专题15 基因工程（3大要点+4大题型）（专题专练）（山东专用）2026高考生物二轮复习讲练测

专题15 基因工程 目录 第一部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第二部分 核心要点提升 要点精析、能力提升 要点01 基因工程的基本工具和DNA粗提取实验 要点02 基因工程的操作步骤 要点03 蛋白质工程 第三部分 题型精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 DNA粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳 题型02 基因表达载体的构建和检测 题型03 PCR技术的类型及应用 题型04 基因编辑技术及其应用 B组·增分能力练 第四部分 真题演练进阶 对标高考，感悟考法 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程的基本工具及DNA粗提取实验 （2024山东卷）DNA粗提取与鉴定 （2022山东卷）DNA粗提取与鉴定 在遗传大题中加入PCR测序确定某个体基因型，综合考察学生对遗传定律和PCR测序的理解。 考察PCR的新类型，如反向PCR、交错延伸PCR等 基因工程的操作步骤 （2025山东卷）用PCR确定基因型 （2025山东卷）基因表达载体构建及测序 （2024山东卷）用PCR确定基因型 （2023山东卷）重组质粒检测 （2022山东卷）构建重组载体获得融合蛋白 蛋白质工程 （2024山东卷）基因编辑技术改造大豆基因 新风向演练 1.【新考法·反向PCR】（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 2.【新载体·遗传大题与基因工程相结合】（2025·山东·高考真题）某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，该植物有2条蓝色素合成途径。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素。已知基因a和基因b不编码蛋白质，无蓝色素时植物的花为白花。相关杂交实验及结果如表所示，不考虑其他突变和染色体互换；各配子和个体活力相同。 组别 亲本杂交组合 F1 F2 实验一 甲（白花植株）×乙（白花植株） 全为蓝花植株 蓝花植株：白花植株=10:6 实验二 AaBb（诱变）（♂）×aabb（♀） 发现1株三体蓝花植株，该三体仅基因A或a所在染色体多了1条 (1)据实验一分析，等位基因A、a和B、b的遗传 （填“符合”或“不符合”）自由组合定律。实验一的F2中，蓝花植株纯合体的占比为 。 (2)已知实验二中被诱变亲本在减数分裂时只发生了1次染色体不分离。实验二中的F1三体蓝花植株的3种可能的基因型为AAaBb、 。请通过1次杂交实验，探究被诱变亲本染色体不分离发生的时期。已知三体细胞减数分裂时，任意2条同源染色体可正常联会并分离，另1条同源染色体随机移向细胞任一极。 实验方案： （填标号），统计子代表型及比例。 ①三体蓝花植株自交    ②三体蓝花植株与基因型为aabb的植株测交 预期结果：若 ，则染色体不分离发生在减数分裂Ⅰ；否则，发生在减数分裂Ⅱ。 (3)已知基因B→b只由1种染色体结构变异导致，且该结构变异发生时染色体只有2个断裂的位点。为探究该结构变异的类型，依据基因B所在染色体的DNA序列，设计了如图所示的引物，并以实验一中的甲、乙及F2中白花植株（丙）的叶片DNA为模板进行了PCR，同1对引物的扩增产物长度相同，结果如图所示，据图分析，该结构变异的类型是 。丙的基因型可能为 ；若要通过PCR确定丙的基因型，还需选用的1对引物是 。    3.【新情境·重叠延伸PCR】（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s、复性15s、延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时只有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5'端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 要点01 基因工程的基本工具和DNA粗提取实验 1.基因工程的基本工具 （1）限制性内切酶 作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 结果：产生黏性末端或平末端 （2）DNA 连接酶 作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两个 DNA 片段 种类：E. coli DNA 连接酶、T₄ DNA 连接酶 （3）载体 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 需具备的条件：能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因 2.DNA粗提取和鉴定 （1）实验原理： ①粗提取原理：DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L的NaCl溶液 ②鉴定原理：DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 （2）操作步骤： ①选材：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA ②研磨：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。 ③过滤：4℃冰箱静置后取上清液，也可离心后取上清液 ④析出：加体积相等、预冷酒精（体积分数95%）静置，得白色丝状物，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水；离心将沉淀物晾干 ⑤鉴定：用2只试管各加入2mol/L的NaCl溶液，一只试管加入DNA溶解，均加入二苯胺沸水浴加热。 【高分必备】 限制酶选择的方法和注意事项 (1)不破坏目的基因原则； (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：一般需要选择两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上， 目的基因的转录方向和载体启动子与终止子的转录方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 【典例1】用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【典例2】下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能 B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝 C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳 D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物 要点02 基因工程的操作步骤 1.目的基因的筛选与获取 获取的方法：人工合成、基因文库中获取、PCR扩增 2.基因表达载体的构建（核心） （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：目的基因 ＋ 启动子（种类：组成型、诱导型、组织特异性） ＋ 终止子 ＋ 标记基因 + 复制原点 （3）构建过程：用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再用DNA连接酶拼接起来。 3.将目的基因导入受体细胞 （1）导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法 （2）导入动物细胞：显微注射技术（导入受精卵） （3）导入微生物细胞：Ca²⁺处理法 4.目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平检测 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法：PCR技术、核酸分子杂交 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法：PCR技术、核酸分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法：抗原-抗体杂交 （2）个体生物学水平鉴定---抗性及抗性程度的鉴定 【易错易混】 1. PCR中两种引物要结合在模版链的3’端。引物可以使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，子链的延伸方向是5’-3’。 2. 要保证目的基因能与载体相连接，还要在两种引物的5’端加上不同的限制酶识别序列。 3. PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出两条链等长的目的基因。 4. 与核酸有关的方向类问题 （1） DNA复制时子链的延伸方向： 5’-3’ （2） 转录时mRNA的合成方向： 5’-3’ （3） 翻译时，核糖体沿着mRNA的移动方向： 5’-3’ 5.受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 【典例3】如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBⅠ121）结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的的是（　　） A.用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 B.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 C.用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因 D.与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 【典例4】（不定项）科研人员构建了可表达 J - V5 融合蛋白的重组质粒并利用引物进行了 PCR 检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 V5 编码序列标签短肽 V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗 J 蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列说法错误的是（　　） A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点 B．为检测 J 基因是否插入图甲所示的位置，需用引物 F1和 R1进行PCR C．若 J 基因转录的模板链位于 b 链，则引物 F2与图甲中 b 链相应部分的序列相同 D．图乙中，条带 1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了 J - V5 融合蛋白 【典例5】科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI PvitⅡ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA CAG↓CTG T↓CTAGA ↓GATC (1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。 (2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12个碱基序列5′- -3′。 (3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,培养基乙中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,菌落 （填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 要点03 蛋白质工程 1. 操作方法及对象：改造或合成基因 2. 结果：来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 3. 基本设计思路：①预期的蛋白质功能→②设计预期的蛋白质结构→③推测应有的氨基酸序列→④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→⑤获得所需蛋白质 4.与基因工程的联系： ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。 【典例6】研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为（　　） A.引物1和引物4 B.引物2和引物6 C.引物2和引物4 D.引物3和引物5 01 DNA粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳 1．（2025·山东潍坊·一模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列说法错误的是（    ） A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂 B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶 C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中 D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高 2.（2025·山东青岛·二模）DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（　　） A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 3.（2025·山东枣庄·二模）下列与DNA有关的实验，说法正确的是（    ） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集 B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，浓度越高，酶活性越大 C．DNA电泳指示剂需要加入到熔化之后凝固之前的琼脂糖中 D．DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳 4．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液 B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中 C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察 5.（2025·山东菏泽·一模）肝脏是生物实验中的常见材料。下列关于肝脏操作处理与目的不相符的是（    ） A．在离心后肝脏研磨液的上清液中加入等量冷却的酒精溶液——粗提取DNA B．向2mL过氧化氢溶液中滴入2滴肝脏研磨液——检测过氧化氢酶的催化效率 C．在25mL肝匀浆中滴入5滴HCl溶液后测pH——比较不同pH下酶的活性 D．在2mL鲜肝提取液中先后加入双缩脲试剂A液1mL和B液4滴——检测蛋白质 02 基因表达载体的构建和检测 6．（2026·山东济南·一模）使用限制酶MboI（识别4核苷酸序列GATC）切割基因组DNA，将外源DNA片段与载体连接后导入大肠杆菌，成功构建了基因组文库，可以从基因组文库中筛选获取目的基因，下列相关叙述正确的是（　　） A．使用限制酶MboI可以对基因组DNA有较高的切割频率 B．非互补的黏性末端经E．coliDNA连接酶处理后均可以转变为平末端 C．为获得有生物活性的目的蛋白，基因组文库的构建需要使用相应的动植物细胞作为受体 D．使用PCR技术筛选目的基因的前提是目的基因的全部序列是已知的 7.（2025·山东青岛·二模）普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。下列说法正确的是（　　）      A．需用限制酶XmaI和NheI对Ti质粒进行切割 B．培养基2与培养基3加入的生长素和细胞分裂素比例不同 C．在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中一定含有改良基因 D．筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为蓝色 8．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 9．（2025·山东青岛·二模）转录因子是一类在基因表达调控中起关键作用的蛋白质，主要功能是通过结合DNA特定序列，控制基因转录的起始和强度。WRKY基因表达的转录因子在植物的抗逆方面发挥着重要的作用。为提高菠萝的抗干旱能力，研究人员利用Gateway克隆技术构建WRKY基因的过表达载体，培育出抗干旱的转基因菠萝。Gateway克隆技术包含BP反应和LR反应两个阶段。    (1)为得到两端含attB的WRKY基因，可采用 技术，完成该技术需要提供的物质有 。 (2)BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换，形成 。这种技术与传统的构建方法相比，区别是 。 (3)LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是 。 (4)pGWB605载体含植物强启动子，能 。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过 技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子的含量外，还需要从 水平来检测转基因菠萝是否培育成功。 10．（2025·山东济南·二模）研究发现水稻MEL2基因等位突变体mel2会导致个体不能产生雌配子，个体的花粉育性保持完全正常，其他农艺性状均不受影响。科研人员将野生型MEL2基因经PCR扩增后接入图甲中含有杀花粉基因ZM-AA1和糊粉层特异性表达的红色荧光基因DsRed2的双T-DNA载体中，以获得新的品系，构建过程如图所示。    (1)通过PCR扩增水稻MEL2基因并正确连入图甲载体中，使用的F引物5'端需要添加的序列为5' CACTGC3'（写出15bp序列）。 (2)使用Bb.Bts1对图甲载体插入位点可得到 个缺口，推测图中94 ℃处理的目的是 ；使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈 色（填“蓝”或“白”）。 (3)将重组载体导入mel2纯合突变体，可在阳性转化苗（两T-DNA均可检测到）的后代中挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A，原因是 ；假设株系A只有一个T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系自交后产生的种子中红色荧光种子的比例为 。 03 PCR技术的类型及应用 11．（2025·山东滨州·二模）应用农杆菌转化法时，目的基因插入T-DNA后，需要对T-DNA测序。测序前根据目的基因的序列设计引物对T-DNA进行PCR扩增的过程如图所示，下列说法正确的是（    ） A．实验需要清楚目的基因的全部碱基序列 B．L、R酶切位点需要在T-DNA外侧，且需用同种限制酶切割 C．引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物b、c D．1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子含有两个游离的磷酸基团 12.（2025·山东潍坊·三模）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 13.（2025·山东滨州·二模）PMA（叠氮溴化丙锭）是一种可以插入死细胞DNA的染料，该染料一旦插入到DNA中，就会抑制后续qPCR扩增。利用PMA—qPCR可以快速测得溶液中活菌的数量，PMA处理后，提取样品细菌DNA进行qPCR。qPCR是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链碱基互补配对的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即每个DNA扩增一次，就产生一个荧光信号。下列说法错误是（    ） A．提取样品细菌DNA前需要除去多余的PMA B．qPCR所用的引物可根据细菌中拟核DNA序列来设计 C．TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合活性和核酸水解酶的活性 D．PCR进行10轮后产生1.023×106个荧光信号，则样品中约含100个活菌 14．（2025·山东潍坊·二模）RACE PCR技术可以在仅知mRNA中部分序列的情况下扩增出对应的DNA，部分过程如图1所示。科研人员在开展植物病害监测工作时，发现一株香石竹呈现出异常症状。经初步检测分析，确定其病因系一种新型病毒——病毒A所致。科研人员欲提取病毒A的mRNA，并通过RACE  PCR技术得到对应的DNA。    (1)为获得较高纯度的病毒A的mRNA，先提取 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内的mRNA，通过逆转录得到DNA单链。将该DNA单链与从 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内提取的mRNA混合，未与DNA配对的mRNA即为病毒A的mRNA。 (2)病毒A的mRNA序列未知，但科研人员已经检测出了该病毒蛋白质的部分氨基酸序列。利用已知的氨基酸序列无法准确推知该病毒mRNA中的对应序列，原因是 。此时，若要顺利进行RACEPCR，就需要合成多种引物GSP。若病毒A蛋白中的一段氨基酸序列为“-半胱氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-组氨酸-酪氨酸-”，结合图2密码子表分析，利用该段序列设计出的含有18个碱基的引物GSP有 种。 第一个 碱基 第二个碱基 第三个碱基 U C A G U 苯丙氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 亮氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 酪氨酸 酪氨酸 终止 终止 半胱氨酸 半胱氨酸 终止 色氨酸 U C A G C 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 组氨酸 组氨酸  谷氨酰胺 谷氨酰胺 精氨酸 精氨酸 精氨酸 精氨酸 U C A G 图2  密码子表（部分） (3)RACE  PCR过程中形成的化学键是 。图1过程完成后，将“3'-RACE”和“5'-RACE”获得的双链DNA置于同一PCR反应体系中，不额外添加引物即可获得完整DNA片段，该过程中充当引物的是 （填图1中序号）。 (4)病毒A的mRNA的3'端为连续多个腺嘌呤核糖核苷酸，故引物1应为 。5'-RACE过程中，需要利用特定的酶为②链的3'添加多个相同的脱氧核苷酸，以便根据这一序列合成引物2。为②链的3'添加的脱氧核苷酸 （填“可以”或“不可以”）是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，理由是 。 15.（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成苏氨酸（密码子为ACG）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。请回答下列问题： (1)若将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是 ，据图分析，写出第51位氨基酸对应的密码子是 。 (2)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…ATAGCAGGC…3' B．5'…ATAACGGGC…3' C．5'…GCCTGCTAT…3' D．5'GCCCGTTAT3' (3)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，则第n次循环共需引物 个。 (4)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是 。在PCR扩增改良的抗菌肽基因时，研究人员尝试利用降落PCR技术提高扩增特异性。降落PCR的原理是：在PCR前几个循环先设置较高的复性温度，随后每个循环均降低一定温度，直至达到适宜复性温度。结合PCR原理分析，降落PCR能提高特异性的原因是 。 04 基因编辑技术及其应用 16.CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas系统的组成如图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成）已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关描述错误的是（　　） A.CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用 B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化 C.内切核酸酶Cas9具有专一性 D.CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割 17．（2026·山东济南·一模）科研人员将来自矮缩病毒（WDV）的复制子WDV盒、向导DNA序列和Cas9-REP融合基因构建了靶向基因敲入载体，如图甲所示。在被转化的水稻细胞中，REP蛋白特异性识别、结合并切割LIR序列，从而使WDV盒环化并大量扩增。扩增的WDV盒与Cas9-REP融合蛋白和向导RNA共同形成复合物，该复合物与水稻染色体中的OsMPK5基因结合，并在特定位点对其进行切割。切割后通过Nanoluc基因（荧光素酶基因）和OsMPK5基因两侧的同源臂（L臂和R臂）以同源重组方式在OsMPK5基因中插入NanoLuc基因，结果如图乙所示。 (1)已知WDV盒中REP基因内部存在两个BsaI限制酶识别序列，需通过定点突变将其消除。为此，在扩增REP基因的引物F2与R2中分别引入了突变。其中，R2引物的序列为5′-ATAATTGTGTGTCCCTAGTGACCTTGCCCAGGAAGTC-3'。对比其与模板的互补区域可知，该引物中通过 （填“T变成A”或“A变成T”）完成了定点突变；为便于后续载体构建，若在引物上添加限制酶识别序列，该突变位点位于限制酶识别序列的 （填“3'端”或“5′端”）。 (2)本研究中Cas9-REP融合蛋白的作用是 （写出两条）。 (3)为了检测WDV盒在水稻中能否正常环化，利用野生型和转基因水稻提取的DNA为模板，可选用图中的 引物进行PCR并电泳检测，若电泳后所呈现的条带结果为 ，说明WDV盒在水稻中能正常环化。 (4)使用OsMPK5蛋白抗体可以检测到转基因水稻中出现预期分子量大小的OsMPK5-NanoLuc融合蛋白，同时也检测到比预期蛋白分子量小的蛋白质，分析图丙，从同源重组的角度简要推测可能的原因是 。 18．（2025·山东潍坊·一模）利用基因编辑技术CRISPR/Cas12a开发出的核酸检测技术，可更加精确快速的进行核酸检测。该系统由crRNA与Cas12a蛋白组成，利用crRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA，Cas12a蛋白切割靶标DNA的同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量。现利用工程菌制备CRISPR/Cas12a复合体来检测自来水中的大肠杆菌，如图所示。 (1)PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是 ，crRNA序列应符合的条件是 。 (2)为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的黏性末端应 （填“相同”或“不同”）。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在F和R引物5'端添加的序列是 （填标号）。 ①F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ②F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' ③F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ④F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' (3)若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加入 ，从菌落分别挑取少许菌体，接种到含 的平板上，若 ，则对应菌落中细菌含有基因表达载体。 (4)下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验中设置不含大肠杆菌对照组的作用是 。一段时间后，荧光信号强度不再升高，原因是 。 19.（2025·山东聊城·三模）CRISPR/Cas12a系统是由crRNA和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的复合体。crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。下图是CRISPR/Cas12a系统的工作原理示意图。请回答下列问题。 注：PAM是一种短DNA序列，N表示任意碱基。PAM可以帮助Cas12a识别和切割目标DNA序列。“”表示在相应位置剪切DNA。 (1)在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含 种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化 水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断，切割DNA后形成的是 （填“黏性”或“平”）末端。 (2)某科研团队基于CRISPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。他们利用crRNA对应基因序列和PX458质粒（如下图）构建crRNA/Cas12a重组载体，转染至HeLa细胞进行相关研究。 ①为保证crRNA对应的基因序列与PX458质粒正确连接，应在扩增该基因序列的一对引物的5’端分别添加 两种限制酶的识别序列。其中P1的碱基序列为5’ 3’（写出前9个碱基）。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是 。 ②将CrRNA/Cas12a重组载体成功转染至HeL.a细胞。与对照组相比，实验组中KIFCl蛋白表达量、细胞数目的变化如下图所示，由此得出结论是 。判断依据是： 。 1．（2026·山东济南·一模）单细胞凝胶电泳实验是通过检测DNA链断裂损伤评估遗传毒性的技术手段。细胞凋亡时，核DNA会被降解成大小不一的片段。将凋亡细胞和正常细胞放于琼脂糖凝胶中，裂解细胞膜后电泳，前者细胞核呈彗星状，后者细胞核保持圆球形。下列叙述正确的是（　　） A．利用台盼蓝也能有效区分凋亡细胞和正常细胞 B．细胞中DNA被降解成片段后不再存在蛋白质的合成过程 C．彗星状的形成与小分子DNA片段在电场中移动速度快有关 D．细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡属于细胞凋亡 2．（2025·山东青岛·二模）DNA足迹法是检测DNA序列中结合蛋白识别部位的一种方法。DNA与蛋白质结合后，由于蛋白质的保护，DNasel酶无法对这一部位进行切割，可以运用此方法来确定启动子在DNA序列中的具体位置。某DNA片段上具有一个启动子，为研究其位置，研究小组决定用DNA足迹法对其进行检测。DNA片段上的DNasel酶酶切位点及各部分的长度如图1所示。对照组和实验组均加入等量的待测DNA样液，然后加入等量的DNasel酶，通过控制酶的用量和作用时间使每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂。酶解后将对照组和实验组分别进行电泳检测所得片段的大小，对照组得到大小分别为10bp、40bp、50bp、90bp、100bp、140bp、150bp、180bp的8个片段，实验组得到大小分别为10bp、50bp、90bp、100bp、140bp、180bp的6个片段。下列说法正确的是（　　）    A．构成启动子的基本单位是脱氧核苷酸，启动子的功能是与DNA聚合酶结合，启动转录 B．根据实验结果可以确定，启动子在DNA上的位置为A点附近 C．DNasel酶可作用于DNA的氢键和磷酸二酯键 D．为使结果更直观呈现，在DNA一端用12P进行标记，若标记在a端，则结果如图2所示 3.（2025·山东济南·一模）突变体是植物功能基因组学研究的基础材料，科研人员利用玉米转座酶基因和D元件的双荧光载体的转座系统（如图甲所示），进行二穗短柄草突变体培育实验。转座酶可识别D元件两端的反向重复序列并将其切离。此外，转座酶能够不断将D元件重新连接到染色体的任意位置，即完成了“转座”过程。相关实验过程、结果如下图所示。 (1)使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因，原因是 ；可选用 基因作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化。 (2)为了检测图中载体中的D元件是否成功在二穗短柄草基因组中发生切离，分别使用F2/R2引物和F2/R4引物对T0代转基因阳性苗进行PCR检测，已知若D元件未发生切离，使用F2/R4引物进行PCR扩增不出条带。据图丙所示植株1至10的电泳结果，既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是 ，原因是 。 (3)对T0代阳性植株自交得到的T1代的幼根同时观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（RFP），得到4组结果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根据上述实验结果推测含有D元件且D元件遗传稳定性高的是 （填序号）组。 (4)研究发现，D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有 。 4．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 5．（2026·山东济南·一模）水稻是一种自花受粉的二倍体植物，通过培育雄性不育植株和杂交可获得具备杂种优势的水稻。水稻产量大小与稻穗大小和稻粒数量有关。 (1)用性状优良的水稻纯合体甲给某雄性不育水稻植株授粉，子一代表现为雄性不育，子一代与甲回交，子二代均表现为雄性不育，连续回交可获得性状优良的雄性不育水稻乙。据此推测控制水稻雄性不育的基因（A）位于 （填“细胞质”或“细胞核”），理由是 。将另一性状优良的水稻纯合体丙与乙杂交，F1均表现为雄性可育，长势和产量优势明显，丙的细胞核基因T的表达产物能抑制自身含有的A基因的表达。以甲和丙为亲本进行正反交实验，F1均为雄性可育。若丙为父本、甲为母本组为正交组，F1自交获得的F2都是雄性可育个体，反交组的F2中的结果是 。 (2)研究人员获得了稻穗显著大于野生型的两种不同的纯合单基因突变体1和突变体2，突变体1和突变体2杂交，F1均为大稻穗，F1自交获得F2，其表型及比例为大稻穗：野生型=13：3，则这两对等位基因位于 （填“一对”或“两对”）同源染色体上，F2中大稻穗植株自交后代不发生性状分离的个体占比为 。 (3)NOG1是控制水稻单穗籽粒数量的基因之一，若将其表达产物X酶中的第240位脯氨酸或第243位色氨酸替换为苏氨酸，水稻单穗籽粒数会显著增加，已知ACA是苏氨酸的密码子之一。a是诱变NOG1第240位脯氨酸编码序列的引物（ACA为诱变序列），下面的b、c、d中有一条是诱变第243位色氨酸编码序列的引物，其配对模板与a的配对模板相同。 a：5'-…GCG/ACA/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5′-…GCG/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' d：5'-…TTC/ACT/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' 据此分析，以上 引物是诱变第243位色氨酸的引物，苏氨酸的密码子除ACA外，还有 ，这一现象称作 ，对生物体生存发展的意义是 。（答出两点） 1．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 2.（2025·山东·高考真题）某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，该植物有2条蓝色素合成途径。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素。已知基因a和基因b不编码蛋白质，无蓝色素时植物的花为白花。相关杂交实验及结果如表所示，不考虑其他突变和染色体互换；各配子和个体活力相同。 组别 亲本杂交组合 F1 F2 实验一 甲（白花植株）×乙（白花植株） 全为蓝花植株 蓝花植株：白花植株=10:6 实验二 AaBb（诱变）（♂）×aabb（♀） 发现1株三体蓝花植株，该三体仅基因A或a所在染色体多了1条 (1)据实验一分析，等位基因A、a和B、b的遗传 （填“符合”或“不符合”）自由组合定律。实验一的F2中，蓝花植株纯合体的占比为 。 (2)已知实验二中被诱变亲本在减数分裂时只发生了1次染色体不分离。实验二中的F1三体蓝花植株的3种可能的基因型为AAaBb、 。请通过1次杂交实验，探究被诱变亲本染色体不分离发生的时期。已知三体细胞减数分裂时，任意2条同源染色体可正常联会并分离，另1条同源染色体随机移向细胞任一极。 实验方案： （填标号），统计子代表型及比例。 ①三体蓝花植株自交    ②三体蓝花植株与基因型为aabb的植株测交 预期结果：若 ，则染色体不分离发生在减数分裂Ⅰ；否则，发生在减数分裂Ⅱ。 (3)已知基因B→b只由1种染色体结构变异导致，且该结构变异发生时染色体只有2个断裂的位点。为探究该结构变异的类型，依据基因B所在染色体的DNA序列，设计了如图所示的引物，并以实验一中的甲、乙及F2中白花植株（丙）的叶片DNA为模板进行了PCR，同1对引物的扩增产物长度相同，结果如图所示，据图分析，该结构变异的类型是 。丙的基因型可能为 ；若要通过PCR确定丙的基因型，还需选用的1对引物是 。    3．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 4．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 5.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 6．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 7．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 8．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 ，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 目录 第一部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第二部分 核心要点提升 要点精析、能力提升 要点01 基因工程的基本工具和DNA粗提取实验 要点02 基因工程的操作步骤 要点03 蛋白质工程 第三部分 题型精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 DNA粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳 题型02 基因表达载体的构建和检测 题型03 PCR技术的类型及应用 题型04 基因编辑技术及其应用 B组·增分能力练 第四部分 真题演练进阶 对标高考，感悟考法 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程的基本工具及DNA粗提取实验 （2024山东卷）DNA粗提取与鉴定 （2022山东卷）DNA粗提取与鉴定 在遗传大题中加入PCR测序确定某个体基因型，综合考察学生对遗传定律和PCR测序的理解。 考察PCR的新类型，如反向PCR、交错延伸PCR等 基因工程的操作步骤 （2025山东卷）用PCR确定基因型 （2025山东卷）基因表达载体构建及测序 （2024山东卷）用PCR确定基因型 （2023山东卷）重组质粒检测 （2022山东卷）构建重组载体获得融合蛋白 蛋白质工程 （2024山东卷）基因编辑技术改造大豆基因 新风向演练 1.【新考法·反向PCR】（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【解析】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 2.【新载体·遗传大题与基因工程相结合】（2025·山东·高考真题）某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，该植物有2条蓝色素合成途径。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素。已知基因a和基因b不编码蛋白质，无蓝色素时植物的花为白花。相关杂交实验及结果如表所示，不考虑其他突变和染色体互换；各配子和个体活力相同。 组别 亲本杂交组合 F1 F2 实验一 甲（白花植株）×乙（白花植株） 全为蓝花植株 蓝花植株：白花植株=10:6 实验二 AaBb（诱变）（♂）×aabb（♀） 发现1株三体蓝花植株，该三体仅基因A或a所在染色体多了1条 (1)据实验一分析，等位基因A、a和B、b的遗传 （填“符合”或“不符合”）自由组合定律。实验一的F2中，蓝花植株纯合体的占比为 。 (2)已知实验二中被诱变亲本在减数分裂时只发生了1次染色体不分离。实验二中的F1三体蓝花植株的3种可能的基因型为AAaBb、 。请通过1次杂交实验，探究被诱变亲本染色体不分离发生的时期。已知三体细胞减数分裂时，任意2条同源染色体可正常联会并分离，另1条同源染色体随机移向细胞任一极。 实验方案： （填标号），统计子代表型及比例。 ①三体蓝花植株自交    ②三体蓝花植株与基因型为aabb的植株测交 预期结果：若 ，则染色体不分离发生在减数分裂Ⅰ；否则，发生在减数分裂Ⅱ。 (3)已知基因B→b只由1种染色体结构变异导致，且该结构变异发生时染色体只有2个断裂的位点。为探究该结构变异的类型，依据基因B所在染色体的DNA序列，设计了如图所示的引物，并以实验一中的甲、乙及F2中白花植株（丙）的叶片DNA为模板进行了PCR，同1对引物的扩增产物长度相同，结果如图所示，据图分析，该结构变异的类型是 。丙的基因型可能为 ；若要通过PCR确定丙的基因型，还需选用的1对引物是 。    【答案】(1) 符合 1/8 (2) AaaBb、aaabb ① 子代蓝花：白花=5:3 (3) 倒位 aaBB或aaBb F1F2或R1R2 【解析】（1）实验一，亲本甲白花植株和乙白花植株杂交，子一代均为蓝花植株，蓝花植株自交子二代蓝花植株：白花植株=10:6，为9:3:3:1的变式，满足自由组合定律，且已知某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，因此等位基因A、a和B、b的遗传符合自由组合定律。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素，说明A-B-和aabb表现为蓝花，A-bb和aaB-表现为白花，蓝花纯合子为AABB和aabb，分别占1/16，因此蓝花植株纯合体的占比为2/16=1/8。 （2）已知该三体蓝花植株仅基因A或a所在染色体多了1条，且被诱变亲本在减数分裂时只发生了1次染色体不分离，同时含A、B个体或同时不含A、B个体表现为蓝花，可能的原因是减数第一次分裂含A和a的同源染色体未分离，产生AaB的配子，与母本产生的ab配子结合形成AaaBb蓝花个体；也可能是减数第一次分裂正常，减数第二次分裂含A的姐妹染色单体分离后移向同一极，从而产生AAB的配子，与母本产生的ab配子结合形成AAaBb的蓝花个体；也可能是减数第二次分裂后期，含a的姐妹染色单体分离后移向同一极，产生aab的配子，与母本产生的ab配子结合形成aaabb的蓝花个体。 减数第一次分裂异常产生的三体蓝花植株基因型为AaaBb，减数第二次分裂异常产生的三体蓝花植株基因型为AAaBb或aaabb，无论自交还是测交，若子代都只有蓝花，则该蓝花植株基因型为aaabb，因此需要区分蓝花植株基因型为AaaBb还是AAaBb。若进行测交，AaaBb个体进行测交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，Aaa可以产生的配子种类及比例为A：a：Aa：aa=1:2:2:1，测交后代含A的个体和不含A的个体比值为1:1，再考虑B、b基因，测交的结果是Bb：bb=1:1，因此子代蓝花：白花=1:1；AAaBb个体进行测交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，AAa可以产生的配子种类及比例为A：a：AA：Aa=2:1:1:2，测交后代含A的个体和不含A的个体比值为5:1，再考虑B、b基因，测交的结果是Bb：bb=1:1，因此子代蓝花：白花=1:1，两种基因型的个体测交结果相同，无法进行判断。若进行自交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，Aaa可以产生的配子种类及比例为A：a：Aa：aa=1:2:2:1，含A的配子：不含A配子=1:1，自交后代含A的个体和不含A的个体比值为3:1，再考虑B、b基因，自交的结果是BB：Bb：bb=1:2：1，因此子代蓝花：白花=5:3；AAaBb个体进行自交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，AAa可以产生的配子种类及比例为A：a：AA：Aa=2:1:1:2，含A的配子：不含A配子=5:1，自交后代含A的个体和不含A的个体比值为35:1，再考虑B、b基因，自交的结果是BB：Bb：bb=1:2：1，因此子代蓝花：白花=（35×3+1）：（35+3）=53:19，两种三体蓝花植株自交子代表型及比例不同，可以判断染色体分离异常发生的时期。 （3）染色体结构变异包括了染色体片段的缺失、重复、倒位和易位，已知同一对引物的扩增产物长度相同，若为易位、缺失和重复则导致b基因和B基因碱基长度不同，因此用同一对引物扩增产生的片段长度不同，因此判断该结构变异为倒位。甲、乙基因型为aaBB、AAbb，结合电泳结果可知，甲无论用哪一对引物扩增均能扩增出产物，引物是根据B基因的碱基序列设计的，因此判断甲的基因型为aaBB，乙的基因型为AAbb，F2白花的基因型有AAbb、Aabb、aaBB、aaBb，丙用F2R1扩增结果与甲相同，与乙不同，说明丙含有B基因，因此丙的基因型为aaBB或aaBb。根据电泳结果判断是F2和R2对应的DNA片段发生了倒位，使得基因B突变为b，倒位后获得的b基因，F1R2引物对应的是同一条单链，F2R1引物对应的是同一条单链，因此用F2R1扩增，乙植物无法扩增出产物。为了确定丙的基因型，即确定是否含有b基因，可以选择引物F1F2或R1R2,由于B基因F1F2引物对应的是同一条单链，R1R2对应的另一条单链，因此无法扩增，而由于倒位，b基因可以正常扩增。 3.【新情境·重叠延伸PCR】（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s、复性15s、延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时只有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5'端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 625 (2)第一轮以LA1为模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列 (3) Xho Ⅰ和BamH I 缺失 将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌 【解析】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，延伸15s，即子链合成了300个碱基，第二轮循环后合成了600个碱基，起始引物片段为25个核苷酸，因此第二轮循环后所得重组型子链长度为300+300+25=625个。 （2）第一轮以LA1（LA2）为模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列。 （3）由于Sal和Pvit2有两个识别位点，若选用则会破坏标记基因或复制原点，因此要选用Xho Ⅰ和BamH I进行切割，为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸的PCR过程引物的5'端需引入Xho Ⅰ和BamH I的识别序列。PMasd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，需要选用asd基因缺失的受体菌，在含DAP的培养基上能生长的应为导入了载体或重组载体的受体菌，即过程③中应采用asd基因缺失的受体菌。PM质粒有完整的氯霉素抗性基因cat，重组PM质粒没有完整的氯霉素抗性基因cat，可以将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌。 要点01 基因工程的基本工具和DNA粗提取实验 1.基因工程的基本工具 （1）限制性内切酶 作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 结果：产生黏性末端或平末端 （2）DNA 连接酶 作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两个 DNA 片段 种类：E. coli DNA 连接酶、T₄ DNA 连接酶 （3）载体 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 需具备的条件：能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因 2.DNA粗提取和鉴定 （1）实验原理： ①粗提取原理：DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L的NaCl溶液 ②鉴定原理：DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 （2）操作步骤： ①选材：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA ②研磨：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。 ③过滤：4℃冰箱静置后取上清液，也可离心后取上清液 ④析出：加体积相等、预冷酒精（体积分数95%）静置，得白色丝状物，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水；离心将沉淀物晾干 ⑤鉴定：用2只试管各加入2mol/L的NaCl溶液，一只试管加入DNA溶解，均加入二苯胺沸水浴加热。 【高分必备】 限制酶选择的方法和注意事项 (1)不破坏目的基因原则； (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：一般需要选择两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上， 目的基因的转录方向和载体启动子与终止子的转录方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 【典例1】用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【答案】D 【解析】若用Hind Ⅲ酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒时，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ酶切，只会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是普通质粒，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用Sph Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet（四环素）的培养基中不能形成菌落，D错误。 【典例2】下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能 B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝 C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳 D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物 【答案】B 【解析】设置对照组的目的是为了排除二苯胺试剂本身或其他实验条件可能产生的颜色变化，从而确保实验结果的特异性，A正确；将丝状物溶于2moL的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现 蓝色，B错误；电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，C正确；在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物，D正确。 要点02 基因工程的操作步骤 1.目的基因的筛选与获取 获取的方法：人工合成、基因文库中获取、PCR扩增 2.基因表达载体的构建（核心） （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：目的基因 ＋ 启动子（种类：组成型、诱导型、组织特异性） ＋ 终止子 ＋ 标记基因 + 复制原点 （3）构建过程：用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再用DNA连接酶拼接起来。 3.将目的基因导入受体细胞 （1）导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法 （2）导入动物细胞：显微注射技术（导入受精卵） （3）导入微生物细胞：Ca²⁺处理法 4.目的基因的检测与鉴定 （1）分子水平检测 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法：PCR技术、核酸分子杂交 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法：PCR技术、核酸分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法：抗原-抗体杂交 （2）个体生物学水平鉴定---抗性及抗性程度的鉴定 【易错易混】 1. PCR中两种引物要结合在模版链的3’端。引物可以使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，子链的延伸方向是5’-3’。 2. 要保证目的基因能与载体相连接，还要在两种引物的5’端加上不同的限制酶识别序列。 3. PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出两条链等长的目的基因。 4. 与核酸有关的方向类问题 （1） DNA复制时子链的延伸方向： 5’-3’ （2） 转录时mRNA的合成方向： 5’-3’ （3） 翻译时，核糖体沿着mRNA的移动方向： 5’-3’ 5.受体细胞的选择 (1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 (2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。 【典例3】如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBⅠ121）结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的的是（　　） A.用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 B.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 C.用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因 D.与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 【答案】B　 【解析】根据GNA—ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，A不符合题意；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B符合题意；雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）均有BsaBⅠ酶切位点，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因，C不符合题意；图中质粒与ACA—GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D不符合题意。 【典例4】（不定项）科研人员构建了可表达 J - V5 融合蛋白的重组质粒并利用引物进行了 PCR 检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 V5 编码序列标签短肽 V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗 J 蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列说法错误的是（　　） A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点 B．为检测 J 基因是否插入图甲所示的位置，需用引物 F1和 R1进行PCR C．若 J 基因转录的模板链位于 b 链，则引物 F2与图甲中 b 链相应部分的序列相同 D．图乙中，条带 1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了 J - V5 融合蛋白 【答案】BC 【解析】作为基因表达载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确；据图甲可知，引物F1能与J基因左端序列配对，引物R2能与终止子序列配对，因此推测为检测J基因是否插入图甲所示的位置，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1，B错误；b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA转录的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F2是左引物，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，C错误；据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白，D正确。 【典例5】科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI PvitⅡ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA CAG↓CTG T↓CTAGA ↓GATC (1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。 (2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12个碱基序列5′- -3′。 (3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,培养基乙中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,菌落 （填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 【答案】(1) XbaI、PvitⅡ 限制酶BclI的识别和切割位点不在启动子和终止子之间的片段中,限制酶Sau3AI不仅切割自己的识别位点,也会切割BclI的识别位点 (2) 5′ XbaI TCTAGAAGCTCA (3) 四环素 青霉素 3和5 【解析】（1）限制酶BclI的识别和切割位点不在启动子和终止子之间的片段中，限制酶Sau3AI不仅切割自己的识别位点，也会切割BclI的识别位点，因此应选择XbaI、PvitⅡ切割质粒，可避免质粒自连及目的基因反接。 （2）b链为基因的模板链，接入质粒后b链的3，端→5，端为启动子到终止子方向，因此在设计PCR引物时，应在b链对应引物的5，端加上XbaI序列（5，TCTAGA3，），在a链对应引物的5，端加上PvitⅡ序列。b链对应引物的5，端加上XbaI序列，且b链的引物与b链的3端配对，序列为5，AGCTCA3，，故该引物的12个碱基序列5，-TCTAGAAGCTCA-3，。 （3）基因表达载体上含有四环素抗性基因，培养基甲中添加四环素可以筛选出重组质粒；重组质粒中青霉素抗性基因被破坏，因此培养基乙中应添加青霉素，以利用影印接种法来筛选重组菌；在甲中能生长、乙中不能生长的为重组菌落，即3和5中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 要点03 蛋白质工程 1. 操作方法及对象：改造或合成基因 2. 结果：来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 3. 基本设计思路：①预期的蛋白质功能→②设计预期的蛋白质结构→③推测应有的氨基酸序列→④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→⑤获得所需蛋白质 4.与基因工程的联系： ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。 【典例6】研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为（　　） A.引物1和引物4 B.引物2和引物6 C.引物2和引物4 D.引物3和引物5 【答案】B　 【解析】题图可知，利用重叠延伸PCR 技术对 DNA 分子进行定点突变的过程中，通过 PCR2 获得产物 CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3'端结合，因此引物 d 的序列为5'GTCACGTG，引物 2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将 mRNA上的第 154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为 A。因此引物c的碱基序列为5'CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B项符合题意，A、C、D不符合题意。 01 DNA粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳 1．（2025·山东潍坊·一模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列说法错误的是（    ） A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂 B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶 C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中 D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高 【答案】D 【解析】DNA 变性是指 DNA 双链解开成为单链的过程，此过程中氢键会断裂，A正确；提取细菌中质粒时，为防止 RNA 对实验的干扰，提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶来水解 RNA，B正确；DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，将提取液中的质粒加乙醇可溶解一些蛋白质（杂质），DNA在适宜浓度的氯化钠溶液（如2mol/L）中溶解度大，因此将质粒析出后可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中，C正确；通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度应较低，这样大质粒才更容易在凝胶中迁移，D错误。 2.（2025·山东青岛·二模）DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（　　） A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 【答案】A 【解析】电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物，A正确；配制琼脂糖凝胶时，待凝胶融化稍冷却后，加入适量的核酸染料混合；电泳时，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，B错误； 电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈桔红色，C错误；DNA的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关，三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率可能相同，D错误。 3.（2025·山东枣庄·二模）下列与DNA有关的实验，说法正确的是（    ） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集 B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，浓度越高，酶活性越大 C．DNA电泳指示剂需要加入到熔化之后凝固之前的琼脂糖中 D．DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳 【答案】D 【解析】DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后，可以用离心法收集，这样能使DNA沉淀更集中，A错误；PCR缓冲液中Mg2 +作用是激活DNA聚合酶，但并不是浓度越高酶活性越大，浓度过高可能会对酶活性产生抑制作用，B错误；核酸染料需要加入到融化之后凝固之前的琼脂糖中，载样缓冲液（内含指示剂）应该在点样的时候（凝胶已经凝固）加入，C错误；DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳，D正确。 4．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液 B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中 C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察 【答案】D 【解析】 DNA 不溶于 95%的冷酒精，这一特性可用于 DNA 的进一步提纯；而 DNA 在 2mol/L NaCl 溶液中的溶解度较高，可溶于该溶液，A正确；将洋葱切碎、研磨、过滤后，滤液放置 4°C 冰箱中静置几分钟，此时 DNA 存在于上清液中，因为 DNA 溶解在研磨液经过处理后的上清液体系中，B正确；在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速率确实与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶浓度影响 DNA 分子在凝胶中的移动阻力，DNA 分子大小决定其移动的难易程度，构象不同也会导致迁移速率不同，C正确； 核酸染料是在凝胶制备时加入到凝胶中，而不是在凝胶载样缓冲液中加入，通过核酸染料与 DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察，D错误。 5.（2025·山东菏泽·一模）肝脏是生物实验中的常见材料。下列关于肝脏操作处理与目的不相符的是（    ） A．在离心后肝脏研磨液的上清液中加入等量冷却的酒精溶液——粗提取DNA B．向2mL过氧化氢溶液中滴入2滴肝脏研磨液——检测过氧化氢酶的催化效率 C．在25mL肝匀浆中滴入5滴HCl溶液后测pH——比较不同pH下酶的活性 D．在2mL鲜肝提取液中先后加入双缩脲试剂A液1mL和B液4滴——检测蛋白质 【答案】C 【解析】由于DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质等杂质溶于酒精，因此在离心后肝脏研磨液的上清液中加入等量冷却的酒精溶液可以粗提取DNA，A不符合题意；肝脏研磨液中含有过氧化氢酶，向2mL过氧化氢溶液中滴入2滴肝脏研磨液，可以检测过氧化氢酶的催化效率，B不符合题意；在25mL肝匀浆中滴入5滴HCl溶液后测pH，探究的是肝匀浆维持pH相对稳定的机制，而不是比较不同pH下酶的活性，C符合题意；鲜肝提取液中含有蛋白质，蛋白质的检测试剂是双缩脲试剂，因此在2mL鲜肝提取液中注入1mL双缩脲试剂A液后滴入双缩脲试剂B液可以检测蛋白质，D不符合题意。 02 基因表达载体的构建和检测 6．（2026·山东济南·一模）使用限制酶MboI（识别4核苷酸序列GATC）切割基因组DNA，将外源DNA片段与载体连接后导入大肠杆菌，成功构建了基因组文库，可以从基因组文库中筛选获取目的基因，下列相关叙述正确的是（　　） A．使用限制酶MboI可以对基因组DNA有较高的切割频率 B．非互补的黏性末端经E．coliDNA连接酶处理后均可以转变为平末端 C．为获得有生物活性的目的蛋白，基因组文库的构建需要使用相应的动植物细胞作为受体 D．使用PCR技术筛选目的基因的前提是目的基因的全部序列是已知的 【答案】A 【解析】限制酶MboI识别4核苷酸序列GATC，识别序列越短，在基因组DNA中出现的频率越高，切割频率也越高，A正确；E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端，不能将非互补的黏性末端转变为平末端，该功能需依赖DNA聚合酶或核酸外切酶处理，B错误；从基因组文库中筛选出目的基因后，要获得有生物活性的蛋白，需要将其克隆到表达载体中，并在合适的宿主系统中进行表达，不一定需要使用动植物细胞作为受体，C错误；PCR技术需已知目的基因部分序列以设计引物，但筛选基因组文库中的目的基因通常采用核酸分子杂交（探针法），无需已知全部序列，D错误。 7.（2025·山东青岛·二模）普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图1为改良基因及Ti质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，图2为后续培养过程。下列说法正确的是（　　）      A．需用限制酶XmaI和NheI对Ti质粒进行切割 B．培养基2与培养基3加入的生长素和细胞分裂素比例不同 C．在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中一定含有改良基因 D．筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为蓝色 【答案】B 【解析】由图1可知：改良基因的左侧和右侧是分别用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割后产生的黏性末端，因此将改良基因和Ti质粒连接时，需用限制酶XmaⅠ和BglⅡ对Ti质粒进行切割，以便产生与改良基因两端相同的黏性末端，A错误；图2中愈伤组织经再分化过程形成转基因水稻苗，培养基2与培养基3的区别是加入的生长素和细胞分裂素比例不同，B正确；在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌细胞中不一定含有改良基因，原因是若农杆菌细胞中导入的是未携带改良基因的质粒，其只要含氨苄青霉素抗性基因，也能在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；Lacz基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。构建重组质粒时，Lacz基因的结构被破坏，含重组质粒的农杆菌不能分解β-半乳糖苷，菌落为白色。可见，筛选含重组质粒的农杆菌时，应该在培养基中加入β-半乳糖苷，目标菌落为白色，D错误。 8．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 【答案】D 【解析】转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误；如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 9．（2025·山东青岛·二模）转录因子是一类在基因表达调控中起关键作用的蛋白质，主要功能是通过结合DNA特定序列，控制基因转录的起始和强度。WRKY基因表达的转录因子在植物的抗逆方面发挥着重要的作用。为提高菠萝的抗干旱能力，研究人员利用Gateway克隆技术构建WRKY基因的过表达载体，培育出抗干旱的转基因菠萝。Gateway克隆技术包含BP反应和LR反应两个阶段。    (1)为得到两端含attB的WRKY基因，可采用 技术，完成该技术需要提供的物质有 。 (2)BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换，形成 。这种技术与传统的构建方法相比，区别是 。 (3)LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是 。 (4)pGWB605载体含植物强启动子，能 。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过 技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子的含量外，还需要从 水平来检测转基因菠萝是否培育成功。 【答案】(1) PCR 模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、原料等 (2) pENTR重组载体 无需限制酶和连接酶 (3)pGWB605载体含ccdB基因，会导致大肠杆菌死亡 (4) 高效驱动WRKY基因的转录 植物组织培养 个体 【解析】（1）为得到两端含attB的WRKY基因（目的基因），可采用PCR技术获得，PCR时需要提供的物质有模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、原料等。 （2）attB和attP为同源序列，所以BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换，使目的基因整合到pENTR载体上，形成pENTR重组载体。这种技术与传统的构建方法相比，区别是无需限制酶和连接酶，利用的是同源重组的原理。 （3）LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是pGWB605载体含ccdB基因，ccdB编码毒性蛋白导致细胞死亡。 （4）pGWB605载体含植物强启动子，能高效驱动WRKY基因的转录。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过植物组织培养技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子的含量外，还需要从个体水平来检测转基因菠萝是否培育成功。 10．（2025·山东济南·二模）研究发现水稻MEL2基因等位突变体mel2会导致个体不能产生雌配子，个体的花粉育性保持完全正常，其他农艺性状均不受影响。科研人员将野生型MEL2基因经PCR扩增后接入图甲中含有杀花粉基因ZM-AA1和糊粉层特异性表达的红色荧光基因DsRed2的双T-DNA载体中，以获得新的品系，构建过程如图所示。    (1)通过PCR扩增水稻MEL2基因并正确连入图甲载体中，使用的F引物5'端需要添加的序列为5' CACTGC3'（写出15bp序列）。 (2)使用Bb.Bts1对图甲载体插入位点可得到 个缺口，推测图中94 ℃处理的目的是 ；使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈 色（填“蓝”或“白”）。 (3)将重组载体导入mel2纯合突变体，可在阳性转化苗（两T-DNA均可检测到）的后代中挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A，原因是 ；假设株系A只有一个T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系自交后产生的种子中红色荧光种子的比例为 。 【答案】(1)CCAGTAGCACTTCGT (2) 6/六 打开氢键，使缺口间的短链解离形成黏性末端 白 (3) 两个T-DNA分别插到不同染色体上，减数分裂后两T-DNA进入不同配子中 1/2/50% 【解析】（1）据图可知，为了保证MEL2基因正确连入图甲载体中，使用F引物5'端需要添加的序列为Bt.Bts1（从而保证用该酶切割目的基因和载体时，产生相同的黏性末端）识别序列附近的序列，即5'CCAGTAGCACTTCGTCACTGC3'。 （2）图中Bb.Bts1识别序列，其中两个在中间，被切割后可产生4个缺口，另外两个在两边，被切割可产生2个缺口，共产生6个缺口。94℃可以是DNA解旋变性，推测图中94 ℃处理的目的是打开氢键，使缺口间的短链解离形成黏性末端。LacZ表达后会使菌落呈蓝色，重组质粒中LacZ被破坏，使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈白色。 （3）T-DNA可分别插入不同的染色体上，经减数分裂后两T-DNA进入不同配子中，所以可在阳性转化苗的后代中挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A。假设株系A只有一个T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系相当于杂合子，可记作AO，由于其含有杀花粉的基因，所以雄配子只产生O，则自交后产生的种子（AO:OO=1：1）中红色荧光种子的比例为1/2。 03 PCR技术的类型及应用 11．（2025·山东滨州·二模）应用农杆菌转化法时，目的基因插入T-DNA后，需要对T-DNA测序。测序前根据目的基因的序列设计引物对T-DNA进行PCR扩增的过程如图所示，下列说法正确的是（    ） A．实验需要清楚目的基因的全部碱基序列 B．L、R酶切位点需要在T-DNA外侧，且需用同种限制酶切割 C．引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物b、c D．1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子含有两个游离的磷酸基团 【答案】D 【解析】实验只需要清楚目的基因两侧的碱基序列，以便设计引物，A错误；L、R酶切位点需要在T-DNA内侧，且需用同种限制酶切割，B错误；引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物a、d，bc只能扩增出目的基因，C错误；1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子为链状，含有两个游离的磷酸基团，D正确。 12.（2025·山东潍坊·三模）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 【答案】A 【解析】引物A、，引物P1与基因甲的一端结合，第二轮循环时，引物P1与含引物P2的子链结合，延伸后可得到含引物P2的双链等长DNA，A错误；在融合PCR 技术里，甲基因扩增依赖引物 P1、P2，乙基因扩增依赖引物 P3、P4。不同基因扩增所需引物特异性结合各自模板链，且反应条件（如引物与模板的适配性等 ）有差异，若放同一反应体系，引物间易相互干扰（P2和P3存在互补序列），无法精准、高效完成甲、乙基因各自扩增，所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系，B正确；结合图示可知，融合PCR第一步两条链5'互补配对，重叠部位可互相作为另一条链的引物，C正确； 若融合PCR获得了64个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，即该过程消耗了64×2-2=126个引物，该过程消耗了126÷2=63个引物P4，D正确。 13.（2025·山东滨州·二模）PMA（叠氮溴化丙锭）是一种可以插入死细胞DNA的染料，该染料一旦插入到DNA中，就会抑制后续qPCR扩增。利用PMA—qPCR可以快速测得溶液中活菌的数量，PMA处理后，提取样品细菌DNA进行qPCR。qPCR是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链碱基互补配对的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即每个DNA扩增一次，就产生一个荧光信号。下列说法错误是（    ） A．提取样品细菌DNA前需要除去多余的PMA B．qPCR所用的引物可根据细菌中拟核DNA序列来设计 C．TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合活性和核酸水解酶的活性 D．PCR进行10轮后产生1.023×106个荧光信号，则样品中约含100个活菌 【答案】D 【解析】分析题意可知，PMA会插入死细胞DNA并抑制qPCR扩增，若未去除多余PMA，残留染料可能干扰活菌DNA的提取和扩增，实验前需清除游离PMA以保证准确性，A正确；引物的设计原则是与目的基因的一段序列进行碱基互补配对，利用PMA—qPCR可以快速测得溶液中活菌的数量，故qPCR所用的引物可根据细菌中拟核DNA序列来设计，B正确；TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合活性，能够催化子链DNA的形成，同时结合题意可知，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，故该酶还具有核酸水解酶的活性，C正确；每个DNA扩增一次，就产生一个荧光信号，10轮PCR扩增后，设初始活菌数量是N₀，理论产物数为N₀×210，若信号数为1.023×10⁶，则初始活菌数≈1.023×10⁶/210=1000个，D错误。 14．（2025·山东潍坊·二模）RACE PCR技术可以在仅知mRNA中部分序列的情况下扩增出对应的DNA，部分过程如图1所示。科研人员在开展植物病害监测工作时，发现一株香石竹呈现出异常症状。经初步检测分析，确定其病因系一种新型病毒——病毒A所致。科研人员欲提取病毒A的mRNA，并通过RACE  PCR技术得到对应的DNA。    (1)为获得较高纯度的病毒A的mRNA，先提取 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内的mRNA，通过逆转录得到DNA单链。将该DNA单链与从 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内提取的mRNA混合，未与DNA配对的mRNA即为病毒A的mRNA。 (2)病毒A的mRNA序列未知，但科研人员已经检测出了该病毒蛋白质的部分氨基酸序列。利用已知的氨基酸序列无法准确推知该病毒mRNA中的对应序列，原因是 。此时，若要顺利进行RACEPCR，就需要合成多种引物GSP。若病毒A蛋白中的一段氨基酸序列为“-半胱氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-组氨酸-酪氨酸-”，结合图2密码子表分析，利用该段序列设计出的含有18个碱基的引物GSP有 种。 第一个 碱基 第二个碱基 第三个碱基 U C A G U 苯丙氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 亮氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 酪氨酸 酪氨酸 终止 终止 半胱氨酸 半胱氨酸 终止 色氨酸 U C A G C 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 组氨酸 组氨酸  谷氨酰胺 谷氨酰胺 精氨酸 精氨酸 精氨酸 精氨酸 U C A G 图2  密码子表（部分） (3)RACE  PCR过程中形成的化学键是 。图1过程完成后，将“3'-RACE”和“5'-RACE”获得的双链DNA置于同一PCR反应体系中，不额外添加引物即可获得完整DNA片段，该过程中充当引物的是 （填图1中序号）。 (4)病毒A的mRNA的3'端为连续多个腺嘌呤核糖核苷酸，故引物1应为 。5'-RACE过程中，需要利用特定的酶为②链的3'添加多个相同的脱氧核苷酸，以便根据这一序列合成引物2。为②链的3'添加的脱氧核苷酸 （填“可以”或“不可以”）是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，理由是 。 【答案】(1) 未感染病毒A 感染病毒A (2) 密码子的简并/大多数氨基酸可对应多种密码子 256 (3) 磷酸二酯键 ④和⑥ (4) 多个胸腺嘧啶脱氧核苷酸构成的单链 不可以 如果为②链添加多个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸单链;⑤链会和③链结合并扩增出错误的DNA 【解析】（1）为获得较高纯度的病毒 A 的 mRNA，先提取未感染病毒 A的石竹细胞内的 mRNA，通过逆转录得到 DNA 单链。将该 DNA 单链与感染病毒 A的石竹细胞内提取的 mRNA 混合，未配对的 mRNA 即为病毒 A 的 mRNA（感染细胞的 DNA 单链包含病毒 A 的互补序列，未感染细胞无病毒 A 的 mRNA，未配对部分即为病毒 A 的 mRNA）。 （2）已知氨基酸序列无法准确推知 mRNA 序列，原因是一种氨基酸可能由多种密码子编码（密码子的简并性）。由于密码子的简并性，即大多数氨基酸可对应多种密码子，所以利用已知的氨基酸序列无法准确推知该病毒mRNA中的对应序列。 对于病毒A蛋白中“半胱氨酸 - 酪氨酸 - 组氨酸 - 丝氨酸 - 组氨酸 - 酪氨酸 - 半胱氨酸”这一段氨基酸序列，根据密码子表，每个氨基酸对应的密码子种类数相乘可得引物GSP的种类数。半胱氨酸有2种密码子，酪氨酸有2种密码子，组氨酸有2种密码子，丝氨酸有4种密码子，氨基酸序列可能是正向也可能是反向，所以引物GSP的种类数为2×2×2×4×2×2×2 = 256种。 （3）PCR过程中形成的化学键是磷酸二酯键；图1中过程完成后，将“3'-RACE”和“5'-RACE”获得的双链DNA置于同一PCR反应体系中，不额外添加引物可获得完整病毒DNA片段，这是因为3'-RACE和5'-RACE获得的片段互为引物，即④和⑥作为引物可获得完整片段。 （4）病毒A的mRNA的3'端为连续多个腺嘌呤核糖核苷酸，所以其对应的序列是连续多个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。5’-RACE 中，给链②的 3’添加的脱氧核苷酸不可以是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，理由是如果为②链添加多个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸单链；⑤链会和③链结合并扩增出错误的DNA。 15.（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成苏氨酸（密码子为ACG）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。请回答下列问题： (1)若将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是 ，据图分析，写出第51位氨基酸对应的密码子是 。 (2)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…ATAGCAGGC…3' B．5'…ATAACGGGC…3' C．5'…GCCTGCTAT…3' D．5'GCCCGTTAT3' (3)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，则第n次循环共需引物 个。 (4)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是 。在PCR扩增改良的抗菌肽基因时，研究人员尝试利用降落PCR技术提高扩增特异性。降落PCR的原理是：在PCR前几个循环先设置较高的复性温度，随后每个循环均降低一定温度，直至达到适宜复性温度。结合PCR原理分析，降落PCR能提高特异性的原因是 。 【答案】(1) G→T、G→C AUA (2)D (3) 3 诱变前的抗菌肽基因 2n (4) 温度偏低时，DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少 PCR前几个循环复性温度较高，减少非特异性产物的形成；随着温度逐步降低，已积累的特异性产物在竞争中占据优势，进一步抑制非特异性扩增，提高了特异性 【解析】（1）mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸为一个密码子，第51位的氨基酸对应的mRNA上的碱基为51×3=153，脯氨酸密码子为CCC，苏氨酸密码子为ACG，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，模板链与mRNA碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基改变为G变为T、G→C。转录从模板链的3，端开始，模板链上第52位对应的碱基为GGG，因此第51位对应的位点为TAT，氨基酸对应的密码子是AUA。 （2）第51位氨基酸对应的模板链为TAT，第52位氨基酸对应的模板链上的碱基为GGG，因此模板链的顺序为3'TATGGG5'，现将第52位的脯氨酸换成苏氨酸，模板链上GGG→TGC，新的模板链为3'TATTGC5'，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选5'GCCCGTTAT3'。 故选D。 （3） 结合DNA的半保留复制，第1、2轮循环的产物均为不等长的DNA ，产物1最早出现在PCR1的第3轮循环：DNA的复制方式位半保留复制，因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知，通过PCR3扩增时应选引物是引物1和引物2进行扩增。若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，第n-1次共有2n-1个DNA，每扩增一个DNA都需要一对引物，因此第n次循环共需引物2n-1×2=2n。 （4）温度偏低时，DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少；PCR前几个循环复性温度较高，减少非特异性产物的形成；随着温度逐步降低，已积累的特异性产物在竞争中占据优势，进一步抑制非特异性扩增，提高了特异性。 04 基因编辑技术及其应用 16.CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas系统的组成如图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成）已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关描述错误的是（　　） A.CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用 B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化 C.内切核酸酶Cas9具有专一性 D.CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割 【答案】D　 【解析】由于CRISPR-Cas9基因编辑技术可以对特定位点进行编辑，因此CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用，内切核酸酶Cas9具有专一性，能使特定部位的磷酸二酯键断开，A、C正确；CRISPR-Cas系统中的CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到 CRISPR，当病毒再次入侵细胞的时候起到免疫作用，这是细菌与病毒协同进化的结果，该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化，B正确；CRISPR-Cas9是由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成，即CRISPR基因经过转录之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割，D错误。 17．（2026·山东济南·一模）科研人员将来自矮缩病毒（WDV）的复制子WDV盒、向导DNA序列和Cas9-REP融合基因构建了靶向基因敲入载体，如图甲所示。在被转化的水稻细胞中，REP蛋白特异性识别、结合并切割LIR序列，从而使WDV盒环化并大量扩增。扩增的WDV盒与Cas9-REP融合蛋白和向导RNA共同形成复合物，该复合物与水稻染色体中的OsMPK5基因结合，并在特定位点对其进行切割。切割后通过Nanoluc基因（荧光素酶基因）和OsMPK5基因两侧的同源臂（L臂和R臂）以同源重组方式在OsMPK5基因中插入NanoLuc基因，结果如图乙所示。 (1)已知WDV盒中REP基因内部存在两个BsaI限制酶识别序列，需通过定点突变将其消除。为此，在扩增REP基因的引物F2与R2中分别引入了突变。其中，R2引物的序列为5′-ATAATTGTGTGTCCCTAGTGACCTTGCCCAGGAAGTC-3'。对比其与模板的互补区域可知，该引物中通过 （填“T变成A”或“A变成T”）完成了定点突变；为便于后续载体构建，若在引物上添加限制酶识别序列，该突变位点位于限制酶识别序列的 （填“3'端”或“5′端”）。 (2)本研究中Cas9-REP融合蛋白的作用是 （写出两条）。 (3)为了检测WDV盒在水稻中能否正常环化，利用野生型和转基因水稻提取的DNA为模板，可选用图中的 引物进行PCR并电泳检测，若电泳后所呈现的条带结果为 ，说明WDV盒在水稻中能正常环化。 (4)使用OsMPK5蛋白抗体可以检测到转基因水稻中出现预期分子量大小的OsMPK5-NanoLuc融合蛋白，同时也检测到比预期蛋白分子量小的蛋白质，分析图丙，从同源重组的角度简要推测可能的原因是 。 【答案】(1) A 变成 T 5′ (2)REP 蛋白功能：特异性识别并切割 WDV 盒上的 LIR 序列，使 WDV 盒环化并大量扩增。 Cas9 蛋白功能：在向导 RNA 的引导下，特异性识别并切割水稻 OsMPK5 基因的特定位点，为同源重组提供条件。 (3) F2和R1 转基因水稻出现相应条带，野生型水稻无条带 (4)可能发生了不完全同源重组、重组过程中导致基因序列发生改变，提前出现了终止密码子 【解析】（1）BsaI 的识别序列是 5'-GGTCTC-3'，它的互补链是 5'-GAGACC-3'。 R2 引物的序列为5′-ATAATTGTGTGTCCCTAGTGACCTTGCCCAGGAAGTC-3'，其中包含原模板互补序列中的 GAGACC 区域。 为了消除该限制酶识别序列，需要将 A 突变成 T，使 GAGACC 变为 GAGTCC，从而不再被 BsaI 识别。 所以，该引物中通过A 变成 T完成了定点突变。限制酶切割后，黏性末端需要与载体连接，而引物的5' 端是后续酶切和连接的关键位置。 因此，若在引物上添加限制酶识别序列，该突变位点应位于限制酶识别序列的5' 端。 （2）REP 蛋白功能：特异性识别并切割 WDV 盒上的 LIR 序列，使 WDV 盒环化并大量扩增。 Cas9 蛋白功能：在向导 RNA 的引导下，特异性识别并切割水稻 OsMPK5 基因的特定位点，为同源重组提供条件。 （3）为了检测 WDV 盒是否环化，可选择能扩增环化后 WDV 盒片段的引物，例如图中的F2和R1 。若 WDV 盒能正常环化，在转基因水稻的 DNA 模板中会出现与阳性对照（或预期大小）一致的条带，而野生型水稻无此条带。 所以，若电泳后呈现的条带结果为转基因水稻出现相应条带，野生型水稻无条带，说明 WDV 盒在水稻中能正常环化。 （4）从同源重组的角度看，可能发生了不完全同源重组。 例如，L 臂和 R 臂仅部分区域与 OsMPK5 基因的同源序列重组，导致 NanoLuc 基因插入不完整。 这会使翻译出的融合蛋白分子量比预期小。 或者，重组过程中导致基因序列发生改变，提前出现了终止密码子。 18．（2025·山东潍坊·一模）利用基因编辑技术CRISPR/Cas12a开发出的核酸检测技术，可更加精确快速的进行核酸检测。该系统由crRNA与Cas12a蛋白组成，利用crRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA，Cas12a蛋白切割靶标DNA的同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量。现利用工程菌制备CRISPR/Cas12a复合体来检测自来水中的大肠杆菌，如图所示。 (1)PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是 ，crRNA序列应符合的条件是 。 (2)为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的黏性末端应 （填“相同”或“不同”）。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在F和R引物5'端添加的序列是 （填标号）。 ①F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ②F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' ③F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ④F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' (3)若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加入 ，从菌落分别挑取少许菌体，接种到含 的平板上，若 ，则对应菌落中细菌含有基因表达载体。 (4)下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验中设置不含大肠杆菌对照组的作用是 。一段时间后，荧光信号强度不再升高，原因是 。 【答案】(1) 激活TaqDNA聚合酶 与大肠杆菌靶标DNA互补配对 (2) 不同 ② (3) 四环素 氨苄青霉素 不能增殖 (4) 排除其他因素对荧光强度的影响 实验组中大肠杆菌的靶标DNA都被切割 【解析】（1）PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶，题意显示，利用crRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA，据此可知，crRNA序列应符合的条件是与大肠杆菌靶标DNA互补配对，进而在该部位实现切割。 （2）为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的黏性末端应“不同”。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在F和R引物5'端添加的序列是②，进而构建出不同的BsaⅠ酶切序列。　 （3）若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加入四环素，因为重组质粒和空质粒中均含有四环素抗性基因，而重组质粒中的氨苄青霉素抗性基因被破坏；因此，接下来的操作是从长出的菌落中分别挑取少许菌体，接种到含氨苄青霉素的平板上，若不能增殖，则对应菌落中细菌含有基因表达载体。 （4）下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验中设置不含大肠杆菌对照组的作用是排除其他因素对荧光强度的影响，是实验结果更具说服力。一段时间后，荧光信号强度不再升高，意味着实验组中大肠杆菌的靶标DNA都被切割，据此可检测大肠杆菌的数量。 19.（2025·山东聊城·三模）CRISPR/Cas12a系统是由crRNA和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的复合体。crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。下图是CRISPR/Cas12a系统的工作原理示意图。请回答下列问题。 注：PAM是一种短DNA序列，N表示任意碱基。PAM可以帮助Cas12a识别和切割目标DNA序列。“”表示在相应位置剪切DNA。 (1)在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含 种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化 水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断，切割DNA后形成的是 （填“黏性”或“平”）末端。 (2)某科研团队基于CRISPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。他们利用crRNA对应基因序列和PX458质粒（如下图）构建crRNA/Cas12a重组载体，转染至HeLa细胞进行相关研究。 ①为保证crRNA对应的基因序列与PX458质粒正确连接，应在扩增该基因序列的一对引物的5’端分别添加 两种限制酶的识别序列。其中P1的碱基序列为5’ 3’（写出前9个碱基）。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是 。 ②将CrRNA/Cas12a重组载体成功转染至HeL.a细胞。与对照组相比，实验组中KIFCl蛋白表达量、细胞数目的变化如下图所示，由此得出结论是 。判断依据是： 。 【答案】(1) 8/八 磷酸二酯键 黏性 (2) PvitII、EcoRI CAGCTGCTC 实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用 KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖 与对照组相比实验组的KIFC1蛋白表达量明显下降 【解析】（1） crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域包含了单链DNA和RNA，DNA的基本单位是四种脱氧核苷酸，RNA的基本单位是四种核糖核苷酸，因此结合区域最多含8种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化磷酸二酯键水解，切割DNA后形成的是黏性末端。 （2） ①质粒上含有3种限制酶识别序列，若选择KpnI限制酶识别序列，对质粒进行切割时会破坏Cas12a基因，因此应选择PvitII、EcoRI对质粒进行酶切获得黏性末端，保证目的基因准确接入完成转录，应在扩增该基因序列的一对引物的5'端分别添加PvitII、EcoRI两种限制酶的识别序列。扩增目的基因时，引物需要与模板链的3'端结合，按照碱基互补配对原则保证子链从5'向3'延伸，结合图示可知，P1的碱基序列为5′CAGCTGCTC3′。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用。 ②结合实验结果可知，对照组KIFCl蛋白表达量多于实验组，对照组的细胞数量多于实验组，对照组和实验组的差异是KIFC1基因的有无，因此可得出的结论是KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。证明HeLa细胞中KIFC1基因敲除成功的依据是与对照组相比实验组的KIFC1蛋白表达量明显下降。 1．（2026·山东济南·一模）单细胞凝胶电泳实验是通过检测DNA链断裂损伤评估遗传毒性的技术手段。细胞凋亡时，核DNA会被降解成大小不一的片段。将凋亡细胞和正常细胞放于琼脂糖凝胶中，裂解细胞膜后电泳，前者细胞核呈彗星状，后者细胞核保持圆球形。下列叙述正确的是（　　） A．利用台盼蓝也能有效区分凋亡细胞和正常细胞 B．细胞中DNA被降解成片段后不再存在蛋白质的合成过程 C．彗星状的形成与小分子DNA片段在电场中移动速度快有关 D．细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡属于细胞凋亡 【答案】C 【解析】台盼蓝染色法可以区分死细胞和活细胞，凋亡细胞和正常细胞都是活细胞，无法区分，A错误； 细胞凋亡过程中，存在基因的选择性表达，因此细胞中DNA被降解成片段后仍然存在蛋白质的合成过程，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA分子片段越小，移动越快，凋亡细胞中DNA分子被降解，DNA分子片段变小，可知彗星状的形成与小分子DNA片段在电场中移动速度快有关，C正确；细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞死亡属于细胞坏死，细胞凋亡是由基因决定的细胞自动结束生命的过程，D错误。 2．（2025·山东青岛·二模）DNA足迹法是检测DNA序列中结合蛋白识别部位的一种方法。DNA与蛋白质结合后，由于蛋白质的保护，DNasel酶无法对这一部位进行切割，可以运用此方法来确定启动子在DNA序列中的具体位置。某DNA片段上具有一个启动子，为研究其位置，研究小组决定用DNA足迹法对其进行检测。DNA片段上的DNasel酶酶切位点及各部分的长度如图1所示。对照组和实验组均加入等量的待测DNA样液，然后加入等量的DNasel酶，通过控制酶的用量和作用时间使每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂。酶解后将对照组和实验组分别进行电泳检测所得片段的大小，对照组得到大小分别为10bp、40bp、50bp、90bp、100bp、140bp、150bp、180bp的8个片段，实验组得到大小分别为10bp、50bp、90bp、100bp、140bp、180bp的6个片段。下列说法正确的是（　　）    A．构成启动子的基本单位是脱氧核苷酸，启动子的功能是与DNA聚合酶结合，启动转录 B．根据实验结果可以确定，启动子在DNA上的位置为A点附近 C．DNasel酶可作用于DNA的氢键和磷酸二酯键 D．为使结果更直观呈现，在DNA一端用12P进行标记，若标记在a端，则结果如图2所示 【答案】D 【解析】启动子是DNA上的一部分，基本单位是脱氧核苷酸；启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，可以启动转录，A错误；结合题干信息和题图1，实验组中存在10bp、180bp的片段，说明D点能被切开；存在90bp、100bp的片段，说明B点能被切开；存在50bp、140bp的片段，说明A点能被切开；若C点能被切开，则应有40bp、150bp的片段，因此启动子在DNA上的位置为C点附近，B错误；DNasel酶作用于DNA的磷酸二酯键，C错误；A点被切开，存在50bp、140bp的片段，分析题图2，现只观察到50bp的条带而没有观察到140bp的片段，因此放射性应该标记在a端，D正确。 3.（2025·山东济南·一模）突变体是植物功能基因组学研究的基础材料，科研人员利用玉米转座酶基因和D元件的双荧光载体的转座系统（如图甲所示），进行二穗短柄草突变体培育实验。转座酶可识别D元件两端的反向重复序列并将其切离。此外，转座酶能够不断将D元件重新连接到染色体的任意位置，即完成了“转座”过程。相关实验过程、结果如下图所示。 (1)使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因，原因是 ；可选用 基因作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化。 (2)为了检测图中载体中的D元件是否成功在二穗短柄草基因组中发生切离，分别使用F2/R2引物和F2/R4引物对T0代转基因阳性苗进行PCR检测，已知若D元件未发生切离，使用F2/R4引物进行PCR扩增不出条带。据图丙所示植株1至10的电泳结果，既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是 ，原因是 。 (3)对T0代阳性植株自交得到的T1代的幼根同时观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（RFP），得到4组结果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根据上述实验结果推测含有D元件且D元件遗传稳定性高的是 （填序号）组。 (4)研究发现，D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有 。 【答案】(1) 引物是根据转座酶基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与转座酶基因的cDNA特异性结合，与转座酶基因互补的序列） HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因）） (2) 2-9组 使用F2/R2引物PCR检测有条带，说明检测的细胞中D元件未切离；使用F2/R4引物进行PCR检测有条带，说明检测的细胞中D元件已切离 (3)③ (4)插入的是非基因序列（或未选择表达的基因或内含子或非编码区等，插入D元件后引发的突变为隐性突变，插入D元件后表达的蛋白质功能未受影响或影响不大） 【解析】（1）引物是根据目的基因（转座酶基因）两端的碱基序列设计的，引物F1/R1能与转座酶基因两端的特定序列互补配对，所以使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因。由图甲可知，载体上含有HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因）），当植物被农杆菌成功转化后，这些基因会进入植物细胞，可通过检测来判断植物是否被成功转化，所以可选用HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因））作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化； （2）由题意可知，使用F2/R2引物扩增的是包含D元件的片段，使用F2/R4引物扩增时，若D元件未发生切离则扩增不出条带。观察图丙，植株2-9组用F2/R2引物扩增出条带，说明细胞中D元件未切离；用F2/R4引物也扩增出条带，说明部分细胞中的D元件发生了切离（因为未切离时F2/R4扩增不出条带），所以既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是2-9组； （3）由图甲可知，D元件插入在绿色荧光蛋白基因（GFP）中，若D元件稳定存在，会破坏GFP基因，导致不产生绿色荧光；红色荧光蛋白基因（RFP）与D元件的转座无关。①组GFP(+)、RFP(+)，说明D元件可能发生了转座，从GFP基因中切离出来，使得GFP基因能正常表达；②组GFP(+)、RFP(-)，不符合载体的基因结构特点（正常载体有RFP基因），可能是异常情况；③组GFP (-)、RFP(+)，说明D元件稳定存在于GFP基因中，破坏了GFP基因，且RFP基因正常表达，所以含有D元件且D元件遗传稳定性高的是③组；④组GFP (-)、RFP(-)，不符合载体的基因结构特点（正常载体有RFP基因），可能是异常情况； （4）D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有插入的是非基因序列（或未选择表达的基因或内含子或非编码区等，插入D元件后引发的突变为隐性突变，插入D元件后表达的蛋白质功能未受影响或影响不大）。 4．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【解析】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 5．（2026·山东济南·一模）水稻是一种自花受粉的二倍体植物，通过培育雄性不育植株和杂交可获得具备杂种优势的水稻。水稻产量大小与稻穗大小和稻粒数量有关。 (1)用性状优良的水稻纯合体甲给某雄性不育水稻植株授粉，子一代表现为雄性不育，子一代与甲回交，子二代均表现为雄性不育，连续回交可获得性状优良的雄性不育水稻乙。据此推测控制水稻雄性不育的基因（A）位于 （填“细胞质”或“细胞核”），理由是 。将另一性状优良的水稻纯合体丙与乙杂交，F1均表现为雄性可育，长势和产量优势明显，丙的细胞核基因T的表达产物能抑制自身含有的A基因的表达。以甲和丙为亲本进行正反交实验，F1均为雄性可育。若丙为父本、甲为母本组为正交组，F1自交获得的F2都是雄性可育个体，反交组的F2中的结果是 。 (2)研究人员获得了稻穗显著大于野生型的两种不同的纯合单基因突变体1和突变体2，突变体1和突变体2杂交，F1均为大稻穗，F1自交获得F2，其表型及比例为大稻穗：野生型=13：3，则这两对等位基因位于 （填“一对”或“两对”）同源染色体上，F2中大稻穗植株自交后代不发生性状分离的个体占比为 。 (3)NOG1是控制水稻单穗籽粒数量的基因之一，若将其表达产物X酶中的第240位脯氨酸或第243位色氨酸替换为苏氨酸，水稻单穗籽粒数会显著增加，已知ACA是苏氨酸的密码子之一。a是诱变NOG1第240位脯氨酸编码序列的引物（ACA为诱变序列），下面的b、c、d中有一条是诱变第243位色氨酸编码序列的引物，其配对模板与a的配对模板相同。 a：5'-…GCG/ACA/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5′-…GCG/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' d：5'-…TTC/ACT/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' 据此分析，以上 引物是诱变第243位色氨酸的引物，苏氨酸的密码子除ACA外，还有 ，这一现象称作 ，对生物体生存发展的意义是 。（答出两点） 【答案】(1) 细胞质 雄性不育植株与甲杂交，子代均表现为雄性不育且子代与甲回交未出现性状分离 雄性可育:雄性不育=3:1 (2) 两对 7/13 (3) d ACU 密码子的简并性 保证翻译的速度、增强密码子的容错性 【解析】（1）雄性不育植株与甲杂交，子代均表现为雄性不育且子代与甲回交未出现性状分离，说明雄性不育的遗传物质没有因为与父本核基因的回交而改变，即控制雄性不育的基因不遵循细胞核基因的遗传规律，由此推测控制雄性不育的基因（A）位于细胞质。将另一性状优良的水稻纯合体丙与乙杂交，F1均表现为雄性可育，长势和产量优势明显，丙的细胞核基因T的表达产物能抑制自身含有的A基因的表达。若A表示控制水稻雄性不育的基因，a表示控制雄性可育的基因，雄性不育水稻乙的基因型为tt（A），丙的基因型为TT（A），甲的基因型为tt（a），若丙为父本、甲为母本组为正交组，F1的基因型为Tt（a），F1自交获得的F2都是雄性可育个体；反交组的丙为母本、甲为父本，两者杂交F1的基因型为Tt（A），F1自交，F2中的基因型及比例为TT(A）：Tt（A）：tt（A）=1：2：1，基因T的表达产物能抑制A基因的表达，故F2中的结果是雄性可育:雄性不育=3:1 （2）突变体1和突变体2杂交，F1均为大稻穗，F1自交获得F2，其表型及比例为大稻穗：野生型=13：3，为9：3：3：1的变式，可知两对等位基因遵循基因的自由组合定律，即这两对等位基因位于两对同源染色体上，若用A/a、B/b表示两对基因，则大稻穗的基因型可为A_B_、_ _bb，野生型的基因型可为aaB_，大稻穗中能稳定遗传的基因型为AAB_、_ _bb，因此F2中大稻穗植株自交后代不发生性状分离的个体占比为7/13。 （3）引物a用于诱变第240位脯氨酸序列中含ACA，替换为苏氨酸。诱变第243位色氨酸编码序列的引物，其配对模板与a的配对模板相同，可知该引物与a的碱基序列大致相同，不同的序列为a链上240位ACA的改变以及243位TGG的改变，比较b、c、d三种引物的序列，可知诱变第243位色氨酸编码序列的引物为d，引物d的243位碱基序列为ACT，该链与mRNA序列相似，可知243为苏氨酸，其对应的密码子为ACU,多个密码子编码同一氨基酸，这一现象称作密码子的简并性，密码子简并性可保证翻译的速度、增强密码子的容错性。 1．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【解析】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 2.（2025·山东·高考真题）某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，该植物有2条蓝色素合成途径。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素。已知基因a和基因b不编码蛋白质，无蓝色素时植物的花为白花。相关杂交实验及结果如表所示，不考虑其他突变和染色体互换；各配子和个体活力相同。 组别 亲本杂交组合 F1 F2 实验一 甲（白花植株）×乙（白花植株） 全为蓝花植株 蓝花植株：白花植株=10:6 实验二 AaBb（诱变）（♂）×aabb（♀） 发现1株三体蓝花植株，该三体仅基因A或a所在染色体多了1条 (1)据实验一分析，等位基因A、a和B、b的遗传 （填“符合”或“不符合”）自由组合定律。实验一的F2中，蓝花植株纯合体的占比为 。 (2)已知实验二中被诱变亲本在减数分裂时只发生了1次染色体不分离。实验二中的F1三体蓝花植株的3种可能的基因型为AAaBb、 。请通过1次杂交实验，探究被诱变亲本染色体不分离发生的时期。已知三体细胞减数分裂时，任意2条同源染色体可正常联会并分离，另1条同源染色体随机移向细胞任一极。 实验方案： （填标号），统计子代表型及比例。 ①三体蓝花植株自交    ②三体蓝花植株与基因型为aabb的植株测交 预期结果：若 ，则染色体不分离发生在减数分裂Ⅰ；否则，发生在减数分裂Ⅱ。 (3)已知基因B→b只由1种染色体结构变异导致，且该结构变异发生时染色体只有2个断裂的位点。为探究该结构变异的类型，依据基因B所在染色体的DNA序列，设计了如图所示的引物，并以实验一中的甲、乙及F2中白花植株（丙）的叶片DNA为模板进行了PCR，同1对引物的扩增产物长度相同，结果如图所示，据图分析，该结构变异的类型是 。丙的基因型可能为 ；若要通过PCR确定丙的基因型，还需选用的1对引物是 。    【答案】(1) 符合 1/8 (2) AaaBb、aaabb ① 子代蓝花：白花=5:3 (3) 倒位 aaBB或aaBb F1F2或R1R2 【解析】（1）实验一，亲本甲白花植株和乙白花植株杂交，子一代均为蓝花植株，蓝花植株自交子二代蓝花植株：白花植株=10:6，为9:3:3:1的变式，满足自由组合定律，且已知某二倍体两性花植物的花色由2对等位基因A、a和B、b控制，因此等位基因A、a和B、b的遗传符合自由组合定律。基因A和基因B分别编码途径①中由无色前体物质M合成蓝色素所必需的酶A和酶B；另外，只要有酶A或酶B存在，就能完全抑制途径②的无色前体物质N合成蓝色素，说明A-B-和aabb表现为蓝花，A-bb和aaB-表现为白花，蓝花纯合子为AABB和aabb，分别占1/16，因此蓝花植株纯合体的占比为2/16=1/8。 （2）已知该三体蓝花植株仅基因A或a所在染色体多了1条，且被诱变亲本在减数分裂时只发生了1次染色体不分离，同时含A、B个体或同时不含A、B个体表现为蓝花，可能的原因是减数第一次分裂含A和a的同源染色体未分离，产生AaB的配子，与母本产生的ab配子结合形成AaaBb蓝花个体；也可能是减数第一次分裂正常，减数第二次分裂含A的姐妹染色单体分离后移向同一极，从而产生AAB的配子，与母本产生的ab配子结合形成AAaBb的蓝花个体；也可能是减数第二次分裂后期，含a的姐妹染色单体分离后移向同一极，产生aab的配子，与母本产生的ab配子结合形成aaabb的蓝花个体。 减数第一次分裂异常产生的三体蓝花植株基因型为AaaBb，减数第二次分裂异常产生的三体蓝花植株基因型为AAaBb或aaabb，无论自交还是测交，若子代都只有蓝花，则该蓝花植株基因型为aaabb，因此需要区分蓝花植株基因型为AaaBb还是AAaBb。若进行测交，AaaBb个体进行测交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，Aaa可以产生的配子种类及比例为A：a：Aa：aa=1:2:2:1，测交后代含A的个体和不含A的个体比值为1:1，再考虑B、b基因，测交的结果是Bb：bb=1:1，因此子代蓝花：白花=1:1；AAaBb个体进行测交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，AAa可以产生的配子种类及比例为A：a：AA：Aa=2:1:1:2，测交后代含A的个体和不含A的个体比值为5:1，再考虑B、b基因，测交的结果是Bb：bb=1:1，因此子代蓝花：白花=1:1，两种基因型的个体测交结果相同，无法进行判断。若进行自交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，Aaa可以产生的配子种类及比例为A：a：Aa：aa=1:2:2:1，含A的配子：不含A配子=1:1，自交后代含A的个体和不含A的个体比值为3:1，再考虑B、b基因，自交的结果是BB：Bb：bb=1:2：1，因此子代蓝花：白花=5:3；AAaBb个体进行自交，利用分离定律思维求解，先考虑A、a基因，AAa可以产生的配子种类及比例为A：a：AA：Aa=2:1:1:2，含A的配子：不含A配子=5:1，自交后代含A的个体和不含A的个体比值为35:1，再考虑B、b基因，自交的结果是BB：Bb：bb=1:2：1，因此子代蓝花：白花=（35×3+1）：（35+3）=53:19，两种三体蓝花植株自交子代表型及比例不同，可以判断染色体分离异常发生的时期。 （3）染色体结构变异包括了染色体片段的缺失、重复、倒位和易位，已知同一对引物的扩增产物长度相同，若为易位、缺失和重复则导致b基因和B基因碱基长度不同，因此用同一对引物扩增产生的片段长度不同，因此判断该结构变异为倒位。甲、乙基因型为aaBB、AAbb，结合电泳结果可知，甲无论用哪一对引物扩增均能扩增出产物，引物是根据B基因的碱基序列设计的，因此判断甲的基因型为aaBB，乙的基因型为AAbb，F2白花的基因型有AAbb、Aabb、aaBB、aaBb，丙用F2R1扩增结果与甲相同，与乙不同，说明丙含有B基因，因此丙的基因型为aaBB或aaBb。根据电泳结果判断是F2和R2对应的DNA片段发生了倒位，使得基因B突变为b，倒位后获得的b基因，F1R2引物对应的是同一条单链，F2R1引物对应的是同一条单链，因此用F2R1扩增，乙植物无法扩增出产物。为了确定丙的基因型，即确定是否含有b基因，可以选择引物F1F2或R1R2,由于B基因F1F2引物对应的是同一条单链，R1R2对应的另一条单链，因此无法扩增，而由于倒位，b基因可以正常扩增。 3．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【解析】在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 4．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 【答案】D 【解析】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。 综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 5.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【解析】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 6．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 【解析】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 7．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【解析】低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； 离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 8．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 ，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 【解析】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 （2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 （3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 （4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 / 学科网（北京）股份有限公司 $