢ切割后片段长度如表所示（每种片段各1个）。由此判定基因长度为___________，该基因上有___________个HindⅢ切割位点，依据是___________。 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindⅢ酶切片段 1000bp、2550bp 1050bp、2500bp、150bp 【答案】(1) 逆转录 不含有 (2) BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 将限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列连接至引物的5'端 (3) 320bp 2/二 pET-28a（+）原有的2个Hind Ⅲ位点被目的基因置换了1个后，得到的环状的pET-28a（+）-kit仍然被Hind Ⅲ切割成3段 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】（1）由题图可知，过程①由mRNA生成基因 kit（即DNA），因此代表逆转录过程，需要用到逆转录酶。该过程得到的DNA片段的碱基序列与mRNA一一对应，只有编码序列，不含有启动子序列。 （2）由于ori复制原点中含有限制酶Hind Ⅲ的识别序列，因此不能用限制酶Hind Ⅲ来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对质粒pET-28a(+)进行双酶切来构建基因表达载体，这样可以防止目的基因与质粒的自身环化以及任意连接；同时要在 kit 基因两端也连上限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸延伸子链，因此必须将限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列连接至引物的5'端，这样经过PCR和双酶切后，才能保证 kit 基因以正确的方向与运载体连接。 （3）观察质粒 pET-28a(+) 图可知，在该质粒上有两个HindⅢ的识别序列，一个在启动子和终止子之间，一个在复制原点ori中，因此用HindⅢ切割质粒 pET-28a(+)后，可得到两个片段，通过表格可知，这两个片段长度分别为1000bp和2550bp，说明质粒pET-28a(+) 总长度是1000bp+2550bp=3550bp；利用双酶切法将 kit 基因与质粒 pET-28a(+) 长度为170bp片段进行置换后，形成的重组质粒 pET-28a（+）-kit 能被HindⅢ切割成三个片段，长度分别是1050bp、2500bp、150bp，说明置换后的kit 基因上含有两个HindⅢ的识别序列，再加上复制原点ori中的一个HindⅢ的识别序列，共三个HindⅢ的识别序列，经HindⅢ酶切后才能将重组质粒pET-28a（+）-kit 切成3段。利用这三段的长度可计算出重组质粒 pET-28a（+）-kit 的总长度为1050bp+2500bp+150bp=3700bp，由于kit 基因与长度为170bp片段进行置换，设kit 基因长度为n，可列出等式：3550+n-170=3700bp，故可计算出kit 基因长度为n=320bp。 10．（2025·四川泸州·二模）虾青素是雨生红球藻产物，具有抗氧化和提高免疫力等特点，但并非其基本生命活动必需的产物。某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因工程改造酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素产业化生产。请回答下列问题: (1)图中质粒还缺少的必备元件是______。为使基因 crtZ 片段能正确连接到图中质粒，应选用限制酶______来处理质粒。 (2)将重组质粒导入大肠杆菌后，需在含氨苄青霉素的培养基上筛选，目的是______；再从阳性大肠杆菌中提取重组质粒，导入URA3基因缺失的酿酒酵母，应在______的培养基上筛选工程酵母。 (3)虾青素的部分代谢途径如下图所示，通过基因编辑技术将crtZ基因定向整合到酿酒酵母染色体上的ERG3基因中，该方法可避免因______（生理过程）导致的目的基因丢失，提高遗传稳定性；同时能进一步提高虾青素产量，原因是______。 【答案】(1) 复制原点 BamHI和 EcoRI (2) 排除未导入质粒的大肠杆菌 不含尿嘧啶 (3) 有丝分裂（细胞增殖） ERG3基因被破坏，使更多前体物质用于虾青素合成途径 【分析】基因工程包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）重组质粒的必备元件包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点（保证质粒在受体细胞中自主复制），图中质粒还缺少的必备元件是复制原点；据图可知，目的基因的两端只有EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ识别序列，目的基因应该用这两种酶切割，为使基因crtZ片段能在受体细胞中表达，应将基因crtZ片段连在质粒的启动子和终止子之间，质粒的启动子和终止子之间有Bgl Ⅱ、EcoRI、BamH I和Hind Ⅲ识别序列，但Bgl Ⅱ有一个识别位点在启动子左边，如果使用此酶，有可能会将启动子切除，不能使用此酶，Bgl Ⅱ和Bam H I切割后产生的黏性末端相同，为保证目的基因和质粒能连接在一起，应该用BamH I和EcoR I切割质粒。 （2）质粒上的标记基因为Ampr（氨苄青霉素抗性基因），在含氨苄青霉素的培养基上筛选，未导入质粒的大肠杆菌无抗性，会被淘汰，故将重组质粒导入大肠杆菌后，需在含氨苄青霉素的培养基上筛选，目的是排除未导入质粒的大肠杆菌；酿酒酵母缺失URA3基因，无法合成尿嘧啶，而重组质粒含URA3基因，故需在不含尿嘧啶的培养基上筛选。 （3）若目的基因仅存在于质粒上，酵母有丝分裂（细胞增殖） 过程中，质粒可能随机分配，导致部分子代细胞丢失目的基因，整合到染色体上可避免这一问题，提高遗传稳定性；据代谢途径可知，ERG3基因控制合成麦角固醇，crtZ基因整合到ERG3基因中会破坏其功能，使前体物质无法流向麦角固醇合成途径，转而更多用于虾青素合成，故产量提高。 考向3基因工程的应用 11．（2025·四川泸州·一模）研究人员利用花粉管通道法将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因Cry导入某玉米品系，通过室内和田间试验证实其对玉米螟具有较高的抗虫性，下列叙述不合理的是（　　） A．花粉管通道法无需使用载体就能直接将Cry基因导入受体细胞 B．从室内鉴定抗虫到田间调查抗虫性的做法，符合风险防控的要求 C．为防止转基因玉米Cry基因传播到野生近缘种，需将其隔离种植 D．长期大面积单一种植抗虫玉米，玉米螟种群中抗性基因频率会上升 【答案】A 【详解】A、花粉管通道法在导入Cry基因前，需先将该基因克隆到载体中进行扩增和操作，再提取重组DNA直接导入受体细胞，因此需要载体，A错误； B、从室内小规模鉴定抗虫性到田间大规模试验，可逐步评估转基因玉米的环境风险和抗虫效果，符合转基因生物安全评价的风险防控原则，B正确； C、隔离种植可减少转基因玉米的花粉传播，防止Cry基因通过基因漂移扩散到野生近缘种，降低生态风险，符合生物安全要求，C正确； D、长期大面积单一种植抗虫玉米，对玉米螟施加持续选择压力，敏感个体被淘汰，抗性个体存活并繁殖，导致种群中抗Cry毒素的基因频率上升，符合自然选择原理，D正确。 故选A。 12．（2025·浙江杭州·模拟预测）基因工程技术在迅猛发展，为人类的生产生活带来很多便利，但同时也带来了一些安全性问题，下列说法正确的是（　　） A．乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与药用蛋白启动子重组后导入动物的受精卵中 B．将外源生长素基因导入鲤鱼中可提高鲤鱼的生长速度 C．通过基因组编辑技术可以设计完美试管婴儿 D．研究转基因农作物时，可采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染 【答案】D 【分析】乳腺生物反应器是将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，以转基因动物的乳腺组织生产药用蛋白的技术。 【详解】A、乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法导入哺乳动物的受精卵中，A错误； B、生长素是植物激素，对动物不起作用。将外源生长激素基因导入鲤鱼中，可提高鲤鱼的生长速度，B错误； C、目前的技术水平还无法通过基因组编辑技术设计出完美的试管婴儿，且“设计试管婴儿”存在伦理争议等诸多问题，C错误； D、子代受精卵中的细胞质几乎全部来自母方，转入叶绿体中的基因不会随花粉传递给子代，研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染，符合生物技术的安全与伦理规范，D正确。 故选D。 13．（2025·河南·模拟预测）CASGEVYTM基因疗法利用CRISPR系统引导RNA定位特定DNA序列并通过Cas9酶进行定点切割，实现对基因的编辑。如图为利用基因疗法治疗镰状细胞病的过程，叙述正确的是（    ） A．CRISPR系统引导RNA定位BCL11A基因时碱基互补配对方式是A-U、U-A、C-G、G-C B．Cas9酶具有核酸内切酶功能，定点切割BCL11A基因时作用部位是磷酸二酯键和氢键 C．基因编辑胎儿血红蛋白编码基因后，细胞启动DNA修复过程，可能需要DNA连接酶 D．CASGEVYTM基因疗法能高效、精确地对基因进行修改，但需要多次进行才能保证治疗效果 【答案】C 【分析】CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。 【详解】A、CRISPR系统引导RNA要与BCL11A基因中的一条链配对，基因的脱氧核苷酸链无U碱基，故发生的碱基互补配对方式是A-U、T-A、G-C、C-G，A错误； B、Cas9仅切割磷酸二酯键，不作用于氢键，B错误； C、基因编辑胎儿血红蛋白编码基因后，DNA双链断裂，细胞会启动修复，此过程需要DNA连接酶重新连接断裂的磷酸二酯键，C正确； D、CRISPR-Cas9编辑通常单次即可实现目标基因的持久修改（如BCL11A基因编辑后可持续激活胎儿血红蛋白），无需多次治疗，D错误。 故选C。 14．（2025·河北·一模）副猪格拉瑟菌(GPS)是定植于猪上呼吸道的一种病原菌，其细胞膜上的寡肽渗透酶(OppA)具有良好的免疫原性。为增加OppA 基因表达量，研究人员利用质粒和外源片段、强启动子构建了可以高表达OppA的GPS菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA 基因如图所示。请回答下列问题： (1)构建OppA 基因过表达载体时，选择 Hind Ⅲ进行酶切___________(填“合适”或“不合适”)，理由是___________。结合图分析，应该选择___________这两种限制酶切割质粒。 (2)已知OppA 基因的甲链为编码链(与模板链互补的DNA链)，图中OppA 基因的转录方向是___________(填“从左往右”或“从右往左”)。据图分析，利用PCR 扩增OppA基因时所需的引物组合是___________。 (3)为便于与质粒连接，需对引物进行特殊处理，在其中一种引物的5'端需添加___________识别序列和强启动子，另一种引物的5'端需添加___________识别序列。已知OppA 基因甲链的碱基序列为5'-TTACAGCGCTCC-3'，强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3'，请写出OppA 基因上游引物的15个碱基序列：5'-_________-3'。 (4)为了筛选出正确串联了强启动子、OppA 基因的重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型b和d加入的抗生素分别是___________、___________，得到 M、N、O三类菌落，其生长状况如下表所示(+表示生长，一表示不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是___________(填“M”“N”或“O”)类。 平板类型 菌落类型 M N O a．无抗生素 + + + b． 一 + + c．氨苄青霉素 一 + 一 d． 一 + 一 【答案】(1) 不合适 该酶会破坏全部标记基因(或该酶会破坏卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因) BamH Ⅰ、Sal Ⅰ (2) 从左往右 ②③ (3) BamH Ⅰ Xho Ⅰ GGATCCCATGCTTAC (4) 卡那霉素 卡那霉素和氨苄青霉素 O 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）标记基因用于筛选和鉴定成功导入了基因表达载体的受体细胞，图示所用质粒的卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，Hind Ⅲ在这两种标记基因上都有酶切位点，会破坏质粒上的全部标记基因，所以选择 Hind Ⅲ进行酶切不合适。图示质粒上，除了Hind Ⅲ，还剩下BamH Ⅰ、Sal Ⅰ的酶切位点，且它们仅破坏氨苄青霉素抗性基因，可以选择BamH Ⅰ、Sal Ⅰ这两种限制酶切割质粒。 （2）转录方向沿DNA模板链的3′ → 5′方向进行，新合成的RNA链则沿5′ → 3′方向延伸，图示OppA 基因的甲链方向为编码链(与模板链互补的DNA链)，乙链为模板链，乙链的左边为3′ 端，OppA 基因的转录方向是沿乙链的3′ → 5′方向进行，即从左往右。PCR扩增时需要一对方向相对的引物，子链DNA的延伸方向是5′ → 3′，引物的3′端必须指向待扩增的DNA区域内部，以保证DNA聚合酶能向模板中间合成新链。引物与碱基互补配对的链方向相反，图中①②③④的3′端指向依次是向左、向右、向左、向右，只有②③的3′端指向OppA基因区域内部，为所需的引物组合。 （3）在（1）中已经分析出在构建重组DNA分子时需要用到BamH I和Sal I识别序列，且看图示转录方向可知BamH I在前，Sal I在后，为了让质粒和OppA基因产生能够互补配对的相同黏性末端，以便在DNA连接酶的作用下将OppA基因定向、准确地插入质粒，需要在扩增OppA基因时，在其中一种引物的5′端添加BamH I识别序列和强启动子。预想在另一种引物的5′端添加Sal I识别序列，但是Sal I在OppA基因内部有酶切位点，不能使用Sal I切割OppA基因，观察、比较限制酶识别序列可知Sal I与Xho Ⅰ切割后能产生相同的黏性末端，因此在另一种引物的5′端应当添加Xho Ⅰ的识别序列。已知OppA 基因甲链的碱基序列为5'-TTACAGCGCTCC-3'，则OppA 基因乙链的相应碱基序列为3'-AATGTCGCGAGG-5'，上游引物（即图中的②）5'端与OppA 基因乙链的相应碱基序列能进行碱基互补配对，且方向相反，为：5'-TTACAGCGCTCC-3'（与甲链的碱基序列相同），再在它5'端加上BamH I识别序列（5'-GGATCC-3'）和强启动子的碱基序列（5'-CATGC-3'），OppA 基因上游引物的15个碱基序列：5'-GGATCCCATGCTTAC-3'。 （4）在构建重组DNA分子时需要用到BamH I和Sal I切割质粒，它们破坏了质粒上的氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏卡那霉素抗性基因，则导入重组质粒的微生物不能在含有氨苄青霉素的培养基上生存，能在含有卡那霉素的培养基上生存。表中平板类型b和d加入的抗生素分别是卡那霉素、卡那霉素和氨苄青霉素。M只能在无抗生素的培养基上生长，证明它是未导入质粒的菌落；N能在添加了卡那霉素和氨苄青霉素的培养基上生长，证明它是导入了空载质粒的菌落；O只能在无抗生素和添加了卡那霉素的培养基上生长，证明它是导入了重组质粒的菌落；根据表中结果判断，应选择的菌落是O。 15．（2025·浙江嘉兴·一模）水稻是我国第一大粮食作物。随着生物技术的发展，水稻育种进入精准设计时代，回答下列问题。 (1)单倍体育种助力水稻育种。取水稻花药离体培养，获愈伤组织，调节培养基的营养和______，愈伤组织经生芽和______过程后发育为单倍体幼苗，这一途径称之为器官发生途径。单倍体幼苗经秋水仙素处理，可获得纯合二倍体水稻。也可对单倍体愈伤组织用______酶处理，获得相应的原生质体，再将同种原生质体进行______，获得纯合二倍体水稻细胞。 (2)基因工程培育特色水稻。将花青素合成基因拼接到T-DNA上，再用______法将基因导入水稻细胞，培育出紫米水稻。对水稻中镉吸收相关基因进行______处理，可培育低镉水稻。 (3)基因工程改良水稻抗性。为提高对除草剂的抗性，先从______获得抗除草剂基因的序列，再利用基因编辑技术改变基因特定位点的______，使该基因表达产物的空间结构发生改变，这种设计和改造蛋白质的技术称为______工程。编辑后的水稻可能与近缘杂草经杂交发生______，产生“超级杂草”，所以应对其进行风险评估。 【答案】(1) 激素的种类和配比 生根 纤维素酶和果胶 细胞融合 (2) 农杆菌转化 敲除 (3) 基因数据库 核苷酸序列 蛋白质 基因漂移 【分析】1、基因的分离定律的实质是：在杂合体的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性，在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。 2、单倍体育种：采用花药(花粉)离体培养的方法来获得单倍体植株，然后经过人工诱导使染色体数目加倍，重新恢复到正常植株的染色体数目。 【详解】（1）单倍体育种助力水稻育种。取水稻花药离体培养，获愈伤组织，调节培养基的营养和激素的种类和配比，愈伤组织经生芽和生根过程后发育为单倍体幼苗，这一途径称之为器官发生途径，该过程的原理是染色体变异和植物细胞的全能性。单倍体幼苗经秋水仙素处理，可获得纯合二倍体水稻。也可对单倍体愈伤组织用纤维素酶和果胶酶处理，获得相应的原生质体，再将同种原生质体进行细胞融合，获得纯合二倍体水稻细胞，进而通过植物组织培养获得纯合二倍体。 （2）基因工程培育特色水稻。将花青素合成基因拼接到T-DNA上，再用农杆菌转化法将基因导入水稻细胞，培育出紫米水稻。对水稻中镉吸收相关基因进行敲除处理，进而可以减少对镉的吸收，进而可培育低镉水稻。 （3）基因工程改良水稻抗性。为提高对除草剂的抗性，先从基因数据库获得抗除草剂基因的序列，再利用基因编辑技术改变基因特定位点的核苷酸序列，使该基因表达产物的空间结构发生改变，这种设计和改造蛋白质的技术称为蛋白质工程。通过蛋白质工程可获得自然界不存在的蛋白质，编辑后的水稻可能与近缘杂草经杂交发生基因漂移，产生“超级杂草”，所以应对其进行风险评估，而后进行推广。 考向4 蛋白质工程 16．（2025·浙江·一模）科学家利用蛋白质工程研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，赖脯胰岛素经皮下注射后易吸收、起效快。下列相关叙述错误的是（　　） A．赖脯胰岛素在受体工程菌的核糖体上合成 B．通过蛋白质工程获取赖脯胰岛素的过程是④⑤⑥①②③ C．必须先合成天然胰岛素基因，再定点突变获得赖脯胰岛素基因 D．物质a是mRNA，物质b是多肽链，二者序列对应关系由密码子决定 【答案】C 【详解】A、赖脯胰岛素基因导入工程菌后，合成的场所确实在受体工程菌核糖体上，A正确； B、蛋白质工程的思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，即图中④⑤⑥①②③过程，B正确； C、利用蛋白质工程获得新蛋白基因，也可直接合成带有突变位点的DNA序列，C错误； D、物质a是mRNA，b是翻译形成的多肽链，二者序列对应关系由密码子决定，D正确。 故选C。 17．（2025·四川德阳·一模）“逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是（　　） A．生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B．从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C．氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D．该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 【答案】C 【详解】A、该模型依据“序列-结构”对应关系生成氨基酸序列，而非肽键结构或氨基酸数目。肽键是氨基酸间的基本连接方式，但模型的核心是学习序列与空间构象的关联，A错误； B、从蛋白质的三维结构推测氨基酸序列，AI模型依据的原理是结构与功能相适应的原理，与中心法则无关，B错误； C、氨基酸替换可能发生在非关键位点，若替换后氨基酸性质相似，蛋白质的空间构象和功能可保持不变，C正确； D、蛋白质工程需通过改造基因来实现蛋白质设计，该模型仅提供序列预测，最终仍需基因操作（如定点突变）表达目标蛋白，D错误。 故选C。 18．（25-26高三上·陕西西安·月考）水蛭素具有较好的抗凝血活性，临床上用来防治血栓。工业上常利用微生物发酵工程生产水蛭素，其中利用酵母菌和大肠杆菌生产的比较如表所示。下列叙述正确的是（　　） 微生物受体 酵母菌 大肠杆菌 生产特点 周期较长，目的基因转录和翻译正常但效率低，肽链折叠正确率较高 周期较短，目的基因转录和翻译正常且效率高，肽链折叠正确率较低 A．一般会用显微注射法将水蛭素相关基因导入酵母菌和大肠杆菌 B．水蛭素相关基因在酵母菌和大肠杆菌中表达时的场所完全不同 C．在构建基因表达载体时，可将酵母菌或大肠杆菌内的启动子与水蛭素相关基因连接 D．可直接对肽链的氨基酸序列进行改造，以提高蛋白质的品质，这属于蛋白质工程 【答案】C 【详解】A、显微注射法一般用于动物细胞（如受精卵），微生物常用转化法（大肠杆菌），A错误； B、基因表达都包括转录（细胞核/拟核）和翻译（细胞质核糖体），但酵母是真核生物（有细胞核，转录在核内），大肠杆菌是原核生物（转录翻译在细胞质且偶联），场所是有差异，但并非“完全不同”，比如翻译都在核糖体，B错误； C、为了使水蛭素基因在相应宿主中表达，需要使用该宿主细胞能识别的启动子。酵母用酵母启动子，大肠杆菌用细菌启动子，C正确； D、蛋白质工程改造的是基因，不是直接改造肽链，D错误。 故选C。 19．（25-26高三上·四川·开学考试）已知某水生动物体内存在一种酶X，由363个氨基酸构成。科学家利用蛋白质工程技术将X中的133位的苏氨酸变为丝氨酸，将254位的精氨酸变为甘氨酸，改变后的蛋白质X不仅仅具有原来X的催化功能还额外具有了转运蛋白的活性。下列相关说法正确的是（    ） A．蛋白质工程生产的蛋白质是自然界本来就存在 B．改造该酶的实质是要改造控制该酶合成的基因 C．可以利用PCR技术从该水生动物基因组中扩增出所需目的基因 D．蛋白质工程也可以对蛋白质直接进行改造，操作时不需要构建基因表达载体 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程通过改造基因生产自然界可能不存在的新蛋白质，A错误； B、蛋白质工程的实质是通过修改基因来改变蛋白质结构，因此改造酶的实质是改造控制该酶合成的基因，B正确； C、PCR扩增需以目标基因为模板，但原基因组中不含改造后的基因序列，无法直接扩增，需人工合成或修饰基因，C错误； D、蛋白质工程需通过基因改造间接实现，不能直接对蛋白质进行可遗传的改造，且必须构建基因表达载体，D错误。 故选B。 20．（2025·黑龙江大庆·模拟预测）t-PA蛋白能降解血栓，但其促进血栓溶解的特异性不高。经研究发现，若将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。 (1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是________，除上述方法外获得t-PA基因的途径还有________（答出1种即可）。 (2)以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为________。这种对现有蛋白质进行改造的过程必须通过________来实现。t-PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，图中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是_______。 (3)据图分析，需选用限制酶_________切开质粒pCLY11，才能保证质粒与t-PA改良基因高效连接。与单酶切相比双酶切的优点是________。 (4)将重组质粒转入受体细胞大肠杆菌前，一般先使其处于一种________状态。经过培养、筛选获得的转基因菌株在特定培养基中菌落颜色为_________。 【答案】(1) DNA半保留复制 人工合成（或从基因文库中获取） (2) 蛋白质工程 改造或合成基因 G (3) XmaⅠ和BglⅡ 防止运载体和目的基因的自身环化以及目的基因和质粒反向连接 (4) 能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 白色 【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR是体外合成DNA的技术，其原理是DNA半保留复制。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪（化学方法）直接人工合成，此外还可从基因文库中直接获取。 （2）天然的t-PA基因控制t-PA蛋白的合成，改良t-PA蛋白需要对天然的t-PA基因序列进行改造，然后用改造的基因作为目的基因让其表达，从而实现对天然蛋白质的改造，题中合成性能优异的改良t-PA蛋白的过程称为蛋白质工程。蛋白质工程中对现有蛋白质进行改造的过程必须通过改造或合成基因来实现。已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，根据碱基互补配对原则可推测，改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为AGA，故若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是G。 （3）目的基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割产生的黏性末端能与目的基因的黏性末端碱基互补，要想把目的基因与质粒pCLY11 （运载体） 拼接起来，需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割。这里用两种不同的限制酶切割质粒是为了使其呈现两种不同的黏性末端分别与目的基因的两个黏性末端连接，这样可以保证目的基因和质粒的正向连接（即防止目的基因和质粒反向连接），同时也可避免目的基因和质粒的自身环化。 （4）将重组质粒转入受体细胞大肠杆菌前，一般用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态状态。据图可知，目的基因转入的位置是在mlacZ基因内，而限制酶XmaⅠ和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，由于mlacZ基因被破坏，无法表达，因此转入重组载体的大肠杆菌在选择培养基上的菌落呈白色。 一、情境拓展·科技前沿（2024-2025热点聚焦） 1. 人工智能辅助基因编辑工具的精准设计突破 基因编辑技术的迭代升级始终是基因工程的核心热点，而人工智能与CRISPR-Cas系统的结合实现了突破性进展。2025年7月，《自然》杂志发表研究成果，科研团队通过大规模挖掘26太碱基的组装基因组和宏基因组，构建了包含100多万个CRISPR操纵子的数据集，利用大型语言模型训练设计出可编程基因编辑器，成功实现人类基因组的精准编辑。这类人工智能设计的编辑器，部分活性和特异性优于传统的SpCas9，且与天然序列差异达400个突变位点，其中Open CRISPR-1编辑器还可兼容碱基编辑，为基因编辑工具的定制化开发提供了全新路径，也打破了天然CRISPR系统的进化限制。 2. 个性化基因编辑治疗的临床里程碑突破 2024-2025年，基因治疗从罕见病向常见病跨越，个性化基因编辑治疗实现历史性突破。2025年5月，美国费城儿童医院与宾夕法尼亚大学医学团队，成功为一名6个月大的CPS1基因突变婴儿实施全球首例个性化CRISPR碱基编辑治疗，通过脂质纳米颗粒将定制编辑工具递送至肝脏，纠正缺陷酶，治疗后患者无严重副作用，蛋白质饮食耐受性显著增强，氮清除药物需求减少。此外，2024年底至2025年，多项针对性基因编辑疗法取得临床突破，包括治疗镰状细胞病的BEAM-101、治疗输血依赖性β地中海贫血的CS-101，均展现出优异的治疗效果，推动基因治疗从实验室走向规模化临床应用。 3. 新型基因编辑策略与递送系统的创新升级 2024-2025年间，基因编辑策略和递送技术的创新的突破，解决了传统技术的核心瓶颈。2025年11月，Broad研究所提出PERT新型基因编辑策略，利用先导编辑技术将人体内冗余的天然tRNA改造成抑制性tRNA，有望用单一治疗方案纠正多种无义突变引发的遗传病。同时，递送系统持续优化，优化后的脂质纳米颗粒配方可显著提高核糖核蛋白（RNPs）的递送效率，细胞穿透肽的应用进一步增强了递送效果，而“AAVLINK”策略则实现了超过11kb长致病基因的分段递送与精准重组，为肌肉疾病、癫痫等疾病的治疗提供了新方案。 4. 基因编辑与CAR-T细胞治疗的融合革新 作为基因工程与细胞治疗的交叉热点，CAR-T细胞治疗在2024-2025年借助基因编辑技术实现效能升级。传统CAR-T治疗存在T细胞耗竭、持久性不足、细胞因子毒性等问题，而CRISPR-Cas9、碱基编辑等技术的应用，可精准优化CAR-T细胞的基因序列，增强其肿瘤杀伤能力、降低毒性并延长体内存活时间。此外，基因编辑技术还助力解决CAR-T治疗的制造难题，推动自体CAR-T向通用型CAR-T发展，降低治疗成本，同时拓展其在实体肿瘤治疗中的应用，为癌症免疫治疗提供了更高效、更安全的新路径。 5. 基因治疗监管批准与产业化进程加速 2024-2025年，全球基因治疗领域监管批准迎来爆发期，标志着技术进入成熟商业化阶段。2025年11月，美国FDA批准诺华Itvisma基因替代疗法，用于治疗2岁及以上SMN1基因突变的脊髓性肌萎缩症患者，成为首个覆盖该广泛患者群体的疗法；同年12月，FDA批准针对Wiskott-Aldrich综合征的Waskyra基因疗法，填补了该疾病的治疗空白。中国在基因治疗领域同样表现突出，2024年有23家公司的基因疗法获得IND批准，复旦大学团队实现全球首个耳聋基因治疗临床试验成功，正序生物完成全球首个APOC3基因编辑治疗高血脂的临床案例，推动我国基因治疗产业跻身世界前沿。 二、新情境探究、结合教材分析以及长句作答 1．（结合教材）分析并回答下列问题： (1)基因工程中，构建基因表达载体时，将目的基因插入Ti质粒的T-DNA区域的原因是_Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，从而使目的基因稳定存在并表达。 (2)PCR技术扩增目的基因时，需要加入引物的原因是DNA聚合酶不能从头合成DNA链，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，引物可与模板DNA结合，为DNA聚合酶提供延伸起点。 (3)基因工程中，目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，而导入动物细胞常用显微注射法，原因是农杆菌易感染植物细胞，可通过其Ti质粒的T-DNA将目的基因转移到植物细胞中；动物细胞结构复杂，显微注射法可精准将目的基因导入动物细胞的细胞核中，提高导入效率。 2．（长句作答类）基因编辑技术（CRISPR/Cas9）可精准编辑生物体内的特定基因，其核心组件包括Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA），gRNA可特异性结合靶基因序列，引导Cas9切割靶基因，进而实现基因的敲除、插入等修饰。回答下列问题： (1)Cas9核酸酶的作用是切割靶基因的特定脱氧核苷酸序列（切割磷酸二酯键），判断的依据是CRISPR/Cas9技术可精准编辑特定基因，gRNA特异性结合靶基因后，Cas9可对靶基因进行切割，从而实现基因修饰。 (2)gRNA能特异性结合靶基因的原因是_gRNA的核苷酸序列与靶基因的特定序列互补配对_，这一过程遵循碱基互补配对原则（A与U配对、G与C配对）。 3、（长句作答）分析并回答下列问题： (1)基因工程中，目的基因成功导入受体细胞后，还需要进行目的基因的检测与鉴定，其中检测目的基因是否转录出mRNA的方法是分子杂交技术，用标记的目的基因作探针，与受体细胞的mRNA进行杂交，若出现杂交带，则说明目的基因已转录出mRNA。 (2)基因表达载体中，启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动目的基因转录出mRNA。 (3)将目的基因导入微生物细胞时，常用Ca²⁺处理微生物细胞，使细胞处于感受态，其目的是_使微生物细胞膜的通透性改变，便于目的基因进入细胞 ；若目的基因导入后未表达，可能的原因是启动子序列异常，导致RNA聚合酶无法结合，或目的基因插入位置不当，或受体细胞内缺少目的基因表达所需的酶、原料等。 4．（新情境）科学家利用基因工程技术培育抗虫转基因棉花，其核心过程是将Bt毒蛋白基因（可控制合成Bt毒蛋白，对棉铃虫等害虫有毒性）导入棉花细胞，培育出抗虫棉品系。研究人员对转基因棉花和普通棉花的抗虫性进行检测，结果如下表所示（虫食率越低，抗虫性越强）： 棉花品系 虫食率（%） Bt毒蛋白含量（μg/g） 普通棉花 38.6 0 转基因棉花品系A 4.2 12.7 转基因棉花品系B 8.9 7.3 回答下列问题： (1)构建含Bt毒蛋白基因的基因表达载体时，除了目的基因和Ti质粒外，还需要加入的组件有启动子、终止子、标记基因。 (2)转基因棉花品系A的抗虫性强于品系B的原因是品系A的Bt毒蛋白含量高于品系B，Bt毒蛋白对棉铃虫有毒性，含量越高，对害虫的抑制作用越强，虫食率越低，抗虫性越强。 (3)若要进一步提高转基因棉花的抗虫性，可采取的措施有优化基因表达载体，提高Bt毒蛋白基因的表达水平；导入多种抗虫基因，增强抗虫范围和效果。（答出两点） 1．（2025·陕西西安·一模）科研人员将增强型启动子连接在水稻高产基因(Os)基因上游，构建超表达载体，并将其导入水稻中，研究该基因表达对产量的影响。下图为利用农杆菌转化法获得Os基因超表达水稻的过程。 (1)农杆菌转化愈伤组织时，用含___________的选择培养基筛选，通过组织培养技术获得Os基因过表达水稻。过程Ⅰ用的酶为___________，该过程需要的原料为___________。 (2)利用双酶切法将Os基因插入质粒，若在基因上游加入SpeI的酶切位点，下游应加入___________的酶切位点。扩增该基因所需的引物F和R应选用下列引物组合为___________。 ①5′-…CTTGGATGAT-3′    ②5′-…TAAGTTGTCT-3′ ③5′-…ATTCAACAGA-3′    ④5′-…TCTGTTGAAT-3′ (3)科研人员将Os基因过表达水稻(①组)、OS基因敲除水稻(②组)以及野生型(③组)三组水稻进行一系列实验，定期测量相关数据，记录于下表： 组别 N吸收、运输和利用率 光合速率 产量 ① +++ +++ ++++++ ② + + + ③ ++ ++ +++ 注：“+”的数目代表程度或数量变化。 为研究Os基因对N吸收、运输和利用率的影响，将三组幼苗进行低氮培养。实验前三组幼苗均需进行氮饥饿处理，其目的是___________。据表中数据，Os基因表达量与植株N的吸收、运输呈___________(填“正”或“负”)相关，这些N为水稻的暗反应所需___________(至少填三种物质)的合成提供原料。 【答案】(1) 潮霉素 逆转录酶(或反转录酶) 四种脱氧核苷酸 (2) EcoRI ①④ (3) 为了消耗水稻自身的氮元素，排除对实验结果的干扰 正 NADPH、ATP、酶(其他合理答案即可) 【分析】基因工程的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）据图分析，重组质粒中潮霉素抗性基因位于T-DNA区域，可作为筛选标记，农杆菌转化愈伤组织时，若目的基因导入受体细胞，则潮霉素抗性基因表达，故需用含潮霉素的选择培养基筛选转化细胞。过程Ⅰ为逆转录，用的酶为逆转录酶(或反转录酶)，需要的原料为四种脱氧核苷酸。 （2）利用双酶切法将Os基因插入质粒，由于目的基因必须添加在T-DNA区段，并且位于启动子和终止子之间，不能用HindⅢ切，因为下游添加相应限制酶切位点后，会把潮霉素抗性基因切掉。若在基因上游加入SpeI的酶切位点，下游加入XbaⅠ酶切位点，则无法保证获得的Os基因与载体正确连接形成重组质粒，因此下游应加入EcoRI酶切位点，才能保证Os基因与载体正确连接。由于Os基因序列为3'-AGACAACTTA……TAGTAGGTTC-5'，所以根据碱基互补配对原则，扩增引物组合应为：①5′-…CTTGGATGAT-3′ ；④5′-…TCTGTTGAAT-3′，故选①④。 （3）为研究Os基因对N吸收、运输和利用率的影响，将三组幼苗进行低氮培养。实验前三组幼苗均需进行氮饥饿处理，其目的是氮饥饿处理可消耗幼苗体内原有氮元素，避免对实验结果的干扰。据表分析，Os基因过表达水稻(①组)的N吸收、运输和利用率最大，而Os基因敲除水稻(②组)最小，所以Os基因表达量与N吸收、运输呈正相关。这些N元素可用于合成暗反应所需的NADPH、ATP、酶。 2．（2025·江苏南京·二模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在_________酶的作用下先合cDNA。选择cDNA而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是_________。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是________。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是_______，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加_________限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有_______（答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品________最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是______。 (4)将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为________，检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为________。天然的干扰素在体外保存相当困难，为了生产出耐储存干扰素，科学家可通过蛋白质工程对干扰素进行改造，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→_________→_________→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。 【答案】(1) 逆转录 受体细胞大肠杆菌无法对转录产生的mRNA进行加工（大肠杆菌无法切除内含子的转录序列） 引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成 (2) ②④ EcoRI、XhoI 模板；4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液 (3) 2 EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段 (4) 用Ca2+处理 抗原-抗体杂交 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要经过RNA变成相应的DNA逆转录过程，需要逆转录酶的作用下先合cDNA。选择cDNA（不含内含子）而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是：受体细胞大肠杆菌无法对转录产生的mRNA进行加工（大肠杆菌无法切除内含子的转录序列）。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，指导新生的多肽链和核糖体与内质网膜结合，使蛋白质的合成和加工在粗面内质网上进行，所以其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成。 （2）为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是②④，其他引物会导致含信号肽序列的干扰素基因的合成；为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上，需要在目的基因两端添加可以与质粒酶切位点互补的限制酶识别序列，结合图2可知，Hind Ⅲ会破坏启动子、Pst I会破坏终止子、Sau 3A I也会破坏启动子（Hind Ⅲ的识别序列中含有Sau 3A I的识别序列），因此，为了保证目的基因的正向连接及防止目的基因及质粒自连，通常需要选择两种酶，因此需要在目的基因的两端添加EcoRI、XhoI限制酶的序列；PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有相应的模板，原料是4种游离的脱氧核苷酸（dNTP），耐高温的DNA聚合酶，含Mg2+缓冲液。 （3） 为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，因为一个切割位点只会将环状的质粒切割成一条线性的DNA，有两个切割位点才能切成2条片段，根据题图分析EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp（486bp）和5800bp的两个片段，所以样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 （4） 将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为用Ca2+处理，使大肠杆菌处于感受态，增大细胞膜的通透性；检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为抗原-抗体杂交；蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。 3．（2025·湖北襄阳·三模）阅读材料，完成下列要求。 M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： (1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是____，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的____断开。 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_______。 (3)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的____淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_____。 【答案】(1) 限制性内切核酸酶 磷酸二酯键 (2)及时清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 (3) B 取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 【分析】1、核移植与胚胎干细胞：体细胞核移植成功率低于胚胎细胞核移植，因体细胞分化程度高，全能性难以恢复。胚胎干细胞由早期胚胎或原始性腺分离，形态上细胞体积小、细胞核大、核仁明显，功能上具有发育的全能性； 2、单克隆抗体制备与应用：用免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体，利用抗原—抗体特异性结合原理，通过抗原—抗体杂交鉴定转基因动物中基因是否表达。 【详解】（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性内切核酸酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性内切核酸酶（限制酶）。限制性内切核酸酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是及时清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养。 （3）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。 4．（2025·山东淄博·三模）荧光素酶互补实验可用于研究两种蛋白质的相互作用。荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光。科研人员利用该技术探究植物中的ERF114蛋白能否与MYB8蛋白相互作用，过程如下图。 (1)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两末端有至少15bp的相同序列，这些相同序列通过设计引物、经PCR获得。图1中为保证基因正向连接在质粒上，PCR的引物中应有______种相同的15bp序列，这些序列应构建在相应引物的______（填“5′端”“3′端”）。 (2)以构建重组载体ERF114-Nluc为例，将PCR获得的ERF114、NLuc及线性化质粒混合并加入三种酶，50℃条件下共同孵育1h可完成连接，原理见图2。图中过程③和过程④分别加入的酶是______、______。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术的优点是______（答出1点即可）。 (3)将构建正确的ERF114-Nluc、MYB8-CLuc、NLuc、CLuc、T-NLuc及p53-CLuc等6种重组载体分别导入农杆菌，将不同农杆菌组合注射到烟草叶片中，24h后将荧光素底物喷洒到叶片上，结果如图3。若ERF114能与MYB8相互作用，则______（填图中数字）区域会发出荧光。该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是______。 【答案】(1) 3/三 5′端 (2) （耐高温的）DNA聚合酶 DNA连接酶 无需限制酶（避免酶切位点的引入）；仅需一次反应就可实现多个基因与载体的连接 (3) 1、2 NLuc+CLuc 【分析】PCR技术： (1) 概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 (2) 原理：DNA双链复制。 (3) 前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一-对引物。 (4) 条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 (5) 过程：高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开) ；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。 【详解】（1）为保证线性化质粒和ERF114及NLuc连接在一起，则需要引物②和引物⑤的15bp序列相同，引物①和引物③的15bp序列相同，引物④和引物⑥的15bp序列相同，且保证基因正向连接在质粒上，说明三种序列不同，即PCR的引物中应有3种相同的15bp序列。PCR子链延伸时，游离的脱氧核苷酸添加到引物的3′端，故这些序列应构建在相应引物的5′端。 （2）由图可知，过程③是PCR延伸子链，需要（耐高温的）DNA聚合酶，过程④将DNA片段拼接到一起，需要DNA连接酶。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术无需限制酶（避免酶切位点的引入）；仅需一次反应就可实现多个基因与载体的连接。 （3）由题干信息“荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光”可知，1、2区域载体的蛋白质基因两侧含有N端（NLuc）和C端（CLuc）相关基因，可产生NLuc和CLuc，发挥荧光素酶活性，故1、2区域会发出荧光。根据单一变量原则，该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是NLuc+CLuc。 5．（2025·江西九江·三模）黄瓜花叶病毒是寄主范围最多的植物病毒之一，对多种重要经济作物的生存造成威胁。研究发现，由该病毒C基因表达出的C蛋白是病毒合成和释放的关键成分，将C基因敲除后，单株烟草病毒侵染性大大降低。为提高烟草等经济作物产量，科研人员利用PCR技术大量扩增出C基因，并将C基因导入Ti质粒中，通过农杆菌转化法获得能表达C基因反义RNA（能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链）的转基因抗病毒烟草。回答以下问题。 注：图1中a~e表示不同的引物；图2为Ti质粒，T-DNA的左、右边界见图，其中EcoRI和XhoI是两种限制酶且切割后形成的黏性末端不互补。 (1)一般来说，设计的引物序列越短，其特异性越_________（填“强”或“弱”）。据图可知扩增完整的C基因，应选择图1中的引物_________。若任意使用图1中涉及的所有引物，通过PCR技术可扩增出_________种等长的DNA片段。 (2)该实验利用反义RNA介导基因沉默，主要抑制病毒C基因表达中的_________过程。结合图2，为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，应在左侧引物的5’端设计添加_________酶切位点。 (3)重组质粒构建完成后需进行琼脂糖凝胶电泳实验验证，为保证电泳结果的准确性，对该环状质粒电泳时需分为无酶切组和单酶切组，结果发现无酶切组的电泳速率慢于酶切组，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其_______有关。 (4)为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，还需进行个体水平检测，请简述实验思路________。 【答案】(1) 弱 c、d 4 (2) 翻译 EcoRI (3)大小与构象 (4)用等量且适量的病毒分别接种（或感染）长势相同的野生型烟草和转基因抗病毒烟草，适宜且相同条件下培养一段时间后，观察并比较二者的生长状况 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导人其中； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测有①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）一般来说，设计的引物序列越长，其特异性越强；引物越短，特异性越弱。人工合成如图1所示的DNA片段，为了扩增C基因，扩增时子链的延伸必须从引物的5‘’到3′端，且引物与模板链方向相反，因此该过程中利用的引物组合为引物c和d进行PCR扩增。图1中有a、b、c、d、e三种引物，若任意使用这些引物，可形成10种组合，其中aa、bb、cc、dd扩增出的DNA片段等长（因为它们分别是从同一端开始扩增相同的模板区域），所以通过PCR技术可扩增出4种等长的DNA片段。 （2）反义RNA能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链，从而阻止mRNA与核糖体结合，抑制了翻译过程。为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，根据图2中T-DNA的左、右边界以及EcoRI和XhoI两种限制酶的位置，且EcoRI和XhoI切割后形成的黏性末端不互补，为了使C基因正确插入T-DNA中，应在左侧引物的5'端设计添加EcoRI酶切位点。 （3）无酶切组的环状质粒和酶切组的线性化质粒相比，无酶切组的电泳速率慢于酶切组，这是因为环状质粒和线性化质粒的大小和构象不同，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其大小和构象有关。 （4）为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，进行个体水平检测的实验思路为：分别用等量且适量的病毒分别接种（或感染）长势相同的野生型烟草和转基因抗病毒烟草，适宜且相同条件下培养一段时间后，观察并比较二者的生长状况。 学科网(北京)股份有限公司1 学科网(北京)股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $