专题13 基因工程（4大串讲+4大题型）（复习讲义）（上海专用）2026年高考生物二轮复习讲练测

专题13 基因工程 ( 目录 第一部分 知识网络构建 思维导航，融会贯通 第二部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第三部分 核心知识串讲 核心串讲 串讲1 基因工程赋予生物新的遗传特性 串讲2 基因工程是一种重组DNA技术 串讲3 基因工程的基本操作流程 串讲4 蛋白质工程 能力进阶 能力1 限制酶的选择原则 能力2 比较限制内切核酸酶、DNA连接酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶的作用 能力3 PCR技术和DNA复制的比较 能力4 PCR扩增过程图解及规律 能力5 基因治疗 能力6 蛋白质工程与基因工程的区别与联系 能力7 实验：DNA的提取和分离、鉴定 能力8 实验：PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定 第四部分 分层精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程的基本工具 题型02 基因工程生物基本操作程序 题型03 基因工程的应用 题型04 蛋白质工程 B组· 增分能力练 第五部分 真题 实战进阶 对标高考，感悟考法 ) 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程 （2024上海卷）PCR扩增的原理和过程 （2022上海卷）基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 1. 结合最新科技研究成果综合考查基因工程，重点考察基因工程在各个方面的应用； 2. 结合遗传规律进行交叉命题，重点考察变异与基因工程、细胞工程与基因工程的综合应用； 3. 拓展最新的基因工程技术，通过材料表述的方式考察对新技术的理解。 新风向演练 1．【新载体·PanD酶】（2026·上海长宁·一模）PanD酶 β-丙氨酸具有调节免疫功能等作用，被广泛应用于医药领域。PanD酶能够催化生成β-丙氨酸，但目前PanD酶活性较低。左图为研发高活性PanD酶的部分过程，其中易错PCR是指在PCR扩增过程中通过调整反应条件增加碱基错配频率，右图为用以构建PanD酶基因表达载体的质粒P。 (1)左图中，步骤Ⅱ和步骤Ⅳ分别需要______和_______。（编号选填） ①限制性内切核酸酶 ②解旋酶 ③DNA聚合酶 ④DNA连接酶 (2)步骤Ⅱ中的易错PCR过程，可获得的产物有_______（编号选填） ①突变的PanD酶基因 ②原PanD酶基因 ③原PanD酶 ④活性更高的PanD酶 ⑤活性更低的PanD酶 表显示步骤Ⅳ构建表达载体P1时，对目的基因使用的PCR引物序列，序列中的下划线部分及①处为引入的限制酶酶切位点。 引物名称 引物 PanD-F 5'-AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGCCCGCTACCG-3' PanD-R 3'-GTCAACGTCGGCGGTTG①GTGGTGGTGGTGGTG-5′ (3)结合表引物序列及质粒P的酶切位点信息，为实现表达载体重组效率最高，引物PanD-R的①的碱基序列为_________。（单选） A．GGTACC B．AGTACT C．CTCGAG D．GAGCTC (4)为验证构建的表达载体中是否成功插入PanD酶突变基因，可采用的检测方法有________。（多选） A．对表达体进行全序列测序 B．使用PanD-F和PanD-R对表达载体进行PCR C．酶切表达载体并电泳检测DNA片段长度 D．观察导入载体的大肠杆菌在含氨苄青霉素培养基上的生长情况 通过左图途径产生多种PanD酶后，最终筛选获得了活性最高的PanD-H8。规模化生产β-丙氨酸有两种方法：使用纯化的PanD酶在体外催化（纯酶法）；使用表达PanD酶的大肠杆菌细胞进行催化（全细胞催化法）。研究人员对两种生产方法进行了评估，相关数据如表所示。 酶种类 纯酶法最适温度 纯酶法最适pH 纯酶法50℃处理2h后的残余活性/热稳定性 全细胞催化法最适温度 原PanD酶 45℃ 7.0 <10% 37℃ PanD-H8 50℃ 7.0 47% 37℃ (5)筛选获得PanD-H8的方法属于蛋白质工程中的__________策略。 (6)结合表及已学知识，你认为选用哪种方法及温度条件，更适合用于规模化生产β-丙氨酸?请说明理由：________________________________________。 2．【新情境·转基因抗虫玉米】（2026·上海黄浦·一模）转基因抗虫玉米的培育 在培育转基因抗虫作物过程中，单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。苏云金芽孢杆菌能产生晶体蛋白Cry1A．301和营养期杀虫蛋白Vip3A等，Vip3A蛋白羧基端结构的完整性对于维持蛋白活性至关重要。为提高作物的抗虫性，研究人员通过连接肽基因将修饰Cry1A．301基因和Vip3A基因拼接成5′-Cry1A．301-连接肽-Vip3A-3′基因（简称C-V基因），并利用相关技术培育出转基因抗虫玉米。具体过程如图1所示，其中Ⅰ~Ⅵ表示步骤。C-V基因表达过程如图2所示。 (1)据题意，将目的基因构建为5′-Cry1A．301-连接肽-Vip3A-3′基因可能的原因是______。（多选） A．单一抗虫基因易引起抗药性问题，而Cry1A．301和Vip3A的抗虫作用相互拮抗 B．由同一个启动子和终止子控制，有利于Cry1A．301基因和Vip3A基因同时表达 C．Cry1A．301基因在前，Vip3A基因在后，有助于保持Vip3A蛋白的羧基端完整性 D．相比较于直接拼接，连接肽的引入有助于避免融合蛋白内部结构和功能的相互影响 (2)利用PCR技术获取C-V基因时，从图2中选择合适的引物是引物______和引物______。 (3)表为各种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点。在步骤Ⅱ，科研人员用Hind III和Xba I处理质粒。为保证高效构建表达载体，则切割C-V基因时，应选用表中的酶______。（编号选填） 编号 限制酶 识别序列及切割位点 ① Hind III 5'-A↓AGCTT-3' ② Xba I 5'-T↓CTAGA-3' ③ Sac I 5'-GAGCT↓C-3' ④ Sal I 5'-G↓TCGAC-3' ⑤ Spe I 5'-A↓CTAGT-3' ⑥ BamH I 5'-G↓GATCC-3' (4)通过酶切法和凝胶电泳对DNA进行鉴定时，图3所示泳道1、2分别是用Hind III切割Ti质粒和重组质粒所得的结果。若用Hind III和Xba I同时酶切重组质粒，请在图3泳道3中绘制出电泳结果（Ti质粒中Hind III和Xba I间隔较近，长度可忽略不计）。 (5)为筛选出含重组质粒的农杆菌，图1步骤III中选用的培养基中应含有______。（编号选填） ①晶体蛋白                ②营养期杀虫蛋白            ③卡那霉素            ④水 (6)图1步骤Ⅰ~Ⅵ中，表示重组质粒导入受体细胞的是______。 (7)下列关于图1步骤III和Ⅵ中培养基的分析，正确的是______。（多选） A．物理状态相同 B．均添加细胞分裂素 C．营养物质齐全 D．后者无需灭菌操作 (8)用玉米原生质体培育出转基因玉米依次经历的过程有______。（选择正确编号并排序） ①细胞融合        ②脱分化        ③细胞壁再生        ④再分化        ⑤授粉 (9)为确定最终培育出的玉米是否符合预期，最直接的检测方法是______。（单选） A．对玉米细胞进行基因测序 B．对玉米特定基因片段进行PCR C．检测玉米植株的抗虫能力 D．酶切玉米基因组DNA后检测片段长度 核心串讲1 基因工程赋予生物新的遗传特性 1.基因工程的诞生是多学科综合发展的成果 （1）基因工程概念：将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。由于重组拼接的基因和运载工具都是DNA分子，因此，基因工程也称为重组DNA技术。 2.基因工程改善人类的生活品质 核心串讲2 基因工程是一种重组DNA技术 1.DNA重组需要三种基本工具 （1）限制性内切核酸酶（限制酶） （2）DNA连接酶 作用：能封闭双链DNA分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 （3）载体 条件 原因 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 大都携带抗生素抗性等基因（有特殊的标记基因） 1. 便于重组DNA分子的筛选； 2.质粒并非其宿主正常生长所必需，但大都携带抗生素抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素的影响。 对受体细胞无毒、易分离 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 病毒DNA特点：病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 核心串讲3 基因工程的基本操作流程 1.PCR是获取目的基因的主要方法（目的基因的筛选和获取） （1）目的基因：人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。 （2）分离获取目的基因方法：（目的基因是基因工程各项产业化应用的前提，也是基因工程项目实施的首要阶段。） （3）PCR（聚合酶链式反应）技术：模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术。 2．切割和连接是构建表达载体的主要方式 （1）表达载体的构建：将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切割出黏性末端（简称“切”），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（简称“接”），形成含目的基因且能表达的表达载体的过程。 （2）基因表达载体的组成： 注意事项：①由于目的基因两侧的黏性末端相同，因而能以正反两种方式等概率接入载体，但在基因工程大多数应用中，只有一种方式是可用的。 ②同样，由于载体片段两侧的黏性末端也相同，因而在连接时载体两个黏性末端可以自我环化，导致载体“空载”（即非重组DNA分子）。 ③根据DNA连接酶的工作原理，目的基因和载体DNA只需黏性末端相同便能有效连接，也就是说，两种DNA并不必须用同一种酶切开。 ④如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会消失，也就是说，不能用相应的限制性内切核酸酶从重组DNA分子中重新“卸下”目的基因。 3．将DNA分子导入受体细胞 （1）目的/导入原因：经连接操作后的DNA分子只有导入受体细胞，才能借助细胞内的基因表达系统使目的基因所蕴含的遗传信息得以表达。 （2）受体细胞种类：微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。 （3）转化（简称“转”）：在自然条件下，DNA很难进入细胞。为了大幅度提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理的一操作。 （4）转化的方法：物理方法（如电击法）、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法） 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 氯化钙法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 （5）扩增（简称“增”）：转化成功的效率也只有10-4～10-2，因而需要高效筛选出接纳了DNA分子的受体细胞。为了做到这一点，转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 4．借助标记基因筛选和鉴定含目的基因 （1）筛选与鉴定：只有少数细胞能接纳DNA分子，而且进入受体细胞的DNA分子还有可能含有空载质粒，因此，需要借助有效的实验技术快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的受体细胞，这一过程称为筛选与鉴定。 （2）筛选含目的基因的受体细胞常用方法：抗药性筛选法和显色筛选法 ①抗药性筛选 抗药性筛选法实施的前提条件：载体DNA携带抗生素的抗性基因 标记基因：可供筛选使用的功能性基因。 第一轮筛选：筛选获得的转化成功克隆有两种类型：含重组质粒的克隆和含空载质粒的克隆。 第二轮筛选：含重组质粒的克隆只能在Amp平板上生长；而含空载质粒的克隆可出现在同时含Amp和Tet的平板上。 ②显色筛选（主要是鉴别） 很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18/19 同时携带Ampr和lacZ'两个标记基因。将外源DNA插在lacZ'标记基因内部的任何限制性内切核酸酶切割位点处，将转化扩增的细菌涂布在同时含有Amp和X-gal的固体培养基上，再长出来的克隆中，白色克隆即为含重组质粒的克隆。 经抗药性或显色筛选获得的含目的基因的受体细胞还需进一步鉴定安装在载体上的目的基因位置是否正确以及是否能高效表达，这需要使用PCR技术和基因表达产物（蛋白质）的结构和功能分析技术。 5.构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 （1）动物：动物的生殖细胞(精细胞和卵细胞)、受精卵(或早期胚胎细胞)、诱导性多能干细胞等 ①DNA显微注射：是动物细胞基因转移普遍采用的一种物理转化方法。 基本操作程序：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配后从其输卵管内取出受精卵，用吸管将受精卵固定在倒置显微镜上，然后借助玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液；将注射了DNA的受精卵移植到母鼠子宫中发育，继而繁殖转基因小鼠子代。 ②病毒感染当采用动物病毒（如腺相关病毒和慢病毒）DNA作表达载体时，可以通过病毒感染的方式高效导入动物细胞中。 （2）植物：植物的愈伤组织（或其他组织的原生质体）、生殖细胞或胚胎组织等 方法：农杆菌转化法或含有表达载体的植物病毒 由于植物的愈伤组织能再生出整株植物，因此转基因植物的构建要比转基因动物的构建更加简便。转基因动植物培育出来后，仍需要使用PCR等技术确认转基因是否获得成功，以及目的基因在动植物体内是否正确表达。 核心串讲4 蛋白质工程 1.蛋白质工程在基因水平上设计和改造蛋白质 （1）蛋白质工程崛起的缘由 ①基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质； ②天然蛋白质的不足：天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 （2）蛋白质工程：采用重组DNA技术在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，可以对天然蛋白质进行理性改造。由人为突变或设计基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程操作流程，又称第二代基因工程。 （3）蛋白质工程 ①修饰改造天然蛋白：两大类操作策略：基因的定点突变（在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列，）和定向进化（在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列）。 优点：修饰改造天然蛋白实质上是一个模拟自然界进化与适应的循序渐进过程，可将数千万年的自然进化历程缩短为数月、数周甚至数天的实验室过程（图所示的循环突变） ②设计制造全新蛋白：蛋白质工程的另一关键方面是根据我们所掌握的蛋白质结构与功能基本信息设计制造全新蛋白。设计制造全新蛋白需要根据已经掌握的蛋白质结构与功能的关系，借助特殊的电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，然后借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 2.蛋白质工程根据人类需要改造目标蛋白质 （1）定点突变方法：化学合成或PCR法：研究表明，人胰岛素样生长因子的结构和性质与人胰岛素高度相似，但它不像人胰岛素那样容易聚合形成多分子。 （2）定向进化：在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因。 能力1 限制酶的选择原则 （1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 （3）确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 （4）限制酶不切割细菌本身的DNA分子含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 能力2 比较限制内切核酸酶、DNA连接酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶的作用 分类 限制内切核酸酶 DNA连接酶 DNA解旋酶 DNA聚合酶 作用 切割DNA分子（切割磷酸二酯键），获得目的基因 连接目的基因与载体，形成磷酸二酯键 催化氢键断裂使DNA双链分开 以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成磷酸二酯键 作用结果 切割DNA分子 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 将双链DNA分子局部解旋为单链 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 作用时间 基因工程中获得目的基因及切割载体 基因工程中目的基因与载体的重组 DNA复制、转录 DNA复制 能力3 PCR技术和DNA复制的比较 名称 PCR技术 DNA复制 原理 半保留复制 半保留复制 场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内（主要是细胞核中） 条件 模板 一段目的DNA片段 整个DNA分子 原料 4种脱氧核苷三磷酸 4种脱氧核苷三磷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 能量 热能（PCR仪控制温度） ATP 引物 单链DNA片段（上游、下游引物） RNA片段 解旋方式 DNA在高温下变性解旋 DNA解旋酶催化 温度条件 在较高温度下进行，需控制温度；Buffer缓冲液，Mg2+、无菌技术等 细胞内温和条件；体内环境 过程 结果 快速复制目的DNA 复制DNA分子（相对速度较慢） 能力4 PCR扩增过程图解及规律 经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。 能力5 基因治疗 生理性T细胞受体（TCR）只有在受到抗原刺激后才能发挥免疫效应，而肿瘤表面抗原较难激活T细胞。用特异性识别特定肿瘤表面抗原的单链抗体（scFv）取代TCR的αβ链，同时对TCR复合物进行结构改造，构成所谓的嵌合型抗原受体（CAR）。与生理性T细胞受体（TCR）复合物相比，第二代嵌合型抗原受体（CAR）在结构上发生了很大改变。将这种携带工程化CAR的T细胞作为治疗用剂输回患者体内，此类疗法统称为CAR-T细胞疗法。 在体内，这种工程化CAR能指导T细胞识别并杀死表面上带有相应抗原的肿瘤细胞。然而，科学研究没有止境，人们担心这种第二代CAR-T细胞输回患者体内后是否会形成新的免疫原性。综上所述，以首例基因治疗临床试验（补充或更换ADA基因）为代表的众多策略均属于忠实于原基因编码序列的基因工程；而以CAR-T细胞疗法（修饰或改造受体蛋白）为代表的新型策略则属于第二代基因工程——蛋白质工程。 能力6 蛋白质工程与基因工程的区别与联系 比较项目 蛋白质工程（第二代基因工程） 基因工程 区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的新的生物类型和生物产品 结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已存在的蛋白质 联系 ①都在生物体外对基因进行操作； ②蛋白质工程是在基因工程基础上聚合出来的第二代基因工程 判断 (1)如果仅将基因用限制酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换、增添或缺失某几个碱基，则属于蛋白质工程。 (2)如果合成的蛋白质是自然界中已存在的蛋白质(天然蛋白质)，则是基因工程；如果合成的蛋白质与天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。 能力7 实验：DNA的提取和分离、鉴定 实验 原理 过程 DNA的提取和分离 分离DNA和蛋白质：DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精 溶解DNA：在一定浓度的乙醇或异丙醇溶液中，DNA溶解度下降，可沉淀形成纤维状絮团，飘浮其中。 实验材料准备（肝脏样品切小块放入培养皿，乙醇放冰箱冷藏）→（培养皿中放入10mL生理盐水，药匙碾压、磨碎肝脏）悬浮、过滤（漏斗+纱布=过滤装置）、收集细胞悬→加入十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，破碎细胞，释放DNA→另取试管，移取细胞悬浮液→加入已预冷的乙醇，沉淀析出DNA→转动玻璃棒→使析出的DNA缠绕在玻璃棒上（絮状白色物质） DNA的鉴定 鉴定DNA：DNA大分子的脱氧核糖在酸性条件下加热，能与二苯胺（质量体积比为1%的冰醋酸溶液）发生反应，生成蓝色化合物。 ①将上述缠绕在玻璃棒上的DNA样品放入3 mL蒸馏水中，加热15min，促进DNA溶解。 ②取上述DNA溶液1mL于另一支试管中，加入2mL二苯胺试剂，混匀。 ③上述混合液于60℃加热15min，观察并记录实验结果。 1.请观察你所提取的DNA的颜色，如果不是白色絮状物，说明了什么？ →说明提取的DNA样品中有较多的杂质。 2.可能有哪些杂质，能用什么方法鉴定这些杂质，并反思操作过程中可能影响结果的关键步骤? →可能有蛋白质、多糖等杂质；可用双缩脲试剂来鉴定蛋白质 →添加SDS的浓度、量或处理时间可能不合适，组蛋白等杂质没有完全与DNA分开 →添加乙醇的浓度或量可能不合适，杂质没有完全溶解。 3.有同学认为采用猪血提取DNA可以减少磨碎、过滤等步骤。实验后却发现没有絮状物缠绕在玻璃棒上，你知道其中的原因吗? →与鸡的红细胞不同，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA，无法用于DNA的提取 4.如果溶液不呈现蓝色，可能的原因有哪些? →说明所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误。 →或所用的二苯胺试剂变质等 5.如果提取的DNA样品中混有RNA和蛋白质杂质，这些杂质会与二苯胺反应吗?为什么? →不会；DNA鉴定的原理是DNA中的脱氧核糖与二苯胺反应，生成蓝色化合物而RNA和蛋白质分子中不存在脱氧核糖，不会与二苯胺发生反应 →正因为如此，我们可以通过这种方法来测定样品中的DNA含量。 应用：亲子关系、法医鉴定（受害人身份，嫌疑人）、考古依据 能力8 实验：PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定 1. 实验原理： 由于核苷酸的磷酸基团使DNA片段带负电荷，所以电泳开始前应将负电极插在凝胶板含DNA样品的一端，将正电极插在另一端。通电后，DNA片段会通过凝胶向正极方向“泳动”。凝胶电泳主要根据核酸分子的大小和结构将它们分离开来。 2.实验步骤： ①按配方配制50×TAE电泳缓冲液。 ②将上述50×TAE电泳缓冲液稀释50倍（即1×TAE），用1×TAE电泳缓冲液配制50 mL浓度为0.7%（W/V）的琼脂糖悬浮液，在微波炉中加热至琼脂糖溶解（溶液澄清）。 ③待琼脂糖溶液冷却至50℃左右，倒入已放置了电泳梳的胶模板中，凝胶厚度为3~5mm。 ④待琼脂糖凝胶完全凝固后，将凝胶连同胶模板一起放入盛有1×TAE 电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液没过凝胶约1mm，然后轻轻拔去电泳梳。 ⑤将PCR扩增产物溶液（即DNA样品）与5×上样缓冲液按4∶1比例混匀后，用移液器取3~10μL（体积视DNA浓度而定）的上述混合液，缓缓加入琼脂糖凝胶的样品槽内。 ⑥盖上电泳槽后通电，电压为80~100V，使DNA向正极泳动。 ⑦当上样缓冲液中的蓝色染料泳动至琼脂糖凝胶全长的三分之二时，切断电源，取出凝胶和胶模板，在紫外灯（或核酸蛋白检测仪）下观察DNA电泳条带。 3.分析： （1）标准样：一种分子质量的DNA样品，作为对照。用来确定待测样品中DNA相对分子质量。 （2）DNA荧光条带： ①条带的有无：代表是否成功扩增出待测样品中的DNA。若无条带，常见原因有：无DNA模板，引物设计不合适。 ②条带的亮度：代表扩增的DNA数量，越亮代表DNA数量越多 ③条带位置：常代表DNA的大小。一般距离点样孔越远，说明跑得越快，DNA的分子质量越小。 01 基因工程的基本工具 1．（2026·上海青浦·一模）二化螟和田间杂草极大影响了稻米的产量和品质，科学家利用转基因技术将抗虫（cry1C）基因和抗草甘膦（EPSPS）基因成功转入水稻细胞中，并利用Cre/loxP重组酶系统特异性删除种子胚乳中的外源基因，获得了胚乳中无外源基因的抗虫、抗除草剂转基因水稻。转基因水稻的部分培育过程如图1所示。 Cre/loxP重组酶系统由Cre重组酶和loxP位点组成，多基因串联体左侧loxP位点的部分序列如图2所示。当DNA分子中存在两个相同的loxP序列且同向时，Cre重组酶能特异性识别并删除两个位点间的DNA序列。 注：LB、RB：多基因串联体左右边界序列，Kan':卡那霉素抗性基因，PstI、SacI、EcoRI:限制性核酸内切酶 (1)据题意推测，Cre重组酶的功能类似于_______。 A．解旋酶 B．DNA连接酶 C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶 (2)结合图2信息，为删除两个loxP位点间的DNA序列，多基因串联体右侧loxP位点间隔区的编码链序列为5'-_______-3'。 (3)人类食用的精米主要是由水稻种子的胚乳加工制成，二化螟主要通过钻蛀叶鞘、叶心、茎秆等绿色组织而危害水稻。结合题干信息，为实现水稻中外源基因的精准表达与特异性删除，启动子1、2、3分别为_______、_______、______。（编号选填）。 ①胚乳特异性启动子 ②绿色组织特异性启动子 ③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性） (4)为使多基因串联体与质粒PC1300Z高效连接，需在其两侧添加______（编号选填） ①SacI的识别序列 ②EcoRI的识别序列 ③PstI的识别序列 (5)下列关于转基因水稻To培育过程的叙述，正确的是________。 A．农杆菌应不具有卡那霉素抗性 B．过程I常用显微注射法 C．过程Ⅱ在含草甘膦的培养基中筛选 D．过程Ⅲ中培养基中适当增加生长素的浓度以诱导生根 (6)将转基因水稻T0自交得到T1，在T1幼苗期喷施适量的草甘膦，发现抗除草剂水稻与不抗除草剂水稻之比约为3:1，则T1中抗二化螟水稻的比例为________。（不考虑突变和交换） 为评估外源基因的敲除是否具有组织特异性，科研人员分别提取转基因水稻各组织细胞的总RNA，通过RT-PCR和凝胶电泳检测各细胞中不同基因的表达情况。结果如表所示，“+”表示“表达”，“-”表示“不表达”。 编号 cry1C基因 EPSPS基因 ① - + ② + - ③ + + ④ - - (7)RT-PCR是以mRNA为模板进行的特殊PCR，主要过程如图3所示。该反应体系中需添加的物质有______。（编号选填） ①水、缓冲液 ②RNA模板 ③dNTP ④DNA模板 ⑤逆转录酶 ⑥耐高温的DNA聚合酶 ⑦RNA引物 (8)表格结果中分别符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的是______。（编号选填） 02 基因工程生物基本操作程序 2．（2025·上海嘉定·一模）彩色棉花的研发 天然彩色棉的棉花纤维是在棉花发育过程中积累色素而形成有色彩的纤维，环保健康，现有的天然彩色棉品种中仅有绿色和棕色两种品种，且存在颜色不深等情况。Lc基因能正向调控玉米中花色素的合成，GhPAP1D基因能提高棉花花色素的合成。科研人员将Lc基因和GhPAP1D基因联合导入棉花植株中，得到了棕红色的棉花，具体流程如图。 注：NcoⅠ、BamHⅠ、SacⅠ、SalⅠ为限制酶酶切位点。启动子1、2属于真核细胞表达系统，Sm+是链霉素抗性基因，Amp+是氨苄青霉素抗性基因，GUS基因编码产生的酶能将无色物质X-Gluc分解，使植物组织呈蓝色，若无GUS基因，则植物组织呈淡黄色。 (1)质粒中的T-DNA能在农杆菌作用下转移至植物细胞并稳定整合到植物核基因组中，由此信息选择合适的限制酶切割质粒，应该选择的限制酶是_____。（编号选填） ①NcoⅠ ②BamHⅠ ③SacⅠ ④SalⅠ (2)科研人员在制备表达载体时，需要利用PCR技术在融合基因Lc—GhPAP1D基因两侧增加相应的限制酶酶切位点，则应在引物_____（用图中编号选填）的_____（5’/3’）端增加序列。 (3)将通过图中步骤①得到重组后的表达载体与农杆菌混合，再将菌液用_____法置于含_____的培养基甲中培养并鉴定，从而获得成功导入表达载体的农杆菌。（编号选填） ①   ②   ③链霉素 ④氨苄青霉素 (4)根据题意判断，下面关于图中培养基乙和丁的说法正确的是（    ）。（单选） 选项 组别 物理状态 用途 A 培养基乙 固体培养基 选择培养基 B 培养基乙 液体培养基 通用培养基 C 培养基丁 液体培养基 通用培养基 D 培养基丁 固体培养基 选择培养基 A．A B．B C．C D．D (5)为得到棉花的愈伤组织，需将棉花的外植体先_____（消毒/灭菌）后再放在细胞分裂素和生长素配比较合适的培养基中进行_____（脱分化/再分化）。得到愈伤组织后，将其与图中步骤⑤得到的农杆菌混合培养，再将愈伤组织放入含_____的培养基丙中培养，一段时间后选择颜色为_____的愈伤组织，放入培养基丁中继续培养得到转基因棉花幼苗。 经过检测，转基因得到的彩色棉花颜色较深，符合预期，结果见图，但棉花纤维的长度较短，具体见图。（DPA指的是棉花开花后天数，ns代表无显著差异，**代表有显著差异）。 (6)结合已有知识，对图分析正确的是（    ）。（单选） A．棉花纤维的主要成分属于双糖，可以作为人类的能源物质 B．棉花纤维的主要成分是纤维素，能和班氏试剂加热后产生红黄色沉淀 C．转基因棉花与野生型棉花的棉花纤维长度在开花后的前12天没有显著差异 D．转基因棉花与野生型棉花的棉花纤维长度在开花后的第20天开始有显著差异 (7)进一步研究发现，融合基因Lc—GhPAP1D基因在促进棉花纤维色素积累的同时，也抑制了棉花纤维的增长。为获得品质更佳的转基因彩色棉，科研人员提出了改良思路：将能干扰Lc—GhPAP1D基因表达的干扰载体RNAi导入棉花愈伤组织中，并在20DPA阶段诱导启动干扰载体RNAi。请你对该方案作出评价。_____ 03 基因工程的应用 3．（2025·上海·模拟预测）乳糖操纵子（lac operon）只存在于原核生物中，是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。乳糖操纵子由调节基因（I）、启动子（P）、操纵基因（O）、结构基因（Z、Y、A）组成（如图）。其中，Z、Y、A基因的表达产物分别为lacZ、lacY与lacA。 (1)乳糖操纵子的表达需多种物质共同协作完成。以下物质中，在转录阶段需要的是______，在翻译阶段需要的是______（编号选填）。 ①核糖核苷三磷酸 ②脱氧核苷三磷酸 ③DNA聚合酶 ④RNA聚合酶 ⑤DNA连接酶 ⑥tRNA ⑦rRNA ⑧氨基酸 (2)据图和所学知识，关于乳糖操纵子的表达机制，以下说法正确的是（　　）（单选）。 A．乳糖操纵子经转录后，经RNA可变剪接切除操纵基因mRNA后，在核糖体上进行后续翻译 B．诱导物与阻遏蛋白的活性中心结合，后者无法与O结合，促进基因表达 C．当诱导物与阻遏蛋白结合时，后续乳糖代谢基因仍可能表达 D．Z、Y、A经翻译后产生的物质需经内质网进一步加工后才可发挥作用 (3)同一段乳糖操纵子基因经中心法则过程可得到不同的蛋白质，其可能的原因是________（编号选填）。 ①mRNA上有不同启动子 ②密码子具有简并性 ③三种蛋白具有同源性 ④基因的表达具有选择性 ⑤RNA聚合酶具有专一性 ⑥乳糖代谢有分级调节 玉米-豆粕饲料是畜牧养殖中重要的蛋白质饲料，但饲料中含有半乳糖苷（抗营养因子）等物质，由于畜禽动物胃肠道内缺乏半乳糖苷酶，导致半乳糖苷在肠道内积聚，进而影响营养物质的吸收。半乳糖苷经肠道微生物发酵产生的NH3等气体还使动物产生胀气，甚至腹泻。因此生产能在动物肠道内表达半乳糖苷酶的转基因动物，可提高饲料中营养物质的利用率，但外源半乳糖苷酶基因在转基因动物中出现过表达的现象，严重影响转基因动物的健康。 (4)研究人员尝试构建能在动物肠道内表达半乳糖苷酶的转基因动物模型，对以下说法进行正误判断（正误判断）。 ①可选用质粒DNA或病毒DNA与半乳糖苷酶基因重连构成表达载体_______。 ②表达载体中无标记基因也可筛选出重组表达载体_______。 ③通过将重组载体通过显微注射法导入动物受精卵中构建动物模型_______。 ④若无法在动物肠道中检出半乳糖苷，则证明该动物模型构建成功_______。 (5)外源半乳糖苷酶在转基因动物中出现过量表达的机制可能是（　　）（多选）。 A．表达载体上的启动子在小肠上皮细胞中过表达。 B．半乳糖苷代谢途径中存在正反馈调节机制。 C．只有半乳糖苷酶基因被导入到表达载体中。 D．半乳糖苷酶发挥作用后无法随饲料排出体外。 (6)分析材料信息并综合所学知识，从肠道微生物、代谢负担、免疫排斥等角度，概述外源半乳糖苷酶严重影响转基因动物的健康的可能原因_______。 (7)研究人员欲利用乳糖操纵子原理解决半乳糖苷酶的过量表达问题。以下研究思路和对应原理中，正确及可能可行的是（　　）（多选）。 A．构建诱导型表达系统：将半乳糖苷酶基因置于乳糖操纵子的调控元件（P、O）下，并引入调节基因I B．动态反馈调节：通过改造操纵子，使半乳糖苷酶的表达水平与底物浓度动态匹配 C．组织特异性调控：结合肠道特异性启动子，确保半乳糖苷酶仅在肠道局部表达，减少对其他组织的潜在影响 D．阻遏蛋白稳定性优化：设计对半乳糖苷敏感的阻遏蛋白变体，使其在底物存在时快速降解，而在底物缺乏时稳定结合操纵基因，增强系统的响应灵敏度和节能性 E．双保险表达控制：引入第二层调控（如温度敏感型阻遏蛋白或小分子诱导系统），在紧急情况下（如酶过量积累）强制关闭基因表达，保障动物健康 04 蛋白质工程 4．（2025·上海崇明·二模）高产苯丙氨酸 苯丙氨酸（PHE）在工业和食品生产等领域具有多种应用价值。大肠杆菌合成PHE的相关过程及催化反应过程的关键酶如图所示，研究人员期望通过对大肠杆菌的改造获得高产菌株。 (1)在大肠杆菌细胞内，进行三羧酸循环的场所是_____。（单选） A．拟核 B．细胞质基质 C．线粒体 D．细胞质基质和线粒体 (2)为缓解大肠杆菌的负反馈调控机制对PHE产量的影响，可将编码下列酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体：_____。（编号选填） ①aroF     ②aroD     ③aroE     ④pheA     ⑤tyrA (3)为进一步提升产率，研究人员将三种调控基因表达效率不同的启动子-高、-中等、-低）分别与编码图中酶的基因（aroF、aroD、aroE、pheA）任意组合，并整合到大肠杆菌中，筛选出PHE产量更高的组合。理论上需研究的组合共有_____。（单选） A．4种 B．6种 C．12种 D．种 (4)为方便检测大肠杆菌的PHE产量，研究人员设计并在大肠杆菌中导入了“PHE传感器”，使PHE产量与传感器发出的红色荧光呈正相关。能反映上述功能的传感器示意图为_____。（编号选填）（注：“●”多少代表PHE浓度，启动子Pmtr受PHE的调控，箭头粗、细分别表示基因表达效率高、低，代表红色荧光基因） ①      ②   ③      ④   (5)科研团队还赋予了图中编码pykF酶的基因特殊的启动子，使该基因在培养液中大肠杆菌数量快速增加时激活表达，而当大肠杆菌数量趋于稳定时则关闭，该做法的目的是_____。 (6)R基因编码的蛋白质能够调控大肠杆菌多个基因的转录，科研人员在DNA水平上对蛋白中的氨基酸进行随机诱变，经过三轮循环的诱变、筛选和检测，获得了PHE产量最高的菌株，该过程涉及的工程或技术包括_____。（编号选填） ①细胞工程    ②蛋白质工程    ③定向进化    ④循环突变 (7)综合信息，用编号与箭头将“大肠杆菌菌株制备与PHE高效生产”流程图填写完整。（编号排序） ①遗传改造    ②筛选高产菌株    ③PHE产量检测 ④基因测序验证    ⑤发酵罐发酵培养    ⑥实验室发酵培养 1．（2025·上海·二模）改造植物乳酸菌 高血压是心血管疾病的常见病因。ACEIP是一种通过重组技术生产出来的融合蛋白。植物乳酸菌（LAB）可被改造成具有降压效果的重组植物乳酸菌（NC8），部分改造流程如图所示。 (1)据图分析，改造获得重组植物乳酸菌（NC8）过程中，需要经过筛选获得相应的物质或细胞的过程有______。（编号选填） ①过程Ⅰ    ②过程Ⅱ    ③过程Ⅲ    ④过程Ⅳ (2)为了高效地构建表达载体，图中pUC57-ACEIP质粒中ACEIP基因左端识别序列是限制酶______。 (3)研究者通过PCR技术扩增ACEIP基因时在其两端分别增加限制酶A、限制酶B的识别序列以获取目的基因。请根据所学知识选择编号并用箭头连接来表示获得大量目的基因的循环过程______。（编号选填并排序） ①降温使含限制酶A识别序列的引物与单链DNA模板结合 ②降温使含限制酶B识别序列的引物与单链DNA模板结合 ③升温由DNA聚合酶催化从引物的3'端逐个聚合脱氧核苷酸形成DNA子链 ④升温由DNA聚合酶催化从引物的5'端逐个聚合脱氧核苷酸形成DNA子链 ⑤升温断开ACEIP基因双链DNA碱基对之间的化学键，获得两条单链DNA模板 ⑥升温断开ACEIP基因双链DNA核苷酸之间的磷酸二酯键，获得两条单链DNA模板 (4)以上PCR过程中，需经过几次循环可首次获得目的基因单链______。（单选） A．1次 B．2次 C．3次 D．4次 (5)据图分析，以下描述正确的是______。（多选） A．过程Ⅰ需对PCR产物进行电泳鉴定 B．过程Ⅱ的培养基中需要添加红霉素 C．过程Ⅲ需要对大肠杆菌进行液体培养 D．过程Ⅳ需要通入无菌空气并匀速振荡 研究者用凝胶电泳对重组植物乳酸菌（NC8）的表达产物ACEIP进行分析，结果显示出一条约8.5 kD的目标蛋白条带，如图所示。 (6)据图实验结果分析，进行凝胶电泳实验时样品槽位于______。（上方/下方）。 ACEIP是由含11个氨基酸的YFP蛋白和含21个氨基酸的TFP蛋白通过精氨酸（R）接头链接，然后再重复一次。ACEIP的完整氨基酸序列如图所示。 (7)由图10信息和已学知识，可推知ACEIP基因至少含有______个碱基对（不考虑终止密码子）。 (8)获取大量ACEIP融合蛋白的设计属于______。（编号选填） ①定点改造蛋白    ②定向进化蛋白    ③蛋白质工程    ④第二代基因工程 为验证口服重组植物乳酸菌（NC8）具有降低血压的效果，科研人员需要大量培育转基因高血压小鼠模型，部分相关过程如图所示。 (9)据图和已学知识分析，获得转基因小鼠的相关技术描述正确的有______。（多选） A．该过程需要动物细胞培养和细胞融合 B．代孕母鼠需注射促雌性激素使其超数排卵 C．可通过胚胎分割技术提高转基因小鼠数量 D．转基因受精卵的获得涉及超数排卵、体外受精等操作 2．（2026·上海浦东新·一模）诺沃霉素的生产 植物病害大多由真菌感染导致。诺沃霉素是由链霉菌（需氧型微生物）产生的一种代谢产物，具有良好的广谱抗真菌活性。 (1)通过大规模培养链霉菌生产诺沃霉素，用到的技术是（    ）（单选） A．细胞融合技术 B．转基因技术 C．微生物培养技术 D．干细胞技术 (2)大规模培养链霉菌，需采用的措施有____________。（编号选填） ①使用固体培养基     ②调节培养基的pH   ③延长光照时间 ④实时监测氧气条件   ⑤及时收集诺沃霉素  ⑥生产过程无菌操作 研究表明，来自透明颤菌的V蛋白（由V基因控制）能够增强菌体呼吸作用，进而提升菌体对氧气的利用效率。通过基因工程获得能表达V蛋白的新型链霉菌，成为提升诺沃霉素产量的有效策略。相关途径如图1所示。 (3)基于上述信息可知，获得新型链霉菌的生物学原理是（    ）（单选） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体变异 D．诱变育种 (4)利用PCR技术从透明颤菌的基因组中获取V基因时，需要用到的引物必须含有的序列是：5'____________3'和5'_________3' (5)图中培养皿B和培养皿C中应添加的抗生素分别是__________和__________；培养皿B和C的1~3和1'~3'中，含有符合育种目标的工程菌株是__________（填编号） 质粒pSET152上的启动子（RNA聚合酶结合的特定DNA序列，与转录起始有关）不同也会影响诺沃霉素的产量。研究人员比较五种启动子（P1、P2、P3、P4和PS）介导下5种新型链霉菌中V基因的表达水平（图1），以及这5种新型链霉菌和原始菌株的诺沃霉素产量（图2）。 (6)根据上述信息，结合已有知识推测，五种启动子应分别插在图1中质粒pSET152的位置是（    ）（单选） A．ori B．PO C．Ampr D．Ter’ (7)综合上述信息并结合已有知识，分析导入P3启动子后诺沃霉素的产量比原始菌株高，但比导入P2启动子的菌株产量低的原因_________。 3．（2024·上海嘉定·一模）miRNA是一类内源非编码单链小RNA，主要通过抑制靶基因表达来参与细胞生物学调控。研究人员通过测序推测miR160的靶基因是TaARF11-7A，为进一步证实该推测，选择图中质粒，按照图流程操作构建了不同的重组质粒，分别导入农杆菌中，获得农杆菌①②③（表），再将其转染烟草叶肉细胞，在激光共聚焦显微镜下观察荧光现象并记录，miR160不影响GFP基因表达。 目的基因 农杆菌 TaARF11-7A基因 ① miR160前体基因 ② miR160前体突变体基因 ③ (1)农杆菌和烟草细胞在结构上最显著的差别是_______。 (2)研究人员若要大量扩增miR160前体基因可以采取PCR技术，其基本原理和过程与细胞内DNA复制类似。以下关于两者共同点的叙述，正确的是________（单选）。 A．都是边解旋边复制 B．都需要引物、DNA解旋酶和DNA聚合酶 C．都需要游离的核糖核苷三磷酸作为原料 D．都遵循碱基互补配对原则 (3)已知miR160前体基因的编码链序列为5’-CATCATACGCC…GATACCGATTG-3’，现利用PCR技术定点突变改造miRNA前体基因，使其编码链个别碱基发生改变，从而获得miRNA前体突变体基因，可以设计的引物序列是______（编号选填）。 ①5’-CATCCGCCGCC-3’ ②5’-GATACCGATTG-3’ ③5’-GGCGGCGGATG-3’ ④5’-CAATCGGTATC-3’ ⑤5’-CATCATACGCC-3’ (4)研究人员在构建重组质粒时，为防止切割后的质粒片段自我连接成环，可以选择_______组合对质粒进行切割（编号选填）。 ①BclL I 和 Sac I    ②BamH I 和 Sal I    ③Bcl I 和 BamH I    ④Sac I 和 SaL I (5)为筛选成功导入重组质粒的农杆菌，研究人员运用图所示方式________（接种方法）将农杆菌接种于含氨苄青霉素（高温易失活）的培养基中培养，并挑选单菌落进行进一步实验。以下是相关培养基配制的操作步骤，请选择合适的排序________（单选）。 ①分装 ②高压蒸汽灭菌 ③溶解 ④加入无菌氨苄青霉素 ⑤称量 ⑥倒平板 ⑦调PH A．⑤③④⑦①②⑥   B．⑤③⑦①②④⑥ C．⑤③①②⑦④⑥   D．⑤③④①②⑦⑥ (6)获得农杆菌后，为进一步检测目的基因之一的小麦基因是否成功导入农杆菌，研究人员将上述筛选所得农杆菌DNA用32题所选限制酶进行酶切和PCR，获得结果如下图：甲是小麦基因的序列扩增电泳结果，乙是农杆菌单菌落的PCR鉴定结果，其中达到预期的是菌落______（填1~5序号）。 研究人员将上述操作获得的不同农杆菌进行组合，分别注射到烟草叶片的A1、A2、B1、B2位置，对烟草叶片进行瞬时转化，转化后观察到的叶片荧光程度如下： 组别 农杆菌组合 荧光程度 A1 ① 荧光亮度较高 A2 I_____ 荧光亮度较低 B1 ① 荧光亮度较高 B2 Ⅱ_____ 荧光亮度较高 备注∶农杆菌②和③中GFP基因不表达 (7)请完善上述表格：I________，Ⅱ________。并据此推测该实验能否验证miR160的靶基因是，并说明理由_______。 4．（2025·上海静安·二模）微藻(如衣藻)可通过光合作用等代谢途径将CO2转化为多种有机物，可被用于处理工业废气、制备生物柴油，但高浓度CO2条件下微藻的细胞质酸化会抑制其增殖。研究人员从烟草中提取了一种能特异性转运H+的载体蛋白基因——PMA基因(4691bp)导入微藻细胞，以提高其对CO2的耐受度。图1展示了构建转基因微藻的部分过程，其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Bler表示博来霉素抗性基因，氨苄青霉素对细菌有毒性，博来霉素对藻类、哺乳动物、植物有毒性。 (1)获取目的基因时，经常在引物末端引入限制酶识别序列，方便后续的DNA重组。图2所示的DNA分子经PCR扩增后应选用的限制酶为___________。(编号选填) ①EcoR Ⅰ        5′-GAATTC-3′    ②Aft Ⅱ        5′-CTTAAG-3′ ③Xho Ⅰ        5′-CTCGAG-3′   ④BamH Ⅰ    5′-GGATCC-3′ ⑤Bgl Ⅱ        5′-AGATCT-3′     ⑥Xba Ⅰ        5′-TCTAGA-3′ (2)图1中先将重组质粒导入大肠杆菌的目的是___________。 (3)图1中的培养基1和培养基2的成分分别为___________和___________。(编号选填) ①NH4Cl、博来霉素                         ②NH4Cl、氨苄青霉素 ③牛肉膏、蛋白胨、博来霉素                ④牛肉膏、蛋白胨、氨苄青霉素 ⑤牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、博来霉素 ⑥牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、氨苄青霉素 (4)经筛选得到若干目标藻株后，通过电泳对其进行目的基因鉴定，图3为部分实验结果，其中A泳道的样品为野生微藻都具有的actin基因的扩增产物。下列分析正确的有___________。(多选) A．藻株1为导入空载质粒的微藻 B．藻株2、3含有目的基因PMA C．设置A泳道的目的是保证实验的有效性 D．依据标准DNA可以知道基因的准确长度 (5)经基因鉴定后获得了a、b两个藻株，为了评估其对高浓度CO2的耐受度，科学家检测了实验开始2h时各藻株的胞内pH以及总光合速率等指标(表1)。有同学认为应选择藻株b作为后续工业应用的微藻，你认为合理吗？试阐明理由。___________。 表1 项目 野生藻株 藻株a 藻株b 胞内pH 6.56 6.65 6.76 总光合速率/nmolO2·106 cells-1·min-1 1.073 2.926 2.061 研究人员尝试利用发酵罐培养转基因微藻来处理燃煤烟气，以评估转基因微藻工业应用的可行性。 (6)如果要设计实验所需的发酵罐，需要考虑的有___________。(多选) A．在进气口处安装空气过滤除菌装置 B．罐体选择透光材质，并增加补光灯 C．添加搅拌器以满足转基因微藻对溶解氧的需求 D．添加温度、pH电极等以便对培养环境进行监测 (7)14天后，科研人员对罐中的微藻液进行取样，欲检测微藻的细胞数量，可采用的方法是___________。此外，为评估微藻对燃煤烟气的转化能力，可用于检测的指标有___________。(编号选填) ①显微镜计数法        ②稀释涂布平板法    ③平板划线法 ④O2的消耗速率        ⑤有机物积累速率    ⑥进入与排出气体中的CO2含量 5．（2025·上海浦东新·二模）汞是广泛存在的环境毒素。科研人员拟运用汞响应蛋白基因（MerR）、紫罗兰色素合成基因（Vio）以及大肠杆菌构建工程菌，快速有效地检测汞污染。图1为部分原理图，Amp'为氨苄青霉素抗性基因，Vio的表达产物可以将色氨酸转化为紫罗兰色素（紫色），①～④为pET-21质粒上的位点。 (1)据图1分析，为检测环境中的Hg2+，Vio基因应插入质粒pET-21的位点是____________。 A①    B②   C③   D④ (2)据图1信息，补全图2中的工程菌检测Hg2+的机制（1）______；（2）______。（编号选填） ①Hg2+与MerR蛋白结合，抑制启动子b ②Hg2+与MerR：蛋白结合，解除对启动子b的抑制 ③Vio基因不表达，分解紫罗兰色素 ④Vio基因表达，合成紫罗兰色素 (3)据图1分析，为使工程菌显现出紫色，培养基应添加的物质是______，该培养基称为显色培养基。 (4)在上述显色培养基中是否应加入氨苄青霉素，小浦同学认为需要，但小东同学认为不需要。你认同谁的观点，并说明理由______。 (5)科研人员将成功转入重组质粒的工程菌置于含一定浓度范围内的不同浓度Hg2+的培养基中，一段时间后裂解细胞，颜色（紫色）深度结果如图3所示。为了绘制Hg2+浓度和溶液颜色深度之间的标准曲线，可以采用___________进一步定量检测颜色深度并进行分析。 A层析法 B同位素标记法 C分光光度法 D显微镜观察法 将等量工程菌接种在含不同浓度Hg2+的显色培养基中，培养一段时间后，其颜色深度和工程菌数量变化如图4所示。 (6)综合上述信息和所学知识分析： 在0～0.024 μM浓度范围内，随着Hg2+浓度升高，______；（编号选填） 在0.024～0.195 μM浓度范围内，随着Hg2+浓度升高，______；（编号选填） 在0.195～3.125 μM浓度范围内，随着Hg2+浓度升高，______；（编号选填） ①工程菌数量不断增加 ②工程菌数量不断减少 ③合成的色素增加 ④合成的色素减少 ⑤Vio基因表达量增加 ⑥Vio基因表达量减少 ⑦对工程菌的毒害作用增加 ⑧对工程菌没有毒害作用 ⑨色素合成酶活性增强 ⑩色素合成酶活性降低 (7)你认为科学家构建的工程菌是否能作为检测污水中汞含量的生物传感器？若认为不能，请阐述理由，并指出存在的问题和改进的措施；若认为能，请阐述理由，并说明该生物传感器使用时与理由相关的注意事项______。 1．（2024·上海·高考真题）CRB1是一种膜蛋白，CRB1基因突变会导致不可逆的致盲眼病（LCA）。CRB1基因的多个位点均可能发生突变。图1显示了部分突变位点，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表突变位点。某4岁男孩因视力迅速下降就医，被诊断患有LCA。经检测，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因。 (1)据题中信息LCA的遗传方式是______。 A．常染色体隐性遗传 B．伴X染色体隐性遗传 C．常染色体显性遗传 D．伴X染色体显性遗传 (2)据图1，编号Ⅰ-Ⅳ所示的突变中，导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是______。 A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ (3)据图1，母亲CRB1突变基因编码的氨基酸序列变化位点是______。 A．652 B．1304 C．1305 D．3914 (4)若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计一对引物时应选择合理区间是______。 A．Ⅰ-Ⅱ B．Ⅰ-Ⅲ C．Ⅲ-Ⅳ D．Ⅱ-Ⅳ (5)该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型______。（编号选填） 科学家利用小鼠对CRB1基因的致病机理进行研究，发现LCA的发生与肠道细菌有关。 (6)为研究LCA发病机理，研究者将实验小鼠饲养在无菌环境，目的是______。 A．避免小鼠肠道中出现细菌 B．避免研究者被感染 C．避免小鼠视网膜中出现细菌 D．避免外源细菌干扰实验 (7)据图2，细菌从小鼠肠道进入视网膜的体液途径是______。 A．淋巴液→组织液→血浆 B．组织液→淋巴液→组织液 C．血浆→组织液→血浆 D．组织液→血浆→组织液 (8)据图2，推测CRB1蛋白作用有______。 A．识别并清除肠道细菌 B．阻碍细胞间物质交换 C．粘连相邻的上皮细胞 D．协助肠道细菌进入体液 (9)根据题干信息，治疗该男孩的有效方案有______。（编号选填） ①基因治疗        ②注意用眼卫生        ③服用抗生素        ④干细胞治疗 (10)某LCA女性患者若与一位表现型正常的男性结婚，为预防后代患LCA，需要对该男性进行基因检测。最经济合理的方法是检测该男性______。 A．CRB1基因的Ⅰ和Ⅳ位点 B．CRB1基因完整序列 C．CRB1基因的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ位点 D．全部基因序列 2．（2021·上海·高考真题）酶的改造：利用DszC酶可以获得低硫石油，减少酸雨，以红球菌获得的天然DszC酶活性会受到产物的抑制。为此改造DszC酶如下： Ⅰ：将三种DszC突变基因用SpeI和EcoRI切割，分别与质粒（图1）连接。 Ⅱ：将连接好的DNA分子导入受体细胞，接入含抗生素的培养基，筛选成功导入目的基因的受体细胞。 Ⅲ：培养受体细胞，并测DszC酶活性与其产物浓度关系（图2）。 (1)在Ⅱ中，培养基上发出绿色荧光的受体细胞中，一定含有的基因是______（填写编号）；Ⅱ筛选到的受体细胞会有基因______（填写编号）。 ①天然DszC酶基因    ②DszC突变基因    ③绿色荧光蛋白基因    ④抗性基因 (2)Ⅰ～Ⅲ中DszC基因表达的阶段是______。 (3)已知DszC基因长度为1254个碱基对，结合图2信息，通过比较不同酶的活性及产物抑制程度，分析DszCγ酶基因的长度，更可能是1257个碱基对还是303个碱基对？写出分析过程_________。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题13 基因工程 ( 目录 第一部分 知识网络构建 思维导航，融会贯通 第二部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第三部分 核心知识串讲 核心串讲 串讲1 基因工程赋予生物新的遗传特性 串讲2 基因工程是一种重组DNA技术 串讲3 基因工程的基本操作流程 串讲4 蛋白质工程 能力进阶 能力1 限制酶的选择原则 能力2 比较限制内切核酸酶、DNA连接酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶的作用 能力3 PCR技术和DNA复制的比较 能力4 PCR扩增过程图解及规律 能力5 基因治疗 能力6 蛋白质工程与基因工程的区别与联系 能力7 实验：DNA的提取和分离、鉴定 能力8 实验：PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定 第四部分 分层精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程的基本工具 题型02 基因工程生物基本操作程序 题型03 基因工程的应用 题型04 蛋白质工程 B组· 增分能力练 第五部分 真题 实战进阶 对标高考，感悟考法 ) 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程 （2024上海卷）PCR扩增的原理和过程 （2022上海卷）基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 1. 结合最新科技研究成果综合考查基因工程，重点考察基因工程在各个方面的应用； 2. 结合遗传规律进行交叉命题，重点考察变异与基因工程、细胞工程与基因工程的综合应用； 3. 拓展最新的基因工程技术，通过材料表述的方式考察对新技术的理解。 新风向演练 1．【新载体·PanD酶】（2026·上海长宁·一模）PanD酶 β-丙氨酸具有调节免疫功能等作用，被广泛应用于医药领域。PanD酶能够催化生成β-丙氨酸，但目前PanD酶活性较低。左图为研发高活性PanD酶的部分过程，其中易错PCR是指在PCR扩增过程中通过调整反应条件增加碱基错配频率，右图为用以构建PanD酶基因表达载体的质粒P。 (1)左图中，步骤Ⅱ和步骤Ⅳ分别需要______和_______。（编号选填） ①限制性内切核酸酶 ②解旋酶 ③DNA聚合酶 ④DNA连接酶 (2)步骤Ⅱ中的易错PCR过程，可获得的产物有_______（编号选填） ①突变的PanD酶基因 ②原PanD酶基因 ③原PanD酶 ④活性更高的PanD酶 ⑤活性更低的PanD酶 表显示步骤Ⅳ构建表达载体P1时，对目的基因使用的PCR引物序列，序列中的下划线部分及①处为引入的限制酶酶切位点。 引物名称 引物 PanD-F 5'-AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGCCCGCTACCG-3' PanD-R 3'-GTCAACGTCGGCGGTTG①GTGGTGGTGGTGGTG-5′ (3)结合表引物序列及质粒P的酶切位点信息，为实现表达载体重组效率最高，引物PanD-R的①的碱基序列为_________。（单选） A．GGTACC B．AGTACT C．CTCGAG D．GAGCTC (4)为验证构建的表达载体中是否成功插入PanD酶突变基因，可采用的检测方法有________。（多选） A．对表达体进行全序列测序 B．使用PanD-F和PanD-R对表达载体进行PCR C．酶切表达载体并电泳检测DNA片段长度 D．观察导入载体的大肠杆菌在含氨苄青霉素培养基上的生长情况 通过左图途径产生多种PanD酶后，最终筛选获得了活性最高的PanD-H8。规模化生产β-丙氨酸有两种方法：使用纯化的PanD酶在体外催化（纯酶法）；使用表达PanD酶的大肠杆菌细胞进行催化（全细胞催化法）。研究人员对两种生产方法进行了评估，相关数据如表所示。 酶种类 纯酶法最适温度 纯酶法最适pH 纯酶法50℃处理2h后的残余活性/热稳定性 全细胞催化法最适温度 原PanD酶 45℃ 7.0 <10% 37℃ PanD-H8 50℃ 7.0 47% 37℃ (5)筛选获得PanD-H8的方法属于蛋白质工程中的__________策略。 (6)结合表及已学知识，你认为选用哪种方法及温度条件，更适合用于规模化生产β-丙氨酸?请说明理由：________________________________________。 【答案】(1) ③ ①④ (2)①② (3)D (4)AB (5)定向进化（或从预期功能出发，通过基因突变与筛选获得目标蛋白） (6)我认为选用全细胞催化法，37℃，更适合用于规模化生产β-丙氨酸； 理由是全细胞催化法无需纯化酶，操作更简便，成本更低； PanD-H8在50℃处理2h后残留活性为47%，但全细胞催化的最适温度为37℃，这个温度条件下酶的稳定性更好，持续催化能力更强；全细胞可以为酶提供更稳定的环境，减少酶的失活，更适合规模化生产 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】（1）步骤Ⅱ是易错PCR技术扩增，这个过程需要③DNA聚合酶，步骤Ⅳ是构建基因表达载体，需要用①限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，用④DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来。 （2）易错PCR的原理是通过调整反应条件增加碱基错配频率，因此扩增后会得到①突变的PanD酶基因，同时也会有②原PanD酶基因，而PanD酶是基因表达的产物，不会在PCR过程中直接生成，①②符合题意，③④⑤不符合题意。 故选①②。 （3）质粒P上含有的酶切位点有NcoI（5′-CCATGG-3′）、BspHI（5′-TCATGA-3′）、XhoI（5′-CTCGAG-3′）， 引物PanD-F引入了限制酶NcoI识别位点（下划线部分 CCATGG ）， 为了让重组效率最高，引物PanD-R需要引入质粒上存在的另一个酶切位点，如果引入的是限制酶BspHI（5′-TCATGA-3′）识别的序列，由于限制酶BspHI识别序列的黏性末端与NcoI识别的序列的黏性末端一样，会造成两个引物发生碱基互补配对，影响目的基因扩增，所以不能选择限制酶BspHI识别序列，只能选择限制酶XhoI识别序列，XhoI的识别序列是5′-CTCGAG-3′，D符合题意，ABC不符合题意。 故选D。 （4）A、对表达载体进行全序列测序，可以直接确认是否插入PanD酶突变基因，A正确； B、使用PanD-F和PanD-R对表达载体进行PCR，若能扩增出目的条带，就说明插入成功，B正确； C、酶切表达载体并电泳可以检测DNA片段长度，但不能确定其碱基序列，C错误； D、质粒P携带的是卡那霉素抗性基因，而非氨苄青霉素抗性基因，因此观察大肠杆菌在氨苄青霉素培养基上的生长情况无法验证，D错误。 故选AB。 （5）该实验是先通过PCR突变得到多种PanD酶基因，再表达得到多种PanD酶，最后筛选出活性最高的PanD-H8，这属于蛋白质工程中的从预期蛋白质功能出发，通过基因改造和筛选获得目标蛋白的策略，也可以表述为定向进化（或基于基因突变的筛选）； （6）我认为选用全细胞催化法，37℃，更适合用于规模化生产β-丙氨酸； 理由是全细胞催化法无需纯化酶，操作更简便，成本更低； PanD-H8在50℃处理2h后残留活性为47%，但全细胞催化的最适温度为37℃，这个温度条件下酶的稳定性更好，持续催化能力更强；全细胞可以为酶提供更稳定的环境，减少酶的失活，更适合规模化生产。 2．【新情境·转基因抗虫玉米】（2026·上海黄浦·一模）转基因抗虫玉米的培育 在培育转基因抗虫作物过程中，单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。苏云金芽孢杆菌能产生晶体蛋白Cry1A．301和营养期杀虫蛋白Vip3A等，Vip3A蛋白羧基端结构的完整性对于维持蛋白活性至关重要。为提高作物的抗虫性，研究人员通过连接肽基因将修饰Cry1A．301基因和Vip3A基因拼接成5′-Cry1A．301-连接肽-Vip3A-3′基因（简称C-V基因），并利用相关技术培育出转基因抗虫玉米。具体过程如图1所示，其中Ⅰ~Ⅵ表示步骤。C-V基因表达过程如图2所示。 (1)据题意，将目的基因构建为5′-Cry1A．301-连接肽-Vip3A-3′基因可能的原因是______。（多选） A．单一抗虫基因易引起抗药性问题，而Cry1A．301和Vip3A的抗虫作用相互拮抗 B．由同一个启动子和终止子控制，有利于Cry1A．301基因和Vip3A基因同时表达 C．Cry1A．301基因在前，Vip3A基因在后，有助于保持Vip3A蛋白的羧基端完整性 D．相比较于直接拼接，连接肽的引入有助于避免融合蛋白内部结构和功能的相互影响 (2)利用PCR技术获取C-V基因时，从图2中选择合适的引物是引物______和引物______。 (3)表为各种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点。在步骤Ⅱ，科研人员用Hind III和Xba I处理质粒。为保证高效构建表达载体，则切割C-V基因时，应选用表中的酶______。（编号选填） 编号 限制酶 识别序列及切割位点 ① Hind III 5'-A↓AGCTT-3' ② Xba I 5'-T↓CTAGA-3' ③ Sac I 5'-GAGCT↓C-3' ④ Sal I 5'-G↓TCGAC-3' ⑤ Spe I 5'-A↓CTAGT-3' ⑥ BamH I 5'-G↓GATCC-3' (4)通过酶切法和凝胶电泳对DNA进行鉴定时，图3所示泳道1、2分别是用Hind III切割Ti质粒和重组质粒所得的结果。若用Hind III和Xba I同时酶切重组质粒，请在图3泳道3中绘制出电泳结果（Ti质粒中Hind III和Xba I间隔较近，长度可忽略不计）。 (5)为筛选出含重组质粒的农杆菌，图1步骤III中选用的培养基中应含有______。（编号选填） ①晶体蛋白                ②营养期杀虫蛋白            ③卡那霉素            ④水 (6)图1步骤Ⅰ~Ⅵ中，表示重组质粒导入受体细胞的是______。 (7)下列关于图1步骤III和Ⅵ中培养基的分析，正确的是______。（多选） A．物理状态相同 B．均添加细胞分裂素 C．营养物质齐全 D．后者无需灭菌操作 (8)用玉米原生质体培育出转基因玉米依次经历的过程有______。（选择正确编号并排序） ①细胞融合        ②脱分化        ③细胞壁再生        ④再分化        ⑤授粉 (9)为确定最终培育出的玉米是否符合预期，最直接的检测方法是______。（单选） A．对玉米细胞进行基因测序 B．对玉米特定基因片段进行PCR C．检测玉米植株的抗虫能力 D．酶切玉米基因组DNA后检测片段长度 【答案】(1)BCD (2) 4 5 (3)①⑤ (4) (5)③④ (6)Ⅳ (7)AC (8)③②④ (9)C 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）A、题干提到单一抗虫基因易引起抗药性，但“相互拮抗”错误，二者应是协同或互补作用，A错误； B、融合基因由同一个启动子和终止子控制，能保证两个基因同时表达，B正确； C、Cry1A.301在前、Vip3A在后，可避免Vip3A的羧基端被破坏，保持其完整性，C正确； D、连接肽可以分隔两个蛋白结构域，避免融合后互相影响结构和功能，D正确。 故选BCD。 （2）引物分别结合在目的基因两条链两端，且方向相反。引物的延伸方向是从5'→3'，所以要保证引物的3'端指向目的基因内部。因此利用PCR技术获取C-V基因时，从图2中选择合适的引物是引物4和引物5。 （3）步骤II中，质粒用Hind III（①）和Xba I（②）处理，为保证目的基因和质粒能高效连接，目的基因两端需要产生与质粒相同的黏性末端。观察限制酶的识别序列：Xba I（5'-T↓CTAGA-3'）和Spe I（5'-A↓CTAGT-3'）切割后产生的黏性末端相同（均为-CTAG-）。因此切割C-V基因应选择Hind III（①）和Spe I（⑤），这样可以与质粒的黏性末端匹配， （4）Ti质粒中HindⅢ和XbaI间隔较近，长度可忽略不计，因重组质粒中没有XbaⅠ识别序列，目的基因用SpeⅠ切割，泳带3和泳带2相同；绘制出相应条带如下： （5）筛选含重组质粒的农杆菌的培养基成分，质粒上带有卡那霉素抗性基因，因此培养基中应添加卡那霉素，同时需要水和其他营养物质来维持农杆菌的生长。故选③④ （6）图1中，步骤Ⅲ是将重组质粒导入农杆菌（受体细胞），步骤Ⅳ是将农杆菌中的目的基因导入玉米原生质体。 （7）A、步骤Ⅲ是培养农杆菌的培养基（液体），步骤Ⅵ是植物组织培养的培养基（液体），物理状态相同，A正确； B、植物组织培养需要添加细胞分裂素，而农杆菌培养不需要，B错误； C、两种培养基都需要营养齐全，以满足细胞生长需求，C正确； D、微生物和植物组织培养都需要严格灭菌，D错误。 故选AC。 （8）玉米原生质体培育转基因玉米的过程：原生质体首先需要细胞壁再生（③），然后经过脱分化（②）形成愈伤组织，再经过再分化（④）形成植株。经历的过程③→②→④。 （9）该转基因玉米的目的是抗虫，因此最直接的检测方法是检测玉米植株的抗虫能力。因此ABD错误，C正确。 故选C。 核心串讲1 基因工程赋予生物新的遗传特性 1.基因工程的诞生是多学科综合发展的成果 （1）基因工程概念：将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。由于重组拼接的基因和运载工具都是DNA分子，因此，基因工程也称为重组DNA技术。 2.基因工程改善人类的生活品质 核心串讲2 基因工程是一种重组DNA技术 1.DNA重组需要三种基本工具 （1）限制性内切核酸酶（限制酶） （2）DNA连接酶 作用：能封闭双链DNA分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 （3）载体 条件 原因 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 大都携带抗生素抗性等基因（有特殊的标记基因） 1. 便于重组DNA分子的筛选； 2.质粒并非其宿主正常生长所必需，但大都携带抗生素抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素的影响。 对受体细胞无毒、易分离 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 病毒DNA特点：病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 核心串讲3 基因工程的基本操作流程 1.PCR是获取目的基因的主要方法（目的基因的筛选和获取） （1）目的基因：人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。 （2）分离获取目的基因方法：（目的基因是基因工程各项产业化应用的前提，也是基因工程项目实施的首要阶段。） （3）PCR（聚合酶链式反应）技术：模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术。 2．切割和连接是构建表达载体的主要方式 （1）表达载体的构建：将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切割出黏性末端（简称“切”），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（简称“接”），形成含目的基因且能表达的表达载体的过程。 （2）基因表达载体的组成： 注意事项：①由于目的基因两侧的黏性末端相同，因而能以正反两种方式等概率接入载体，但在基因工程大多数应用中，只有一种方式是可用的。 ②同样，由于载体片段两侧的黏性末端也相同，因而在连接时载体两个黏性末端可以自我环化，导致载体“空载”（即非重组DNA分子）。 ③根据DNA连接酶的工作原理，目的基因和载体DNA只需黏性末端相同便能有效连接，也就是说，两种DNA并不必须用同一种酶切开。 ④如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会消失，也就是说，不能用相应的限制性内切核酸酶从重组DNA分子中重新“卸下”目的基因。 3．将DNA分子导入受体细胞 （1）目的/导入原因：经连接操作后的DNA分子只有导入受体细胞，才能借助细胞内的基因表达系统使目的基因所蕴含的遗传信息得以表达。 （2）受体细胞种类：微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。 （3）转化（简称“转”）：在自然条件下，DNA很难进入细胞。为了大幅度提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理的一操作。 （4）转化的方法：物理方法（如电击法）、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法） 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 氯化钙法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 （5）扩增（简称“增”）：转化成功的效率也只有10-4～10-2，因而需要高效筛选出接纳了DNA分子的受体细胞。为了做到这一点，转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 4．借助标记基因筛选和鉴定含目的基因 （1）筛选与鉴定：只有少数细胞能接纳DNA分子，而且进入受体细胞的DNA分子还有可能含有空载质粒，因此，需要借助有效的实验技术快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的受体细胞，这一过程称为筛选与鉴定。 （2）筛选含目的基因的受体细胞常用方法：抗药性筛选法和显色筛选法 ①抗药性筛选 抗药性筛选法实施的前提条件：载体DNA携带抗生素的抗性基因 标记基因：可供筛选使用的功能性基因。 第一轮筛选：筛选获得的转化成功克隆有两种类型：含重组质粒的克隆和含空载质粒的克隆。 第二轮筛选：含重组质粒的克隆只能在Amp平板上生长；而含空载质粒的克隆可出现在同时含Amp和Tet的平板上。 ②显色筛选（主要是鉴别） 很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18/19 同时携带Ampr和lacZ'两个标记基因。将外源DNA插在lacZ'标记基因内部的任何限制性内切核酸酶切割位点处，将转化扩增的细菌涂布在同时含有Amp和X-gal的固体培养基上，再长出来的克隆中，白色克隆即为含重组质粒的克隆。 经抗药性或显色筛选获得的含目的基因的受体细胞还需进一步鉴定安装在载体上的目的基因位置是否正确以及是否能高效表达，这需要使用PCR技术和基因表达产物（蛋白质）的结构和功能分析技术。 5.构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 （1）动物：动物的生殖细胞(精细胞和卵细胞)、受精卵(或早期胚胎细胞)、诱导性多能干细胞等 ①DNA显微注射：是动物细胞基因转移普遍采用的一种物理转化方法。 基本操作程序：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配后从其输卵管内取出受精卵，用吸管将受精卵固定在倒置显微镜上，然后借助玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液；将注射了DNA的受精卵移植到母鼠子宫中发育，继而繁殖转基因小鼠子代。 ②病毒感染当采用动物病毒（如腺相关病毒和慢病毒）DNA作表达载体时，可以通过病毒感染的方式高效导入动物细胞中。 （2）植物：植物的愈伤组织（或其他组织的原生质体）、生殖细胞或胚胎组织等 方法：农杆菌转化法或含有表达载体的植物病毒 由于植物的愈伤组织能再生出整株植物，因此转基因植物的构建要比转基因动物的构建更加简便。转基因动植物培育出来后，仍需要使用PCR等技术确认转基因是否获得成功，以及目的基因在动植物体内是否正确表达。 核心串讲4 蛋白质工程 1.蛋白质工程在基因水平上设计和改造蛋白质 （1）蛋白质工程崛起的缘由 ①基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质； ②天然蛋白质的不足：天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 （2）蛋白质工程：采用重组DNA技术在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，可以对天然蛋白质进行理性改造。由人为突变或设计基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程操作流程，又称第二代基因工程。 （3）蛋白质工程 ①修饰改造天然蛋白：两大类操作策略：基因的定点突变（在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列，）和定向进化（在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列）。 优点：修饰改造天然蛋白实质上是一个模拟自然界进化与适应的循序渐进过程，可将数千万年的自然进化历程缩短为数月、数周甚至数天的实验室过程（图所示的循环突变） ②设计制造全新蛋白：蛋白质工程的另一关键方面是根据我们所掌握的蛋白质结构与功能基本信息设计制造全新蛋白。设计制造全新蛋白需要根据已经掌握的蛋白质结构与功能的关系，借助特殊的电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，然后借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 2.蛋白质工程根据人类需要改造目标蛋白质 （1）定点突变方法：化学合成或PCR法：研究表明，人胰岛素样生长因子的结构和性质与人胰岛素高度相似，但它不像人胰岛素那样容易聚合形成多分子。 （2）定向进化：在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因。 能力1 限制酶的选择原则 （1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 （3）确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 （4）限制酶不切割细菌本身的DNA分子含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 能力2 比较限制内切核酸酶、DNA连接酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶的作用 分类 限制内切核酸酶 DNA连接酶 DNA解旋酶 DNA聚合酶 作用 切割DNA分子（切割磷酸二酯键），获得目的基因 连接目的基因与载体，形成磷酸二酯键 催化氢键断裂使DNA双链分开 以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成磷酸二酯键 作用结果 切割DNA分子 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 将双链DNA分子局部解旋为单链 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 作用时间 基因工程中获得目的基因及切割载体 基因工程中目的基因与载体的重组 DNA复制、转录 DNA复制 能力3 PCR技术和DNA复制的比较 名称 PCR技术 DNA复制 原理 半保留复制 半保留复制 场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内（主要是细胞核中） 条件 模板 一段目的DNA片段 整个DNA分子 原料 4种脱氧核苷三磷酸 4种脱氧核苷三磷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 能量 热能（PCR仪控制温度） ATP 引物 单链DNA片段（上游、下游引物） RNA片段 解旋方式 DNA在高温下变性解旋 DNA解旋酶催化 温度条件 在较高温度下进行，需控制温度；Buffer缓冲液，Mg2+、无菌技术等 细胞内温和条件；体内环境 过程 结果 快速复制目的DNA 复制DNA分子（相对速度较慢） 能力4 PCR扩增过程图解及规律 经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。 能力5 基因治疗 生理性T细胞受体（TCR）只有在受到抗原刺激后才能发挥免疫效应，而肿瘤表面抗原较难激活T细胞。用特异性识别特定肿瘤表面抗原的单链抗体（scFv）取代TCR的αβ链，同时对TCR复合物进行结构改造，构成所谓的嵌合型抗原受体（CAR）。与生理性T细胞受体（TCR）复合物相比，第二代嵌合型抗原受体（CAR）在结构上发生了很大改变。将这种携带工程化CAR的T细胞作为治疗用剂输回患者体内，此类疗法统称为CAR-T细胞疗法。 在体内，这种工程化CAR能指导T细胞识别并杀死表面上带有相应抗原的肿瘤细胞。然而，科学研究没有止境，人们担心这种第二代CAR-T细胞输回患者体内后是否会形成新的免疫原性。综上所述，以首例基因治疗临床试验（补充或更换ADA基因）为代表的众多策略均属于忠实于原基因编码序列的基因工程；而以CAR-T细胞疗法（修饰或改造受体蛋白）为代表的新型策略则属于第二代基因工程——蛋白质工程。 能力6 蛋白质工程与基因工程的区别与联系 比较项目 蛋白质工程（第二代基因工程） 基因工程 区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的新的生物类型和生物产品 结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已存在的蛋白质 联系 ①都在生物体外对基因进行操作； ②蛋白质工程是在基因工程基础上聚合出来的第二代基因工程 判断 (1)如果仅将基因用限制酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换、增添或缺失某几个碱基，则属于蛋白质工程。 (2)如果合成的蛋白质是自然界中已存在的蛋白质(天然蛋白质)，则是基因工程；如果合成的蛋白质与天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。 能力7 实验：DNA的提取和分离、鉴定 实验 原理 过程 DNA的提取和分离 分离DNA和蛋白质：DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精 溶解DNA：在一定浓度的乙醇或异丙醇溶液中，DNA溶解度下降，可沉淀形成纤维状絮团，飘浮其中。 实验材料准备（肝脏样品切小块放入培养皿，乙醇放冰箱冷藏）→（培养皿中放入10mL生理盐水，药匙碾压、磨碎肝脏）悬浮、过滤（漏斗+纱布=过滤装置）、收集细胞悬→加入十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，破碎细胞，释放DNA→另取试管，移取细胞悬浮液→加入已预冷的乙醇，沉淀析出DNA→转动玻璃棒→使析出的DNA缠绕在玻璃棒上（絮状白色物质） DNA的鉴定 鉴定DNA：DNA大分子的脱氧核糖在酸性条件下加热，能与二苯胺（质量体积比为1%的冰醋酸溶液）发生反应，生成蓝色化合物。 ①将上述缠绕在玻璃棒上的DNA样品放入3 mL蒸馏水中，加热15min，促进DNA溶解。 ②取上述DNA溶液1mL于另一支试管中，加入2mL二苯胺试剂，混匀。 ③上述混合液于60℃加热15min，观察并记录实验结果。 1.请观察你所提取的DNA的颜色，如果不是白色絮状物，说明了什么？ →说明提取的DNA样品中有较多的杂质。 2.可能有哪些杂质，能用什么方法鉴定这些杂质，并反思操作过程中可能影响结果的关键步骤? →可能有蛋白质、多糖等杂质；可用双缩脲试剂来鉴定蛋白质 →添加SDS的浓度、量或处理时间可能不合适，组蛋白等杂质没有完全与DNA分开 →添加乙醇的浓度或量可能不合适，杂质没有完全溶解。 3.有同学认为采用猪血提取DNA可以减少磨碎、过滤等步骤。实验后却发现没有絮状物缠绕在玻璃棒上，你知道其中的原因吗? →与鸡的红细胞不同，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA，无法用于DNA的提取 4.如果溶液不呈现蓝色，可能的原因有哪些? →说明所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误。 →或所用的二苯胺试剂变质等 5.如果提取的DNA样品中混有RNA和蛋白质杂质，这些杂质会与二苯胺反应吗?为什么? →不会；DNA鉴定的原理是DNA中的脱氧核糖与二苯胺反应，生成蓝色化合物而RNA和蛋白质分子中不存在脱氧核糖，不会与二苯胺发生反应 →正因为如此，我们可以通过这种方法来测定样品中的DNA含量。 应用：亲子关系、法医鉴定（受害人身份，嫌疑人）、考古依据 能力8 实验：PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定 1. 实验原理： 由于核苷酸的磷酸基团使DNA片段带负电荷，所以电泳开始前应将负电极插在凝胶板含DNA样品的一端，将正电极插在另一端。通电后，DNA片段会通过凝胶向正极方向“泳动”。凝胶电泳主要根据核酸分子的大小和结构将它们分离开来。 2.实验步骤： ①按配方配制50×TAE电泳缓冲液。 ②将上述50×TAE电泳缓冲液稀释50倍（即1×TAE），用1×TAE电泳缓冲液配制50 mL浓度为0.7%（W/V）的琼脂糖悬浮液，在微波炉中加热至琼脂糖溶解（溶液澄清）。 ③待琼脂糖溶液冷却至50℃左右，倒入已放置了电泳梳的胶模板中，凝胶厚度为3~5mm。 ④待琼脂糖凝胶完全凝固后，将凝胶连同胶模板一起放入盛有1×TAE 电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液没过凝胶约1mm，然后轻轻拔去电泳梳。 ⑤将PCR扩增产物溶液（即DNA样品）与5×上样缓冲液按4∶1比例混匀后，用移液器取3~10μL（体积视DNA浓度而定）的上述混合液，缓缓加入琼脂糖凝胶的样品槽内。 ⑥盖上电泳槽后通电，电压为80~100V，使DNA向正极泳动。 ⑦当上样缓冲液中的蓝色染料泳动至琼脂糖凝胶全长的三分之二时，切断电源，取出凝胶和胶模板，在紫外灯（或核酸蛋白检测仪）下观察DNA电泳条带。 3.分析： （1）标准样：一种分子质量的DNA样品，作为对照。用来确定待测样品中DNA相对分子质量。 （2）DNA荧光条带： ①条带的有无：代表是否成功扩增出待测样品中的DNA。若无条带，常见原因有：无DNA模板，引物设计不合适。 ②条带的亮度：代表扩增的DNA数量，越亮代表DNA数量越多 ③条带位置：常代表DNA的大小。一般距离点样孔越远，说明跑得越快，DNA的分子质量越小。 01 基因工程的基本工具 1．（2026·上海青浦·一模）二化螟和田间杂草极大影响了稻米的产量和品质，科学家利用转基因技术将抗虫（cry1C）基因和抗草甘膦（EPSPS）基因成功转入水稻细胞中，并利用Cre/loxP重组酶系统特异性删除种子胚乳中的外源基因，获得了胚乳中无外源基因的抗虫、抗除草剂转基因水稻。转基因水稻的部分培育过程如图1所示。 Cre/loxP重组酶系统由Cre重组酶和loxP位点组成，多基因串联体左侧loxP位点的部分序列如图2所示。当DNA分子中存在两个相同的loxP序列且同向时，Cre重组酶能特异性识别并删除两个位点间的DNA序列。 注：LB、RB：多基因串联体左右边界序列，Kan':卡那霉素抗性基因，PstI、SacI、EcoRI:限制性核酸内切酶 (1)据题意推测，Cre重组酶的功能类似于_______。 A．解旋酶 B．DNA连接酶 C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶 (2)结合图2信息，为删除两个loxP位点间的DNA序列，多基因串联体右侧loxP位点间隔区的编码链序列为5'-_______-3'。 (3)人类食用的精米主要是由水稻种子的胚乳加工制成，二化螟主要通过钻蛀叶鞘、叶心、茎秆等绿色组织而危害水稻。结合题干信息，为实现水稻中外源基因的精准表达与特异性删除，启动子1、2、3分别为_______、_______、______。（编号选填）。 ①胚乳特异性启动子 ②绿色组织特异性启动子 ③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性） (4)为使多基因串联体与质粒PC1300Z高效连接，需在其两侧添加______（编号选填） ①SacI的识别序列 ②EcoRI的识别序列 ③PstI的识别序列 (5)下列关于转基因水稻To培育过程的叙述，正确的是________。 A．农杆菌应不具有卡那霉素抗性 B．过程I常用显微注射法 C．过程Ⅱ在含草甘膦的培养基中筛选 D．过程Ⅲ中培养基中适当增加生长素的浓度以诱导生根 (6)将转基因水稻T0自交得到T1，在T1幼苗期喷施适量的草甘膦，发现抗除草剂水稻与不抗除草剂水稻之比约为3:1，则T1中抗二化螟水稻的比例为________。（不考虑突变和交换） 为评估外源基因的敲除是否具有组织特异性，科研人员分别提取转基因水稻各组织细胞的总RNA，通过RT-PCR和凝胶电泳检测各细胞中不同基因的表达情况。结果如表所示，“+”表示“表达”，“-”表示“不表达”。 编号 cry1C基因 EPSPS基因 ① - + ② + - ③ + + ④ - - (7)RT-PCR是以mRNA为模板进行的特殊PCR，主要过程如图3所示。该反应体系中需添加的物质有______。（编号选填） ①水、缓冲液 ②RNA模板 ③dNTP ④DNA模板 ⑤逆转录酶 ⑥耐高温的DNA聚合酶 ⑦RNA引物 (8)表格结果中分别符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的是______。（编号选填） 【答案】(1)D (2)ATGTATGC (3) ① ② ③ (4)①③ (5)ACD (6)3/4 (7)①②③⑤⑥ (8)①④ 【分析】基因工程基本工具：限制酶、DNA连接酶、运载体。核心酶：限制酶（识别特定序列，切割DNA）、DNA连接酶（连接黏性末端/平末端，构建重组质粒）。PCR的原料与条件，原料：模板DNA、引物、dNTP、Taq酶、缓冲液+水；步骤：变性（90℃）→复性（50℃左右）→延伸（72℃左右）。 【详解】（1）Cre重组酶能特异性识别loxP位点，并切除两个同向loxP位点间的DNA序列，这与限制性核酸内切酶识别特定DNA序列并切割DNA链的功能一致；ABC不符合题意，D符合题意。 故选D。 （2）loxP由34bp组成，包含两个13bp的反向重复序列(IR）和一个8bp的间隔区（spacer）。间隔区的序列决定loxP的方向。若两个loxP位点方向相同，Cre酶切除中间序列；若方向相反，则可能反转序列。题目要求删除中间序列，说明两个loxP方向相同。左侧loxP的间隔区模板链为5'- GCATACAT-3'，所以右侧loxP位点间隔区的编码链序列为5'-ATGTATGC-3'。 （3）抗虫（cry1C）和抗草甘膦（EPSPS）基因需要在绿色组织（叶鞘、叶心、茎秆）表达，才能抵御二化螟和草甘膦，因此启动子1：驱动抗虫、抗草甘膦基因表达，这些基因需要发挥作用以抵御二化螟和草甘膦，因此选①胚乳特异性启动子。启动子2：驱动Cre重组酶基因表达，因此选②绿色组织特异性启动子；启动子3：为保证Cre/loxP重组系统的调控元件、标记基因等在所有组织中稳定表达，需要选③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性）。故启动子1、2、3分别为①②③。 （4）质粒PC1300Z上有SacI、PstI的酶切位点，而EcoRI位点可能破坏质粒关键结构/标记基因，因此多基因串联体两侧需添加①SacI和③PstI的识别序列，才能与酶切后的质粒高效连接（相同限制酶切产生相同黏性末端，便于连接）故选①③。 （5）A、农杆菌本身不应有卡那霉素抗性，否则无法通过卡那霉素筛选出含重组质粒的农杆菌，A正确； B、水稻是植物，农杆菌转化法是转基因水稻的常用方法，显微注射法主要用于动物细胞，B错误； C、质粒含抗草甘膦（EPSPS）基因，因此过程II可在含草甘膦的培养基中筛选出成功导入外源基因的愈伤组织，C正确； D、过程III是诱导生根，生长素浓度偏高有利于根的分化，细胞分裂素偏高利于芽的分化，D正确。 故选ACD。 （6）T0自交得到T1，抗除草剂与不抗除草剂比例为3:1，说明抗除草剂基因（EPSPS）为单拷贝显性基因，T0基因型为Aa（A为抗除草剂基因，a为隐性），抗虫基因（cryIC）与抗除草剂基因位于同一转基因片段上，二者连锁遗传，因此T0的抗虫基因也为单拷贝显性，T1中抗虫性状的分离比与抗除草剂性状一致，即抗二化螟水稻占3/4（不考虑突变和交换）。 （7）RT-PCR分为逆转录和PCR扩增两步：逆转录阶段：以②RNA模板（mRNA）为模板，需要⑤逆转录酶、③dNTP（原料）、引物、①水、缓冲液。PCR扩增阶段：以逆转录得到的cDNA为模板，需要⑥耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、③dNTP、引物，同样需要①水、缓冲液；全程无需④DNA模板，也无需⑦RNA引物。因此需添加的物质①②③⑤⑥。 （8）题干要求实现胚乳中删除外源基因，绿色组织（根/茎/叶）保留并表达外源基因。根细胞：cry1C不表达，EPSPS表达，对应表格中①（-、+）；胚乳细胞：Cre重组酶切除外源基因，两个基因均不表达，对应表格中④（-、-）。因此符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的是①④。 02 基因工程生物基本操作程序 2．（2025·上海嘉定·一模）彩色棉花的研发 天然彩色棉的棉花纤维是在棉花发育过程中积累色素而形成有色彩的纤维，环保健康，现有的天然彩色棉品种中仅有绿色和棕色两种品种，且存在颜色不深等情况。Lc基因能正向调控玉米中花色素的合成，GhPAP1D基因能提高棉花花色素的合成。科研人员将Lc基因和GhPAP1D基因联合导入棉花植株中，得到了棕红色的棉花，具体流程如图。 注：NcoⅠ、BamHⅠ、SacⅠ、SalⅠ为限制酶酶切位点。启动子1、2属于真核细胞表达系统，Sm+是链霉素抗性基因，Amp+是氨苄青霉素抗性基因，GUS基因编码产生的酶能将无色物质X-Gluc分解，使植物组织呈蓝色，若无GUS基因，则植物组织呈淡黄色。 (1)质粒中的T-DNA能在农杆菌作用下转移至植物细胞并稳定整合到植物核基因组中，由此信息选择合适的限制酶切割质粒，应该选择的限制酶是_____。（编号选填） ①NcoⅠ ②BamHⅠ ③SacⅠ ④SalⅠ (2)科研人员在制备表达载体时，需要利用PCR技术在融合基因Lc—GhPAP1D基因两侧增加相应的限制酶酶切位点，则应在引物_____（用图中编号选填）的_____（5’/3’）端增加序列。 (3)将通过图中步骤①得到重组后的表达载体与农杆菌混合，再将菌液用_____法置于含_____的培养基甲中培养并鉴定，从而获得成功导入表达载体的农杆菌。（编号选填） ①   ②   ③链霉素 ④氨苄青霉素 (4)根据题意判断，下面关于图中培养基乙和丁的说法正确的是（    ）。（单选） 选项 组别 物理状态 用途 A 培养基乙 固体培养基 选择培养基 B 培养基乙 液体培养基 通用培养基 C 培养基丁 液体培养基 通用培养基 D 培养基丁 固体培养基 选择培养基 A．A B．B C．C D．D (5)为得到棉花的愈伤组织，需将棉花的外植体先_____（消毒/灭菌）后再放在细胞分裂素和生长素配比较合适的培养基中进行_____（脱分化/再分化）。得到愈伤组织后，将其与图中步骤⑤得到的农杆菌混合培养，再将愈伤组织放入含_____的培养基丙中培养，一段时间后选择颜色为_____的愈伤组织，放入培养基丁中继续培养得到转基因棉花幼苗。 经过检测，转基因得到的彩色棉花颜色较深，符合预期，结果见图，但棉花纤维的长度较短，具体见图。（DPA指的是棉花开花后天数，ns代表无显著差异，**代表有显著差异）。 (6)结合已有知识，对图分析正确的是（    ）。（单选） A．棉花纤维的主要成分属于双糖，可以作为人类的能源物质 B．棉花纤维的主要成分是纤维素，能和班氏试剂加热后产生红黄色沉淀 C．转基因棉花与野生型棉花的棉花纤维长度在开花后的前12天没有显著差异 D．转基因棉花与野生型棉花的棉花纤维长度在开花后的第20天开始有显著差异 (7)进一步研究发现，融合基因Lc—GhPAP1D基因在促进棉花纤维色素积累的同时，也抑制了棉花纤维的增长。为获得品质更佳的转基因彩色棉，科研人员提出了改良思路：将能干扰Lc—GhPAP1D基因表达的干扰载体RNAi导入棉花愈伤组织中，并在20DPA阶段诱导启动干扰载体RNAi。请你对该方案作出评价。_____ 【答案】(1)①② (2) ②③ 5′ (3) ② ③ (4)B (5) 消毒 脱分化 X-Gluc 淡黄色 (6)C (7)该方案的优点是在20DPA阶段诱导干扰载体RNAi，可在棉花纤维色素积累完成后，抑制Lc-GhPAP1D基因的表达，减少其对纤维增长的抑制作用，从而在保留深颜色的同时，改善纤维长度较短的问题；该方案的不足是需验证RNAi的干扰效率和特异性，避免对其他基因产生影响，同时需确认20DPA的诱导时机是否精准，以平衡色素积累与纤维生长的关系 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达； 2、从分子水平上检测目的基因的方法：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。 【详解】（1）要将目的基因插入质粒的T-DNA区域，需要选择T-DNA上的限制酶切位点，图中NcoⅠ（①）和 BamHⅠ（②）位于T-DNA上，为了保证目的基因连接方向正确，需要选择两种酶NcoⅠ（①）和 BamHⅠ（②）； （2）PCR扩增时，引物②③分别与基因的两条链的3′端互补，选择引物②③能扩增出目的基因，限制酶切位点需要添加在引物的5′端，这样才能在扩增后保留酶切位点，便于后续构建表达载体； （3）将通过图中步骤①得到重组后的表达载体与农杆菌混合，再将菌液用②稀释涂布平板法涂布在培养基上，质粒上的T-DNA区域的标记基因是Sm⁺（链霉素抗性基因），因此需要在含链霉素（③）的培养基中筛选成功导入表达载体的农杆菌； （4）AB、培养基乙的目的是扩大化培养农杆菌，需要使用液体培养基和通用培养基，A错误，B正确； CD、培养基丁用于愈伤组织再分化，需要使用固体培养基和通用培养基，CD错误。 故选B。 （5）为得到棉花的愈伤组织，需将棉花的外植体先消毒（避免杂菌污染，同时保留外植体活性）后再放在细胞分裂素和生长素配比较合适的培养基中进行脱分化可形成愈伤组织；根据题意，GUS基因编码的酶能分解X-Gluc使组织呈蓝色，若无GUS基因则呈淡黄色，在构建基因表达载体时由于导入了目的基因，替换了GUS基因，因此需在含X-Gluc的培养基丙中筛选，选择淡黄色的愈伤组织，放入培养基丁中继续培养得到转基因棉花幼苗； （6）A 、棉花纤维的主要成分是纤维素，属于多糖，参与构建细胞的结构，不能作为人类的能源物质，A错误； B 、班氏试剂用于检测还原糖，纤维素不是还原糖，纤维素不与班氏试剂反应生成红黄色沉淀，B错误； C、图中7DPA 到12DPA在开花后前12天标注“ns”，代表无显著差异，C正确； D、图中20DPA时标注“**”，代表转基因棉花与野生型棉花的纤维长度已经有显著差异，而非开始有显著差异，D错误。 故选C。 （7）该方案的优点是在20DPA阶段诱导干扰载体RNAi，可在棉花纤维色素积累完成后，抑制Lc-GhPAP1D基因的表达，减少其对纤维增长的抑制作用，从而在保留深颜色的同时，改善纤维长度较短的问题；该方案的不足是需验证RNAi的干扰效率和特异性，避免对其他基因产生影响，同时需确认20DPA的诱导时机是否精准，以平衡色素积累与纤维生长的关系。 03 基因工程的应用 3．（2025·上海·模拟预测）乳糖操纵子（lac operon）只存在于原核生物中，是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。乳糖操纵子由调节基因（I）、启动子（P）、操纵基因（O）、结构基因（Z、Y、A）组成（如图）。其中，Z、Y、A基因的表达产物分别为lacZ、lacY与lacA。 (1)乳糖操纵子的表达需多种物质共同协作完成。以下物质中，在转录阶段需要的是______，在翻译阶段需要的是______（编号选填）。 ①核糖核苷三磷酸 ②脱氧核苷三磷酸 ③DNA聚合酶 ④RNA聚合酶 ⑤DNA连接酶 ⑥tRNA ⑦rRNA ⑧氨基酸 (2)据图和所学知识，关于乳糖操纵子的表达机制，以下说法正确的是（　　）（单选）。 A．乳糖操纵子经转录后，经RNA可变剪接切除操纵基因mRNA后，在核糖体上进行后续翻译 B．诱导物与阻遏蛋白的活性中心结合，后者无法与O结合，促进基因表达 C．当诱导物与阻遏蛋白结合时，后续乳糖代谢基因仍可能表达 D．Z、Y、A经翻译后产生的物质需经内质网进一步加工后才可发挥作用 (3)同一段乳糖操纵子基因经中心法则过程可得到不同的蛋白质，其可能的原因是________（编号选填）。 ①mRNA上有不同启动子 ②密码子具有简并性 ③三种蛋白具有同源性 ④基因的表达具有选择性 ⑤RNA聚合酶具有专一性 ⑥乳糖代谢有分级调节 玉米-豆粕饲料是畜牧养殖中重要的蛋白质饲料，但饲料中含有半乳糖苷（抗营养因子）等物质，由于畜禽动物胃肠道内缺乏半乳糖苷酶，导致半乳糖苷在肠道内积聚，进而影响营养物质的吸收。半乳糖苷经肠道微生物发酵产生的NH3等气体还使动物产生胀气，甚至腹泻。因此生产能在动物肠道内表达半乳糖苷酶的转基因动物，可提高饲料中营养物质的利用率，但外源半乳糖苷酶基因在转基因动物中出现过表达的现象，严重影响转基因动物的健康。 (4)研究人员尝试构建能在动物肠道内表达半乳糖苷酶的转基因动物模型，对以下说法进行正误判断（正误判断）。 ①可选用质粒DNA或病毒DNA与半乳糖苷酶基因重连构成表达载体_______。 ②表达载体中无标记基因也可筛选出重组表达载体_______。 ③通过将重组载体通过显微注射法导入动物受精卵中构建动物模型_______。 ④若无法在动物肠道中检出半乳糖苷，则证明该动物模型构建成功_______。 (5)外源半乳糖苷酶在转基因动物中出现过量表达的机制可能是（　　）（多选）。 A．表达载体上的启动子在小肠上皮细胞中过表达。 B．半乳糖苷代谢途径中存在正反馈调节机制。 C．只有半乳糖苷酶基因被导入到表达载体中。 D．半乳糖苷酶发挥作用后无法随饲料排出体外。 (6)分析材料信息并综合所学知识，从肠道微生物、代谢负担、免疫排斥等角度，概述外源半乳糖苷酶严重影响转基因动物的健康的可能原因_______。 (7)研究人员欲利用乳糖操纵子原理解决半乳糖苷酶的过量表达问题。以下研究思路和对应原理中，正确及可能可行的是（　　）（多选）。 A．构建诱导型表达系统：将半乳糖苷酶基因置于乳糖操纵子的调控元件（P、O）下，并引入调节基因I B．动态反馈调节：通过改造操纵子，使半乳糖苷酶的表达水平与底物浓度动态匹配 C．组织特异性调控：结合肠道特异性启动子，确保半乳糖苷酶仅在肠道局部表达，减少对其他组织的潜在影响 D．阻遏蛋白稳定性优化：设计对半乳糖苷敏感的阻遏蛋白变体，使其在底物存在时快速降解，而在底物缺乏时稳定结合操纵基因，增强系统的响应灵敏度和节能性 E．双保险表达控制：引入第二层调控（如温度敏感型阻遏蛋白或小分子诱导系统），在紧急情况下（如酶过量积累）强制关闭基因表达，保障动物健康 【答案】(1) ①④ ⑥⑦⑧ (2)B (3)①④ (4) 正确 错误 正确 错误 (5)AB (6)从肠道微生物角度：外源半乳糖苷酶可能改变肠道微生物的种类和数量，破坏肠道微生物的平衡，影响动物健康。 从代谢负担角度：过量表达的外源半乳糖苷酶可能消耗过多的细胞内物质和能量，增加动物的代谢负担，影响动物正常的生长发育。从免疫排斥角度：动物机体可能将外源半乳糖苷酶识别为抗原，引发免疫排斥反应，影响动物健康。 (7)ABCDE 【分析】在转录过程中，RNA聚合酶首先与启动区结合，通过操纵区向右转录。转录从O区中间开始，按Z→Y→A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。转录的调控主要在启动区和操纵区进行。P序列、O序列和CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区，三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。乳糖操纵子通过这种方式，精确地调控乳糖代谢相关基因的表达，确保细胞在乳糖存在时能够高效地分解和吸收乳糖。 【详解】（1）转录是以DNA为模板合成RNA的过程。该过程需要原料核糖核苷三磷酸（①），在RNA聚合酶（④）的催化作用下进行。所以在转录阶段需要的是①④。 翻译阶段：翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程。该过程需要原料氨基酸（⑧），tRNA（⑥）作为转运氨基酸的工具，rRNA（⑦）是核糖体的组成成分，核糖体是翻译的场所。所以在翻译阶段需要的是⑥⑦⑧。 （2）A、原核生物基因转录后没有RNA可变剪接的过程，A错误； B、由图可知，诱导物与阻遏蛋白的活性中心结合，使阻遏蛋白无法与操纵基因O结合，RNA聚合酶可以正常结合启动子进行转录，从而促进基因表达，B正确； C、当诱导物与阻遏蛋白结合时，若没有引起阻遏蛋白构象改变，阻止了结合在启动子P上的RNA聚合酶向前移动，使转录不能进行，则后续乳糖代谢基因不能表达，C错误；   D、原核生物没有内质网，Z、Y、A经翻译后产生的物质不需要内质网加工，D错误。故选B。 （3）①、启动子在基因上，mRNA上不含启动子，①错误； ②、密码子具有简并性是指一种氨基酸可以由一种或几种密码子决定，不会导致同一段基因得到不同的蛋白质，②错误； ③、三种蛋白具有同源性与同一段基因经中心法则得到不同蛋白质无关，③错误； ④、基因的表达具有选择性，在不同时间、不同条件下，同一段基因可能以不同方式表达，从而得到不同的蛋白质，④正确； ⑤、RNA聚合酶具有专一性是指其只能催化RNA的合成，与得到不同蛋白质无关，⑤错误； ⑥、乳糖代谢有分级调节与同一段基因经中心法则得到不同蛋白质无关，⑥错误； 故选：④。 （4）①用质粒DNA或病毒DNA作为载体与半乳糖苷酶基因重连构成表达载体，因为质粒和病毒DNA都具有能够携带外源基因进入受体细胞并使其表达的特性，①正确。 ②表达载体中的标记基因主要用于筛选含有重组表达载体的受体细胞，如果没有标记基因，很难筛选出重组表达载体，②错误。   ③由于动物受精卵具有全能性，通过显微注射法将重组载体导入动物受精卵中，能够使重组载体中的基因在发育成的动物个体中表达，从而构建动物模型，③正确。 ④若无法在动物肠道中检出半乳糖苷酶，说明半乳糖苷酶基因可能没有在动物肠道中表达，不能证明该动物模型构建成功，④错误。 （5）A、表达载体上的启动子在小肠上皮细胞中过表达，会导致半乳糖苷酶基因转录增强，从而使外源半乳糖苷酶过量表达，A正确； B、半乳糖苷代谢途径中存在正反馈调节机制，会使得随着半乳糖苷酶的作用，代谢产物增加，进一步促进半乳糖苷酶的表达，导致过量表达，B正确；   C、只有半乳糖苷酶基因被导入到表达载体中，不会直接导致半乳糖苷酶过量表达，C错误； D、半乳糖苷酶发挥作用后无法随饲料排出体外，不会直接引起半乳糖苷酶过量表达，D错误。 故选：AB。 （6）从肠道微生物角度：外源半乳糖苷酶可能改变肠道微生物的种类和数量，破坏肠道微生物的平衡，影响动物健康。 从代谢负担角度：过量表达的外源半乳糖苷酶可能消耗过多的细胞内物质和能量，增加动物的代谢负担，影响动物正常的生长发育。从免疫排斥角度：动物机体可能将外源半乳糖苷酶识别为抗原，引发免疫排斥反应，影响动物健康。 （7）A、构建诱导型表达系统，将半乳糖苷酶基因置于乳糖操纵子的调控元件（P、O）下，并引入调节基因I ，可以通过调节诱导物的存在与否来控制半乳糖苷酶基因的表达，从而解决过量表达问题，A正确； B、动态反馈调节，通过改造操纵子，使半乳糖苷酶的表达水平与底物浓度动态匹配，能够避免半乳糖苷酶的过量表达，B正确； C、组织特异性调控，结合肠道特异性启动子，确保半乳糖苷酶仅在肠道局部表达，减少对其他组织的潜在影响，同时也有助于控制其表达量，C正确； D、阻遏蛋白稳定性优化，设计对半乳糖苷敏感的阻遏蛋白变体，使其在底物存在时快速降解，而在底物缺乏时稳定结合操纵基因，增强系统的响应灵敏度和节能性，能够合理调控半乳糖苷酶基因表达，D正确； E、双保险表达控制，引入第二层调控（如温度敏感型阻遏蛋白或小分子诱导系统），在紧急情况下（如酶过量积累）强制关闭基因表达，保障动物健康，E正确。 故选：ABCDE。  04 蛋白质工程 4．（2025·上海崇明·二模）高产苯丙氨酸 苯丙氨酸（PHE）在工业和食品生产等领域具有多种应用价值。大肠杆菌合成PHE的相关过程及催化反应过程的关键酶如图所示，研究人员期望通过对大肠杆菌的改造获得高产菌株。 (1)在大肠杆菌细胞内，进行三羧酸循环的场所是_____。（单选） A．拟核 B．细胞质基质 C．线粒体 D．细胞质基质和线粒体 (2)为缓解大肠杆菌的负反馈调控机制对PHE产量的影响，可将编码下列酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体：_____。（编号选填） ①aroF     ②aroD     ③aroE     ④pheA     ⑤tyrA (3)为进一步提升产率，研究人员将三种调控基因表达效率不同的启动子-高、-中等、-低）分别与编码图中酶的基因（aroF、aroD、aroE、pheA）任意组合，并整合到大肠杆菌中，筛选出PHE产量更高的组合。理论上需研究的组合共有_____。（单选） A．4种 B．6种 C．12种 D．种 (4)为方便检测大肠杆菌的PHE产量，研究人员设计并在大肠杆菌中导入了“PHE传感器”，使PHE产量与传感器发出的红色荧光呈正相关。能反映上述功能的传感器示意图为_____。（编号选填）（注：“●”多少代表PHE浓度，启动子Pmtr受PHE的调控，箭头粗、细分别表示基因表达效率高、低，代表红色荧光基因） ①      ②   ③      ④   (5)科研团队还赋予了图中编码pykF酶的基因特殊的启动子，使该基因在培养液中大肠杆菌数量快速增加时激活表达，而当大肠杆菌数量趋于稳定时则关闭，该做法的目的是_____。 (6)R基因编码的蛋白质能够调控大肠杆菌多个基因的转录，科研人员在DNA水平上对蛋白中的氨基酸进行随机诱变，经过三轮循环的诱变、筛选和检测，获得了PHE产量最高的菌株，该过程涉及的工程或技术包括_____。（编号选填） ①细胞工程    ②蛋白质工程    ③定向进化    ④循环突变 (7)综合信息，用编号与箭头将“大肠杆菌菌株制备与PHE高效生产”流程图填写完整。（编号排序） ①遗传改造    ②筛选高产菌株    ③PHE产量检测 ④基因测序验证    ⑤发酵罐发酵培养    ⑥实验室发酵培养 【答案】(1)B (2)①④⑤ (3)D (4)①③ (5)i  在大肠杆菌增殖时，该基因的表达可促进三羧酸循环，为DNA复制、细胞分裂等生命活动供应更多能量 ii  在大肠杆菌增殖减缓时关闭该基因，将更多PEP导向与PHE合成有关的反应，有利于PHE产量增加 (6)②③④ (7)→①→④→⑥→③→②→            →⑤→/→①→⑥→③→②→④→            →⑤→ 【分析】原核生物中三羧酸循环发生的场所是细胞质，真核生物则是线粒体基质。在这个过程中，柠檬酸经过一系列酶促的氧化脱氢和脱羧反应生成草酰乙酸，而草酰乙酸又可与另1分子的乙酰辅酶A（乙酰-CoA）结合，生成柠檬酸，从而产生循环。整个过程总共消耗了3分子H2O，生成1分子GTP（可转换为1分子的ATP）、4对H和2分子CO2，其中H可通过后续反应产生ATP，为细胞供能。 【详解】（1）A、拟核区是控制代谢的中心，不进行三羧酸循环，A错误； B、细胞质基质是三羧酸循环的场所，B正确； CD、大肠杆菌是原核生物，无线粒体，CD错误。 故选B。 （2）结合图示可知，PHE通过抑制pheA进行负反馈调节，因此可将编码pheA酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体，这样PHE无法发挥反馈调节作用。作为PHE的前体物质PPA，含量升高时会通过TYR反馈抑制aroF 和tyrA，使得PPA含量减少，进一步使得PHE含量减少，因此可将编码aroF 和tyrA酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体。故①④⑤正确。 故选①④⑤。 （3）每种基因可以与3种不同的启动子组合，一共有四种基因，因此组合方式为3×3×3×3=34种。 故选D。 （4）“●”多少代表PHE浓度，PHE产量与传感器发出的红色荧光呈正相关，箭头粗、细分别表示基因表达效率高、低，因此“●”越多，箭头越粗，红色荧光蛋白越多，与图中①符合。“●”越少，箭头越细，红色荧光蛋白越少，与图中③符合。 故选①③。 （5）在大肠杆菌增殖时，该基因的表达可促进三羧酸循环，为DNA复制、细胞分裂等生命活动供应更多能量，因此编码pykF酶的基因特殊的启动子，使该基因在培养液中大肠杆菌数量快速增加时激活表达，而当大肠杆菌数量趋于稳定时则关闭，这样有助于维持大肠杆菌数量的稳定。或者在大肠杆菌增殖减缓时关闭该基因，将更多PEP导向与PHE合成有关的反应，有利于PHE产量增加。 （6）①该工程在基因层面上进行改造，属于基因工程的延伸，不属于细胞工程，①错误； ②在DNA水平上对R蛋白中的氨基酸进行随机诱变，生产出更好的蛋白质，因此属于蛋白质工程，②正确； ③在DNA水平上对R蛋白中的氨基酸进行随机诱变，获得了PHE产量最高的菌株，因此属于定向进化，③正确； ④经过三轮循环的诱变、筛选和检测，属于循环突变，④正确。 故选②③④。 （7）将“大肠杆菌菌株制备与PHE高效生产”需先在实验室中对大肠杆菌进行改造，然后进行测序，与原基因进行比对看是否改造成功，接下来在实验室进行发酵培养，培养后进行PHE产量检测，以筛选筛选高产菌株。优质、高产的菌株是发酵工程的前提，因此最后再进行发酵罐发酵培养。完整流程图为→①→④→⑥→③→②→ →⑤→。 测序也可以在实验室发酵培养、PHE产量检测、筛选高产菌株后进行，即→①→⑥→③→②→④→ →⑤→。 1．（2025·上海·二模）改造植物乳酸菌 高血压是心血管疾病的常见病因。ACEIP是一种通过重组技术生产出来的融合蛋白。植物乳酸菌（LAB）可被改造成具有降压效果的重组植物乳酸菌（NC8），部分改造流程如图所示。 (1)据图分析，改造获得重组植物乳酸菌（NC8）过程中，需要经过筛选获得相应的物质或细胞的过程有______。（编号选填） ①过程Ⅰ    ②过程Ⅱ    ③过程Ⅲ    ④过程Ⅳ (2)为了高效地构建表达载体，图中pUC57-ACEIP质粒中ACEIP基因左端识别序列是限制酶______。 (3)研究者通过PCR技术扩增ACEIP基因时在其两端分别增加限制酶A、限制酶B的识别序列以获取目的基因。请根据所学知识选择编号并用箭头连接来表示获得大量目的基因的循环过程______。（编号选填并排序） ①降温使含限制酶A识别序列的引物与单链DNA模板结合 ②降温使含限制酶B识别序列的引物与单链DNA模板结合 ③升温由DNA聚合酶催化从引物的3'端逐个聚合脱氧核苷酸形成DNA子链 ④升温由DNA聚合酶催化从引物的5'端逐个聚合脱氧核苷酸形成DNA子链 ⑤升温断开ACEIP基因双链DNA碱基对之间的化学键，获得两条单链DNA模板 ⑥升温断开ACEIP基因双链DNA核苷酸之间的磷酸二酯键，获得两条单链DNA模板 (4)以上PCR过程中，需经过几次循环可首次获得目的基因单链______。（单选） A．1次 B．2次 C．3次 D．4次 (5)据图分析，以下描述正确的是______。（多选） A．过程Ⅰ需对PCR产物进行电泳鉴定 B．过程Ⅱ的培养基中需要添加红霉素 C．过程Ⅲ需要对大肠杆菌进行液体培养 D．过程Ⅳ需要通入无菌空气并匀速振荡 研究者用凝胶电泳对重组植物乳酸菌（NC8）的表达产物ACEIP进行分析，结果显示出一条约8.5 kD的目标蛋白条带，如图所示。 (6)据图实验结果分析，进行凝胶电泳实验时样品槽位于______。（上方/下方）。 ACEIP是由含11个氨基酸的YFP蛋白和含21个氨基酸的TFP蛋白通过精氨酸（R）接头链接，然后再重复一次。ACEIP的完整氨基酸序列如图所示。 (7)由图10信息和已学知识，可推知ACEIP基因至少含有______个碱基对（不考虑终止密码子）。 (8)获取大量ACEIP融合蛋白的设计属于______。（编号选填） ①定点改造蛋白    ②定向进化蛋白    ③蛋白质工程    ④第二代基因工程 为验证口服重组植物乳酸菌（NC8）具有降低血压的效果，科研人员需要大量培育转基因高血压小鼠模型，部分相关过程如图所示。 (9)据图和已学知识分析，获得转基因小鼠的相关技术描述正确的有______。（多选） A．该过程需要动物细胞培养和细胞融合 B．代孕母鼠需注射促雌性激素使其超数排卵 C．可通过胚胎分割技术提高转基因小鼠数量 D．转基因受精卵的获得涉及超数排卵、体外受精等操作 【答案】(1)①②③④ (2)HindⅢ (3)  或⑤→①②/②①→③→⑤ (4)B (5)ABC (6)上方 (7)201 (8)③④ (9)CD 【分析】转录、复制都是从模板链的3'端开始，因此新合成链的方向均为5'→3'。质粒作为基因的载体，与目的基因形成重组质粒时，需要形成相同的黏性末端，才能重新组合。 【详解】（1）在图中，过程Ⅰ、过程Ⅱ、过程Ⅲ和过程Ⅳ都涉及筛选或获得特定的物质或细胞。过程Ⅰ：将ACEIP基因插入质粒中，形成重组质粒。 过程Ⅱ：将重组质粒质粒转入大肠杆菌中，筛选出含有该质粒的大肠杆菌。 过程Ⅲ：在大肠杆菌中表达ACEIP基因，获得重组蛋白。 过程Ⅳ：将重组蛋白转入植物乳酸菌中，筛选出具有降压效果的重组植物乳酸菌（NC8）。 因此，需要经过筛选获得相应的物质或细胞的过程有：①过程Ⅰ、②过程Ⅱ、③过程Ⅲ、④过程Ⅳ。 （2）根据图示，pUC57-ACEIP质粒中ACEIP基因左端的识别序列是限制酶HindⅢ。 （3）PCR扩增过程的正确步骤如下：  升温断开ACEIP基因双链DNA碱基对之间的化学键，获得两条单链DNA模板（⑤）。 降温使含限制酶A识别序列的引物与单链DNA模板结合（①）。 降温使含限制酶B识别序列的引物与单链DNA模板结合（②）。 升温由DNA聚合酶催化从引物的3'端逐个聚合脱氧核苷酸形成DNA子链（③），获得两条单链DNA模板（⑤）。 因此，正确的循环过程是：  或⑤→①②/②①→③→⑤ （4）在PCR过程中，第一次循环后会得到两个单链DNA模板，第二次循环后会得到四个单链DNA模板，其中包含目的基因的单链。因此，需经过2次循环可首次获得目的基因单链。   故选B。 （5）A、过程Ⅰ需对PCR产物进行电泳鉴定，电泳鉴定可以确认PCR产物的大小和纯度，A正确； B、红霉素抗性基因用于筛选含有pUC57-ACEIP质粒的大肠杆菌，B正确； C、液体培养有利于大肠杆菌的生长和重组蛋白的表达，C正确； D、乳酸菌代谢类型为异养厌氧型，不需要通入空气，D错误。 故选ABC。 （6）图中显示了不同分子量的条带（14.4kD和5.8kD），这些条带从上到下排列，条带越小，电泳时扩散速度越快，表明样品是从上方加载的。因此，样品槽位于上方。 （7）ACEIP是由含11个氨基酸的YFP蛋白和含21个氨基酸的TFP蛋白通过精氨酸（R）接头链接，然后再重复一次因此，ACEIP蛋白的总氨基酸数为： 11（YFP） + 1（R） +21（TFP） + 1（R） + 11（YFP）+ 1（R） +21（TFP） + = 67个氨基酸  每个氨基酸由3个碱基对编码，因此ACEIP基因至少含有的碱基对数为： 67个氨基酸 × 3个碱基对/氨基酸 = 201个碱基对 （8）接下来，获取大量ACEIP融合蛋白的设计属于蛋白质工程。蛋白质工程是通过基因工程手段对蛋白质进行设计和改造，属于 ④第二代基因工程和③蛋白质工程，故选③④。 （9）A、转基因小鼠的获得通常需要动物细胞培养，但未涉及动物细胞融合，A错误； B、代孕母鼠通常不需要注射促雌性激素使其超数排卵，B错误； C、胚胎分割技术可以将一个胚胎分割成多个部分，从而增加转基因小鼠的数量，C正确； D、转基因受精卵的获得通常涉及超数排卵、体外受精等操作，以便获得足够的受精卵进行基因改造，D正确。 故选CD。 2．（2026·上海浦东新·一模）诺沃霉素的生产 植物病害大多由真菌感染导致。诺沃霉素是由链霉菌（需氧型微生物）产生的一种代谢产物，具有良好的广谱抗真菌活性。 (1)通过大规模培养链霉菌生产诺沃霉素，用到的技术是（    ）（单选） A．细胞融合技术 B．转基因技术 C．微生物培养技术 D．干细胞技术 (2)大规模培养链霉菌，需采用的措施有____________。（编号选填） ①使用固体培养基     ②调节培养基的pH   ③延长光照时间 ④实时监测氧气条件   ⑤及时收集诺沃霉素  ⑥生产过程无菌操作 研究表明，来自透明颤菌的V蛋白（由V基因控制）能够增强菌体呼吸作用，进而提升菌体对氧气的利用效率。通过基因工程获得能表达V蛋白的新型链霉菌，成为提升诺沃霉素产量的有效策略。相关途径如图1所示。 (3)基于上述信息可知，获得新型链霉菌的生物学原理是（    ）（单选） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体变异 D．诱变育种 (4)利用PCR技术从透明颤菌的基因组中获取V基因时，需要用到的引物必须含有的序列是：5'____________3'和5'_________3' (5)图中培养皿B和培养皿C中应添加的抗生素分别是__________和__________；培养皿B和C的1~3和1'~3'中，含有符合育种目标的工程菌株是__________（填编号） 质粒pSET152上的启动子（RNA聚合酶结合的特定DNA序列，与转录起始有关）不同也会影响诺沃霉素的产量。研究人员比较五种启动子（P1、P2、P3、P4和PS）介导下5种新型链霉菌中V基因的表达水平（图1），以及这5种新型链霉菌和原始菌株的诺沃霉素产量（图2）。 (6)根据上述信息，结合已有知识推测，五种启动子应分别插在图1中质粒pSET152的位置是（    ）（单选） A．ori B．PO C．Ampr D．Ter’ (7)综合上述信息并结合已有知识，分析导入P3启动子后诺沃霉素的产量比原始菌株高，但比导入P2启动子的菌株产量低的原因_________。 【答案】(1)C (2)②④⑤⑥ (3)B (4) GAATTC GGATCC (5) 氨苄青霉素 四环素 1、3 (6)B (7)据图2和图3可知，P3启动子导入链霉菌后增强了V蛋白的表达，进一步增强 了菌体的呼吸作用，提升菌体对氧气的利用效率，有利于细胞的代谢活动的进行，因此诺沃霉素的产量比原始菌株高。但是与导入P2启动子组相比，虽然V蛋白的表达量显著高于该 组，但是由于导入P3启动子组的细胞中更多的物质和能量用于了V蛋白的合成，使得异源 蛋白的高表达给细胞带来了额外的代谢负担，从而导致诺沃霉素的产量比导入P2启动子低 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）大规模培养链霉菌（微生物）生产诺沃霉素，需要用到微生物培养技术来提供适宜的环境，让链霉菌大量繁殖并产生代谢产物。C符合题意，ABD不符合题意。 故选C。 （2）①链霉菌的大规模培养一般使用液体培养基，这样有利于菌体与营养物质充分接触以及代谢产物的扩散等，而不是固体培养基，①不符合题意；②不同微生物生长对培养基pH有不同要求，调节培养基的pH可满足链霉菌生长需求，②符合题意；③链霉菌是需氧微生物，其生长与光照无关，不需要延长光照时间，③不符合题意；④链霉菌是需氧微生物，实时监测氧气条件可保证其正常生长和代谢，④符合题意；⑤及时收集诺沃霉素可避免其在培养体系中积累可能带来的反馈抑制等问题，⑤符合题意；⑥生产过程无菌操作可防止杂菌污染，保证链霉菌的正常生长和诺沃霉素的产量与质量，⑥符合题意。大规模培养链霉菌，需采用的措施有②④⑤⑥。 （3）通过基因工程获得新型链霉菌，基因工程的原理是基因重组，将透明颤菌的V基因导入链霉菌，使链霉菌获得新的性状。B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 （4）要从透明颤菌的基因组中获取V基因，利用PCR技术时，引物需要与V基因两端的序列互补。结合图中V基因的两端序列（以及限制酶切割位点等信息）可知，V基因两端分别是限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的切割位点，所以需要用到的引物必须含有的序列是5'GAATTC3'和5'GGATCC3'。 （5）由图可知，重组质粒中氨苄青霉素抗性基因完整，四环素抗性基因被破坏，据图可知，C培养基中有些位点没有菌落，所以培养皿B中应添加氨苄青霉素，培养皿C中应添加四环素；含有符合育种目标的工程菌株应是含有重组质粒的菌株，由于重组质粒中四环素抗性基因被破坏，所以在含有四环素的培养皿C中不能生长，在含有氨苄青霉素的培养皿B中能生长，因此培养皿B和C的1-3和1'-3'中，含有育种目标的工程菌株是1和3。 （6）启动子是RNA聚合酶结合的特定DNA序列，与转录起始有关，应该插入在目的基因上游调控目的基因转录，PO是启动子区域，五种启动子应分别插在该位置来调控基因表达。B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 （7）据图2和图3可知，P3启动子导入链霉菌后增强了V蛋白的表达，进一步增强 了菌体的呼吸作用，提升菌体对氧气的利用效率，有利于细胞的代谢活动的进行，因此诺沃霉素的产量比原始菌株高。但是与导入P2启动子组相比，虽然V蛋白的表达量显著高于该 组，但是由于导入P3启动子组的细胞中更多的物质和能量用于了V蛋白的合成，使得异源 蛋白的高表达给细胞带来了额外的代谢负担，从而导致诺沃霉素的产量比导入P2启动子低。 3．（2024·上海嘉定·一模）miRNA是一类内源非编码单链小RNA，主要通过抑制靶基因表达来参与细胞生物学调控。研究人员通过测序推测miR160的靶基因是TaARF11-7A，为进一步证实该推测，选择图中质粒，按照图流程操作构建了不同的重组质粒，分别导入农杆菌中，获得农杆菌①②③（表），再将其转染烟草叶肉细胞，在激光共聚焦显微镜下观察荧光现象并记录，miR160不影响GFP基因表达。 目的基因 农杆菌 TaARF11-7A基因 ① miR160前体基因 ② miR160前体突变体基因 ③ (1)农杆菌和烟草细胞在结构上最显著的差别是_______。 (2)研究人员若要大量扩增miR160前体基因可以采取PCR技术，其基本原理和过程与细胞内DNA复制类似。以下关于两者共同点的叙述，正确的是________（单选）。 A．都是边解旋边复制 B．都需要引物、DNA解旋酶和DNA聚合酶 C．都需要游离的核糖核苷三磷酸作为原料 D．都遵循碱基互补配对原则 (3)已知miR160前体基因的编码链序列为5’-CATCATACGCC…GATACCGATTG-3’，现利用PCR技术定点突变改造miRNA前体基因，使其编码链个别碱基发生改变，从而获得miRNA前体突变体基因，可以设计的引物序列是______（编号选填）。 ①5’-CATCCGCCGCC-3’ ②5’-GATACCGATTG-3’ ③5’-GGCGGCGGATG-3’ ④5’-CAATCGGTATC-3’ ⑤5’-CATCATACGCC-3’ (4)研究人员在构建重组质粒时，为防止切割后的质粒片段自我连接成环，可以选择_______组合对质粒进行切割（编号选填）。 ①BclL I 和 Sac I    ②BamH I 和 Sal I    ③Bcl I 和 BamH I    ④Sac I 和 SaL I (5)为筛选成功导入重组质粒的农杆菌，研究人员运用图所示方式________（接种方法）将农杆菌接种于含氨苄青霉素（高温易失活）的培养基中培养，并挑选单菌落进行进一步实验。以下是相关培养基配制的操作步骤，请选择合适的排序________（单选）。 ①分装 ②高压蒸汽灭菌 ③溶解 ④加入无菌氨苄青霉素 ⑤称量 ⑥倒平板 ⑦调PH A．⑤③④⑦①②⑥   B．⑤③⑦①②④⑥ C．⑤③①②⑦④⑥   D．⑤③④①②⑦⑥ (6)获得农杆菌后，为进一步检测目的基因之一的小麦基因是否成功导入农杆菌，研究人员将上述筛选所得农杆菌DNA用32题所选限制酶进行酶切和PCR，获得结果如下图：甲是小麦基因的序列扩增电泳结果，乙是农杆菌单菌落的PCR鉴定结果，其中达到预期的是菌落______（填1~5序号）。 研究人员将上述操作获得的不同农杆菌进行组合，分别注射到烟草叶片的A1、A2、B1、B2位置，对烟草叶片进行瞬时转化，转化后观察到的叶片荧光程度如下： 组别 农杆菌组合 荧光程度 A1 ① 荧光亮度较高 A2 I_____ 荧光亮度较低 B1 ① 荧光亮度较高 B2 Ⅱ_____ 荧光亮度较高 备注∶农杆菌②和③中GFP基因不表达 (7)请完善上述表格：I________，Ⅱ________。并据此推测该实验能否验证miR160的靶基因是，并说明理由_______。 【答案】(1)有无核膜包被的细胞核 (2)D (3)①④ (4)①②④ (5) 稀释涂布平板法 B (6)1 (7) ①+② ①+③ 根据结果，感染农杆菌①+②的烟草叶片的荧光亮度低于只感染农杆菌①的烟草叶片，表明靶基因表达被影响，导致其后的GFP无法正常表达；感染农杆菌①+③的烟草叶片的荧光亮度与只感染农杆菌①的烟草叶片相当，表明miRNA前体突变体不影响靶基因的表达，从而GFP正常表达。因此本实验有效证明了miR160的靶基因是TaARF11-7A 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）农杆菌（原核生物）和烟草细胞（真核生物）在结构上最显著的差别是有无核膜包被的细胞核。 （2）PCR技术和DNA复制的共同点是都需要引物、DNA聚合酶、复制过程中都遵循碱基互补原则，都需要以游离的脱氧核苷酸为原料，D正确。 （3）已知miR160前体基因的编码链序列为5’-CATCATACGCC…GATACCGATTG-3’,说明启动子在编码连的左边，现利用PCR技术定点突变改造miRNA前体基因，使其编码链个别碱基发生改变，引物应该与模板连的3'结合，故其中一条引物（靠近终止子）应该为5’-CAATCGGTATC-3’，另一条引物（靠近启动子）应该为5’-CATCCGCCGCC-3’（其中部分碱基应改变）这样才能扩增得到改造miRNA前体基因，故选①和④。 （4）Bcl I和BamH I两种限制酶切割产生的黏性末端相同，Sac I和sal I两种限制酶切割产生的黏性末端互补，为防止切割后的质粒片段自我连接成环，不能同时选择Bcl I和BamH I两种限制酶去切割目的质粒，故可以选择①②④。 （5）看图片（使用了涂布棒）可知研究人员运用稀释涂布平板法将农杆菌接种于含氨苄青霉素（高温易失活）的培养基中培养，并挑选单菌落进行进一步实验，培养基的配制的步骤包括：称量，溶解，调pH，分装，灭菌，加入无菌的氨苄青霉素，最后倒平板。 （6）从甲图可知，小麦TARF11-7A基因的序列扩增电泳片段大小为：小于200bp，大于100bp，只有乙图中的1菌落PCR扩增序列的片段大小符合，说明1菌落中含有目的基因。已知miRNA主要通过抑制靶基因表达来参与细胞生物学调控，为了验证miR160的靶基因是TaARF11-7，设计四组实验（自变量是TaARF11-7A的表达与否，因变量是荧光强度），A1和B1是对照组只含有TaARF11-7A，A2组合含有miRNA+TaARF11-7A基因，B2组含有miR160前体突变体基因+TaARF11-7A基因，根据结果，感染农杆菌①+②的烟草叶片的荧光亮度低于只感染农杆菌①的烟草叶片，表明靶基因表达被影响，导致其后的GFP无法正常表达；感染农杆菌①+③的烟草叶片的荧光亮度与只感染农杆菌①的烟草叶片相当，表明miRNA前体突变体不影响靶基因的表达，从而GFP正常表达。因此本实验有效证明了miR160的靶基因是TaARF11-7A。 4．（2025·上海静安·二模）微藻(如衣藻)可通过光合作用等代谢途径将CO2转化为多种有机物，可被用于处理工业废气、制备生物柴油，但高浓度CO2条件下微藻的细胞质酸化会抑制其增殖。研究人员从烟草中提取了一种能特异性转运H+的载体蛋白基因——PMA基因(4691bp)导入微藻细胞，以提高其对CO2的耐受度。图1展示了构建转基因微藻的部分过程，其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Bler表示博来霉素抗性基因，氨苄青霉素对细菌有毒性，博来霉素对藻类、哺乳动物、植物有毒性。 (1)获取目的基因时，经常在引物末端引入限制酶识别序列，方便后续的DNA重组。图2所示的DNA分子经PCR扩增后应选用的限制酶为___________。(编号选填) ①EcoR Ⅰ        5′-GAATTC-3′    ②Aft Ⅱ        5′-CTTAAG-3′ ③Xho Ⅰ        5′-CTCGAG-3′   ④BamH Ⅰ    5′-GGATCC-3′ ⑤Bgl Ⅱ        5′-AGATCT-3′     ⑥Xba Ⅰ        5′-TCTAGA-3′ (2)图1中先将重组质粒导入大肠杆菌的目的是___________。 (3)图1中的培养基1和培养基2的成分分别为___________和___________。(编号选填) ①NH4Cl、博来霉素                         ②NH4Cl、氨苄青霉素 ③牛肉膏、蛋白胨、博来霉素                ④牛肉膏、蛋白胨、氨苄青霉素 ⑤牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、博来霉素 ⑥牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、氨苄青霉素 (4)经筛选得到若干目标藻株后，通过电泳对其进行目的基因鉴定，图3为部分实验结果，其中A泳道的样品为野生微藻都具有的actin基因的扩增产物。下列分析正确的有___________。(多选) A．藻株1为导入空载质粒的微藻 B．藻株2、3含有目的基因PMA C．设置A泳道的目的是保证实验的有效性 D．依据标准DNA可以知道基因的准确长度 (5)经基因鉴定后获得了a、b两个藻株，为了评估其对高浓度CO2的耐受度，科学家检测了实验开始2h时各藻株的胞内pH以及总光合速率等指标(表1)。有同学认为应选择藻株b作为后续工业应用的微藻，你认为合理吗？试阐明理由。___________。 表1 项目 野生藻株 藻株a 藻株b 胞内pH 6.56 6.65 6.76 总光合速率/nmolO2·106 cells-1·min-1 1.073 2.926 2.061 研究人员尝试利用发酵罐培养转基因微藻来处理燃煤烟气，以评估转基因微藻工业应用的可行性。 (6)如果要设计实验所需的发酵罐，需要考虑的有___________。(多选) A．在进气口处安装空气过滤除菌装置 B．罐体选择透光材质，并增加补光灯 C．添加搅拌器以满足转基因微藻对溶解氧的需求 D．添加温度、pH电极等以便对培养环境进行监测 (7)14天后，科研人员对罐中的微藻液进行取样，欲检测微藻的细胞数量，可采用的方法是___________。此外，为评估微藻对燃煤烟气的转化能力，可用于检测的指标有___________。(编号选填) ①显微镜计数法        ②稀释涂布平板法    ③平板划线法 ④O2的消耗速率        ⑤有机物积累速率    ⑥进入与排出气体中的CO2含量 【答案】(1)①⑤ (2)扩增重组质粒（目的基因） (3) ④ ① (4)ABC (5)有合理性。首先，藻株b的胞内pH下降少，避免了胞质酸化，有利于微藻增殖，吸收 更多CO2；同时，藻株b的总光合速率比较高，能吸收更多的CO2。但是，藻株b的总光合速率小于藻株a，综合考虑胞质酸化对增殖的影响和光合速率，藻株b的吸收CO2的总量不一定高于藻株a;而且，实验只进行了2h，随之实验时间的增加，二者的胞内 pH和总光合速率可能还会发生变化 (6)ABD (7) ①② ⑤⑥ 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR扩增时从模板链的3'→5'，引物和DNA模板链复制起始端互补配对，因此扩增PMA基因时选择引物2和3，根据引物2的碱基序列可知对应的限制酶为⑤Bgl Ⅱ，根据引物3的碱基序列可知对应的限制酶是①EcoR Ⅰ。 （2）根据图示可知，导入重组质粒的大肠杆菌经过培养后提取了大量的重组质粒，因此说明将重组质粒导入大肠杆菌的目的是利用大肠杆菌大量扩增重组质粒。 （3）已知氨苄青霉素对细菌有毒性，而成功导入重组质粒的大肠杆菌含有氨苄青霉素抗性基因，因此利用氨苄青霉素可以筛选成功导入重组质粒（普通质粒）的大肠杆菌，此外大肠杆菌在培养时需要氮源和碳源，即牛肉膏和蛋白胨，故培养基1的成分是④。已知博来霉素对藻类、哺乳动物、植物有毒性，而重组质粒含有博来霉素抗性基因，因此利用博来霉素可以筛选成功导入质粒的微藻，微藻是自养型生物，所需的碳源来自二氧化碳，氮源则来自NH4Cl，故培养基2的成分为①。 （4）A、藻株1的P泳道无条带，说明没有扩增出目的基因，可能为导入空载质粒的微藻，A正确； B、藻株2和3的P泳道均出现条带，说明成功导入了目的基因PMA，B正确； C、A泳道的actin基因为野生微藻共有的，作为对照可以说明电泳过程是正常发生的，P泳道没有条带说明目的基因未成功导入，C正确； D、根据标准DNA已知长度的条带制作标准曲线，可以估算基因的长度（碱基对数量），但不能知道准确长度，D错误。 故选ABC。 （5）有合理性。选择藻株b作为后续工业应用的微藻有合理性。首先，藻株b的胞内pH下降少，避免了胞质酸化，有利于微藻增殖，吸收更多CO2；同时，藻株b的总光合速率比较高，能吸收更多的CO2。但是，藻株b的总光合速率小于藻株a，综合考虑胞质酸化对增殖的影响和光合速率，藻株b的吸收CO2的总量不一定高于藻株a；而且，实验只进行了2h，随之实验时间的增加，二者的胞内 pH和总光合速率可能还会发生变化。 （6）A、发酵需防止杂菌污染，进气口安装空气过滤除菌装置可过滤空气中杂菌，A正确； B、若培养微藻，微藻需光照进行光合作用，罐体选透光材质并补光，满足其生长需求，B正确； C、由于微藻光合作用需要消耗二氧化碳，因此搅拌器能促进气体交换，有利于微藻吸收二氧化碳，C错误； D、温度、pH会影响微生物生长代谢，安装电极实时监测培养环境，便于调控，D正确。 故选ABD。 （7）微藻的细胞数量，可采用显微镜计数法直接计数，也可以通过稀释涂布平板进行计数，平板划线法无法对细胞进行计数，故可采用的方法是①②。为评估微藻对燃煤烟气的转化能力，即固定二氧化碳的能力，二氧化碳用于光合作用合成有机物，因此可用于检测的指标有有机物积累速率、进入与排出气体中的CO2含量，光合作用是产生氧气，可以用氧气的产生速率作为指标，因此可用于检测的指标有⑤⑥。 5．（2025·上海浦东新·二模）汞是广泛存在的环境毒素。科研人员拟运用汞响应蛋白基因（MerR）、紫罗兰色素合成基因（Vio）以及大肠杆菌构建工程菌，快速有效地检测汞污染。图1为部分原理图，Amp'为氨苄青霉素抗性基因，Vio的表达产物可以将色氨酸转化为紫罗兰色素（紫色），①～④为pET-21质粒上的位点。 (1)据图1分析，为检测环境中的Hg2+，Vio基因应插入质粒pET-21的位点是____________。 A①    B②   C③   D④ (2)据图1信息，补全图2中的工程菌检测Hg2+的机制（1）______；（2）______。（编号选填） ①Hg2+与MerR蛋白结合，抑制启动子b ②Hg2+与MerR：蛋白结合，解除对启动子b的抑制 ③Vio基因不表达，分解紫罗兰色素 ④Vio基因表达，合成紫罗兰色素 (3)据图1分析，为使工程菌显现出紫色，培养基应添加的物质是______，该培养基称为显色培养基。 (4)在上述显色培养基中是否应加入氨苄青霉素，小浦同学认为需要，但小东同学认为不需要。你认同谁的观点，并说明理由______。 (5)科研人员将成功转入重组质粒的工程菌置于含一定浓度范围内的不同浓度Hg2+的培养基中，一段时间后裂解细胞，颜色（紫色）深度结果如图3所示。为了绘制Hg2+浓度和溶液颜色深度之间的标准曲线，可以采用___________进一步定量检测颜色深度并进行分析。 A层析法 B同位素标记法 C分光光度法 D显微镜观察法 将等量工程菌接种在含不同浓度Hg2+的显色培养基中，培养一段时间后，其颜色深度和工程菌数量变化如图4所示。 (6)综合上述信息和所学知识分析： 在0～0.024 μM浓度范围内，随着Hg2+浓度升高，______；（编号选填） 在0.024～0.195 μM浓度范围内，随着Hg2+浓度升高，______；（编号选填） 在0.195～3.125 μM浓度范围内，随着Hg2+浓度升高，______；（编号选填） ①工程菌数量不断增加 ②工程菌数量不断减少 ③合成的色素增加 ④合成的色素减少 ⑤Vio基因表达量增加 ⑥Vio基因表达量减少 ⑦对工程菌的毒害作用增加 ⑧对工程菌没有毒害作用 ⑨色素合成酶活性增强 ⑩色素合成酶活性降低 (7)你认为科学家构建的工程菌是否能作为检测污水中汞含量的生物传感器？若认为不能，请阐述理由，并指出存在的问题和改进的措施；若认为能，请阐述理由，并说明该生物传感器使用时与理由相关的注意事项______。 【答案】(1)D (2) ② ④ (3)Hg2+和色氨酸 (4)小浦；若无选择压，工程菌易丢失带有外源基因的质粒，影响后续检测结果 (5)C (6) ③ ④⑦⑩ ②④⑦ (7)观点1：不能。科学家用工程菌检测环境污水中汞污染的依据是随Hg2+与工程菌合成紫色色素 的量正相关，可借助分光光度计检测颜色深度进而得出Hg2+浓度。然而据图可知，若溶 液中Hg2+浓度大于0.024μM，Hg2+对工程菌的毒害作用随浓度增加而增强，可能改变酶的 空间结构使酶活性降低或使工程菌数量减少，Hg2+浓度与颜色深度不符合正相关的关系， 故不能作为生物传感器。改进的措施为：通过蛋白质工程等方式，提高紫色素合成酶空间 结构的稳定性，提高工程菌对高浓度Hg2+的耐受程度等 观点2 ：能。科学家用工程菌检测环境污水中汞污染的依据是随Hg2+与工程菌合成紫色色素的 量正相关，可借助分光光度计检测颜色深度进而得出Hg2+浓度。据图可知，若溶液中Hg2+浓度小于0.024μM，随Hg2+浓度的增加，工程菌的数量基本稳定，Hg2+解除MerR蛋 白对Vio基因表达的抑制，表达更多紫罗兰色素合成酶，Hg2+浓度与颜色深度符合正相关的 关系，因此能作为生物传感器。在使用时需注意若污水中Hg2+浓度过高，需要稀释至 0-0.024μM范围再测定。 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）根据题干信息，Vio基因的表达产物可以将色氨酸转化为紫罗兰色素（紫色），为了检测环境中的Hg²⁺，Vio基因需要与汞响应蛋白基因（MerR）协同工作。MerR蛋白在Hg²⁺存在时会解除对启动子的抑制，从而启动Vio基因的表达。因此，Vio基因应插入到启动子b的下游，即位点④，以便在Hg²⁺存在时启动Vio基因的表达。 故选D。 （2）根据题干信息，Hg²⁺与MerR蛋白结合后，会解除对启动子b的抑制，从而启动Vio基因的表达。因此，工程菌检测Hg²⁺的机制如下：Hg²⁺与MerR蛋白结合，解除对启动子b的抑制（②）；Vio基因表达，合成紫罗兰色素（④）。 （3）科研人员拟运用汞响应蛋白基因（MerR）、紫罗兰色素合成基因（Vio）以及大肠杆菌构建工程菌，快速有效地检测汞污染Vio基因的表达产物可以将色氨酸转化为紫罗兰色素，为了使工程菌显现出紫色，培养基中应添加色氨酸作为底物，同时需要加入待检测物质Hg²⁺。 （4）Amp’是氨苄青霉素抗性基因，加入氨苄青霉素可以筛选出成功转入重组质粒的工程菌，避免未转入质粒的细菌生长，确保实验结果的准确性，故认同小浦同学的观点。 （5）分光光度法可以通过测量溶液在特定波长下的吸光度来定量检测颜色深度，适合用于绘制标准曲线。层析法、同位素标记法和显微镜观察法不适合用于定量检测颜色深度。 故选C。 （6）根据图4的信息，随着Hg²⁺浓度的增加，颜色深度（紫色）在0～0.195 μM范围内逐渐增加，说明Vio基因表达量增加，合成的色素增加。在0.195～3.125 μM范围内，颜色深度不再增加，且工程菌数量减少，说明Hg²⁺对工程菌的毒害作用增加，导致工程菌数量减少，故分析如下：在0～0.024 μM浓度范围内，随着Hg²⁺浓度升高，③合成的色素增加；在0.024～0.195 μM浓度范围内，随着Hg²⁺浓度升高，⑦对工程菌的毒害作用增加，⑩色素合成酶活性降低，同时④合成的色素减少；在0.195～3.125 μM浓度范围内，随着Hg²⁺浓度升高，⑦对工程菌的毒害作用增加，②工程菌数量不断减少，④合成的色素减少。 （7）该工程菌通过MerR蛋白响应Hg²⁺，启动Vio基因表达，合成紫罗兰色素，从而通过颜色变化直观地检测Hg²⁺的存在，可以有以下观点： 观点1：不能。科学家用工程菌检测环境污水中汞污染的依据是随Hg2+与工程菌合成紫色色素 的量正相关，可借助分光光度计检测颜色深度进而得出Hg2+浓度。然而据图可知，若溶 液中Hg2+浓度大于0.024μM，Hg2+对工程菌的毒害作用随浓度增加而增强，可能改变酶的 空间结构使酶活性降低或使工程菌数量减少，Hg2+浓度与颜色深度不符合正相关的关系， 故不能作为生物传感器。改进的措施为：通过蛋白质工程等方式，提高紫色素合成酶空间 结构的稳定性，提高工程菌对高浓度Hg2+的耐受程度等。 观点2 ：能。科学家用工程菌检测环境污水中汞污染的依据是随Hg2+与工程菌合成紫色色素的 量正相关，可借助分光光度计检测颜色深度进而得出Hg2+浓度。据图可知，若溶液中Hg2+浓度小于0.024μM，随Hg2+浓度的增加，工程菌的数量基本稳定，Hg2+解除MerR蛋 白对Vio基因表达的抑制，表达更多紫罗兰色素合成酶，Hg2+浓度与颜色深度符合正相关的 关系，因此能作为生物传感器。在使用时需注意若污水中Hg2+浓度过高，需要稀释至 0-0.024μM范围再测定。 1．（2024·上海·高考真题）CRB1是一种膜蛋白，CRB1基因突变会导致不可逆的致盲眼病（LCA）。CRB1基因的多个位点均可能发生突变。图1显示了部分突变位点，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表突变位点。某4岁男孩因视力迅速下降就医，被诊断患有LCA。经检测，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因。 (1)据题中信息LCA的遗传方式是______。 A．常染色体隐性遗传 B．伴X染色体隐性遗传 C．常染色体显性遗传 D．伴X染色体显性遗传 (2)据图1，编号Ⅰ-Ⅳ所示的突变中，导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是______。 A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ (3)据图1，母亲CRB1突变基因编码的氨基酸序列变化位点是______。 A．652 B．1304 C．1305 D．3914 (4)若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计一对引物时应选择合理区间是______。 A．Ⅰ-Ⅱ B．Ⅰ-Ⅲ C．Ⅲ-Ⅳ D．Ⅱ-Ⅳ (5)该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型______。（编号选填） 科学家利用小鼠对CRB1基因的致病机理进行研究，发现LCA的发生与肠道细菌有关。 (6)为研究LCA发病机理，研究者将实验小鼠饲养在无菌环境，目的是______。 A．避免小鼠肠道中出现细菌 B．避免研究者被感染 C．避免小鼠视网膜中出现细菌 D．避免外源细菌干扰实验 (7)据图2，细菌从小鼠肠道进入视网膜的体液途径是______。 A．淋巴液→组织液→血浆 B．组织液→淋巴液→组织液 C．血浆→组织液→血浆 D．组织液→血浆→组织液 (8)据图2，推测CRB1蛋白作用有______。 A．识别并清除肠道细菌 B．阻碍细胞间物质交换 C．粘连相邻的上皮细胞 D．协助肠道细菌进入体液 (9)根据题干信息，治疗该男孩的有效方案有______。（编号选填） ①基因治疗        ②注意用眼卫生        ③服用抗生素        ④干细胞治疗 (10)某LCA女性患者若与一位表现型正常的男性结婚，为预防后代患LCA，需要对该男性进行基因检测。最经济合理的方法是检测该男性______。 A．CRB1基因的Ⅰ和Ⅳ位点 B．CRB1基因完整序列 C．CRB1基因的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ位点 D．全部基因序列 【答案】(1)A (2)A (3)C (4)B (5)①②③④（或①②） (6)D (7)D (8)C (9)③④ (10)B 【分析】人类遗传病通常是指由于遗传物质改变而引起的人类疾病，主要分为单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病三大类。单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，包括常染色体隐性遗传病、常染色体显性遗传病、伴X染色体隐性遗传病、伴X染色体显性遗传病。 【详解】（1）某4岁男孩患有LCA，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因，据此可推知：LCA的遗传方式是常染色体隐性遗传，A正确，BCD错误。 故选A。 （2）编码链是指双链DNA中不能进行转录的那一条DNA链（非模板链），转录的方向是从模板链的3′到5′端，据此分析图1中四个突变位点及附近的碱基序列可知：转录时，编号Ⅰ所对应的mRNA的片段突中最先出现终止密码子，因此导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是Ⅰ，A正确，BCD错误。 故选A。 （3）翻译时，mRNA上3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基构成1个密码子。据图1，突变位点Ⅲ和Ⅳ分别为编码链的第3493位点的碱基和第3914位点的碱基，突变位点Ⅲ和Ⅳ之间的基因片段编码的氨基酸数为（3914－3493）÷3≈140.3，而突变位点Ⅲ的突变基因编码的氨基酸序列变化位点是1165，所以母亲CRB1（突变位点Ⅳ）突变基因编码的氨基酸序列变化位点是1165＋140＝1305，C正确，ABD错误。 故选C。 （4）突变位点Ⅱ是父亲CRB1基因突变的位点，若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计的一对引物应该能够与突变位点Ⅱ两侧的碱基序列进行互补配对，所以应选择的合理区间是Ⅰ-Ⅲ，B正确，ACD错误。 故选B。 （5）突变位点Ⅱ是父亲CRB1基因突变的位点，突变位点Ⅳ是母亲CRB1基因突变的位点。该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞在减数第一次分裂的前期，若四分体中的非姐妹染色单体之间没有发生交叉互换，则经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型为①②；若四分体中的非姐妹染色单体之间发生了交叉互换，则经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型为①②③④。 （6）已知LCA的发生与肠道细菌有关，若利用小鼠对CRB1基因的致病机理进行研究，则需要将实验小鼠饲养在无菌环境中，以避免外源细菌干扰实验，ABC错误，D正确。 故选D。 （7）据图2，从小鼠肠道中的细菌先进入肠细胞间隙的组织液，再透过毛细血管壁进入血浆，通过血液循环到达视网膜处的毛细血管，进而透过毛细血管壁进入组织液，即其途径是：组织液→血浆→组织液，ABC错误，D正确。 故选D。 （8）图2显示，CRB1损失后，肠道中的细菌能够通过肠细胞间隙的组织液而进入血液；CRB1存在时将肠细胞粘附连接，阻止肠道中的细菌进入血液。据此可推测CRB1蛋白的作用是粘连相邻的上皮细胞，C正确，ABD错误。 故选C。 （9）CRB1是一种膜蛋白，LCA的发生与CRB1的损失引起视网膜退化及肠道细菌有关，因此治疗该男孩的有效方案有：③服用抗生素和④干细胞治疗。 （10）CRB1基因突变会导致不可逆的致盲眼病（LCA）。CRB1基因的多个位点均可能发生突变。某LCA女性患者若与一位表现型正常的男性结婚，为预防后代患LCA，需要对该男性进行基因检测。最经济合理的方法是检测该男性的CRB1基因完整序列，B正确，ACD错误。 故选B。 2．（2021·上海·高考真题）酶的改造：利用DszC酶可以获得低硫石油，减少酸雨，以红球菌获得的天然DszC酶活性会受到产物的抑制。为此改造DszC酶如下： Ⅰ：将三种DszC突变基因用SpeI和EcoRI切割，分别与质粒（图1）连接。 Ⅱ：将连接好的DNA分子导入受体细胞，接入含抗生素的培养基，筛选成功导入目的基因的受体细胞。 Ⅲ：培养受体细胞，并测DszC酶活性与其产物浓度关系（图2）。 (1)在Ⅱ中，培养基上发出绿色荧光的受体细胞中，一定含有的基因是______（填写编号）；Ⅱ筛选到的受体细胞会有基因______（填写编号）。 ①天然DszC酶基因    ②DszC突变基因    ③绿色荧光蛋白基因    ④抗性基因 (2)Ⅰ～Ⅲ中DszC基因表达的阶段是______。 (3)已知DszC基因长度为1254个碱基对，结合图2信息，通过比较不同酶的活性及产物抑制程度，分析DszCγ酶基因的长度，更可能是1257个碱基对还是303个碱基对？写出分析过程_________。 【答案】(1) ③④ ②④ (2)Ⅱ、Ⅲ (3)1257个碱基对。分析过程：据图2可知，在产物浓度为0时，DszCγ酶、其他改造酶和天然酶的活性虽然有所差异但是相差不大，说明突变改造后的DszCγ酶与底物结合以及在发挥催化活性的关键结构上没有发生改变，推测控制该酶的基因结构本身没有发生明显的改变；随着产物浓度的逐渐增加，天然酶和改造后的酶活性均受到产物抑制，但是与其他DszC酶活性相比，DszCγ酶仍然保持了较高的活性，说明该酶基因突变后极大地缓解了产物对DszCγ酶的抑制作用。根据DszCγ酶初始活力和该突变有效地解除了产物对DszCγ酶的抑制作用可知，其突变并不会显著改变酶本身的分子结构，如缩短酶分子的氨基酸数量，故DszCγ酶基因的长度更可能是1257个碱基对，而非是303个碱基对。 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1所示的质粒上含有绿色荧光蛋白基因和抗性基因。将三种DszC突变基因用SpeI和EcoRI切割，分别与质粒连接，则将连接好的DNA分子，均含有绿色荧光蛋白基因和抗性基因，其中有的分别含有三种DszC突变基因（构建的重组质粒），有的为空载质粒（不含目的基因），因此在Ⅱ中，培养基上发出绿色荧光的受体细胞中，一定含有的基因是③绿色荧光蛋白基因和④抗性基因；Ⅱ筛选到的受体细胞为成功导入分别含有三种DszC突变基因（目的基因）的受体细胞，而且对培养基中含有的抗生素具有抗性，所以会有②DszC突变基因和④抗性基因。 （2）由题意可知：DszC基因表达的产物是DszC酶。Ⅰ是构建基因表达载体，Ⅱ是将构建的基因表达载体导入受体细胞并筛选成功导入目的基因的受体细胞，Ⅲ是培养受体细胞并进行DszC酶活性与其产物浓度关系的检测，因此在Ⅰ～Ⅲ中，DszC基因表达的阶段是Ⅱ和Ⅲ。 （3）据图2可知，在产物浓度为0时，DszCγ酶、DszC β酶、DszCα酶和天然DszC酶的活性虽然有所差异但是相差不大，说明突变改造后的DszCγ酶与底物结合以及发挥催化活性的关键结构上没有发生明显改变，而酶蛋白是由基因表达即转录和翻译产生的，由此推测DszCγ酶基因的结构本身没有发生明显变化，这样转录出的mRNA的碱基序列和翻译出的酶蛋白的氨基酸序列才不会发生明显改变。随着产物浓度的增加，天然DszC酶和改造后的DszC酶活性均受到产物抑制，但是与其他DszC酶活性相比，DszCγ酶仍然保持了较高的活性，说明该酶基因突变后极大地缓解了产物对DszCγ酶的抑制作用。根据DszCγ酶初始活力和该突变有效地解除了产物对DszCγ酶的抑制作用可知，其突变并不会显著改变酶蛋白本身的分子结构，如缩短酶分子的氨基酸数量，故DszCγ酶基因的长度更可能是1257个碱基对，而非是303个碱基对。 / 学科网（北京）股份有限公司 $