1.2.2 微生物的选择培养和计数课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 微生物的培养技术及应用 第1章 发酵工程 第2课时 微生物的选择培养和计数 情景导入 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。 美国黄石公园的热泉 讨论：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ 这是因为水生栖热菌能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 实验室微生物的筛选:人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 选择培养 一、选择培养基 一、选择培养基 1.概念: 2.类型: 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 4 青霉素是抗生素，对真菌没有抑制作用，因为它作用于细菌细胞壁的肽聚糖 思考：如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 【思考讨论】选择培养基配方的设计 尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。 尿素的立体结构 土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶： CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 1、你如何设计培养基配方，能将土壤稀释液中分解尿素的细菌分离出来？ 培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 5 2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 葡萄糖 10.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml ①碳源 ②提供能量 ①提供无机盐 ②作为缓冲物质调节pH ▼表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同 二、微生物的选择培养 思考：仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？ 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 　不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 二、微生物的选择培养 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 主要过程: A、梯度稀释菌液 B、涂布平板 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 稀释涂布平板法 【P18 土壤中分解尿素的细菌的分离】 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物的培养与观察 土壤微生物存在土壤中，怎么选择合适的土壤？ 土壤收集后能不能直接倒入平板内培养？该怎么操作？ 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 【P18 土壤中分解尿素的细菌的分离】 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物的培养与观察 1×10 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 102 103 104 105 106 107 10g 9 mL 无菌水 90mL无菌水 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。 【P18 土壤中分解尿素的细菌的分离】 样品的稀释 涂布平板 微生物的培养与观察 土壤取样 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 稀释涂布平板法★ 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 平板划线法 vs 稀释涂布平板法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到固体培养基表面，经数次划线培养后，可以分离得到单菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面进行培养，当稀释度足够高时，即可获得单菌落 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。 每个稀释度下应涂布几个平板？为什么？ 本实验用了多少培养基平板吗？分别是什么类型？ 组别 具体组别 具体操作 作用 实 验 组 实验组1 选择 培养基 接种 3次重复，排除偶然因素对实验结果的影响； 用以分离并计数能分解尿素的细菌。 实验组2 接种 实验组3 接种 实验组4 完全 培养基 接种 验证选择培养基是否具有选择作用 对 照 组 对照组1 选择 培养基 不接种 验证选择培养基中是否含有杂菌 对照组2 完全 培养基 不接种 验证完全培养基中是否含有杂菌 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如：注明组别、培养日期和稀释度。 样品的稀释 涂布平板 微生物的培养与观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。 土壤取样 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 空白对照 【P18 土壤中分解尿素的细菌的分离】 每隔 统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果， 原因： 。 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 24h 【P18 土壤中分解尿素的细菌的分离】 内容 现象 结论 有无杂菌污染 的判断 选择培养基的 筛选作用 样品的稀释操作 重复组的结果 未被杂菌污染 选择培养基具有 筛选作用 若选取同一种土样，统计结果应相近 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 空白对照的培养基中无菌落生长 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板 ·结果分析与评价 操作成功 【P18 土壤中分解尿素的细菌的分离】 ·进一步探究：土壤中分解尿素的细菌的鉴定 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。 方法：在培养基中加入酚红指示剂 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 18 原理： 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 固体培养基： 【补充】鉴别培养基 1.概念 2.类型 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 类型 主要用途 主要化学物质 特征性变化 伊红-美蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝（美蓝，碱性染料） 出现带金属光泽的深紫色菌落 刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后菌落周围会出现透明圈 三、微生物的数量测定 三、微生物的数量测定 （1）原理： 1.稀释涂布平板法 2.显微镜直接计数法 ——间接计数法 ——直接计数法 1.间接计数法 — 稀释涂布平板法 （2）计数原则: ①一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。 ②同一稀释度应至少对3个平板进行重复计数，算出平均数。 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 思考：在操作规范的前提下，你认为此方法统计得出的菌数与真实值相比，会偏大还是偏小？ 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 计算公式★: 每g（每mL）样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 （234÷0.1）×106=2.34×109 答 B 例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 2.直接计数法 — 显微镜直接计数法 原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 缺点： a.不能区分死菌和活菌→偏大。 b.不适于对运动细菌的计数。 c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点： 快速、直观 血细胞计数板： 细菌计数板： 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 思考：如何避免不能区分死菌和活菌？ 可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。 课堂小结 微生物的数量测定 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 结果分析评价 课后习题 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） 一、概念检测 ✔ ✔ ✔ 课后习题 2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 一、概念检测 D 课后习题 1. 反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 二、拓展应用 由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 提示：瘤胃中的微生物多为厌氧菌 课后习题 1. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。 二、拓展应用 已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。 当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 纤维素 纤维二糖 葡萄糖 课后习题 （1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌，请你给出详细的实验方案。 用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养 并在培养基加入刚果红进行鉴别。 纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 土壤微生物的分离-稀释涂布平板法 jasmine $