第10单元 第51讲 基因工程的基本工具和基本操作程序(课件PPT)-【精讲精练】2026年高考生物一轮复习（人教版 单选）

第十单元　生物技术与工程 第51讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 目 录 核心考点突破 01 高考真题演练 02 知能达标训练 03 CONTENTS 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 01 核心考点突破 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 × √ × √ 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 改变受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 结构和功能 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 花粉管通道法 Ca2＋ 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 PCR、分子杂交 抗原—抗体杂交 抗性实验 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 √ √ × × √ √ 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 √ × × × 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 甲 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 02 高考真题演练 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 03 知能达标训练 点击进入Word 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 谢谢观看 返回目录 高考总复习·生物学 1 第十单元　生物技术与工程 [课标要求]　1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.实验：DNA的粗提取与鉴定和利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定。 考点一　重组DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 二、基因工程的基本工具 1．限制性内切核酸酶 2．DNA连接酶 3．载体 1．限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。( ) 2．限制酶在识别序列中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。( ) 3．基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。( ) 4．质粒上标记基因的存在，是便于重组DNA分子的筛选。( ) 1．(选择性必修3 P71“旁栏思考”)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 2．(选择性必修3 P77“正文”)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示　DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 3．(选择性必修3 P80“正文”)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？ 提示　选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。 4．(选择性必修3 P81“资料卡”)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？ 提示　Ti质粒上的T－DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。 考向一　基因工程的基本工具 1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 解析　限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 答案　B 限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 考向二　基因工程所需载体的作用及特点 2．(2024·南昌模拟)研究人员通过PCR扩增质粒pDNR－LIB中的sacB基因，该基因的产物对蔗糖敏感，是一种常见的反选择标记基因。TetA是四环素抗性基因，利用基因工程将sacB基因插入到质粒pAH162上，构建含有TetA－sacB双重选择系统的重组质粒，即pAH162－sacB，具体过程如下图所示。将pAH162－sacB导入大肠杆菌验证其双重选择作用。下列分析错误的是(　　) A．将sacB基因插入到pAH162上需要用到的酶有BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA连接酶 B．大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功 C．为保证正向连接，进行PCR前，应在sacB基因上游引物添加BamHⅠ识别序列 D．需用Ca2＋处理大肠杆菌细胞使其处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态 解析　根据图示信息，将sacB基因插入到pAH162上需要利用BamHⅠ、EcoRⅠ将质粒切割，利用DNA连接酶将质粒和目的基因连接，A正确；具有双重选择系统的大肠杆菌应同时满足在含四环素的培养基中生长，在含蔗糖的培养基中不生长的条件，而不是仅仅能在含四环素的培养基中生长，B错误；根据图示箭头方向，箭头位置是目的基因的上游，为保证正向连接，PCR前应在sacB基因上游引物添加BamHⅠ识别序列，C正确；导入重组质粒前，需用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，使重组质粒容易进入受体细胞，D正确。 答案　B 3．大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是(　　) A．试管1中应加入限制酶和DNA连接酶 B．试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌 C．能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色 D．试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养 解析　分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于感受态，B正确；能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。 答案　B 目的基因的检测与鉴定方法 (1)载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素，就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示： (2)使用目的基因作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的载体上是否含目的基因。 (3)使用目的基因作探针，运用分子杂交技术检测目的基因是否转录出特定mRNA。 (4)采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 (5)采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的鉴定。　 考点二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于____________________或获得_______________等的基因。主要是指_____________的基因。 (2)筛选目的基因的方法 ①从相关的已知_____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 2．基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的目的 使目的基因_____________________________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成 (3)基因表达载体的构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、_______________ 显微注射法 _____处理法 受体细胞 体细胞或受精卵　 受精卵 原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 ______________等技术 目的基因是否转录出了mRNA 是否合成出与目的基因相对应的蛋白质 __________________ 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 __________ 1．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。( ) 2．构建基因表达载体是基因工程的核心工作。( ) 3．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动DNA的复制过程。( ) 4．将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中，就可获得具有理想性状的转基因植物。( ) 5．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。( ) 6．Ti质粒上的T－DNA可携带目的基因进入宿主细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。( ) 1．(选择性必修3 P81“资料卡”)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将目的基因导入受体细胞并整合到染色体的DNA上，为什么？ 提示　农杆菌能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 2．(选择性必修3 P80“正文”)不能将目的基因插入载体的标记基因中，为什么？ 提示　标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。 3．(选择性必修3 P80“图3－6”)在构建质粒载体时，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的识别序列，为什么？ 提示　不能，因为目的基因的序列中若含有用到的限制酶的识别序列，目的基因可能会被切断。 4．(教材拓展)利用大肠杆菌可生产出人的胰岛素，联系前面各种细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，请分析若要生产人的胰岛素，可用大肠杆菌吗？ 提示　不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。 考向　基因工程的基本操作程序 (2024·1月九省联考甘肃卷)胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是(　　) A．用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步 B．构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 C．大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体 D．抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞 解析　用PCR技术扩增人胰岛素基因时，扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解旋为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3′－端，如此重复循环多次。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步，A正确；在构建人胰岛素基因表达载体时，首先用一定的限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子，B正确；大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰 岛素基因表达载体，C正确；抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成胰岛素，若抗原—抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。 答案　D 考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 (2)实验步骤 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定 1．DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度大。( ) 2．可用滤纸过滤洋葱研磨液以除去其中的杂质。( ) 3．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。( ) 4．进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存。( ) 1．(选择性必修3 P74、P84“探究·实践”) (1)DNA的粗提取实验中的过滤能否用滤纸代替纱布？为什么？ 提示　不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 (2)实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 提示　研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。 (2)若操作者进行电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 提示　操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或含有其他DNA片段，以此为模板，进行了扩增。 (3)实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？ 提示　搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。 2．(选择性必修3 P74、P84“探究·实践”) (1)DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？ 提示　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。 考向一　DNA的粗提取与鉴定 1．(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 解析　研磨后，可以将研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，可以不使用离心机，A正确，B错误；鉴定过程中的沸水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误；该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加DNA的对照组，D错误。 答案　A 2．(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 解析　研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 答案　D 考向二　DNA片段的扩增与电泳鉴定 3．(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 解析　应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段(带负电)越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 答案　A 4．(2024·重庆模拟)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(　　) 乙 A．引物不可重复利用，PCR第四次循环时需要消耗15对引物 B．据图乙可知，进行电泳时，琼脂糖凝胶的加样孔在B端 C．据图乙可知，2号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D．换用引物1和引物3进行PCR，能更好区分杂合子和纯合子 解析　引物不可重复利用，PCR四次循环共需要消耗24－1＝15对引物，PCR第四次循环时需要消耗24－23＝8对引物，A错误；相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，据图乙可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，B错误；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C正确；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子都能扩增出相应的片段则不能区分杂合子和纯合子，D错误。 答案　C 1．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析　若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 答案　D 2．(2023·重庆卷)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　) A．实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 解析　根据扩增所得的DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接，D正确。 答案　B 3．(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 解析　裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 答案　D 4．(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 解析　低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 答案　B 5．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J­V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 注：F1、F2、R1、R2表示引物 甲 乙 (1)与图甲中启动子结合的酶是______________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有__________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物______________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析　(1)基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据 图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，在引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J­V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 答案　(1)RNA聚合酶　 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等(合理即可) (2)F2和R1(或F1与R2)　a链 (3)J­V5融合蛋白　不是 $$