3.1 重组DNA技术的基本工具 课件 2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 1 一、基因的结构和功能（回顾） 基因：是有遗传效应的DNA片段 基本单位：脱氧核苷酸 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 基因的功能 储存、传递、表达遗传信息 复制 子代DNA 转录、翻译 控制蛋白质合成 结构蛋白质——直接控制 酶的合成——间接控制 生物性状 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 基因的结构 DNA 基因 ？ 启动子 与RNA聚合酶结合位点 终止子 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 基因的结构——原核生物的基因结构 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 基因的结构——真核生物的基因结构 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 RNA的剪接 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 普通棉花不抗虫，苏云金芽孢杆菌可以合成抗虫毒素——Bt毒蛋白，请思考如何生产抗虫棉？ 杂交育种？ 诱变育种？ 等技术能否实现？为什么？ 杂交育种：同种生物之间进行 诱变育种：在原有基因基础上发生基因突变， 结果产生新基因——等位基因（不定向） 克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物性状 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 苏云金杆菌 毒蛋白基因 毒蛋白 杀死害虫 棉花细胞 抗虫棉的培育 目的基因 受体细胞 基因的表达产物 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 二、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 二、基因工程的诞生 1.遗传基础理论的重大突破 艾弗里、赫尔希、蔡斯等人证明DNA是遗传物质 1953年，沃森和克里克提出DNA双螺旋结构 1958年，梅塞尔松和斯塔尔证明DNA半保留复制 1963~1967年，尼伦伯格、马太、霍拉纳破译遗传密码 中心法则的提出和完善指出遗传信息在大分子间的传递 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 2.技术发明使基因工程的实施成为可能 二、基因工程的诞生 （1）基因转移载体的发现： 1967年，细菌质粒的自我复制能力，并且能够在细菌之间转移 为基因的转移找到运输工具 （2）工具酶的发现： 1970年，从细菌分离出限制性核酸内切酶 陆续发现多种限制酶和连接酶 为基因的切割和拼接创造条件 （3）DNA体外重组的实现： 1972年，构建出体外重组DNA分子 1973年，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因转入大肠杆菌，重组DNA表达成功 基因工程诞生的标志 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 三、重组DNA技术的基本工具 基因的剪刀（分子手术刀）——限制性核酸内切酶（限制酶） 基因的针线（分子缝合针）——DNA连接酶 基因的运输工具（分子运输车）——（运）载体 13 三、重组DNA技术的基本工具 任务1 阅读教材P71，思考并回答以下问题： 1.限制性内切核酸酶的简称是什么？ 2.来源于哪里？ 3.有什么特点？ 4.作用结果是什么？ 14 1.基因工程的剪刀——限制性内切核酸酶 回文序列 磷酸二酯键 (原核生物) P71旁栏思考题 1.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 二、拓展应用 1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 黏性末端 平末端 5′ 3′ 5′ 3′ 中心轴线 EcoRⅠ 5′ 3′ 5′ 3′ SmaⅠ 1.基因工程的剪刀——限制性核酸内切酶 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 同尾酶 切开的黏性末端如何连接起来呢 黏性末端之间按照碱基互补配对原则通过氢键连接。 但是剩下的缺口呢？ 这就需要“分子缝合针”--DNA连接酶来对它进行缝合。 任务2 阅读教材P72，思考并回答以下问题： 1.什么是DNA连接酶？ 2.它的作用是什么？ 3.E·coliDNA连接酶与T4DNA连接酶有哪些异同点？ 三、重组DNA技术的基本工具 ⑵作用： 将 “缝合”起来，恢复被 切开的__________。 双链DNA片段 限制酶 磷酸二酯键 ⑴概念： 能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。 两个DNA片段 2.基因工程的缝合针——DNA连接酶 ⑶种类： 类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 缝合_________ 缝合 和 。 黏性末端 平末端 （效率低） 黏性末端 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ T4 DNA连接酶 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 DNA连接酶与DNA聚合酶作用一样吗？为什么？（P72旁栏思考题） 2.基因工程的缝合针——DNA连接酶 DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键，不需要模板。 DNA聚合酶将单个核苷酸加到已有核酸片段的末端，形成磷酸二酯键，需要以一条DNA链为模板。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 外源基因很难进入细胞，进入后也不容易稳定存在并表达，怎么解决这个问题呢？ 将外源基因送入受体细胞，还需要有运输工具，它就是“分子运输车”，又叫载体或运载体。 三、重组DNA技术的基本工具 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 三、重组DNA技术的基本工具 任务3 阅读教材P72-73，思考并回答以下问题： 1.最常用的载体是什么？ 2.作为载体应具备哪些特点？ 3.载体的作用是什么？ 4.载体的种类有哪些？ 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 3.基因的分子运输车——基因进入受体细胞的载体 质粒是裸露、结构简单、独立于细菌拟核之外的小型环状DNA 具备什么条件才能充当“分子运输车”？ 天然的质粒可以直接用做基因工程载体吗？为什么？ 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 3.基因的分子运输车——基因进入受体细胞的载体 特点： 标记基因 便于重组DNA分子的鉴定和选择 复制原点 目的基因插入位点 （多个酶切位点） 四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性因 ①能在受体细胞内复制并稳定地保存 ②具有多个限制酶切割位点,便于目的基因插入 ③具有标记基因，便于重组DNA分子的鉴定和选择 ④必需是安全的，对受体细胞无害 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 3.基因的分子运输车——基因进入受体细胞的载体 （1）作用： （2）特点： （3）种类： 大肠杆菌中的质粒是最常用的运载体 将目的基因送入受体细胞 ①能在受体细胞内复制并稳定地保存 ②具有多个限制酶切割位点,便于目的基因插入 ③具有标记基因，便于重组DNA分子的鉴定和选择 ④必需是安全的，对受体细胞无害 质粒、噬菌体、动植物病毒 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 苏云金杆菌 毒蛋白基因 毒蛋白 杀死害虫 棉花细胞 抗虫棉的培育 目的基因 受体细胞 基因的表达产物 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 BamH Ⅰ GGATCCAAGCTTGGG CCTAGGTTCGAACCC CCCAAGCTT GGGTTCGAA Hind Ⅲ Hind Ⅲ BamH Ⅰ Bt基因 Hind Ⅲ Xba Ⅰ Sma Ⅰ 多 克 隆 位 点 动 子 启 终 子 止 标 R 记 基 因 Kan 复制 原点 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 AGCTT A GGATCCA CCTAGGTTCGA Bt基因 A T G C A A C G T T A T Bt基因 A A C G T T T G C A A T T A C G T A T A T A C G Bt基因 A A C G T T T G C A A T T A C G T A T A T A C G DNA连接酶 同一种限制酶切（单酶切） 正向连接 反向连接 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 关于限制酶的选择 例题.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 目的基因与目的基因 质粒片段与质粒片段 反向连接 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 Bt基因 A A C G T T C T A G G C C A C G T A T G C G A T A C T A G A C G T T G C AGCTT A G CCTAG Bt基因 两种限制酶切（双酶切） 避免自身环化，增大目的基因和运载体连接的概率， 能避免反向连接 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 35 关于限制酶的选择 例题.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （2）为避免目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，例如可选择用__________和__________这两种限制酶。 PstⅠ EcoRⅠ 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 任务4 阅读教材P74，并结合视频简述实验思路及过程： 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 实验思路： 获取细胞 破碎细胞 提取DNA 鉴定DNA 取材 研磨、过滤、离心取上清液 冷酒精析出DNA NaCl溶液溶解DNA并鉴定 实验过程： DNA不溶于酒精， 某些蛋白质溶于酒精 在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂 DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液中 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 练习与应用 一、概念检测 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是  （ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针 C A 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 二、拓展应用 1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 DNA重组技术 的 基本工具 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 1944年，艾弗里（O. Avery，1877-1955)等人通过肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 1958年，梅塞尔森（M. Meselson，1930-）和斯塔尔（F. W. Stahl。1929-）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。 1961年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg，1927-2010）和马太（J. H. Matthaei，1929-）破译了第一个编码氨基酸的密码子，截止1966年64个密码子均倍破译。 1970年，科学家在细菌中发现了第一个限 1972年，伯格（P. Berg，1926-）首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流，基因正式问世。 1950年，埃德曼（P. V. Edman，1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F. Sanger，1918-2013）首次完成了胰岛素氨基酸序列的测定。 1953年，沃森（J. D. Watson，1928-）和克里克（F. Crick，1916-2004）建立了双螺旋结构模型并提出了 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒具有自我复制能力，并可在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、链接及功能基因的获得创造了条件。 遗传物质自我复制的假说。 制性内切核酸酶（简称限制酶）。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 44 1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。 1984年，我国科学家朱作言（1941-）领导的团队培育出设计上第一条转基因鱼。 1985年，穆里斯（K. Mullis，1944-）等人发明了PCR，为获取目的基因提供了有效手段。 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。 1990年，人类基因组计划启动。2003年该计划的测序任务顺利完成。 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可是实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。 2013年，华人科学家张锋（1982-）及其团队首次报道了利用最新的基因编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 课件创意@小狗啃骨头（刘永生） 课件引用图片仅限于教学用途 45 $