3.1.2 PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定-【步步高】2023-2024学年高二生物学选择性必修3 生物技术与工程（苏教版）

第2课时　PCR技术和利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 [学习目标]　1.简述PCR的原理、条件及过程。2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。 一、聚合酶链式反应(PCR)技术 1．含义：聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。 2．原理：DNA半保留复制。 3．操作步骤：在向PCR管中加入一定量的模板DNA、引物对、4种dNTP、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2＋等后，设置好反应程序，启动PCR仪，自动完成反应步骤。 4．反应步骤 (1)变性：在约94 ℃高温下，作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。 (2)退火：反应体系的温度降至约55 ℃，2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。 (3)延伸：反应体系的温度回升到约72 ℃(Taq酶催化作用的最适反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则，在Taq酶的作用下连接到引物3′端之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。 (4)完成上述第一次循环后，PCR仪会按设定接着进行第二次、第三次……循环。 5．PCR技术的应用 (1)广泛应用于医学及分子生物学等领域，如：病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 (2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 判断正误 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　) (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　　) (3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　) (4)PCR需要热稳定的DNA聚合酶、解旋酶、4种dNTP和模板DNA之外，还需要引物等基本条件(　　) (5)PCR的每一次循环都包括变性→退火→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一次循环的模板(　　) 答案　(1)×　(2)√　(3)√　(4)×　(5)√ 任务一：分析PCR扩增的过程 图1、图2分别表示PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： (1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？ 提示　第3轮。 (2)如果循环n次，则共需要消耗多少对引物？ 提示　共需要消耗2n－1对引物。 (3)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 提示　第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (4)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 提示　要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 　PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 1．下列有关PCR技术的说法，错误的是(　　) A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 B．PCR技术的原理是DNA半保留复制 C．退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D．PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料 答案　D 解析　PCR过程中需要模板DNA、引物对、反应缓冲液、4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2＋等，D错误。 2．聚合酶链式反应(PCR)被广泛应用于遗传疾病的诊断、刑事侦查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基因。下列有关叙述错误的是(　　) A．扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B．PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温 C．PCR技术扩增时，两种引物的碱基序列要尽可能互补 D．若目的基因扩增5次，则需要消耗62个引物分子 答案　C 解析　PCR技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是根据这一序列合成引物，A正确；PCR技术需要使用Taq酶而不是普通的DNA聚合酶，主要原因是Taq酶耐高温，B正确；PCR技术中所用的两种引物的碱基序列不能互补，原因是若能互补则会发生配对，从而减小引物与目的基因的结合概率，C错误；若一个目的基因扩增5次，可得到32个DNA分子，共64条DNA单链，其中原目的基因两条单链不需要引物，所以共需消耗62个引物分子，D正确。 二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 1．实验目的 (1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段。 (2)关注PCR技术的应用。 (3)学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。 2．实验原理 (1)扩增DNA片段的过程包括变性、退火和延伸等步骤的多次循环。 (2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的2n倍。 (3)PCR反应体系包括：DNA模板、反应缓冲液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物对、Taq酶等。 (4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的不同温度。 (5)PCR和体内DNA复制的差异 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 场所 试管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3′端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶(Taq酶) 多种酶 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 3.实验器材和试剂 (1)仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪、微孔加热器(微量恒温仪)等。 (2)试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。 4．实验步骤 (1)PCR扩增目的基因 ①配制反应体系。 ②按程序进行扩增。 a．94 ℃预变性5 min→b.94 ℃变性1 min→c.55 ℃退火1 min→d.72 ℃延伸2 min→e.重复b～d,30个循环→f.72 ℃延伸7～10 min。 (2)电泳分析 ①电泳：维持恒压80 V 1.5～2 h。 ②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或紫外透射仪观察和记录电泳结果。 5．结果和分析：略。 判断正误 (1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中(　　) (2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率(　　) (3)PCR循环之前，通常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率(　　) (4)利用PCR扩增DNA片段时，在每一次循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性(　　) 答案　(1)√　(2)√　(3)√　(4)× 任务二：PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的分析 1．在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？ 提示　可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 2．试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？ 提示　变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。 (1)影响DNA分子迁移速率的因素有：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。 (2)未出现扩增条带的原因主要有： ①Taq酶失活。 ②引物出现质量问题。 ③Mg2＋浓度过低。 ④变性时的温度低，变性时间短。 (3)出现非特异性扩增条带的原因主要有： ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2＋浓度过高。 ④退火时的温度过低等。 3．(多选)(2022·启东高二期末)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2＋。下列有关说法正确的是(　　) A．细胞核内DNA复制的引物是一小段RNA，PCR的引物通常是一小段DNA B．酶是指热稳定的DNA聚合酶，它能从引物的3′端羟基(—OH)开始延伸DNA链 C．dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、U、C、G 4种碱基 D．引物自身不应存在连续的互补序列，引物对间也不应有较强的互补性 答案　ABD 解析　PCR过程中需要的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)，它能从引物的3′端羟基(—OH)开始延伸DNA链，以形成DNA子链，B正确；dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、T、C、G 4种碱基，C错误；设计的引物是用于目的基因的复制，因此，引物应能与目的基因的碱基互补配对，但每种引物自身不应存在互补性，引物对间也不应有较强的互补性，防止引物自身配对，D正确。 4．下列有关电泳的叙述，不正确的是(　　) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 答案　C 解析　由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。 题组一　聚合酶链式反应(PCR)技术 1．下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　) A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上 B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的 D．该技术利用DNA半保留复制的原理，需要模板、原料、能量、酶等条件 答案　D 解析　PCR技术扩增的目的基因序列不一定是完全已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。 2．PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是(　　) ①稳定的缓冲溶液环境　②DNA模板　③引物　④dNTP　⑤热稳定的DNA聚合酶　⑥解旋酶　⑦限制性内切核酸酶　⑧温控设备 A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤⑥⑦⑧ C．③④⑤⑥⑧ D．①②③④⑤⑧ 答案　D 解析　PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳定的缓冲溶液环境，①正确；PCR反应需要一定量的模板DNA、引物对、4种dNTP(提供能量和原料)、热稳定的DNA聚合酶，②③④⑤正确；PCR反应过程中通过高温使DNA变性解旋，不需要解旋酶，⑥错误；PCR反应不需要限制性内切核酸酶，⑦错误；PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，⑧正确。 3．下列关于聚合酶链式反应(PCR)技术的叙述，正确的是(　　) A．PCR过程中只需要两个引物分子 B．PCR的循环过程分为变性、退火和延伸三步 C．PCR扩增仪需保持在37 ℃以维持Taq酶最佳活性 D．PCR过程中边解旋边复制 答案　B 解析　PCR过程中需要两种引物，引物的数目需要根据扩增的次数确定，A错误；PCR的循环过程分为高温变性(DNA双链打开)、退火(模板链与引物结合)和延伸(合成子链)三步，B正确；PCR扩增仪温度会达到90 ℃以上，C错误；PCR过程中，在变性阶段打开双链，延伸阶段合成子链，故先解旋再复制，D错误。 4．下列有关PCR过程的叙述，错误的是(　　) A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键 B．复制过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核糖核苷酸 D．PCR技术与细胞内DNA复制相比所需要的酶的最适温度较高 答案　C 解析　延伸过程中需要热稳定的DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸、引物对等，C错误。 5．PCR技术中，如何设计引物(　　) A．PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计 B．PCR引物要根据已知的DNA序列对应的RNA序列来设计 C．PCR引物要根据已知的DNA序列对应的tRNA的序列来设计 D．以上方法都不正确 答案　A 解析　设计引物就是直接根据基因序列来设计，即根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，A正确。 6．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　) A．从理论上推测，第二轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 B．在第二轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因 D．热稳定的DNA聚合酶将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3′端 答案　B 解析　由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，B错误；引物A和引物B必须与目的基因配对，如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因，C正确；由于复制过程子链的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸，所以热稳定的DNA聚合酶将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3′端，D正确。 题组二　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 7．下列关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述中，不正确的是(　　) A．PCR过程需要Taq酶 B．PCR过程需要DNA连接酶 C．PCR扩增区域由2种引物来决定 D．不同大小的DNA在电场中迁移速率不同 答案　B 解析　PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以复制过程中要用热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)，A正确；PCR过程中用热稳定的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合，不需要DNA连接酶，B错误；PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物，由于DNA的两条模板链为反向平行，所以复制时需要两种引物，C正确；不同大小的DNA在电场中的迁移速率不同，因此可通过电泳的方法检测扩增产物，D正确。 8．(2023·徐州高二质检)在PCR反应体系中，加入过量的只与双链而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在游离状态不发出荧光，只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光。下列分析错误的是(　　) A．PCR体系中需要加入Mg2＋来激活Taq酶 B．若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因的两种引物 C．荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中 D．荧光信号强度与产物的数量呈正相关 答案　B 解析　在PCR体系中需要加入Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合酶，用于合成DNA子链，A正确；若要扩增一个DNA上的某基因，应加入该基因的两种引物，B错误；荧光染料只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光，在PCR反应的延伸阶段形成DNA双链，C正确；荧光染料可用来鉴定扩增结果，扩增的产物越多，则荧光信号强度越强，D正确。 9．利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是(　　) A．引物越短，PCR扩增出来的非目标DNA就越多 B．适温延伸过程中，需要提供ATP C．引物中G/C含量越高，退火温度越高 D．共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成 答案　B 解析　当引物越短时，其特异性降低，可能会与非目的基因结合，因此PCR扩增出来的非目标DNA就越多，A正确；适温延伸过程中，不需要提供ATP，B错误；退火表示引物与模板相连，若退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，由于G—C之间含有三个氢键，A—T之间含有两个氢键，所以G—C含量越高的引物，退火温度越高，C正确；PCR技术的原理是DNA半保留复制，根据DNA分子半保留复制特点可知，无论复制多少次，总有原来的模板DNA分子的两条单链不含引物，故共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成，D正确。 10．(多选)(2023·南京金陵中学高二学情调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR体系中每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增1条链，就有1个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是(　　) A．图示引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B．Taq酶催化子链从3′端向5′端延伸，需要dNTP作为原料 C．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶 D．原料充足时，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关 答案　BD 解析　图示引物与探针均为根据某条模板链设计的单链DNA，因而具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；根据图示中引物延伸的方向可以确定Taq酶可以催化子链沿着5′端向3′端的方向延伸，需要dNTP作为原料，B错误；若要用上述技术检测某基因的转录水平，需要以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成DNA再进行PCR的扩增，因此要用到逆转录酶，C正确；由题干信息“每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针”“每扩增1条链，就有1个荧光分子生成”可知，原料充足时，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D错误。 11．(多选)PCR技术可用于遗传多样性的研究。如图是对跳虫A和跳虫B的DNA分析实验过程，下列有关叙述正确的是(　　) A．蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时，加入蛋白酶有助于释放出DNA B．Taq酶能够耐高温，常在PCR中用于DNA链的合成 C．将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小 D．阴性对照是加入DNA模板和PCR扩增过程中所需的其他混合物，以检测是否有“污染” 答案　ABC 解析　蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，真核生物的DNA与蛋白质结合在一起，因此，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA，A正确；Taq酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的合成，B正确；阴性对照是未加入DNA模板但加入PCR扩增过程中所需的其他混合物，目的是检测试剂是否污染，D错误。 12．(多选)(2022·南通高二月考)为了分析模板DNA链的核苷酸序列，在4组反应体系中加入放射性标记的引物、单链DNA模板、热稳定的DNA聚合酶、dNTP以及特定的ddNTP(双脱氧核苷酸)，ddNTP可以取代相应的dNTP，终止DNA子链的延伸，反应后得到不同长度的DNA片段混合物，再进行凝胶电泳放射自显影测序，得到如下结果。下列叙述正确的是(　　) A．构成dNTP的五碳糖是核糖，构成ddNTP的五碳糖是脱氧核糖 B．引物链与模板链配对后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸子链 C．上述过程的原理是碱基互补配对，不需要加入解旋酶 D．据图分析，模板链由5′端→3′端的碱基序列是－CTGACTTCGACAA－ 答案　BD 解析　构成dNTP的五碳糖是脱氧核糖，A错误；引物的作用是定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点。引物链与模板链配对后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸子链，B正确；题述过程的原理是DNA复制，C错误；加入ddNTP可以终止DNA子链的延伸，所以根据电泳图上显影位置距起点的距离知道片段的长短，离起点近的是最早被终止的片段末端，以此类推，可知与模板结合的链上碱基序列依次是－GACTGAAGCTGTT－，根据碱基互补配对原则，可知模板链由5′端→3′端的碱基序列是－CTGACTTCGACAA－，D正确。 13．(2023·盐城实验高级中学高二期中)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题： (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过__________，获得DNA用于PCR扩增。 (2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________切割位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。 (3)图中步骤1代表__________，步骤2代表退火，步骤3代表__________，这三个步骤组成一轮循环。 (4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏____________________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________________的引物需要设定更高的退火温度。 (5)如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有____________(填序号)。 ①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物 答案　(1)逆转录　(2)限制性内切核酸酶(限制酶)　碱基互补配对　(3)变性　延伸　(4)引物与模板　G—C含量高　(5)②③ 解析　(1)PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶(限制酶)的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物时需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低退火温度、重新设计引物等。 14．(2023·泰州高二期中)巢式PCR扩增在两次PCR中使用两组不同引物，先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增，产生中间产物，然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增，产生目标产物。如图是巢式PCR工作原理示意图，请回答下列问题： (1)巢式PCR体系中需要加入模板、____________、____________、引物对、Mg2＋、反应缓冲液等。 (2)相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得的产物特异性__________，原因是如果利用外引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率____________。 (3)巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应，然后将中间产物等转移到第二个试管中进行第二阶段反应，不在同一试管完成的主要原因是________________________________ ______________________________________________________________________________。 答案　(1)Taq酶　dNTP　(2)更强　降低　(3)防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染 解析　(2)巢式PCR通过两轮PCR扩增，使用两组引物扩增DNA片段，第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率很低。因此相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得的产物特异性更强。 (3)巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的，因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要原因是防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。 学科网（北京）股份有限公司 $$