第三章 基因工程（单元自测卷）生物苏教版选择性必修3

2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第三章 基因工程 一、单选题：本题共15个小题，每小题2分，共30分。 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A C D C B D B C A C 题号 11 12 13 14 15 答案 C B D A D 二、多项选择题：本题包括4小题，每小题3分，共12分。 题号 16 17 18 19 答案 ABD ACD ABC AD 三、非选择题：本题共5小题，除特别标注外，每空1分，共58分。 20．（10分） (1)磷酸二酯 黏性 可能相同 (2)不同PCR反应的退火温度有差异 不同引物间会互补配对 BsmBⅠ酶、DNA连接酶（2分） (3)5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (4)abd 21.（11分） (1) 引物、模板（或模板长度） (2) RNA聚合酶 替代后无法保证GLP-1仅在有光照时表达 (3) 胰高血糖素 肝糖原分解、脂肪等非糖物质的转化（2分） 避免HEK-293细胞被小鼠免疫系统清除（或便于HEK-293细胞在小鼠体内长期存在或避免免疫排斥） (4) 抗原-抗体杂交 远红光 （停止光照后GMP含量降低）转录激活因子不能被活化 更方便快捷（更易调控或节约成本） 22．（11分） (1) 5' ad (2) 感受 氨苄青霉素 2 基因测序 (3) 上清液 >T 绿色荧光 (4)ELP无治疗效果；LL-37和LL-37-ELP均具有治疗作用，且LL-37-ELP治疗效果更好（2分） 23．（11分） (1)复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (2) 使引物与单链相应互补序列结合（或复性/退火） 激活TaqDNA聚合酶的活性 (3)凝胶电泳 凝胶载样缓冲液 - (4)杀灭农杆菌（或抑制农杆菌生长/抑制农杆菌/抑菌） 卡那霉素 注意抗生素的种类、剂量及作用时间等 (5)F1与R2（或F2与R1）（2分） 24.（15分） (1) EcoRI、HindⅢ 0、2 (2) DNA连接（酶） 基因突变 (3) CaCl2（或Ca2+） 卡那霉素 (4) S-F、E-R 耐高温DNA聚合酶（或Taq酶）、脱氧核苷酸（或dNTP）、含Mg2+的缓冲溶液等（至少答出2个）（2分） (5) 启动子 用少量mRNA分子合成大量蛋白质（或可同时合成多条肽链，提高蛋白质合成速率） (6)44.44kDa（2分） (7) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 / 学科网（北京）股份有限公司 $ ( ………………○………………外………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… ) ( ………………○………………内………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… ) ( 此卷只装订不密封 ) ( ………………○………………内………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… ………………○………………外………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… … 学校： ______________ 姓名： _____________ 班级： _______________ 考号： ______________________ ) 2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第三章 基因工程 （测试时间：75分钟 满分：100分） 一、单项选择题：（本部分包括15题，每题2分，共计30分。每题只有一个选项最符合题意。) 1.cDNA 文库是以特定组织或细胞在某一发育阶段表达的mRNA 为模板，通过逆转录酶合成互补DNA（cDNA），再将其克隆至载体构建的基因集合。该文库仅包含表达基因的编码序列，反映特定条件下的转录信息。利用该文库便于筛选功能基因，广泛应用于基因克隆、功能研究、真核生物基因表达及差异表达分析，下列叙述正确的有几项（　　） ①水稻cDNA 文库中的基因不含有启动子所对应的序列 ②水稻cDNA 文库中的基因不含有终止密码子所对应的序列 ③构建cDNA 文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和 DNA 聚合酶等 ④从不同组织细胞中提取的mRNA 建立的cDNA 文库不完全相同 ⑤通过定向改变cDNA 序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程 A．四项 B．三项 C．一项 D．零项 2．2023年2月7日，美国马里兰医学院进行了全球首例猪心脏移植进入人体的手术，如图为猪心脏移植过程图，下列有关叙述正确的是（　　） A．D猪出生后完全呈现A猪的遗传性状 B．从免疫角度看移植到人体的猪心属于抗体 C．植入的基因是位于DNA上与遗传有关的片段 D．往A猪的体细胞中植入人类基因，采用了克隆技术 3．下列关于高中生物学“载体”的叙述，正确的是（　　） A．载体蛋白转运物质时自身构象不会发生改变 B．作为基因工程载体的质粒仅存在于原核生物中 C．氢载体NADH在叶绿体基质中可用于碳固定过程 D．腺苷三磷酸在生物体内可作为能量和磷酸的载体 4. 图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindIII切割位点。AluI限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（　　） A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性 B．HindIII切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂 C．产前诊断时，该致病基因可选用HindIII限制酶开展酶切鉴定 D．两种限制酶酶切形成的末端类型不同，均可用E.coliDNA连接酶连接 5．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图），利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列有关叙述错误的是（　　） A．Cas9蛋白能作用于目的基因的磷酸二酯键 B．sgRNA可以在逆转录酶作用下催化合成 C．sgRNA序列越短则编辑对象出错率越高 D．基因编辑技术引起的变异属于基因突变 6．2025年研究显示，一种新型DNA聚合酶可耐受92℃高温。其通过引入古菌特有糖基化修饰位点形成保护性水合层，进而显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是（　　） A．当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应 B．这类耐高温的DNA聚合酶的基本单位是脱氧核苷酸 C．为维持较高的催化活性，适宜在70℃~75℃下保存 D．对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性 7. 人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 8.下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（　　） A．DNA体内复制与体外复制（PCR）所需能量均只来自dNTP B．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 C．PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶 D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物 9.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A． 通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 B． 在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 B． 表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 D．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 10．如图表示基因工程化干细胞通过分泌外泌体（能产生调控基因表达的RNA）修复受损细胞的过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．将目标基因导入干细胞前，仅需DNA连接酶构建含目标基因的表达载体 B．外泌体携带目标基因可直接整合到受损细胞的基因组中实现修复 C．相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险 D．若受损细胞是胰岛B细胞，该外泌体可直接产生胰岛素 11．某科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌（工程菌），可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如下图所示，天然大肠杆菌不含有图中所示基因。（GFP基因为绿色荧光蛋白基因）。下列有关说法正确的是（　　） A．启动子1、2是DNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程 B．转基因工程菌中的GFP基因表达产物还需要内质网等细胞器的加工 C．当环境中存在四环素时，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光 D．转基因工程菌中TetR基因的表达是GFP基因表达的前提条件 12．下列有关生物技术与工程的相关叙述正确的是（　　） A．利用DNA可溶于95%酒精的性质去除部分不溶的杂质 B．PCR技术中复性的温度既要“足够低”又要“足够高” C．将二苯胺试剂加入溶解了DNA的NaCl溶液中溶液呈蓝色 D．电泳时凝胶的浓度与样品的大小有关，电压的大小与凝胶的宽度有关 13．某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法正确的是（　　） A．制备的膀胱生物反应器，只有膀胱细胞中才含有W蛋白基因 B．可使用显微注射法将含有W蛋白基因的表达载体导入膀胱细胞中 C．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白使用的启动子相同 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 14．下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述正确的是（　　） A．上述技术流程属于蛋白质工程的范畴 B．通过电泳检测，可确认基因突变是否成功 C．上述过程需要人工设计核糖核苷酸片段作为引物 D．导入受体细胞后复制产生的子代 DNA 大多为突变型 15．通过蛋白质工程将胰岛素B链第28位脯氨酸替换为天冬氨酸，研制成“德谷胰岛素”具有快速和长效的特点，极大改善糖尿病患者的血糖控制灵活性。下列叙述错误的是（　　） A．若使用大肠杆菌作为受体细胞，直接产生的胰岛素可能不具有生物活性 B．“德谷胰岛素”的最终获得还需经过基因工程，并验证产品的功能 C．该过程一般不可通过对天然胰岛素的氨基酸进行直接替换完成 D．根据中心法则可推断出“德谷胰岛素”的唯一脱氧核苷酸序列 二、多项选择题：(本题包括4小题，每小题3分，共12分。每小题给出的四个选项中，有不止一个选项符合题意。每小题全选对者得3分，选对但不全的得1分，错选或不答的得0分。) 16.如图表示利用大肠杆菌生产干扰素的部分操作，质粒A中的lacZ基因的表达产物β-半乳糖苷酶可分解无色化合物X-gal而使菌落显蓝色，不含lacZ基因的菌落则呈白色。表格为不同限制酶的识别及切割位点。下列叙述正确的是（　　） 限制酶 BamHI BclI SmaI EcoRI 识别序列及切割位点(5’→3’) G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG G↓AATTC A．扩增干扰素基因时在一对引物的5’端分别添加BamHI及SmaI识别序列 B．受体大肠杆菌需具备氨苄青霉素敏感和β-半乳糖苷酶合成缺陷等特征 C．转化后的菌液经稀释涂布后，挑取蓝色的单菌落作为目标工程菌 D．构建重组质粒B时，需用到BamHI、BclI、SmaI、T4DNA连接酶 17. 下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。有关说法错误的是（　　） A． 应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列 B．将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物 D．图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割 18. 已知T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。对该植株自交后代F1利用图1所示引物分别进行PCR检测，电泳结果如图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．以Aa植株为父本与野生型杂交，F1中卡那霉素抗性植株的比例为1/2 B．子代数量太少导致F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株 C．仅考虑基因A和a，该植株会产生2种基因型的可育花粉 D．根据电泳结果，图2中Ⅰ型植株占比为2/3 19．苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白 Cry具有杀虫毒性，但 Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry 蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将 Cry 蛋白第282位、第283 位的丙氨酸和亮 氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（　　） A．改造 Cry 蛋白应从 Cry 蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构 B．Cry蛋白的毒性提高了3~7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构 C．使用蛋白质工程改造 Cry蛋白过程中需要使用限制酶和 DNA 连接酶 D．对Cry 蛋白的改造是通过直接替换 Cry 蛋白中的氨基酸来实现的 三、非选择题：(本题共5小题，除特别标注外，每空1分，共58分。) 20.（10分）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的 键，产生 （类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端 （填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有 、 。过程②需要的酶有 （2分）。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为 （接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列 （接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有 。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 21.（11分）胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是治疗糖尿病的重要药物。某团队将相关基因连入载体后导入人源HEK-293细胞，再将导入成功的细胞移植至小鼠体内，成功构建出光照下可合成GLP-1的糖尿病治疗模型小鼠，机制如图1所示。请回答下列问题： (1) 构建载体1前需分别扩增光敏色素基因与磷酸二酯酶基因。扩增这两种基因时，因反应体系 中 不同，导致PCR的退火温度、延伸时间也不同。 (2)启动子1与 结合，即可驱动目的基因转录；启动子2需先与转录激活因子结合才能驱动目的基因转录。构建载体3时，不能用启动子1替代启动子2的理由是 。 (3)血糖升高时，GLP-1一方面可促进胰岛B细胞分泌胰岛素，降低血糖浓度；另一方面能抑制胰岛A细胞分泌 ，抑制 （2分），从而减少血糖的来源。从免疫角度推测，用水凝胶胶囊包裹人源HEK-293细胞的目的是 。 (4)为验证GLP-1基因是否实现有效表达，一般要先提取GLP-1，再用 技术检测其表达水平。本实验也能通过测定分泌型碱性磷酸酶的活性，间接反映GLP-1基因的表达情况，图2是相关检测结果。分析图2可知，选用 照射更有利于GLP-1基因的表达。停止光照后，GLP-1基因的表达在短时间内迅速下降，结合图1推测原因是 。与直接注射GLP-1相比，该糖尿病治疗模型的优点是 。 22.（11分）LL-37是人体内一种重要抗菌肽，但易被蛋白酶分解。为解决上述问题，研究人员运用基因工程技术将类弹性蛋白多肽（ELP）融合表达至LL-37抗菌肽的C-末端，从而将LL-37包裹在ELP纳米纤维内部。ELP具有显著热响应性，当温度低于可逆相变温度（T）时ELP呈溶解状态，反之则沉淀。下图为构建融合蛋白表达载体的流程，其中pUC19和为质粒，含有前导肽序列，其表达产物可引导融合蛋白分泌至细胞外；GFP表示绿色荧光蛋白基因，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。请回答下列问题： (1)已知LL-37基因编码序列为5'-TTGTTGGGTGACTTC-（中间省略81个碱基）-CCAAGAACTGAATCC-3'，限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列和切割位点分别为5'-G↓AATTC-3'、5'-G↓GATCC-3'。为了使LL-37基因正确克隆到pUC19质粒中，利用PCR技术扩增LL-37基因时需在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，该对引物的序列应选用 （在a～d中选填）。 a．5'-CGGAATTCTTGTTGGGTGACTTC-3' b．5'-CGGAATTCCTTCAGTGGGTTGTT-3' c．5'-CGGGATCCCCAAGAACTGAATCC-3' d．5'-CGGGATCCGGATTCAGTTCTTGG-3' (2)用按上图所示方法构建的质粒转化处于 态的大肠杆菌，培养后挑取单克隆菌落，接种到含 的液体培养基中，16h后提取质粒经双酶切、电泳鉴定，结果如图2。若质粒构建成功，则第5泳道会出现 个条带，对于片段大小符合预期的质粒，还需要通过 进一步确认序列的正确性。 (3)将构建成功的pET25b+-LL-37-ELP质粒转化进大肠杆菌，培养24h，经培养液离心→取细菌→破坏细胞→离心→取 （填“沉淀物”或“上清液”）→调节温度至 （填“>T”、“=T”或“<T”）→分离纯化LL-37-ELP-GFP融合蛋白。该融合蛋白置于荧光显微镜下可观察到 。 (4)为了探究LL-37-ELP对脓毒症的治疗效果，研究人员利用LL-37、LL-37-ELP以及ELP对盲肠结扎穿刺手术（CLP）诱导的脓毒症模型小鼠进行治疗，结果如图3。结果表明 （2分）。 23.（11分）SBPase基因编码的酶是卡尔文循环的关键酶。为提高甜菜的光合效率和产量，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，获得如图1的表达载体。请回答下列问题： (1)图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，还未指示出的结构元件有 ，其中启动子的功能是 。 (2)人工合成SBPase基因后进行扩增，正确选择引物后对目的基因进行PCR，PCR程序设置如图2所示，其中，60℃20s环节的目的是 。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，一般还需要添加Mg2+，添加Mg2+的作用是 。 (3)获取的PCR产物还需要经 鉴定。扩增后的PCR产物需先与 混合后再注入 （填“+”或“-”）电极端的点样孔内（提示：通常DNA分子片段带负电荷）。电泳之后切割凝胶再将其溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。 (4)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有氨苄青霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项有 。 (5)为便于纯化SBPase酶蛋白，现改进生产路线，另将小段TAP基因序列（标签）与SBPase基因相连，构建出能表达SBPase酶融合蛋白的重组DNA（如图3，F1、F2、R1、R2表示引物）。为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有 （填字母）。 24.（15分）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列—（GTTCCTGGTGTTGGC）50—限制酶b识别序列，50为重复次数。 (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。质粒PET-SOD在用EcoR I酶切前后含有的游离磷酸基团的数目分别是 个。 (2)ELP50与SOD在 酶作用下形成磷酸二酯键连到一起形成融合基因SOD-ELP50，发生的变异类型是 。 (3)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。 (4)用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 （2分） 。在进行PCR时，除了图中提供的物质，还需要 。 (5)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录产生mRNA，经翻译过程合成SOD-ELP50蛋白。研究发现，一个mRNA分子上会与多个核糖体结合，意义是 。 (6)已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，不考虑合成的SOD-ELP50蛋白相对分子质量约为 （2分）。 (7)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图所示。 20℃时，加入NaCl后实验结果是 ；100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 试题 第3页（共8页） 试题 第4页（共8页） 试题 第1页（共8页） 试题 第2页（共8页） 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第3章 基因工程 （测试时间：75分钟 满分：100分） 一、单项选择题：（本部分包括15题，每题2分，共计30分。每题只有一个选项最符合题意。) 1.cDNA 文库是以特定组织或细胞在某一发育阶段表达的mRNA 为模板，通过逆转录酶合成互补DNA（cDNA），再将其克隆至载体构建的基因集合。该文库仅包含表达基因的编码序列，反映特定条件下的转录信息。利用该文库便于筛选功能基因，广泛应用于基因克隆、功能研究、真核生物基因表达及差异表达分析，下列叙述正确的有几项（　　） ①水稻cDNA 文库中的基因不含有启动子所对应的序列 ②水稻cDNA 文库中的基因不含有终止密码子所对应的序列 ③构建cDNA 文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和 DNA 聚合酶等 ④从不同组织细胞中提取的mRNA 建立的cDNA 文库不完全相同 ⑤通过定向改变cDNA 序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程 A．四项 B．三项 C．一项 D．零项 2．2023年2月7日，美国马里兰医学院进行了全球首例猪心脏移植进入人体的手术，如图为猪心脏移植过程图，下列有关叙述正确的是（　　）    A．D猪出生后完全呈现A猪的遗传性状 B．从免疫角度看移植到人体的猪心属于抗体 C．植入的基因是位于DNA上与遗传有关的片段 D．往A猪的体细胞中植入人类基因，采用了克隆技术 3．下列关于高中生物学“载体”的叙述，正确的是（　　） A．载体蛋白转运物质时自身构象不会发生改变 B．作为基因工程载体的质粒仅存在于原核生物中 C．氢载体NADH在叶绿体基质中可用于碳固定过程 D．腺苷三磷酸在生物体内可作为能量和磷酸的载体 4. 图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindIII切割位点。AluI限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（　　） A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性 B．HindIII切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂 C．产前诊断时，该致病基因可选用HindIII限制酶开展酶切鉴定 D．两种限制酶酶切形成的末端类型不同，均可用E.coliDNA连接酶连接 5．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图），利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列有关叙述错误的是（　　） A．Cas9蛋白能作用于目的基因的磷酸二酯键 B．sgRNA可以在逆转录酶作用下催化合成 C．sgRNA序列越短则编辑对象出错率越高 D．基因编辑技术引起的变异属于基因突变 6．2025年研究显示，一种新型DNA聚合酶可耐受92℃高温。其通过引入古菌特有糖基化修饰位点形成保护性水合层，进而显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是（　　） A．当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应 B．这类耐高温的DNA聚合酶的基本单位是脱氧核苷酸 C．为维持较高的催化活性，适宜在70℃~75℃下保存 D．对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性 7. 人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 8.下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（　　） A．DNA体内复制与体外复制（PCR）所需能量均只来自dNTP B．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 C．PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶 D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物 9.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A． 通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 B． 在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 B． 表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 D．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 10．如图表示基因工程化干细胞通过分泌外泌体（能产生调控基因表达的RNA）修复受损细胞的过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．将目标基因导入干细胞前，仅需DNA连接酶构建含目标基因的表达载体 B．外泌体携带目标基因可直接整合到受损细胞的基因组中实现修复 C．相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险 D．若受损细胞是胰岛B细胞，该外泌体可直接产生胰岛素 11．某科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌（工程菌），可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如下图所示，天然大肠杆菌不含有图中所示基因。（GFP基因为绿色荧光蛋白基因）。下列有关说法正确的是（　　） A．启动子1、2是DNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程 B．转基因工程菌中的GFP基因表达产物还需要内质网等细胞器的加工 C．当环境中存在四环素时，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光 D．转基因工程菌中TetR基因的表达是GFP基因表达的前提条件 12．下列有关生物技术与工程的相关叙述正确的是（　　） A．利用DNA可溶于95%酒精的性质去除部分不溶的杂质 B．PCR技术中复性的温度既要“足够低”又要“足够高” C．将二苯胺试剂加入溶解了DNA的NaCl溶液中溶液呈蓝色 D．电泳时凝胶的浓度与样品的大小有关，电压的大小与凝胶的宽度有关 13．某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法正确的是（　　） A．制备的膀胱生物反应器，只有膀胱细胞中才含有W蛋白基因 B．可使用显微注射法将含有W蛋白基因的表达载体导入膀胱细胞中 C．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白使用的启动子相同 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 14．下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述正确的是（　　） A．上述技术流程属于蛋白质工程的范畴 B．通过电泳检测，可确认基因突变是否成功 C．上述过程需要人工设计核糖核苷酸片段作为引物 D．导入受体细胞后复制产生的子代 DNA 大多为突变型 15．通过蛋白质工程将胰岛素B链第28位脯氨酸替换为天冬氨酸，研制成“德谷胰岛素”具有快速和长效的特点，极大改善糖尿病患者的血糖控制灵活性。下列叙述错误的是（　　） A．若使用大肠杆菌作为受体细胞，直接产生的胰岛素可能不具有生物活性 B．“德谷胰岛素”的最终获得还需经过基因工程，并验证产品的功能 C．该过程一般不可通过对天然胰岛素的氨基酸进行直接替换完成 D．根据中心法则可推断出“德谷胰岛素”的唯一脱氧核苷酸序列 2、 多项选择题：(本题包括4小题，每小题3分，共12分。每小题给出的四个选项中，有不止一个选项符合题意。每小题全选对者得3分，选对但不全的得1分，错选或不答的得0分。) 16.如图表示利用大肠杆菌生产干扰素的部分操作，质粒A中的lacZ基因的表达产物β-半乳糖苷酶可分解无色化合物X-gal而使菌落显蓝色，不含lacZ基因的菌落则呈白色。表格为不同限制酶的识别及切割位点。下列叙述正确的是（　　） 限制酶 BamHI BclI SmaI EcoRI 识别序列及切割位点(5’→3’) G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG G↓AATTC A．扩增干扰素基因时在一对引物的5’端分别添加BamHI及SmaI识别序列 B．受体大肠杆菌需具备氨苄青霉素敏感和β-半乳糖苷酶合成缺陷等特征 C．转化后的菌液经稀释涂布后，挑取蓝色的单菌落作为目标工程菌 D．构建重组质粒B时，需用到BamHI、BclI、SmaI、T4DNA连接酶 17. 下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。有关说法错误的是（　　） A． 应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列 B．将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物 D．图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割 18. 已知T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。对该植株自交后代F1利用图1所示引物分别进行PCR检测，电泳结果如图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．以Aa植株为父本与野生型杂交，F1中卡那霉素抗性植株的比例为1/2 B．子代数量太少导致F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株 C．仅考虑基因A和a，该植株会产生2种基因型的可育花粉 D．根据电泳结果，图2中Ⅰ型植株占比为2/3 19．苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白 Cry具有杀虫毒性，但 Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry 蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将 Cry 蛋白第282位、第283 位的丙氨酸和亮 氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（　　） A．改造 Cry 蛋白应从 Cry 蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构 B．Cry蛋白的毒性提高了3~7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构 C．使用蛋白质工程改造 Cry蛋白过程中需要使用限制酶和 DNA 连接酶 D．对Cry 蛋白的改造是通过直接替换 Cry 蛋白中的氨基酸来实现的 3、 非选择题：(本题共5小题，除特别标注外，每空1分，共58分。) 20.（10分）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的 键，产生 （类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端 （填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有 、 。过程②需要的酶有 （2分）。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为 （接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列 （接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有 。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 21.（11分）胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是治疗糖尿病的重要药物。某团队将相关基因连入载体后导入人源HEK-293细胞，再将导入成功的细胞移植至小鼠体内，成功构建出光照下可合成GLP-1的糖尿病治疗模型小鼠，机制如图1所示。请回答下列问题： (1) 构建载体1前需分别扩增光敏色素基因与磷酸二酯酶基因。扩增这两种基因时，因反应体系 中 不同，导致PCR的退火温度、延伸时间也不同。 (2)启动子1与 结合，即可驱动目的基因转录；启动子2需先与转录激活因子结合才能驱动目的基因转录。构建载体3时，不能用启动子1替代启动子2的理由是 。 (3)血糖升高时，GLP-1一方面可促进胰岛B细胞分泌胰岛素，降低血糖浓度；另一方面能抑制胰岛A细胞分泌 ，抑制 （2分），从而减少血糖的来源。从免疫角度推测，用水凝胶胶囊包裹人源HEK-293细胞的目的是 。 (4)为验证GLP-1基因是否实现有效表达，一般要先提取GLP-1，再用 技术检测其表达水平。本实验也能通过测定分泌型碱性磷酸酶的活性，间接反映GLP-1基因的表达情况，图2是相关检测结果。分析图2可知，选用 照射更有利于GLP-1基因的表达。停止光照后，GLP-1基因的表达在短时间内迅速下降，结合图1推测原因是 。与直接注射GLP-1相比，该糖尿病治疗模型的优点是 。 22.（11分）LL-37是人体内一种重要抗菌肽，但易被蛋白酶分解。为解决上述问题，研究人员运用基因工程技术将类弹性蛋白多肽（ELP）融合表达至LL-37抗菌肽的C-末端，从而将LL-37包裹在ELP纳米纤维内部。ELP具有显著热响应性，当温度低于可逆相变温度（T）时ELP呈溶解状态，反之则沉淀。下图为构建融合蛋白表达载体的流程，其中pUC19和为质粒，含有前导肽序列，其表达产物可引导融合蛋白分泌至细胞外；GFP表示绿色荧光蛋白基因，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。请回答下列问题： (1)已知LL-37基因编码序列为5'-TTGTTGGGTGACTTC-（中间省略81个碱基）-CCAAGAACTGAATCC-3'，限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列和切割位点分别为5'-G↓AATTC-3'、5'-G↓GATCC-3'。为了使LL-37基因正确克隆到pUC19质粒中，利用PCR技术扩增LL-37基因时需在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，该对引物的序列应选用 （在a～d中选填）。 a．5'-CGGAATTCTTGTTGGGTGACTTC-3' b．5'-CGGAATTCCTTCAGTGGGTTGTT-3' c．5'-CGGGATCCCCAAGAACTGAATCC-3' d．5'-CGGGATCCGGATTCAGTTCTTGG-3' (2)用按上图所示方法构建的质粒转化处于 态的大肠杆菌，培养后挑取单克隆菌落，接种到含 的液体培养基中，16h后提取质粒经双酶切、电泳鉴定，结果如图2。若质粒构建成功，则第5泳道会出现 个条带，对于片段大小符合预期的质粒，还需要通过 进一步确认序列的正确性。 (3)将构建成功的pET25b+-LL-37-ELP质粒转化进大肠杆菌，培养24h，经培养液离心→取细菌→破坏细胞→离心→取 （填“沉淀物”或“上清液”）→调节温度至 （填“>T”、“=T”或“<T”）→分离纯化LL-37-ELP-GFP融合蛋白。该融合蛋白置于荧光显微镜下可观察到 。 (4)为了探究LL-37-ELP对脓毒症的治疗效果，研究人员利用LL-37、LL-37-ELP以及ELP对盲肠结扎穿刺手术（CLP）诱导的脓毒症模型小鼠进行治疗，结果如图3。结果表明 （2分）。 23.（11分）SBPase基因编码的酶是卡尔文循环的关键酶。为提高甜菜的光合效率和产量，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，获得如图1的表达载体。请回答下列问题： (1)图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，还未指示出的结构元件有 ，其中启动子的功能是 。 (2)人工合成SBPase基因后进行扩增，正确选择引物后对目的基因进行PCR，PCR程序设置如图2所示，其中，60℃20s环节的目的是 。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，一般还需要添加Mg2+，添加Mg2+的作用是 。 (3)获取的PCR产物还需要经 鉴定。扩增后的PCR产物需先与 混合后再注入 （填“+”或“-”）电极端的点样孔内（提示：通常DNA分子片段带负电荷）。电泳之后切割凝胶再将其溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。 (4)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有氨苄青霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项有 。 (5)为便于纯化SBPase酶蛋白，现改进生产路线，另将小段TAP基因序列（标签）与SBPase基因相连，构建出能表达SBPase酶融合蛋白的重组DNA（如图3，F1、F2、R1、R2表示引物）。为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有 （填字母）。 24.（15分）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列—（GTTCCTGGTGTTGGC）50—限制酶b识别序列，50为重复次数。 (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。质粒PET-SOD在用EcoR I酶切前后含有的游离磷酸基团的数目分别是 个。 (2)ELP50与SOD在 酶作用下形成磷酸二酯键连到一起形成融合基因SOD-ELP50，发生的变异类型是 。 (3)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。 (4)用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 （2分） 。在进行PCR时，除了图中提供的物质，还需要 。 (5)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录产生mRNA，经翻译过程合成SOD-ELP50蛋白。研究发现，一个mRNA分子上会与多个核糖体结合，意义是 。 (6)已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，不考虑合成的SOD-ELP50蛋白相对分子质量约为 （2分）。 (7)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图所示。 20℃时，加入NaCl后实验结果是 ；100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第3章 基因工程 （测试时间：75分钟 满分：100分） 1、 单项选择题：（本部分包括15题，每题2分，共计30分。每题只有一个选项最符合题意。) 1.cDNA 文库是以特定组织或细胞在某一发育阶段表达的mRNA 为模板，通过逆转录酶合成互补DNA（cDNA），再将其克隆至载体构建的基因集合。该文库仅包含表达基因的编码序列，反映特定条件下的转录信息。利用该文库便于筛选功能基因，广泛应用于基因克隆、功能研究、真核生物基因表达及差异表达分析，下列叙述正确的有几项（　　） ①水稻cDNA 文库中的基因不含有启动子所对应的序列 ②水稻cDNA 文库中的基因不含有终止密码子所对应的序列 ③构建cDNA 文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和 DNA 聚合酶等 ④从不同组织细胞中提取的mRNA 建立的cDNA 文库不完全相同 ⑤通过定向改变cDNA 序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程 A．四项 B．三项 C．一项 D．零项 【答案】A 【解析】①启动子是DNA上的序列，用于启动基因转录，而cDNA文库是以mRNA为模板逆转录形成的，mRNA是转录的产物，不包含启动子对应的序列，所以水稻cDNA文库中的基因不含有启动子所对应的序列，①正确； ②终止密码子在mRNA上，cDNA是由mRNA逆转录而来，所以水稻cDNA文库中的基因含有终止密码子所对应的序列，②错误； ③构建cDNA文库时，首先用逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA单链，再用DNA聚合酶合成cDNA双链，之后用限制酶切割载体和cDNA片段，以便将cDNA 片段插入载体，所以构建cDNA文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和DNA聚合酶等，③正确； ④不同组织细胞中基因是选择性表达的，即转录出的mRNA不同，那么以这些不同的mRNA为模板建立的 cDNA文库不完全相同，④正确； ⑤蛋白质工程是通过改造基因（包括cDNA序列）来定向改造蛋白质结构，所以通过定向改变cDNA序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程，⑤正确。 综上所述②错误，①③④⑤正确，正确的叙述有四项。 故选A。 2．2023年2月7日，美国马里兰医学院进行了全球首例猪心脏移植进入人体的手术，如图为猪心脏移植过程图，下列有关叙述正确的是（　　）    A．D猪出生后完全呈现A猪的遗传性状 B．从免疫角度看移植到人体的猪心属于抗体 C．植入的基因是位于DNA上与遗传有关的片段 D．往A猪的体细胞中植入人类基因，采用了克隆技术 【答案】C 【解析】细胞核中含有主要的遗传物质，在A猪的体细胞中植入人体基因，其细胞核中遗传物质发生了变化，且D猪含有来自B猪的质基因，故D猪出生后不会完全呈现A猪的遗传性状，A错误。抗原是能引起淋巴细胞产生抗体的物质，抗原包括进入人体的微生物等病原体、异物、异体器官等，可见，从免疫角度看移植到人体的猪心属于抗原，B错误。基因通常是包含遗传信息（具有遗传效应）的DNA片段，猪与人的遗传物质是DNA，因此植入的基因是位于DNA上与遗传有关的片段，C正确。转基因技术是把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术，所以往A猪的体细胞中植入人类基因，采用了转基因技术，D错误。 故选C。 3．下列关于高中生物学“载体”的叙述，正确的是（　　） A．载体蛋白转运物质时自身构象不会发生改变 B．作为基因工程载体的质粒仅存在于原核生物中 C．氢载体NADH在叶绿体基质中可用于碳固定过程 D．腺苷三磷酸在生物体内可作为能量和磷酸的载体 【答案】D 【解析】载体蛋白转运物质时需与物质结合，并发生自身构象的改变以完成运输，A错误；质粒不仅存在于原核生物中，某些真核生物（如酵母菌）也含有质粒，B错误；叶绿体基质中暗反应的碳固定过程需要NADPH提供氢和能量，而NADH参与呼吸作用，C错误；ATP水解时释放能量并转移磷酸基团，可作为能量和磷酸的载体，D正确。 故选D。 4. 图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindIII切割位点。AluI限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（　　） A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性 B．HindIII切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂 C．产前诊断时，该致病基因可选用HindIII限制酶开展酶切鉴定 D．两种限制酶酶切形成的末端类型不同，均可用E.coliDNA连接酶连接 【答案】C 【解析】突变是不定向的，所以突变具有可逆性，A错误；HindⅢ切割基因A时，破坏磷酸二酯键，B错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，C正确；E.coliDNA连接酶连接平末端的效率低于T4DNA连接酶，而AluI限制酶切割DNA形成的是平末端，应该用T4DNA连接酶，D错误。 故选C。 5．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图），利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列有关叙述错误的是（　　） A．Cas9蛋白能作用于目的基因的磷酸二酯键 B．sgRNA可以在逆转录酶作用下催化合成 C．sgRNA序列越短则编辑对象出错率越高 D．基因编辑技术引起的变异属于基因突变 【答案】B 【解析】Cas9蛋白是一种核酸内切酶，相当于限制酶，能作用于目的基因的磷酸二酯键，将DNA分子切断，从而实现对DNA的编辑，A正确；sgRNA（单链向导RNA）是通过转录形成的，而逆转录酶是催化以RNA为模板合成DNA的酶，不能催化合成sgRNA，B错误；sgRNA序列越短，其特异性越低，与非目标DNA序列结合的可能性就越大，从而导致编辑对象出错率越高，C正确；基因编辑技术是对DNA分子上的基因进行定点修饰，导致基因结构的改变，这种变异属于基因突变，D正确。 故选B。 6．2025年研究显示，一种新型DNA聚合酶可耐受92℃高温。其通过引入古菌特有糖基化修饰位点形成保护性水合层，进而显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是（　　） A．当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应 B．这类耐高温的DNA聚合酶的基本单位是脱氧核苷酸 C．为维持较高的催化活性，适宜在70℃~75℃下保存 D．对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性 【答案】D 【解析】DNA聚合酶催化反应需模板DNA、引物及脱氧核苷酸，仅模板和底物无法启动反应，A错误；DNA聚合酶的本质是蛋白质，其基本单位为氨基酸，而脱氧核苷酸是DNA的基本单位，B错误；酶保存通常需低温（如4℃）以维持活性，高温保存会破坏酶结构，即使耐高温酶长期保存仍需低温，C错误；通过突变特定氨基酸位点可优化酶结构域稳定性，如糖基化修饰以提升耐热性，进一步突变可能增强特性，D正确。 故选D。 7. 人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 【答案】B 【解析】根据图示，正常引物延伸方向是从5'到3'，突变引物延伸方向也是从5'到3'，按照碱基互补配对原则，最终得到的突变序列应该是5'-AAGCCC-3’，A正确；PCR扩增过程中，一条为突变引物，一条为正常引物，经过2轮循环即可得到目标基因，其中一个DNA分子只含有正常引物，一个DNA分子只含有突变引物，剩下的DNA分子既含有正常引物又含有突变引物，30轮PCR后，得到230个DNA分子，可见突变基因多于正常基因，B错误；PCR每次循环一 般可以分为变性（超过90℃）、复性（50℃左右）和延伸（72℃左右）三步，PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高，C正确；PCR 产物电泳主要是用于检测 PCR 扩增是否成功，即是否得到了预期大小的 DNA 片段。但仅通过电泳检测 PCR 产物，并不能确定基因是否改造成功。基因改造成功与否不仅取决于是否扩增出特定片段，还涉及到基因序列的精确改变、是否插入或缺失特定碱基对、基因表达情况以及是否产生预期的功能变化等多方面。电泳只能直观呈现 DNA 片段的大小和数量，无法反映基因内部序列的精确改变以及功能上的变化，D正确。 故选B。 8.下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（　　） A．DNA体内复制与体外复制（PCR）所需能量均只来自dNTP B．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 C．PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶 D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物 【答案】C 【解析】体内DNA复制由ATP（解旋）、dNTP提供能量，体外DNA复制（PCR）由dNTP和加热提供能量，A错误；根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，B错误；DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+，C正确；引物③的5′端添加了某序列，经过第 1 次循环，得到的1个 DNA 分子中有 1 条链含有该序列；经过第 2 次循环，得到的1个 DNA 分子的两条链均含有该序列，所以至少需经 2 次循环就可获得该序列的双链产物，D错误。 故选C。 9.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　） A． 通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 B． 在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 B． 表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 D．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 【答案】A 【解析】双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，A正确；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，B错误；转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，C错误；如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，D错误。 故选A。 10．如图表示基因工程化干细胞通过分泌外泌体（能产生调控基因表达的RNA）修复受损细胞的过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．将目标基因导入干细胞前，仅需DNA连接酶构建含目标基因的表达载体 B．外泌体携带目标基因可直接整合到受损细胞的基因组中实现修复 C．相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险 D．若受损细胞是胰岛B细胞，该外泌体可直接产生胰岛素 【答案】C 【解析】构建含目标基因的表达载体时，不仅需要DNA连接酶，还需要限制酶来切割运载体和获取目的基因，A错误；外泌体是分泌的能产生调控基因表达的RNA，并不是携带目标基因直接整合到受损细胞的基因组中，而是通过调控基因表达来实现修复，B错误；直接移植干细胞，干细胞作为外来细胞，容易引起免疫排斥反应，而外泌体是细胞分泌的物质，相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险，C正确；外泌体是产生调控基因表达的RNA，不能直接产生胰岛素，胰岛素是由胰岛B细胞中的相关基因表达产生的，D错误。 故选C。 11．某科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌（工程菌），可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如下图所示，天然大肠杆菌不含有图中所示基因。（GFP基因为绿色荧光蛋白基因）。下列有关说法正确的是（　　） A．启动子1、2是DNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程 B．转基因工程菌中的GFP基因表达产物还需要内质网等细胞器的加工 C．当环境中存在四环素时，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光 D．转基因工程菌中TetR基因的表达是GFP基因表达的前提条件 【答案】C 【解析】启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程，而不是DNA聚合酶，DNA聚合酶参与DNA的复制过程，A错误；大肠杆菌是原核生物，原核生物没有内质网等复杂的细胞器，B错误；从图中可以看出，当环境中存在四环素时，四环素与TetR蛋白结合，使得TetR蛋白对GFP基因的抑制作用被解除，从而GFP基因能够表达，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光，C正确；由图可知，TetR基因表达产生的TetR蛋白会抑制GFP基因的表达，所以TetR基因的表达不是GFP 基因表达的前提条件，D错误。 故选C。 12．下列有关生物技术与工程的相关叙述正确的是（　　） A．利用DNA可溶于95%酒精的性质去除部分不溶的杂质 B．PCR技术中复性的温度既要“足够低”又要“足够高” C．将二苯胺试剂加入溶解了DNA的NaCl溶液中溶液呈蓝色 D．电泳时凝胶的浓度与样品的大小有关，电压的大小与凝胶的宽度有关 【答案】B 【解析】DNA不溶于冷酒精，实验中用冷却的95%酒精沉淀DNA以去除杂质，而非利用其溶解性，A错误；PCR技术中，复性温度需确保引物与模板DNA特异性结合（足够低），同时避免非特异性结合（足够高），通常为55℃左右，符合操作要求，B正确；二苯胺试剂鉴定DNA时，需将试剂加入DNA溶液后沸水浴加热才能呈现蓝色，直接混合不显色，C错误；电泳时，凝胶浓度影响DNA片段迁移速率（浓度越高，小分子迁移越快），电压大小影响迁移速度，但与凝胶长度（非宽度）相关，D错误。 故选B。 13．某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路来制备山羊膀胱生物反应器，可以从转基因动物尿液中分离纯化出所需要的W蛋白。下列说法正确的是（　　） A．制备的膀胱生物反应器，只有膀胱细胞中才含有W蛋白基因 B．可使用显微注射法将含有W蛋白基因的表达载体导入膀胱细胞中 C．用膀胱生物反应器和乳腺生物反应器生产W蛋白使用的启动子相同 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受受体生物性别和年龄限制 【答案】D 【解析】转基因动物的所有体细胞均由受精卵分裂分化而来，均含有W蛋白基因，但仅在膀胱细胞中表达，A错误；显微注射法通常用于将目的基因导入受精卵，而非体细胞（如膀胱细胞）。体细胞常采用其他方法（如电穿孔法或病毒载体），B错误；乳腺生物反应器使用乳腺组织特异性启动子（如乳蛋白基因启动子），而膀胱生物反应器需用膀胱上皮细胞特异性启动子，两者不同，C错误；乳腺生物反应器需雌性个体且需泌乳期才能产蛋白，而膀胱生物反应器通过尿液持续分泌W蛋白，不受性别和年龄限制，D正确。 故选D。 14．下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述正确的是（　　） A．上述技术流程属于蛋白质工程的范畴 B．通过电泳检测，可确认基因突变是否成功 C．上述过程需要人工设计核糖核苷酸片段作为引物 D．导入受体细胞后复制产生的子代 DNA 大多为突变型 【答案】A 【解析】蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表型性状，合成新的蛋白质，上述技术流程属于蛋白质工程的范畴，A正确；电泳可用于检测PCR产物或质粒大小，但确认突变需结合测序或限制性酶切分析，仅凭电泳无法直接确认突变，B错误；定点突变通常使用脱氧核糖核酸（DNA）作为引物，C错误；定点突变通常通过PCR或质粒复制实现，但子代DNA是否为突变型取决于突变效率和筛选方式，若未特别筛选，据图示过程，野生型和突变型可能相等，D错误。 故选A。 15．通过蛋白质工程将胰岛素B链第28位脯氨酸替换为天冬氨酸，研制成“德谷胰岛素”具有快速和长效的特点，极大改善糖尿病患者的血糖控制灵活性。下列叙述错误的是（　　） A．若使用大肠杆菌作为受体细胞，直接产生的胰岛素可能不具有生物活性 B．“德谷胰岛素”的最终获得还需经过基因工程，并验证产品的功能 C．该过程一般不可通过对天然胰岛素的氨基酸进行直接替换完成 D．根据中心法则可推断出“德谷胰岛素”的唯一脱氧核苷酸序列 【答案】D 【解析】大肠杆菌缺乏内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工，直接产生的多肽链无生物活性，A正确；蛋白质工程需通过基因工程表达改造后的基因，并验证产物功能，B正确；蛋白质工程通过改造基因来实现对蛋白质结构的改变，直接替换蛋白质中的氨基酸在技术上不可行，C正确；中心法则无法确定唯一DNA序列，因不同密码子可能对应同一氨基酸（密码子简并性），D错误。 故选D。 2、 多项选择题：(本题包括4小题，每小题3分，共12分。每小题给出的四个选项中，有不止一个选项符合题意。每小题全选对者得3分，选对但不全的得1分，错选或不答的得0分。) 16.如图表示利用大肠杆菌生产干扰素的部分操作，质粒A中的lacZ基因的表达产物β-半乳糖苷酶可分解无色化合物X-gal而使菌落显蓝色，不含lacZ基因的菌落则呈白色。表格为不同限制酶的识别及切割位点。下列叙述正确的是（　　） 限制酶 BamHI BclI SmaI EcoRI 识别序列及切割位点(5’→3’) G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG G↓AATTC A．扩增干扰素基因时在一对引物的5’端分别添加BamHI及SmaI识别序列 B．受体大肠杆菌需具备氨苄青霉素敏感和β-半乳糖苷酶合成缺陷等特征 C．转化后的菌液经稀释涂布后，挑取蓝色的单菌落作为目标工程菌 D．构建重组质粒B时，需用到BamHI、BclI、SmaI、T4DNA连接酶 【答案】ABD 【解析】设计干扰素基因的引物时，由于目的基因中间有BclI的识别序列，因此不能在引物中设计该序列，而只能选择与该引物能产生相同黏性末端的引物BamHI，即需要在两种引物的5'端分别添加BamHI、SmaI酶的识别序列，A正确；质粒含氨苄青霉素抗性基因，受体大肠杆菌需氨苄青霉素敏感，质粒的 lacZ基因控制 β-半乳糖苷酶合成，受体需β-半乳糖苷酶合成缺陷，B正确；筛选时，将转化后的菌液经稀释后接种于含X-gal和氨苄青霉素的培养基上，含有重组质粒的大肠杆菌因具有氨苄青霉素抗性而能在培养基上生长，又因为其lacZ基因被破坏，不能合成β-半乳糖苷酶，无法分解无色化合物X-gal，所以菌落呈白色，经培养后挑取白色的单菌落，即为目标工程菌，C错误；需要选用Bc1I、Smal酶切割质粒A，用BamHI、SmaI切割目的基因，SmaI切割后产生的是平末端，可通过T4DNA连接酶连接获得重组质粒，D正确。 故选ABD。 17. 下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。有关说法错误的是（　　） A． 应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列 B．将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物 D．图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割 【答案】ACD 【解析】耐高温的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，A错误；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置，B正确；农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，C错误；图中T-DNA两侧应该用相同限制酶切割，以便酶切后连接成环状，D错误。 故选ACD。 18. 已知T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。对该植株自交后代F1利用图1所示引物分别进行PCR检测，电泳结果如图2所示。下列叙述错误的是（　　） A．以Aa植株为父本与野生型杂交，F1中卡那霉素抗性植株的比例为1/2 B．子代数量太少导致F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株 C．仅考虑基因A和a，该植株会产生2种基因型的可育花粉 D．根据电泳结果，图2中Ⅰ型植株占比为2/3 【答案】ABC 【解析】根据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失（a基因）会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0，A错误；F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株，B错误；仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为A0Aa（2号染色体为Aa，3号染色体为A0）。该植株会产生4种基因型的花粉，即AA、A0、Aa、a0，其中a0不育，即产生3种可育基因型的花粉，C错误；该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0，均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F₁的基因型为AAAA：AAA0：AAAa：AAa0：AA00：Aa00：AAaa：A0a0：Aaa0=1：2：2：3：1：1：1：1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR扩增出600bp（a）和900bp（A）条带。Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900bp条带。其中Ⅰ型植株占比为2/3，D正确。 故选ABC。 19．苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白 Cry具有杀虫毒性，但 Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry 蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry 蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将 Cry 蛋白第282位、第283 位的丙氨酸和亮 氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（　　） A．改造 Cry 蛋白应从 Cry 蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构 B．Cry蛋白的毒性提高了3~7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构 C．使用蛋白质工程改造 Cry蛋白过程中需要使用限制酶和 DNA 连接酶 D．对Cry 蛋白的改造是通过直接替换 Cry 蛋白中的氨基酸来实现的 【答案】AD 【解析】对Cry蛋白的改造是通过改造Cry蛋白的相关基因来实现的，改造Cry蛋白应从Cry蛋白的预期功能出发设计其特有的结构，并改造或合成相关基因，A错误；蛋白质的结构决定功能，Cry蛋白的毒性提高了3~7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构，B正确；白质工程的基础是基因工程，需要改造或合成相关的基因，故使用蛋白质工程改造Cry蛋白过程中需要使用限制酶和DNA连接酶，C正确；蛋蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，D错误。 故选AD。 3、 非选择题：(本题共5小题，除特别标注外，每空1分，共58分。) 20.（10分）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的 键，产生 （类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端 （填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有 、 。过程②需要的酶有 （2分）。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为 （接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列 （接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有 。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 【答案】（10分） (1)磷酸二酯 黏性 可能相同 (2)不同PCR反应的退火温度有差异 不同引物间会互补配对 BsmBⅠ酶、DNA连接酶（2分） (3)5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (4)abd 【解析】（1）限制性核酸内切酶切割的是DNA中的磷酸二酯键。由图1可知，BsmBⅠ切割后产生的是黏性末端。因为其识别序列及切割位点位于接头序列两侧，如果接头序列相同切割后产生的两个末端是相同的，如果接头序列不相同切割后产生的两个末端是不相同的，所以BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端可能相同。 （2）PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，一方面是因为不同片段长度不同，PCR反应条件（如退火温度等）可能不同，在同一体系中难以同时满足；另一方面，不同片段的引物都含有BsmBⅠ识别序列，不同引物之间可能会互补配对，影响PCR的进行。过程②是将片段与质粒连接形成重组质粒，需要的酶是限制酶（BsmBⅠ酶）和DNA连接酶。 （3）据图可知片段1和片段2经PCR后需要连接在一起，即R1被切割后形成的黏性末端需和F2被切割后形成的黏性末端互补，据图1可知，限制性核酸内切酶BsmBⅠ切割后的黏性末端为接头序列，由于R1序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列由识别序列和接头序列以及片段2部分序列组成，即5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3'。由R1序列可知本方案接头序列属于片段1的一部分，所以另一套方案中F2中的接头序列可以用片段二的一部分（前4个碱基）即5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'，而R1则为5’CGTCTCNgcacCGACCAAAT…3’ （4）通过设计接头序列，可以在任意位置引入酶切位点，所以不受天然酶切位点的限制，a符合题意；从图2可以看出，多个片段可以一次性有序连接，b符合题意；该技术可以实现多片段的连接，有利于小片段DNA的高效连接，c不符合题意；片段1~n之间通过接头序列碱基互补原则连接，不会引入外源序列实现无缝连接，d符合题意。 故选abd。 21.（11分）胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是治疗糖尿病的重要药物。某团队将相关基因连入载体后导入人源HEK-293细胞，再将导入成功的细胞移植至小鼠体内，成功构建出光照下可合成GLP-1的糖尿病治疗模型小鼠，机制如图1所示。请回答下列问题： (1) 构建载体1前需分别扩增光敏色素基因与磷酸二酯酶基因。扩增这两种基因时，因反应体系 中 不同，导致PCR的退火温度、延伸时间也不同。 (2)启动子1与 结合，即可驱动目的基因转录；启动子2需先与转录激活因子结合才能驱动目的基因转录。构建载体3时，不能用启动子1替代启动子2的理由是 。 (3)血糖升高时，GLP-1一方面可促进胰岛B细胞分泌胰岛素，降低血糖浓度；另一方面能抑制胰岛A细胞分泌 ，抑制 （2分），从而减少血糖的来源。从免疫角度推测，用水凝胶胶囊包裹人源HEK-293细胞的目的是 。 (4)为验证GLP-1基因是否实现有效表达，一般要先提取GLP-1，再用 技术检测其表达水平。本实验也能通过测定分泌型碱性磷酸酶的活性，间接反映GLP-1基因的表达情况，图2是相关检测结果。分析图2可知，选用 照射更有利于GLP-1基因的表达。停止光照后，GLP-1基因的表达在短时间内迅速下降，结合图1推测原因是 。与直接注射GLP-1相比，该糖尿病治疗模型的优点是 。 【答案】（11分） (1) 引物、模板（或模板长度） (2) RNA聚合酶 替代后无法保证GLP-1仅在有光照时表达 (3) 胰高血糖素 肝糖原分解、脂肪等非糖物质的转化（2分） 避免HEK-293细胞被小鼠免疫系统清除（或便于HEK-293细胞在小鼠体内长期存在或避免免疫排斥） (4) 抗原-抗体杂交 远红光 （停止光照后GMP含量降低）转录激活因子不能被活化 更方便快捷（更易调控或节约成本） 【解析】 （1）PCR扩增特定基因的关键是加入特异性引物，引物与目的基因的两端互补配对才能实现片段扩增。不同基因的引物碱基序列、长度不同，退火温度由引物的碱基组成（G/C含量）、长度决定，G/C含量越高、引物越长，退火温度越高；延伸时间由引物扩增的目的基因片段长度决定，片段越长，延伸时间越长。因此扩增光敏色素基因和磷酸二酯酶基因时，因引物、模板（或模板长度）不同，退火温度和延伸时间也不同。 （2）启动子是基因表达载体的重要组件，是RNA 聚合酶的特异性结合位点，RNA 聚合酶与启动子结合后，沿 DNA 链移动，驱动目的基因的转录过程。实验目的是构建光照下可合成 GLP-1的模型，启动子 2 的特性是需先与转录激活因子结合才能驱动转录（转录激活因子的功能受光照调控），而启动子 1 可直接与 RNA 聚合酶结合驱动转录，无需激活因子。若用启动子 1 替代启动子 2，GLP-1 基因会脱离光照的调控，在无光照时也持续表达，替代后无法保证GLP-1仅在有光照时表达，无法实现 “光照下合成 GLP-1” 的实验设计，因此不能替代。 （3）血糖升高的来源主要有：胰岛 A 细胞分泌的胰高血糖素促进肝糖原分解和非糖物质转化为葡萄糖，以及肠道对葡萄糖的吸收。GLP-1 降低血糖的机制之一是抑制胰岛 A 细胞分泌胰高血糖素，进而抑制肝糖原的分解和非糖物质转化为葡萄糖，减少血糖的生成来源。人源 HEK-293 细胞对小鼠而言属于异源细胞，小鼠的免疫系统会识别异源细胞的抗原，进而产生免疫排斥反应，导致移植的细胞死亡。用水凝胶胶囊包裹该细胞，可物理隔离异源细胞与小鼠的免疫细胞，避免细胞被识别和攻击，避免HEK-293细胞被小鼠免疫系统清除（或便于HEK-293细胞在小鼠体内长期存在或避免免疫排斥），保证移植细胞的存活和功能发挥。 （4）GLP-1是蛋白质类物质，检测目的基因的蛋白质表达产物，常用抗原-抗体杂交技术：用针对GLP-1的特异性抗体作为探针，与提取的蛋白质样品杂交，若出现杂交带，说明GLP-1基因成功表达，杂交带的深浅可反映其表达水平；分析图2可知，远红光照射下，分泌型碱性磷酸酶的活性显著高于其他光照条件，因此选用远红光照射更有利于 GLP-1 基因的表达；结合图 1 的光控机制，光照激活光敏色素，进而调控GMP的合成，GMP激活转录激活因子，转录激活因子与启动子 2 结合驱动 GLP-1 基因转录。停止光照后，（停止光照后GMP含量降低）转录激活因子不能被活化，光敏色素快速失活，磷酸二酯酶将细胞内的GMP水解，转录激活因子失去活性，无法与启动子 2 结合，GLP-1基因的转录迅速终止；同时，细胞内已合成的GLP-1作为蛋白质，会被蛋白酶快速降解，因此其表达在短时间内迅速下降；与直接注射 GLP-1相比，该光控糖尿病治疗模型的核心优点是实现了 GLP-1合成的精准调控：可通过 “光照/停止光照” 精准控制GLP-1的合成与分泌，根据血糖水平调节光照时间，实现血糖的精准调节；此外，移植的细胞可在体内持续合成GLP-1，避免了外源GLP-1反复注射的麻烦；同时减少了直接注射外源蛋白可能引发的过敏、免疫反应等副作用，更方便快捷（更易调控或节约成本）。 22.（11分）LL-37是人体内一种重要抗菌肽，但易被蛋白酶分解。为解决上述问题，研究人员运用基因工程技术将类弹性蛋白多肽（ELP）融合表达至LL-37抗菌肽的C-末端，从而将LL-37包裹在ELP纳米纤维内部。ELP具有显著热响应性，当温度低于可逆相变温度（T）时ELP呈溶解状态，反之则沉淀。下图为构建融合蛋白表达载体的流程，其中pUC19和为质粒，含有前导肽序列，其表达产物可引导融合蛋白分泌至细胞外；GFP表示绿色荧光蛋白基因，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。请回答下列问题： (1)已知LL-37基因编码序列为5'-TTGTTGGGTGACTTC-（中间省略81个碱基）-CCAAGAACTGAATCC-3'，限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列和切割位点分别为5'-G↓AATTC-3'、5'-G↓GATCC-3'。为了使LL-37基因正确克隆到pUC19质粒中，利用PCR技术扩增LL-37基因时需在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，该对引物的序列应选用 （在a～d中选填）。 a．5'-CGGAATTCTTGTTGGGTGACTTC-3' b．5'-CGGAATTCCTTCAGTGGGTTGTT-3' c．5'-CGGGATCCCCAAGAACTGAATCC-3' d．5'-CGGGATCCGGATTCAGTTCTTGG-3' (2)用按上图所示方法构建的质粒转化处于 态的大肠杆菌，培养后挑取单克隆菌落，接种到含 的液体培养基中，16h后提取质粒经双酶切、电泳鉴定，结果如图2。若质粒构建成功，则第5泳道会出现 个条带，对于片段大小符合预期的质粒，还需要通过 进一步确认序列的正确性。 (3)将构建成功的pET25b+-LL-37-ELP质粒转化进大肠杆菌，培养24h，经培养液离心→取细菌→破坏细胞→离心→取 （填“沉淀物”或“上清液”）→调节温度至 （填“>T”、“=T”或“<T”）→分离纯化LL-37-ELP-GFP融合蛋白。该融合蛋白置于荧光显微镜下可观察到 。 (4)为了探究LL-37-ELP对脓毒症的治疗效果，研究人员利用LL-37、LL-37-ELP以及ELP对盲肠结扎穿刺手术（CLP）诱导的脓毒症模型小鼠进行治疗，结果如图3。结果表明 （2分）。 【答案】（11分） (1) 5' ad (2) 感受 氨苄青霉素 2 基因测序 (3) 上清液 >T 绿色荧光 (4)ELP无治疗效果；LL-37和LL-37-ELP均具有治疗作用，且LL-37-ELP治疗效果更好（2分） 【解析】（1）LL-37基因的编码序列为5'-TTGTTGGGTGACTTC-（中间省略）-CCAAGAACTGAATCC-3'，需为基因两端分别添加EcoRⅠ（5'-GAATTC-3'）和BamHⅠ（5'-GGATCC-3'）的识别序列。正向引物需匹配基因5'端的起始序列，在5'端添加EcoRⅠ识别序列（CGGAATTC），即a：5'-CGGAATTCTTGTTGGGTGACTTC-3'，与基因5'端起始序列完全互补。反向引物需与基因3'端的互补链匹配，基因3'端序列为5'-CCAAGAACTGAATCC-3'，其互补链为3'-GGTTCTTGACTTAGG-5'，因此反向引物5'端添加BamHⅠ识别序列（CGGGATCC）后，序列为d：5'-CGGGATCCGGATTCAGTTCTTGG-3'，与基因3'端互补链匹配。b序列与基因5'端起始序列不匹配，c序列与基因3'端互补链不匹配，故排除 bc。 （2）大肠杆菌属于原核生物，需先用Ca²⁺处理使其处于感受态，此时细胞膜通透性增大，能吸收周围环境中的环状质粒DNA，完成转化过程。题干中指出质粒含有Ampr（氨苄青霉素抗性基因），该基因为标记基因，可筛选出成功导入质粒的大肠杆菌。在含氨苄青霉素的液体培养基中培养时，未导入质粒的大肠杆菌因无抗性会被杀死，只有导入质粒的大肠杆菌能存活并增殖。构建成功的 pET25b+-LL-37-ELP质粒为环状DNA，经双酶切后会被切割为两段线性DNA片段，因此电泳鉴定时第5泳道会出现2个条带；若质粒未构建成功（如自身环化、目的基因反向连接等），酶切结果会与预期不同（条带数或大小异常）。双酶切和电泳仅能验证质粒中目的基因的片段大小是否符合预期，无法确认目的基因的核苷酸序列是否完全正确（如是否存在碱基突变、缺失等）。基因测序能直接测定质粒中DNA的核苷酸序列，是确认序列正确性的金标准。 （3）题干指出质粒含有前导肽序列，其表达产物可引导融合蛋白分泌至细胞外。因此破坏大肠杆菌细胞后，融合蛋白存在于细胞外的培养液中，离心后细菌菌体形成沉淀物，融合蛋白位于上清液中，取上清液即可获得含融合蛋白的粗提液。ELP具有热响应性，温度低于可逆相变温度（T）时溶解，高于T时沉淀。为了分离纯化LL-37-ELP-GFP融合蛋白，需调节温度至>T，使ELP携带融合蛋白发生沉淀，通过离心即可将融合蛋白与上清液中的其他杂质分离。融合蛋白中含有GFP（绿色荧光蛋白基因），该基因表达的绿色荧光蛋白具有天然的荧光特性，无需添加底物，置于荧光显微镜下可直接观察到绿色荧光，以此验证融合蛋白是否成功表达。 （4）实验的自变量为处理试剂（LL-37、LL-37-ELP、ELP），因变量为脓毒症模型小鼠的治疗效果（如存活率、病症缓解程度等）。 ELP为类弹性蛋白多肽，无抗菌肽的功能，因此对脓毒症无治疗效果（模型小鼠存活率低、病症无缓解）。 LL-37是天然抗菌肽，能发挥抗菌作用，对脓毒症有治疗效果；LL-37-ELP融合蛋白中，ELP将LL-37包裹在内，避免其被蛋白酶分解，抗菌效果更稳定、持久，因此治疗效果优于天然LL-37（模型小鼠存活率更高、病症缓解更明显）。 综上，该实验结果证明了融合蛋白改造能有效解决LL-37易被蛋白酶分解的问题，提升其对脓毒症的治疗效果。 23.（11分）SBPase基因编码的酶是卡尔文循环的关键酶。为提高甜菜的光合效率和产量，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，获得如图1的表达载体。请回答下列问题： (1)图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，还未指示出的结构元件有 ，其中启动子的功能是 。 (2)人工合成SBPase基因后进行扩增，正确选择引物后对目的基因进行PCR，PCR程序设置如图2所示，其中，60℃20s环节的目的是 。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，一般还需要添加Mg2+，添加Mg2+的作用是 。 (3)获取的PCR产物还需要经 鉴定。扩增后的PCR产物需先与 混合后再注入 （填“+”或“-”）电极端的点样孔内（提示：通常DNA分子片段带负电荷）。电泳之后切割凝胶再将其溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。 (4)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有氨苄青霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项有 。 (5)为便于纯化SBPase酶蛋白，现改进生产路线，另将小段TAP基因序列（标签）与SBPase基因相连，构建出能表达SBPase酶融合蛋白的重组DNA（如图3，F1、F2、R1、R2表示引物）。为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有 （填字母）。 【答案】（11分） (1)复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (2) 使引物与单链相应互补序列结合（或复性/退火） 激活TaqDNA聚合酶的活性 (3)凝胶电泳 凝胶载样缓冲液 - (4)杀灭农杆菌（或抑制农杆菌生长/抑制农杆菌/抑菌） 卡那霉素 注意抗生素的种类、剂量及作用时间等 (5)F1与R2（或F2与R1）（2分） 【解析】 （1）一个完整的基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点等，图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，未指示出复制原点。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 （2）PCR的基本过程是先进行预变性，然后发生变性→复性→延伸的循环。60℃20s环节发生复性/退火，即引物与单链相应互补序列结合。Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶的活性。 （3）获取的PCR产物还需要经凝胶电泳鉴定。扩增后的PCR产物需先与凝胶载样缓冲液混合，通常DNA分子片段带负电荷，所以加样品加到-电极端的点样孔内，使DNA样品向正极迁移。 （4）氨苄青霉素和头孢霉素都属于抗生素，能杀死细菌，在此是为了杀灭农杆菌（抑制农杆菌生长、抑制农杆菌）。因重组质粒的标记基因是卡那霉素抗性基因，故转入含有卡那霉素的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意抗生素的种类、剂量及作用时间等，防止对外植体产生毒害作用。 （5）为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有F1与R2（或F2与R1），若融合基因未插入或方向错误，则得不到产物。 24.（15分）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列—（GTTCCTGGTGTTGGC）50—限制酶b识别序列，50为重复次数。 (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。质粒PET-SOD在用EcoR I酶切前后含有的游离磷酸基团的数目分别是 个。 (2)ELP50与SOD在 酶作用下形成磷酸二酯键连到一起形成融合基因SOD-ELP50，发生的变异类型是 。 (3)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。 (4)用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 （2分） 。在进行PCR时，除了图中提供的物质，还需要 。 (5)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录产生mRNA，经翻译过程合成SOD-ELP50蛋白。研究发现，一个mRNA分子上会与多个核糖体结合，意义是 。 (6)已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，不考虑合成的SOD-ELP50蛋白相对分子质量约为 （2分）。 (7)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图所示。 20℃时，加入NaCl后实验结果是 ；100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 【答案】（15分） (1) EcoRI、HindⅢ 0、2 (2) DNA连接（酶） 基因突变 (3) CaCl2（或Ca2+） 卡那霉素 (4) S-F、E-R 耐高温DNA聚合酶（或Taq酶）、脱氧核苷酸（或dNTP）、含Mg2+的缓冲溶液等（至少答出2个）（2分） (5) 启动子 用少量mRNA分子合成大量蛋白质（或可同时合成多条肽链，提高蛋白质合成速率） (6)44.44kDa（2分） (7) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 【解析】 （1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合图示可知，目的基因应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b应该分别对应的是EcoR I、Hind Ⅲ；DNA分子中游离磷酸基团在DNA分子两端各一个，质粒PET-SOD在用EcoR I酶切前，是环状DNA，无游离磷酸基团，酶切后，有两端，共两个游离磷酸基团。 （2）DNA连接酶具有连接两个DNA片段的作用，因此ELP50与SOD需要在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键连到一起形成融合基因SOD-ELP50；该操作对基因中的碱基序列造成了改变，故属于基因突变。 （3）转化微生物时，通常用CaCl2（或Ca2+）处理，使细胞处于感受态，易吸收外源DNA分子；筛选目的基因，可以通过质粒上的标记基因进行筛选，重组质粒上存在卡那霉素抗性基因，故可以用含有卡那霉素的培养基进行筛选。 （4）成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有SOD和ELP50基因序列，结合图示可知，引物S-F可以与SOD基因相应序列结合，引物E-R可以与ELP50相应序列结合，对导入重组质粒的大肠杆菌可以扩增出产物，对导入普通质粒的大肠杆菌则不能扩增出产物；若使用引物S-F和S-R（或者S-F和P-R），导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌均可以通过PCR扩增出产物，无法区分。若用引物E-F和P-R，对导入重组质粒的大肠杆菌可以扩增出产物，对导入普通质粒的大肠杆菌则不能扩增出产物，用引物E-F和S-R，导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌均不可以通过PCR扩增出产物；用引物E-F和E-R，仅只能扩增ELP50区段；PCR技术需要的条件有模板，引物，耐高温DNA聚合酶（或Taq酶）、脱氧核苷酸（或dNTP）、含Mg2+的缓冲溶液等。 （5）转录过程需要RNA聚合酶与启动子结合，启动转录；翻译过程中，一个mRNA分子上会与多个核糖体结合，可以利用少量mRNA分子合成大量蛋白质，提高合成蛋白质的效率。 （6）由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+15=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa。 （7）由图可知，20℃时，较不加NaCl，SOD-ELP50组加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 / 学科网（北京）股份有限公司 $