第三章 基因工程（知识清单）生物苏教版选择性必修3

该高中生物学基因工程知识清单系统梳理了基因工程工具、PCR技术、操作程序、应用及蛋白质工程等核心内容，通过可视化思维导图建立知识框架，以重难考点总结和易错提醒为学习支架，覆盖9个考点及10余个易错点。 清单采用星级标注分级呈现知识（如基因工程操作程序★★★★★），设计DNA酶对比表、PCR与体内复制差异分析等关联内容，结合实验步骤（如DNA粗提取）和热点问题预测，培养科学思维与探究实践能力，教师可据此精准教学，学生能高效自主复习。

第三章 基因工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、陷阱规避 第1节 基因工程及其技术（4个考点+7个易错提醒） 考点1 基因工程是在多学科基础上发展而来的 ★★☆☆☆ 考点2 基因工程的基本工具★★★★☆ 考点3 聚合酶链式反应（PCR）技术★★★★☆ 考点4 基因工程的基本操作程序★★★★★ 第2节 基因工程的应用价值（3个考点+1个易错提醒） 考点1 基因工程在农牧业中的应用价值★★☆☆☆ 考点2 基因工程在食品业中的应用价值★★☆☆☆ 考点3 基因工程在医药业中的应用价值★★☆☆☆ 第3节 蛋白质工程（2个考点+1个易错提醒） 考点1 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 考点2 蛋白质工程的设计思路与应用★★★☆☆ 素养加油站：热点问题分析、聚焦考点预测 方法储备库：高频考点，方法归纳 第1节 基因工程及其技术 考点1 基因工程是在多学科基础上发展而来的★★☆☆☆ 知识1　基因工程的诞生和发展 1.基因工程的诞生和发展 考点2 基因工程的基本工具★★★★☆ 知识1　基因工程的概念 1.概念：基因工程又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 知识2　基因工程的基本工具 1.“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(又称限制酶) （1）作用及特点——特点：特异性(专一性)很强；作用：能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 （2）切割方式——错位切：在DNA分子两条链的不同部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的单链，这种单链称为黏性末端；平切：在DNA分子两条链上相同的部位进行切割，切割后形成平末端。 2.“分子黏合剂”——DNA连接酶 （1）两个具有黏性末端的DNA分子的连接：通过碱基互补配对可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来；DNA分子基本骨架之间的磷酸二酯键通过DNA连接酶的作用连接。 （2）DNA连接酶的分布及作用——分布：广泛存在于各种生物体内；作用：在DNA复制、修复以及体内外重组过程中起着重要作用。 （3）种类： 种类 来源 作用 E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 可以用于连接具有黏性末端的DNA分子 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 可以用于连接具有黏性末端或平末端的DNA分子 3. “分子搬运工”——载体 （1）概念：将外源基因导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定遗传和表达，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。 （2）种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。 ①常用载体——质粒。 a.化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状DNA分子。 b.质粒作为载体所具备的条件及原因 序列 原因 复制原点 使外源基因在受体细胞中稳定复制和遗传 标记基因 用于鉴定和选择重组DNA分子 多种限制酶的切割位点 便于外源基因的插入 【易错提醒】 (1)回文序列：限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。 (2)同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶。其特点是 ①识别的序列不同，但可以切割出相同的黏性末端，且切割出的黏性末端可以相互配对； ②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下不能再被原来的限制酶识别。 如图： BamHⅠ和BglⅡ识别序列不同，黏性末端均为GATC，因此二者为同尾酶。 （3）与DNA相关的几种酶的比较 比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解 旋为单链 考点3 聚合酶链式反应（PCR）技术★★★★☆ 知识1　聚合酶链式反应 1. 聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。 2．原理：DNA半保留复制。 3．操作步骤：在向PCR管中加入一定量的模板DNA、引物对、4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2＋等后，设置好反应程序，启动PCR仪，自动完成反应步骤。 4．反应程序 (1)变性：在约94_℃高温下，作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。 (2)退火：反应体系的温度降至约55_℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 (3)延伸：反应体系的温度回升到约72_℃(Taq酶催化作用的最适反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。 (4)完成上述第一次循环后，PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。 5．应用 (1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 (2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 【易错提醒】 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、退火和延伸都在最适的条件下进行。 (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。 (4)PCR需要热稳定的DNA聚合酶、4种dNTP和模板DNA之外，还需要引物等基本条件,不需要解旋酶。 (5)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板。 (6)如果循环n次，则共需要消耗2n－1对引物。 (7)要保证目的基因能与载体相连接，还要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 (8)PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 知识2　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 1. 实验目的——尝试运用PCR仪扩增DNA片段；关注PCR技术的应用；学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。 2. 实验原理： (1)扩增DNA片段的过程包括变性、退火和延伸等步骤的多次循环。 (2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的2n倍。 (3)PCR反应体系包括：DNA模板、反应缓冲液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物对、Taq酶等。 (4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的不同温度。 (5)PCR和体内DNA复制的差异 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 场所 试管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3′端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶(Taq酶) 多种酶 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 3 .实验器材和试剂 (1)仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器(微量恒温仪)等。 (2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。 4. 实验步骤 (1)PCR扩增目的基因 ①配制反应体系。 ②按程序进行扩增。 a.94 ℃预变性5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃退火1 min→d.72 ℃延伸2 min→e.重复b～d,30个循环→f.72 ℃延伸7～10 min。 (2)电泳分析：电泳维持恒压80_V 1.5～2 h；电泳鉴定：采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果。 5. 结果和分析：略。 【易错提醒】 (1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。 (2)凝胶中影响DNA分子迁移速率的因素：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在利用PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。 (3)PCR循环之前，通常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 (4)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性，增加大分子模板DNA彻底变性的概率，同时激活Taq酶。 (5)在电泳鉴定中，可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 考点4 基因工程的基本操作程序★★★★★ 知识1　基因工程的基本操作程序 1. 基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，以及目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 (1)目的基因的获取 ①通过化学合成法直接人工合成目的基因 DNA合成仪直接人工合成（全合成法）——适用条件：目的基因比较小，且脱氧核苷酸序列明确， 半合成法——适用条件：较大基因，可降低成本； 合成过程为： ②通过基因文库获取目的基因 a.基因组文库 b.cDNA文库 ③获得基因组DNA或mRNA的基本过程:裂解细胞使核酸分子释放出来；从释放出来的细胞成分中分离核酸分子；纯化获得核酸分子。 ④质粒DNA的提取：先用碱裂解法获取质粒，再提取质粒DNA。 ⑤纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在理化性质方面的差异。 (2)基因表达载体的构建【易错提醒】 (1)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶。 (2)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因可以转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。 (3)基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用(如启动子和终止子)，不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。 (4)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。 (5)将从基因组文库中获取的人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞，不能成功表达，因为从基因组文库中获取的人胰岛素基因含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，细胞内缺乏剪切内含子转录片段的系统，不能形成成熟的mRNA。 目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。 基因表达载体的组成：目的基因、复制原点、启动子、终止子、和标记基因等。 复制原点：能与特定的受体细胞相匹配，使外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传；启动子是位于目的基因上游的一段DNA序列，也是RNA聚合酶识别、结合的部位，RNA聚合酶与启动子的结合能驱动基因开始转录，进而合成出相应的mRNA；终止子是位于目的基因下游的一段DNA片段，是终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列；标记基因的作用是初步筛选出接受了目的基因的受体细胞；常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）或某些生化标记基因。 【易错提醒】 (1)载体的种类——按功能分类：克隆载体和表达载体两类。克隆载体是最基本的载体。可以在宿主细胞中通过克隆获取目的基因。表达载体：带有基因表达所需要的各种调控元件，使外源基因（目的基因）能在宿主细胞中表达。有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。 (2)启动子、终止子和起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别并结合的位点，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 (3)将目的基因导入受体细胞 ①将目的基因导入植物细胞 主要方法：农杆菌转化法。 农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物；当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动； 特点：农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA(T－DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上； 原理：将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达。 ②将目的基因导入哺乳动物细胞 主要方法：显微注射法；其他方法：用病毒DNA与目的基因构建载体，再去感染受体动物细胞，使目的基因导入动物细胞内。 转基因动物的制备过程：使母畜在预先确定的时间排卵并受精→收集受精卵→在显微镜下用口径为1 μm的玻璃微管向受精卵注射含500～600个拷贝的目的基因的载体→把这些受精卵移植到处于相同发情周期的母畜子宫内→转基因动物 ③将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞：经过适当处理(如用Ca2＋处理)后，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。 过程：Ca2＋处理细胞―→感受态细胞―→感受态细胞和重组的基因表达载体混合转化后的细胞带有目的基因的微生物。 (4)目的基因及其表达产物的检测鉴定 ①检测与鉴定的原因：基因导入受体细胞后，能否有效地表达目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。 ②分子水平的检测 a.从DNA方面进行检测——检测方法：DNA分子杂交法；检测原理：具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照碱基互补配对原则形成双链。基因探针：用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。结果分析：若待测DNA中有能与基因探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已经插入转基因生物的DNA分子中。 检测过程 b.从RNA方面进行检测——检测目的：检测目的基因是否能发挥其功能，即是否转录出相应的mRNA分子。 检测方法：分子杂交技术；检测过程：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交，如果有杂交带出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。 c.从蛋白质方面进行检测——检测方法：抗原—抗体杂交法；检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交；结果分析：如果有杂交带出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。 d.个体水平的检测——检测目的：对生物的某些特定性状进行鉴定；实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与天然产品比较，确定其是否具有了抗冻性状。 【易错提醒】 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时常以体细胞作为受体细胞。在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是受精卵具有全能性，若用体细胞作受体细胞，可利用核移植技术得到转基因个体。 (2)将目的基因导入动物细胞的方法主要是显微注射法，微生物细胞经Ca2＋处理，其细胞质膜对DNA的通透性发生改变，目的是使细胞处于一种容易接受外来DNA分子的生理状态。 (3)农杆菌转化法中两次拼接、两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 (4)常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 (5)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的DNA单链；检测目的基因是否成功表达需用和抗原—抗体杂交法，不遵循碱基互补配对原则。 (6)通过基因工程产生的变异属于基因重组，是定向的；基因工程是否成功需从个体生物学水平对生物的性状进行鉴定。 知识2　DNA的粗提取和鉴定 1.DNA的粗提取 (1)原理:利用DNA与RNA、蛋白质等物质在理化性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 (2)步骤 2.DNA的鉴定 原理：在酸性条件下，DNA与二苯胺发生反应，溶液呈蓝色。 步骤：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2(mol·L-1)的NaCl溶液中，使其溶解， 再加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色。 【易错提醒】 (1)DNA的粗提取一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需要先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和各种细胞器，无DNA分子。 (2)在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的目的不相同，第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。 (3)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。 实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是使DNA充分溶解。当NaCl的浓度低于2mol·L－1时，DNA的溶解度下降，从溶液中析出。 (4)向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。 (5)DNA溶液中加入二苯胺试剂后需沸水浴加热数分钟后出现蓝色。 第2节 基因工程的应用价值 考点1 基因工程在农牧业中的应用价值★★☆☆☆ 知识1　基因工程在农牧业中的应用价值 1. 转基因生物：利用基因工程技术培育的、能稳定遗传外源基因所决定的性状的生物称为转基因生物。 2. 植物基因工程硕果累累 (1)转基因抗病植物的生产带来效益：科学家将番木瓜环斑病毒毒株中的复制酶基因转入番木瓜细胞内，培育出具有很强抗病性能的转基因品系——“华农1号”；科学家将病毒的复制酶基因和衣壳蛋白基因以及几丁质酶基因、植物抗病毒基因导入小麦、甜椒或番茄等作物，获得了抗病的小麦、甜椒或番茄等新品种。 (2)转基因抗虫植物已广泛投入生产：科学家已将从苏云金杆菌中分离出来的编码苏云金杆菌Bt毒蛋白的基因导入棉细胞，培育出了转基因抗虫棉；转基因抗虫水稻、玉米、大豆等品种也培育成功。 (3)转基因抗逆植物的培育带来新希望：科学家已经成功地将抗冻蛋白基因转入番茄细胞，培育出转基因抗冻番茄；科学家已经成功地向某些作物转入一些可以调节细胞渗透压的基因来提高作物的抗盐碱和抗干旱的能力。 3. 动物基因工程显示出诱人的应用前景 (1)改善畜牧产品的品质：利用ω－3脂肪酸去饱和酶基因；培育成可产生较多ω－3脂肪酸的转基因猪。 (2)提高动物的生长速度：利用外源生长激素基因培育转基因绵羊和转基因三文鱼。 4. 运用基因工程改良动植物品种的优点：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。 考点2 基因工程在食品业中的应用价值★★☆☆☆ 知识1　基因工程在食品业中的应用价值 1.植物品质改良主要包括植物蛋白质、糖类、脂肪品质的改良以及维生素种类和含量的改良等方面。 2.基因工程在氨基酸、助鲜剂、甜味剂等食品添加剂的生产，以及广泛应用于食品制造业的淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶的大规模生产方面也大显身手。 考点3 基因工程在医药业中的应用价值★★☆☆☆ 知识1　基因工程在医药业中的应用价值 1.基因工程药物 (1)利用转基因工程菌生产药物。 (2)利用生物反应器生产药物——生物反应器的种类：乳腺生物反应器、膀胱生物反应器、输卵管生物反应器等；乳腺生物反应器的构建：将药用蛋白基因、乳腺蛋白基因的启动子重组后、导入受精卵,发育为早期胚胎后移植到母体内发育成转基因动物，利用分泌的乳汁生产所需的药物。 2.基因治疗：是指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法，包括基因诊断、基因分离、载体构建、目的基因导入等多项技术。基因治疗有体内和体外两种途径。体内途径是将分离出来的带有治疗作用的基因通过载体转入患者体内的某些细胞，直接纠正或弥补缺陷基因的功能；体外途径则是采用转基因技术将带有治疗作用的基因导入病毒基因组，再用病毒感染受体细胞，治疗基因整合到受体基因组后，受体细胞经体外培养、增殖后导入患者体内。 【易错提醒】 (1)转基因生物的获取过程中，不是直接将目的基因导入相应的受体细胞，需构建基因表达载体后再导入相应的受体细胞。运用基因工程改良动植物品种，最突出的优点是能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。 (2)体细胞中出现了新基因的植物不一定是转基因植物，基因突变也可能出现新基因，这样的植物不能称为转基因植物。 (3)转入外源生长激素基因的转基因动物，生长速度更快。 (4)转基因抗虫棉的Bt毒蛋白基因能抵抗棉铃虫的侵害，但不能抵抗病毒、细菌、真菌，因为抗虫基因具有专一性。从环境保护角度出发，转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面减少了化学农药的使用量，降低了环境污染等。 (5)大肠杆菌和酵母菌均可作为生产胰岛素的工程菌，该类工程菌的优点是单细胞、繁殖快(至少答出两点)，但用大肠杆菌生产的人的胰岛素没有活性，因为其细胞内无内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工和修饰。 (6)要确保人胰岛素基因只在牛的乳腺细胞中表达，应该采取的措施是将人胰岛素基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起。 (7)与工厂化生产药用蛋白相比，用动物乳腺作为反应器生产药用蛋白的优势是动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，生产的蛋白质活性高，更稳定；产物直接经乳汁分泌，易提取。 (8)乳腺生物反应器和膀胱生物反应器二者均提高药用蛋白产量，易于提取。但乳腺生物反应器必须是在雌性个体发育到泌乳期才能获得产物；而膀胱生物反应器不受性别和发育时期的限制，受体来源广泛且可以在生物发育的任何时期提取药物。 第3节 蛋白质工程 考点1 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 知识1　蛋白质工程的一般过程 1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，以改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。 2.蛋白质工程的一般过程：新蛋白质预期功能―→设计蛋白质结构推测氨基酸序列基因(DNA)合成新的蛋白质。 3.基因工程的不足：原则上只能生产自然界中已经存在的蛋白质；生产的蛋白质不一定符合人们生产和生活的需要。 4.蛋白质工程的优势：能更充分地利用自然界中存在的蛋白质；能在分子水平上对蛋白质进行再设计和改造，进而创造出自然界中不存在的蛋白质。 5.实例：将水蛭素第47位天冬酰胺变成赖氨酸或精氨酸时，其抗凝血效率可提高4倍。 知识2 蛋白质工程首先要获取基因和蛋白质的结构数据 1.获取基因和蛋白质的结构数据的途径 (1)GenBank生物大分子数据库 ①序列文件的基本单位是序列条目，包括核苷酸排列顺序和注释两部分。 ②GenPept是由GenBank中的核酸序列翻译而得到的蛋白质序列数据库。 (2)Entrez数据库查询系统是一个将核酸、蛋白质序列和基因图谱、蛋白质结构数据库整合在一起的综合数据库查询系统。 知识3　通过基因改造生产目标蛋白质 1.基因的体外定向突变——适用对象：掌握了基本结构信息的蛋白质；类型 目的 方法 大面积的定向突变 基因全合成 单一或少数几个突变位点的基因定向突变 引物定点引入法 定点诱变法的过程示意图： 2.非定点诱变技术——适用对象：不能预先确定诱变位点的蛋白质；缺点：目的性和针对性不够强；优点：突变位点多，有时会产生意想不到的改造效果。 考点2 蛋白质工程的设计思路与应用★★★☆☆ 知识1　蛋白质工程的设计思路与应用 2.蛋白质工程与基因工程的区别与联系 比较项目 蛋白质工程 基因工程 区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因 过程 新蛋白质预期功能→设计蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→改造或合成可以产生新蛋白质的相关DNA序列→合成新的蛋白质 目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因及其表达产物的检测鉴定 目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的新的生物类型和生物产品 结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已经存在的蛋白质 联系 ①都在生物体外对基因进行操作； ②蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。 【易错提醒】 (1)蛋白质工程的过程实际是中心法则的逆推，蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 (2)大引物PCR定点突变技术：大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物(该技术的流程如图所示)。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 1. 限制酶主要存在于原核生物中，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是：限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。 2. 限制酶不切割细菌本身的DNA分子的原因：含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 3．DNA连接酶与DNA聚合酶的作用不一样。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是单个脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键，不需要模板；DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有核酸片段的末端，形成磷酸二酯键，需要以一条DNA链为模板。 4．不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础是：DNA基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸；双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构；DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。 5. 载体上标记基因的标记原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 6. 电泳结果条带问题分析： 如果未出现扩增条带，原因主要有：Taq酶失活、引物出现质量问题、Mg2＋浓度过低、变性时的温度低，变性时间短。 如果电泳鉴定的结果不止一条条带，原因主要有：模板DNA出现污染；引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 如果出现非特异性扩增条带，原因主要有：模板DNA出现污染、引物特异性不强或形成引物二聚体、Mg2＋浓度过高、退火时的温度过低等。 7. 基因组文库与cDNA文库的比较 种类 基因组文库 cDNA文库 含义 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体 包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合 特点 含有某种生物的全部基因，基因结构完整 含有某种生物的部分基因，基因中不含有启动子、终止子、内含子等 构建方法 提纯的原核生物或真核生物的基因组DNA 8. DNA粗提取中注意事项 (1)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。 (2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果。 9. 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别(在生产人的药用蛋白方面) 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 基因结构 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌的基因结构与人类有较大差异 基因表达 合成的药用蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药用蛋白可能没有活性 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌；严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 10.基因治疗的两种途径比较 途径 体外基因治疗 体内基因治疗 不同点 方法 从患者体内获得某种细胞→细胞培养→体外完成基因转移→筛选、细胞增殖→转入患者体内 特点 操作复杂，但效果可靠 相同点 都是将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷或异常基因引起的疾病，目前两种方法都处于临床试验阶段 考点预测： ✅ 能够分析重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用，聚合酶链式反应的条件和步骤；掌握利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定的方法。 ✅ 掌握基因工程中作为载体需要具备的条件、目的基因的获取方法、基因表达载体的组成及构建过程。 根据DNA的粗提取和鉴定的原理及过程分析试剂和步骤的作用，阐明将目的基因导入受体细胞的方法、 目的基因及其表达产物的检测鉴定的方法。 ✅ 理性看待基因工程在生产和生活中的应用，能举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白质的过程。 1.下列有关限制酶的叙述，正确的是(　　) A.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小 B.只有用相同的限制酶处理含目的基因和质粒，才能形成重组质粒 C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同 D.用限制酶切割DNA分子中部，获得一个目的基因时被水解的磷酸二酯键有2个 【答案】C 【解析】限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，A错误；用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶也可能形成重组质粒，B错误；－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都是4个，C正确；用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，需要切开两个切口，水解4个磷酸二酯键，D错误。 故选C。 2. 下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是(　　) A.限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可通过E.coli DNA连接酶相互连接 B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 D.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端 【答案】B 【解析】限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，A、D错误；DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的RNA片段上形成磷酸二酯键，B正确；并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列由4个或8个核苷酸组成，C错误。 故选B。 3. (多选)番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是(　　) A．基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和质粒 B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C．应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接 D．能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 【答案】BC 【解析】基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶，质粒属于基因工程中的常见工具，但不属于酶，A错误；启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确；为了防止目的基因和质粒自连或反接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确；仅导入了质粒的情况下细胞也具有青霉素抗性，故能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中不一定含有AFPs基因，D错误。 故选BC。 4. 图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是(　　) A． 图1、2中搅拌的目的不同 B．图1、2中加入蒸馏水的目的不同 C．图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液 D．图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol·L－1 的NaCl溶液中进行后续鉴定 【答案】C 【解析】图1加入蒸馏水是使细胞吸水破裂，图2加入蒸馏水是析出DNA，A正确；图1搅拌是为了破碎鸡血细胞，图2用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，获得含有一定杂质的DNA，图1、2中搅拌的目的不同，B正确；在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，C错误；图2完成后另取烧杯加2 mol·L－1NaCl溶液使丝状物重新溶解，进行后续鉴定，D正确。 故选C。 5．目前常用的生物反应器有乳腺生物反应器和膀胱生物反应器。采用基因工程将人凝血因子基因导入山羊受精卵，成功培育出了人凝血因子只存在于乳汁中的转基因羊。下列相关说法错误的是(　　) A.构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起 B.与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制 C.用显微注射法将表达载体导入受精卵细胞来获得转基因动物 D.在转基因动物的乳腺细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因 【答案】D 【解析】构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，以保证药用蛋白基因能在乳腺中正常表达，A正确；雌性山羊发育到一定阶段才能产生乳汁，乳腺生物反应器往往受羊生长发育的阶段和性别的限制，而膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制，B正确；动物受精卵的全能性最高，应用显微注射法将表达载体导入受精卵来获得转基因动物，C正确；药用蛋白基因存在于该转基因羊所有细胞中，只是在乳腺细胞中选择性表达，D错误； 故选D。 6.基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。如图为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是(　　) A．利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 B．酶①应为热稳定的DNA聚合酶，引物X和Y应该为引物2和4 C．由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过改造或合成基因来完成 D．可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间 【答案】D 【解析】图示的过程为重叠延伸PCR技术，可以利用重叠互补引物将两个不同的基因拼接到一起，A正确；酶①要在高温条件下延伸DNA，所以酶①为热稳定的DNA聚合酶，由图可知，要得到两条链一样长的DNA单链，应选择引物2和引物4，所以引物X和Y应该为引物2和4，B正确；基因控制蛋白质的合成，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过改造或合成基因来完成，C正确；由图可知，引物1和引物3存在互补配对片段，置于同一个反应系统时它们会发生结合而失去作用，D错误。 故选D。 【解题方法归纳】 1.启动子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别、结合的部位，使转录开始；终止子位于目的基因的下游，使转录终止；目的基因要插入启动子和终止子之间，只有顺序正确，目的基因才能正常转录。 2.启动子的类型：组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异；诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类启动子的调控下大幅度地提升或降低；组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。 3.构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此处，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”，这样能够避免载体与目的基因的反向连接。 4.DNA粗提取中不同试剂的作用 试剂 作用 蒸馏水 加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破 加到含DNA的2(mol·L－1)的NaCl溶液中，使其浓度下降析出DNA NaCl溶液 2(mol·L－1)的NaCl溶液可以溶解DNA 0.14(mol·L－1)的NaCl溶液可以析出DNA 乙醇 冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA 柠檬酸钠 抗凝剂，防止血液凝固 二苯胺 鉴定DNA的试剂 5.乳腺生物反应器、膀胱生物反应器、输卵管生物反应器的比较 乳腺生物反应器的操作过程中，构建基因表达载体时，目的基因要与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，否则目的基因在乳腺上皮细胞中不能转录。构建好的基因表达载体导入受精卵，而不是乳腺上皮细胞，这样由受精卵发育成的个体细胞均含有目的基因(如药用蛋白基因)，但其只在乳腺上皮细胞中表达；膀胱生物反应器是让药用蛋白基因在受体动物的膀胱上皮细胞中特异性表达；输卵管生物反应器是让药用蛋白基因在受体动物的输卵管细胞中特异性表达。 三者都可用于生产药用蛋白，优点是收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。用乳腺(房)生物反应器生产的优点是产量高、质量好、成本低、易提取，但从乳汁中提取蛋白质，该转基因个体必须是雌性的，若利用膀胱生物反应器从尿液中提取目的基因的产物则具有周期短、不受性别和年龄限制的优势。 学科网（北京）股份有限公司第1页共14页 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 第三章 基因工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、陷阱规避 第1节 基因工程及其技术（4个考点+7个易错提醒） 考点1 基因工程是在多学科基础上发展而来的 ★★☆☆☆ 考点2 基因工程的基本工具★★★★☆ 考点3 聚合酶链式反应（PCR）技术★★★★☆ 考点4 基因工程的基本操作程序★★★★★ 第2节 基因工程的应用价值（3个考点+1个易错提醒） 考点1 基因工程在农牧业中的应用价值★★☆☆☆ 考点2 基因工程在食品业中的应用价值★★☆☆☆ 考点3 基因工程在医药业中的应用价值★★☆☆☆ 第3节 蛋白质工程（2个考点+1个易错提醒） 考点1 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 考点2 蛋白质工程的设计思路与应用★★★☆☆ 素养加油站：热点问题分析、聚焦考点预测 方法储备库：高频考点，方法归纳 第1节 基因工程及其技术 考点1 基因工程是在多学科基础上发展而来的★★☆☆☆ 知识1　基因工程的诞生和发展 1.基因工程的诞生和发展 考点2 基因工程的基本工具★★★★☆ 知识1　基因工程的概念 1.概念：基因工程又称为 ，是指在 通过 “剪切”和“拼接”等方法， 将 与载体DNA进行组合形成 ，然后导入 ，并使其在受体细胞中表达，产生 的技术。 知识2　基因工程的基本工具 1.“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(又称限制酶) （1）作用及特点——特点： (专一性)很强；作用：能识别 上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的 断开。 （2）切割方式——错位切：在DNA分子两条链的 部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的 ，这种单链称为 ；平切：在DNA分子两条链上 的部位进行切割，切割后形成 。 2.“分子黏合剂”——DNA连接酶 （1）两个具有黏性末端的DNA分子的连接：通过 可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来；DNA分子基本骨架之间的 通过DNA连接酶的作用连接。 （2）DNA连接酶的分布及作用——分布：广泛存在于各种生物体内；作用：在 、 以及体内外重组过程中起着重要作用。 （3）种类： 种类 来源 作用 连接酶 大肠杆菌 可以用于连接具有 的DNA分子 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 可以用于连接具有 或 的DNA分子 3. “分子搬运工”——载体 （1）概念：将外源基因导入 ，并使其在受体细胞中 ，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为 。 （2）种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。 ①常用载体—— 。 a.化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的 。 b.质粒作为载体所具备的条件及原因 序列 原因 复制原点 使外源基因在受体细胞中稳定复制和遗传 标记基因 用于 重组DNA分子 多种 的切割位点 便于外源基因的插入 【易错提醒】 (1)回文序列：限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为，为回文序列。 (2)同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶。其特点是 ①识别的序列不同，但可以切割出相同的黏性末端，且切割出的黏性末端可以相互配对； ②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下不能再被原来的限制酶识别。 如图： BamHⅠ和BglⅡ识别序列不同，黏性末端均为GATC，因此二者为同尾酶。 （3）与DNA相关的几种酶的比较 比较项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解 旋为单链 考点3 聚合酶链式反应（PCR）技术★★★★☆ 知识1　聚合酶链式反应 1. 聚合酶链式反应简称 ，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。 2．原理：DNA半保留复制。 3．操作步骤：在向PCR管中加入一定量的 、 、4种 、缓冲液和 酶(Taq酶)、 等后，设置好反应程序，启动 ，自动完成反应步骤。 4．反应程序 (1)变性：在约 高温下，作为模板的双链DNA (变性)为两条单链DNA。 (2)退火：反应体系的温度降至约 ，2条 分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 (3)延伸：反应体系的温度回升到约 (Taq酶催化作用的 反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据 原则，在 的作用下连接到引物 端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。 (4)完成上述第一次循环后，PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。 5．应用 (1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如病原体鉴定、 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 (2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 【易错提醒】 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、退火和延伸都在最适的条件下进行。 (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。 (4)PCR需要热稳定的DNA聚合酶、4种dNTP和模板DNA之外，还需要引物等基本条件,不需要解旋酶。 (5)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板。 (6)如果循环n次，则共需要消耗2n－1对引物。 (7)要保证目的基因能与载体相连接，还要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 (8)PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 知识2　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 1. 实验目的——尝试运用PCR仪扩增DNA片段；关注PCR技术的应用；学习 检测DNA片段的方法和技术。 2. 实验原理： (1)扩增DNA片段的过程包括 、 和 等步骤的多次循环。 (2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加 ，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的 倍。 (3)PCR反应体系包括：DNA模板、 、 、人工合成的 、Taq酶等。 (4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的 温度。 (5)PCR和体内DNA复制的差异 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 场所 试管中 细胞内 方式 半保留 局部区域复制 半保留 全链复制 起始位点 引物 端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶(Taq酶) 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 解旋 解旋 引物 片段，保留在复制的子链中 片段， 在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 3 .实验器材和试剂 (1)仪器： 、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或 、微孔加热器(微量恒温仪)等。 (2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。 4. 实验步骤 (1)PCR扩增目的基因 ①配制反应体系。 ②按程序进行扩增。 a.94 ℃ 5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃ 1 min→d.72 ℃ 2 min→e.重复b～d,30个循环→f.72 ℃ 7～10 min。 (2)电泳分析：电泳维持 1.5～2 h；电泳鉴定：采用凝胶成像仪或 观察和记录电泳结果。 5. 结果和分析：略。 【易错提醒】 (1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。 (2)凝胶中影响DNA分子迁移速率的因素：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在利用PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。 (3)PCR循环之前，通常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 (4)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性，增加大分子模板DNA彻底变性的概率，同时激活Taq酶。 (5)在电泳鉴定中，可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 考点4 基因工程的基本操作程序★★★★★ 知识1　基因工程的基本操作程序 1. 基因工程的基本操作程序包括 、 、 ，以及 等步骤。 (1)目的基因的获取 ①通过 直接人工合成目的基因 DNA合成仪直接人工合成（全合成法）——适用条件：目的基因比较 ，且脱氧核苷酸序列 ， 半合成法——适用条件：较 基因，可降低成本； 合成过程为： ②通过基因文库获取目的基因 a.基因组文库 b.cDNA文库 ③获得基因组DNA或mRNA的基本过程:裂解细胞使 分子释放出来；从释放出来的细胞成分中分离核酸分子；纯化获得核酸分子。 ④质粒DNA的提取：先用碱裂解法获取 ，再提取质粒 。 ⑤纯化DNA的原理：通常利用了DNA与RNA、蛋白质等物质在 方面的差异。 (2)基因表达载体的构建【易错提醒】 (1)Klenow酶是一种能将双链DNA的突出5′端补平的DNA聚合酶。 (2)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因可以转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库(cDNA文库)仅含有该生物的部分基因。 (3)基因在结构上分为编码区和非编码区，非编码区位于编码区的上游和下游，在对基因的表达调控中发挥重要作用(如启动子和终止子)，不编码蛋白质。真核生物基因的编码区一般是不连续的，由外显子和内含子相间排列组成，整个编码区转录的产物为不成熟的mRNA，然后，不成熟的mRNA中的内含子转录的片段被剪切掉，外显子转录的片段拼接起来，形成成熟的mRNA；原核生物基因的编码区是连续的，转录的产物即为成熟的mRNA。 (4)一般采用核酸探针杂交的方法从基因组文库中筛选目的基因。 (5)将从基因组文库中获取的人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞，不能成功表达，因为从基因组文库中获取的人胰岛素基因含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，细胞内缺乏剪切内含子转录片段的系统，不能形成成熟的mRNA。 目的：使目的基因进入受体细胞并有效 ，而且要能 存在且 给后代。 基因表达载体的组成： 、 、启动子、 、和标记基因等。 复制原点：能与特定的受体细胞相匹配，使外源基因在受体细胞中能 ； 是位于目的基因上游的一段DNA序列，也是 识别、结合的部位，RNA聚合酶与启动子的结合能驱动基因开始 ，进而合成出相应的 ；终止子是位于目的基因下游的一段 ，是 目的基因转录的脱氧核苷酸序列； 的作用是初步筛选出接受了目的基因的受体细胞；常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）或某些生化标记基因。 【易错提醒】 (1)载体的种类——按功能分类：克隆载体和表达载体两类。克隆载体是最基本的载体。可以在宿主细胞中通过克隆获取目的基因。表达载体：带有基因表达所需要的各种调控元件，使外源基因（目的基因）能在宿主细胞中表达。有些载体兼有克隆载体和表达载体的特点。 (2)启动子、终止子和起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别并结合的位点，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 (3)将目的基因导入受体细胞 ①将目的基因导入植物细胞 主要方法： 。 农杆菌能在自然条件下感染 植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物；当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的 化合物，吸引农杆菌向伤口处移动； 特点：农杆菌含有 质粒，上面有一段 (T－DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细 胞 的DNA上； 原理：将目的基因插到农杆菌Ti质粒的 特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞 上，使目的基因得到稳定的 。 ②将目的基因导入哺乳动物细胞 主要方法： ；其他方法：用 与目的基因构建载体，再去感染受体动物细胞，使目的基因导入动物细胞内。 转基因动物的制备过程：使母畜在预先确定的时间排卵并 →收集 →在显微镜下用口径为1 μm的玻璃微管向受精卵注射含500～600个拷贝的 的载体→把这些受精卵移植到处 于 的母畜子宫内→转基因动物 ③将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞：经过适当处理(如用 处理)后，细胞质膜对DNA的 会发生改变，细胞变得 接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 细胞。 过程：Ca2＋处理细胞―→ 细胞―→感受态细胞和重组的 混合转化后的细胞带有 的微生物。 (4)目的基因及其表达产物的检测鉴定 ①检测与鉴定的原因：基因导入受体细胞后，能否有效地 目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。 ②分子水平的检测 a.从DNA方面进行检测——检测方法： ；检测原理：具有一定 的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照 原则形成双链。基因探针：用放射性 或荧光标记的已知DNA片段。结果分析：若待测DNA中有能与基因探针 的特异性DNA片段，用于 的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的 ，表明目的基因已经插入转基因生物的 分子中。 检测过程 b.从RNA方面进行检测——检测目的：检测目的基因是否能发挥其 ，即是否 出相应的mRNA分子。 检测方法： ；检测过程：从待测转基因生物细胞中提取 分子，用已标记的 片段作为探针与mRNA杂交，如果有 出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。 c.从蛋白质方面进行检测——检测方法： ；检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行 杂交；结果分析：如果有 出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。 d.个体水平的检测——检测目的：对生物的某些 进行鉴定；实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与 比较，确定其是否具有了抗冻性状。 【易错提醒】 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时常以体细胞作为受体细胞。在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是受精卵具有全能性，若用体细胞作受体细胞，可利用核移植技术得到转基因个体。 (2)将目的基因导入动物细胞的方法主要是显微注射法，微生物细胞经Ca2＋处理，其细胞质膜对DNA的通透性发生改变，目的是使细胞处于一种容易接受外来DNA分子的生理状态。 (3)农杆菌转化法中两次拼接、两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 (4)常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 (5)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的DNA单链；检测目的基因是否成功表达需用和抗原—抗体杂交法，不遵循碱基互补配对原则。 (6)通过基因工程产生的变异属于基因重组，是定向的；基因工程是否成功需从个体生物学水平对生物的性状进行鉴定。 知识2　DNA的粗提取和鉴定 1.DNA的粗提取 (1)原理:利用DNA与RNA、蛋白质等物质在 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 (2)步骤 2.DNA的鉴定 原理：在酸性条件下，DNA与 发生反应，溶液呈 。 步骤：将分离的丝状物放入物质的量浓度为2(mol·L-1)的 溶液中，使其溶解， 再加入 试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现 。 【易错提醒】 (1)DNA的粗提取一般选取鸡血来提取DNA，鸡血中血细胞含量高，DNA含量丰富，材料易得，细胞易吸水涨破。也可以选用植物细胞如洋葱等，只是破碎植物细胞比较麻烦，提取洋葱DNA时，需要先将洋葱切碎，然后加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和各种细胞器，无DNA分子。 (2)在DNA的粗提取中，两次加入蒸馏水的目的不相同，第一次加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，释放出核物质，第二次加入的目的是稀释NaCl溶液，从而析出DNA。 (3)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度曲线。 实验中加入2 mol·L－1的NaCl的目的是使DNA充分溶解。当NaCl的浓度低于2mol·L－1时，DNA的溶解度下降，从溶液中析出。 (4)向溶解有DNA和蛋白质的溶液中加入适量冷却的、体积分数为95%的乙醇溶液，溶液中会出现白色丝状物即DNA，而部分蛋白质会溶解在乙醇溶液中，这样可以对DNA起到进一步的纯化作用。 (5)DNA溶液中加入二苯胺试剂后需沸水浴加热数分钟后出现蓝色。 第2节 基因工程的应用价值 考点1 基因工程在农牧业中的应用价值★★☆☆☆ 知识1　基因工程在农牧业中的应用价值 1. 转基因生物：利用基因工程技术培育的、能稳定遗传 所决定的性状的生物称为转基因生物。 2. 植物基因工程硕果累累 (1)转基因抗病植物的生产带来效益：科学家将番木瓜环斑病毒毒株中的 转入番木瓜细胞内，培育出具有很强抗病性能的转基因品系——“华农1号”；科学家将病毒的复制酶基因和 基因以及 基因、植物抗病毒基因导入小麦、甜椒或番茄等作物，获得了抗病的小麦、甜椒或番茄等新品种。 (2)转基因抗虫植物已广泛投入生产：科学家已将从苏云金杆菌中分离出来的编码苏云金杆菌 的基因导入棉细胞，培育出了转基因抗虫棉；转基因抗虫水稻、玉米、大豆等品种也培育成功。 (3)转基因抗逆植物的培育带来新希望：科学家已经成功地将 基因转入番茄细胞，培育出转基因抗冻番茄；科学家已经成功地向某些作物转入一些可以调节细胞 的基因来提高作物的抗盐碱和抗干旱的能力。 3. 动物基因工程显示出诱人的应用前景 (1)改善畜牧产品的品质：利用ω－3脂肪酸去饱和酶基因；培育成可产生较多 的转基因猪。 (2)提高动物的生长速度：利用 基因培育转基因绵羊和转基因三文鱼。 4. 运用基因工程改良动植物品种的优点：能打破常规育种难以突破的 的界限。 考点2 基因工程在食品业中的应用价值★★☆☆☆ 知识1　基因工程在食品业中的应用价值 1.植物品质改良主要包括植物 、糖类、脂肪品质的改良以及维生素 的改良等方面。 2.基因工程在 、助鲜剂、甜味剂等食品添加剂的生产，以及广泛应用于食品制造业的淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶的大规模生产方面也大显身手。 考点3 基因工程在医药业中的应用价值★★☆☆☆ 知识1　基因工程在医药业中的应用价值 1.基因工程药物 (1)利用转基因工程菌生产药物。 (2)利用 生产药物——生物反应器的种类： 生物反应器、 生物反应器、 生物反应器等；乳腺生物反应器的构建：将药用蛋白基因、乳腺蛋白基因的启动子重组后、导入受精卵,发育为早期胚胎后移植到母体内发育成转基因动物，利用分泌的乳汁生产所需的药物。 2.基因治疗：是指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法，包括 、 、 、目的基因导入等多项技术。基因治疗有体内和体外两种途径。 是将分离出来的带有治疗作用的基因通过载体转入患者体内的某些细胞， 纠正或弥补缺陷基因的功能； 则是采用转基因技术将带有治疗作用的基因导入病毒基因组，再用病毒感染受体细胞，治疗基因整合到受体基因组后，受体细胞经体外培养、增殖后导入患者体内。 【易错提醒】 (1)转基因生物的获取过程中，不是直接将目的基因导入相应的受体细胞，需构建基因表达载体后再导入相应的受体细胞。运用基因工程改良动植物品种，最突出的优点是能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。 (2)体细胞中出现了新基因的植物不一定是转基因植物，基因突变也可能出现新基因，这样的植物不能称为转基因植物。 (3)转入外源生长激素基因的转基因动物，生长速度更快。 (4)转基因抗虫棉的Bt毒蛋白基因能抵抗棉铃虫的侵害，但不能抵抗病毒、细菌、真菌，因为抗虫基因具有专一性。从环境保护角度出发，转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面减少了化学农药的使用量，降低了环境污染等。 (5)大肠杆菌和酵母菌均可作为生产胰岛素的工程菌，该类工程菌的优点是单细胞、繁殖快(至少答出两点)，但用大肠杆菌生产的人的胰岛素没有活性，因为其细胞内无内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工和修饰。 (6)要确保人胰岛素基因只在牛的乳腺细胞中表达，应该采取的措施是将人胰岛素基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起。 (7)与工厂化生产药用蛋白相比，用动物乳腺作为反应器生产药用蛋白的优势是动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，生产的蛋白质活性高，更稳定；产物直接经乳汁分泌，易提取。 (8)乳腺生物反应器和膀胱生物反应器二者均提高药用蛋白产量，易于提取。但乳腺生物反应器必须是在雌性个体发育到泌乳期才能获得产物；而膀胱生物反应器不受性别和发育时期的限制，受体来源广泛且可以在生物发育的任何时期提取药物。 第3节 蛋白质工程 考点1 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 知识1　蛋白质工程的一般过程 1.蛋白质工程是指以 及其与生物功能的关系为基础，对编码该蛋白的基因进行 的设计改造，以改造 蛋白质或制造 的蛋白质。 2.蛋白质工程的一般过程：新蛋白质预期功能―→设计蛋白质结构推测氨基酸序列基因(DNA)合成新的蛋白质。 3.基因工程的不足：原则上只能生产自然界中 的蛋白质；生产的蛋白质 符合人们生产和生活的需要。 4.蛋白质工程的优势：能更充分地利用自然界中 的蛋白质；能在分子水平上对蛋白质进行再设计和改造，进而创造出自然界中 的蛋白质。 5.实例：将水蛭素第47位天冬酰胺变成赖氨酸或精氨酸时，其抗凝血效率可提高4倍。 知识2 蛋白质工程首先要获取基因和蛋白质的结构数据 1.获取基因和蛋白质的结构数据的途径 (1)GenBank生物大分子数据库 ①序列文件的基本单位是序列条目，包括 和注释两部分。 ②GenPept是由GenBank中的核酸序列翻译而得到的 。 (2)Entrez数据库查询系统是一个将核酸、蛋白质序列和基因图谱、蛋白质结构数据库整合在一起的综合数据库查询系统。 知识3　通过基因改造生产目标蛋白质 1.基因的体外定向突变——适用对象：掌握了 的蛋白质；类型 目的 方法 大面积的定向突变 基因全合成 单一或少数几个突变位点的基因定向突变 引物定点引入法 定点诱变法的过程示意图： 3. 非定点诱变技术——适用对象：不能预先确定诱变位点的蛋白质；缺点：目的性和针对性不够强；优 点： ，有时会产生意想不到的改造效果。 考点2 蛋白质工程的设计思路与应用★★★☆☆ 知识1　蛋白质工程的设计思路与应用 2.蛋白质工程与基因工程的区别与联系 比较项目 蛋白质工程 基因工程 区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因 过程 新蛋白质预期功能→设计蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→改造或合成可以产生新蛋白质的相关DNA序列→合成新的蛋白质 目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因及其表达产物的检测鉴定 目标 或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的新的生物类型和生物产品 结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界 的蛋白质 联系 ①都在 对基因进行操作； ②蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代 。 【易错提醒】 (1)蛋白质工程的过程实际是中心法则的逆推，蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 (2)大引物PCR定点突变技术：大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物(该技术的流程如图所示)。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 1. 限制酶主要存在于原核生物中，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是：限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。 2. 限制酶不切割细菌本身的DNA分子的原因：含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 3．DNA连接酶与DNA聚合酶的作用不一样。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是单个脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键，不需要模板；DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有核酸片段的末端，形成磷酸二酯键，需要以一条DNA链为模板。 4．不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础是：DNA基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸；双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构；DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。 5. 载体上标记基因的标记原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 6. 电泳结果条带问题分析： 如果未出现扩增条带，原因主要有：Taq酶失活、引物出现质量问题、Mg2＋浓度过低、变性时的温度低，变性时间短。 如果电泳鉴定的结果不止一条条带，原因主要有：模板DNA出现污染；引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 如果出现非特异性扩增条带，原因主要有：模板DNA出现污染、引物特异性不强或形成引物二聚体、Mg2＋浓度过高、退火时的温度过低等。 7. 基因组文库与cDNA文库的比较 种类 基因组文库 cDNA文库 含义 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体 包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合 特点 含有某种生物的全部基因，基因结构完整 含有某种生物的部分基因，基因中不含有启动子、终止子、内含子等 构建方法 提纯的原核生物或真核生物的基因组DNA 8. DNA粗提取中注意事项 (1)过滤含DNA的黏稠物时不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA被吸附到滤纸上，而导致DNA大量损失。 (2)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏，但细胞破裂时应快速搅拌。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果。 9. 乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别(在生产人的药用蛋白方面) 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 基因结构 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌的基因结构与人类有较大差异 基因表达 合成的药用蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药用蛋白可能没有活性 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌；严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 10.基因治疗的两种途径比较 途径 体外基因治疗 体内基因治疗 不同点 方法 从患者体内获得某种细胞→细胞培养→体外完成基因转移→筛选、细胞增殖→转入患者体内 特点 操作复杂，但效果可靠 相同点 都是将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷或异常基因引起的疾病，目前两种方法都处于临床试验阶段 考点预测： ✅ 能够分析重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用，聚合酶链式反应的条件和步骤；掌握利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定的方法。 ✅ 掌握基因工程中作为载体需要具备的条件、目的基因的获取方法、基因表达载体的组成及构建过程。 根据DNA的粗提取和鉴定的原理及过程分析试剂和步骤的作用，阐明将目的基因导入受体细胞的方法、 目的基因及其表达产物的检测鉴定的方法。 ✅ 理性看待基因工程在生产和生活中的应用，能举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白质的过程。 1.下列有关限制酶的叙述，正确的是(　　) A.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小 B.只有用相同的限制酶处理含目的基因和质粒，才能形成重组质粒 C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同 D.用限制酶切割DNA分子中部，获得一个目的基因时被水解的磷酸二酯键有2个 2. 下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是(　　) A.限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可通过E.coli DNA连接酶相互连接 B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 D.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端 3. (多选)番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述正确的是(　　) A．基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和质粒 B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C．应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接 D．能在含青霉素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 4. 图1、2分别为“DNA的粗提取和鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述错误的是(　　) A． 图1、2中搅拌的目的不同 B．图1、2中加入蒸馏水的目的不同 C．图1中完成过滤后应向滤液中加入一定量的柠檬酸钠溶液 D．图2完成后要将玻璃棒上丝状物重新溶解到2 mol·L－1 的NaCl溶液中进行后续鉴定 5．目前常用的生物反应器有乳腺生物反应器和膀胱生物反应器。采用基因工程将人凝血因子基因导入山羊受精卵，成功培育出了人凝血因子只存在于乳汁中的转基因羊。下列相关说法错误的是(　　) A.构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起 B.与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制 C.用显微注射法将表达载体导入受精卵细胞来获得转基因动物 D.在转基因动物的乳腺细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因 6.基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。如图为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是(　　) A．利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 B．酶①应为热稳定的DNA聚合酶，引物X和Y应该为引物2和4 C．由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过改造或合成基因来完成 D．可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间 【解题方法归纳】 1.启动子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别、结合的部位，使转录开始；终止子位于目的基因的下游，使转录终止；目的基因要插入启动子和终止子之间，只有顺序正确，目的基因才能正常转录。 2.启动子的类型：组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异；诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类启动子的调控下大幅度地提升或降低；组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。 3.构建基因表达载体时，可以选择用同一种限制酶或两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子，这两种方法分别简称为“单酶切法”和“双酶分别切割法”。此处，还可以选择用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，这种新的方法被称为“双酶同时切割法”，这样能够避免载体与目的基因的反向连接。 4.DNA粗提取中不同试剂的作用 试剂 作用 蒸馏水 加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破 加到含DNA的2(mol·L－1)的NaCl溶液中，使其浓度下降析出DNA NaCl溶液 2(mol·L－1)的NaCl溶液可以溶解DNA 0.14(mol·L－1)的NaCl溶液可以析出DNA 乙醇 冷却的、体积分数为95%的乙醇可以除去杂质以提纯DNA 柠檬酸钠 抗凝剂，防止血液凝固 二苯胺 鉴定DNA的试剂 5.乳腺生物反应器、膀胱生物反应器、输卵管生物反应器的比较 乳腺生物反应器的操作过程中，构建基因表达载体时，目的基因要与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，否则目的基因在乳腺上皮细胞中不能转录。构建好的基因表达载体导入受精卵，而不是乳腺上皮细胞，这样由受精卵发育成的个体细胞均含有目的基因(如药用蛋白基因)，但其只在乳腺上皮细胞中表达；膀胱生物反应器是让药用蛋白基因在受体动物的膀胱上皮细胞中特异性表达；输卵管生物反应器是让药用蛋白基因在受体动物的输卵管细胞中特异性表达。 三者都可用于生产药用蛋白，优点是收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。用乳腺(房)生物反应器生产的优点是产量高、质量好、成本低、易提取，但从乳汁中提取蛋白质，该转基因个体必须是雌性的，若利用膀胱生物反应器从尿液中提取目的基因的产物则具有周期短、不受性别和年龄限制的优势。 学科网（北京）股份有限公司第1页共14页 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $