2026年高中生物竞赛讲义生物化学第十五章 核酸的生物合成（含DNA、RNA、蛋白质的合成）

第十五章 核酸的生物合成 学习目的： 通过学习核酸的复制、转录过程,从分子水平认识遗传信息传递的机制;在此基础上理解基因突变、DNA损伤及其修复与重大疾病如肿瘤发生的关系,为临床相关疾病的患者提供康复与护理指导。 学习要点： 遗传信息传递的中心法则;核酸(DNA和RNA)生物合成(复制和转录);端粒与端粒酶反转录;DNA损伤与修复。 1869年 Johannes Miescher从细胞核中发现了组成DNA的物质,当时称为核素(nuclein Colin. Macleod F和 Maclyn Mccarty进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明DNA是遗传信息的载体。1953 4J年 Watson和 l Francis. Crick提出了DNA双螺旋结构的分子模型,为生物化学发展进入分子生物学时代的重要标志。现代遗传学已充分证明遗传信息是以脱氧核苷酸排列顺序的方式储存在DNA分子上,亲代DNA通过复制将遗传信息传递给子代。在生长发育过程中,遗传信息自DNA转录给RNA,再翻译成特异的蛋白质执行各种生理功能。 第一节DNA的生物合成 DNA是生物遗传的物质基础,遗传信息以基因的形式存在于DNA分子中。基因(gene)是指DNA分子中贮存遗传信息的基本单位,它含有编码一条多肽链或功能RNA所必需的全部信息,表现为特定的脱氧核苷酸序列。基因组(genome)是一个生物体或细胞内所有遗传信息的总和基因组中蕴藏的遗传信息决定着物种的遗传和变异。与真核生物相比,原核生物基因组相对较小,容纳的基因数量有限。如大肠杆菌基因组序列约为4.60×10bp,约含430个基因;人的染色体基因组序列长3.03×10bp,编码2万~2.万个基因,存在1.万个基因家族,蕴含着人类发生、发育、衰老、疾病和死亡的全部遗传信息。 DNA复制(replication),即DNA的生物合成,是以亲代DNA为模板,按照碱基互补配对原则合成子代DNA,是基因组的复制过程。其化学本质是酶促脱氧核苷酸的聚合反应。在个体发育过程中,细胞又以DNA为模板合成RNA,将遗传信息转抄给RNA分子,这一过程称为转录(transcription),即RNA的生物合成。然后以mrNA为模板,由mRNA中的遗传密码决定蛋白质的氨基酸排列顺序,这一过程称为翻译(translation),即蛋白质的生物合成。通过转录和翻译,将储存在DNA中的遗传信息转变成为有特定生物学功能的蛋白质,称为基因表达(gene expression)1958年Francis H.Crick 归纳的中心法则（the central dogma）即指遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程。1970年 Howard Temin David Baltimore分别从致癌的RNA病毒中发现了逆转录酶,证实少数病毒RNA也是遗传信息的携带者,能以RNA为模板指导DNA的合成。这种遗传信息的传递方向与转录过程相反,故称逆转录(reverse transcription)。病毒RNA遗传信息逆转录现象的发现,使中心法则的内容得以扩充(图15-1)。 中心法则代表了大多数生物遗传信息贮存和表达的规律,是指导包括医学在内的生命科学研究的重要原则。对某些RNA具有催化活性的研究,使人们认识到RN不仅是沟通DNA与蛋白质的桥梁,还可能是比DNA分子具有更广泛功能的信息分子这预示着中心法则可能还将继续得到补充和修正。 一、DNA复制的特征 (一)半保留复制 自从人们认识了DNA两条链严格按照碱基互补配对和DNA双螺旋结构,就开始揣测遗传信息传递的机制。1958年, Mathew Meselson和 Franklin stahl通过大量实验证明,DNA合成时,亲代DNA双链先解旋、解链分开为两条单链,然后每条链各自作为模板,按照A与T、G与C碱基互补配对原则指导合成一股新的互补链;新合成的子代DNA分子中,一条链单链是亲代模板,另一条链则是与之互补合成的,新生成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基序列完全相同,保留了亲代全部遗传信息,因此称之为DNA的半保留复制( semiconservative replication)(图15-2)。 DNA复制是一个复杂而精细的酶促反应过程。除了需要以亲代DNA双链为模板和4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)为原料外,还需要多种酶及蛋白因子的协同多,本节主要介绍原生物DNA的复制过程及相关酶的主要作ASi,E.coli的研究居参与。DNA复制的相关知识来自原核生物大肠杆菌( Escherichia coli ,E. coli )的研究居多，本节主要介绍原核生物DNA的复制过程及相关酶的主要作用。 (二)复制起始点和方向 复制不是在基因组上的任意部位随机起始。原核生物基因组是环状DNA,为单点起始双向复制,即从固定的复制起始点( origin)开始,向两个方向进行解链,形成两个延伸方向相反的开链区,称为复制叉( replication fork)。从一个DNA复制起始点起始的DNA复制区域称为复制子( replicon),是独立完成复制的功能单位。例如,E.coli的复制有一个固定的起始点,称为oriC(图15-3),含245b,两组短的重复序列构成,包括上游的3个13bp的串联重复序列和下游的2个9bp的反向重复序列。上游的串联重复序列称为识别区,下游的反向重复序列碱基组成以A、T为主,称为富含AT(ATich)区。DNA双链中,AT间的配对只有2个氢键维系,故富含AT的部位利于双链DNA解开。 原核生物的染色质和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，只有一个复制起始点，向两侧形成两个复制叉，称为复制体(replisome)或单复制子的复制。真核生物基因组庞大复杂，由多个染色体组成，全部的染色体均需要复制，而每个染色体上有多个复制起始点，呈多起始点双向复制特征，称为多复制子(multireplicon)复制。每个复制的起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时复制叉汇合连接。高等生物有数以万计的复制子，复制子间的长度差别很大，在13-900kb之间。 (三)半不连续复制 DNA双螺旋结构中的两条链反向平行，一条链为5’→3'方向，其互补链为3’-5’方向。DNA合成酶只能催化DNA链从5’-3'方向的生物合成，因此，子链复制时延伸方向是5'-3’.在同一个复制叉上，解链方向只有一个，在复制时一条子链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以边解链边合成新链，这段连续复制的子链称为领头链(leading strand);另一条链的合成方向与解链方向相反，不能连续延长，需要等待模板解开足够的长度后，沿5,-3'生成引物并复制一段子链，随着模板链的不断解开并逐段合成许多不连续的DNA片段，最后经去除引物，填补引物留下的空隙，连接成一条完整的DNA新链，这一不连续复制的链称为随从链(lagging strand),复制中领头链连续复制而随从链不连续复制的现象，称为半不连续复制(semidiscontinuous replication),在引物合成和子链延长上，随从链迟于领头链，故两条互补链的合成不对称。 半不连续复制现象是1968年日本科学家冈崎(Reiji Okazaki)提出的，因此把随从链中不连续生成的DNA片段命名为冈崎片段(0kazaki fragment),原核生物冈崎片段长度约为1000~2000个核苷酸残基，相当于一个顺反子(cistron)的大小；真核生物的冈崎片段长度为100~200个核苷酸残基。复制完成后，这些不连续片段经过去除引物和填补引物留下的空隙，连接成完整的DNA长链。 二、参与DNA复制的主要酶类 复制时亲代DNA需要解成单链才能做模板，这个过程需要多种酶及蛋白质因子参与，共同解开并理顺DNA双链，且在一段时间内维持局部处于单链状态。参与复制的体系包括:DNA模板、4种dNTP、RNA引物、DNA聚合酶等酶类、蛋白质因子和无机离子(如Mg2+、Mn2+) （一）参与双螺旋DNA解链的酶类 1.解螺旋酶( helicase)又称为解链酶,利用AT供能,断开互补链配对碱基间的氢键,使DNA双链打开成为两条单链。解螺旋酶通常为多聚体,有多个DNA结合位点,能在DNA上定向移动。原核生物复制时,DNA超螺旋结构被拓扑异构酶松驰后解链过程需要DnA、DmB、DuC等多种解链蛋白参与,解螺旋酶是由DnB基因编 码的DnaB蛋白。复制过程中DnaB蛋白由ATP供能,推动解链蛋白沿着模板链复制又方向移动,促使DNA双链不断解开 2.DNA拓扑异构酶( DNA topoisomerase)简称拓扑酶,广泛存在于原核和真核生物。拓扑酶分为1型、Ⅱ型,最近发现了拓扑酶Ⅲ,它能够水解和连接DNA分子中的磷酸二酯键以松弛DNA超螺旋结构。DNA链是很长的双螺旋线性分子,随着DNA复制的进行,解链前方会扭结形成正超螺旋,此时主要有两类拓扑酶作用以改变DNA待解接中链的拓扑构象,理顺DNA链的结构配合复制的进程。拓扑酶能切Ⅰ断DNA双链中的一条,切口链末端绕另一条链沿着松弛超螺旋方向旋转至适当时候将切口封闭,DNA超螺旋变为松弛状态,1型酶的作用不消耗ATP。拓扑酶Ⅱ可在一定位置切断处于正超螺旋的DNA两条链,通过切口旋转使超螺旋松弛,然后利用ATP供能催化封闭切口 在复制末期新合成的子链与模板链也会相互缠绕,形成打结或连环,需要拓扑酶Ⅱ的 作用。因此,通过拓扑酶的切断、旋转和再连接等作用,理顺DNA拓扑构象,使复制 转录和重组得以顺利进行。拓扑酶在生物体DNA复制中起了非常重要的作用,也是某些化疗药物与抗生素作用的重要靶标。 3.单链DNA结合蛋白( single-stranded DNA binding protein,SSB)模板DNA解为单链状态时,两链间由于碱基互补配对,具有重新形成双链的趋势,并且单链易被细胞内广泛存在的核酸酶降解,因此,原核和真核细胞内存在的SSB可迅速与单链DNA可逆结合并保护解开的DNA单链模板,维持模板处于单链状态。在复制过程中1分子的SSB可覆盖7-8个核苷酸残基,若干个SSB同时结合在DNA单链上,随着双链的打开,SSB不断脱离又不断与新解开的DNA单链结合,通过这种结合、脱离,向复制叉移动的方向前进。 (二)引发体与引物酶 复制是在DNA聚合酶的催化下,脱氧核苷酸聚合的连续化学反应,但DNA聚合酶不能催化两个游离的d NTP聚合,只能催化核酸片段的3′-OH末端与dNP间的聚合。这种提供3′-0H末端的多核苷酸短片段RNA称为RNA引物( primer)。无论是领头链还是随从链中冈崎片段的合成都需要引物,引物最终被DNA置换。催化引物合成的酶称为引物酶( primase,它是一种特殊的依赖DNA的RNA聚合酶(DNA -dependent RNA polymerase,DDRP,该酶不同于转录过程中的RNA聚合酶,是一种催化反应速度慢且具有差错倾向性的聚合酶。在复制起始时,以复制起始点的DNA为模板,NTP为原料,多种蛋白因子和酶参与催化合成5→3的RNA,获得RNA 3′-OH末端,这一过程称为引发( priming)。 原核生物D naA蛋白辨认并结合于oriC的重复序列(AT区)上,形成DNA-蛋白质复合体结构,DNA发生解链,ATP供能,DnaB(解螺旋酶)、D naC蛋白因子先后参与, 结合复制起始区域的DNA蛋白质复合体,进而结合引物酶,形成引发体( prosome)。D naB是个复合功能蛋白,除了具有解旋酶作用外,还具有激活引物酶、促进RNA引物合成的作用。引物酶( primase)是由dnaG基因编码的DnaG蛋白,它是一种性质独特的RNA聚合酶,以核糖核苷三磷酸(NTP)为原料,催化合成一小段RNA引物(约有数十个核苷酸)其3′-OH端是DNA合成的起始点。 (三)DNA聚合酶 DNA聚合酶全称为依赖DNA的DNA聚合酶( DNA dependent DNA polymerase, DDDP, DNA-pol),在DNA模板、引物、d NTP存在的条件下,能催化与模板链互补的DNA新链合成。1958年Arthur Kornberg等在E.coli中首先发现了 DNA-pol,当时命名为复制酶( replicase)。现已发现多种 DNA-pol,且真核与原核的不同。 1.原核生物有3种DNA聚合酶大肠杆菌E.coli基因组中已发现三种DNA聚合酶,按发现的顺序称为 DNA pol I、Ⅱ和Ⅲ,这三种酶都具有5→3方向延长脱氧核苷酸链的聚合活性。以3′→5方向的DNA链为模板,按碱基配对A=T、C≡G)规则在引物RNA3′-OH末端基础上,催化合成5→3方向的DNA新链(图15-5)。三种酶还具有3→5外切酶活性,在复制过程中,当出现一些错配碱基时, DNA pol能够识别、切除并纠正错误碱基,具有“校读”( proofreading)功能,从而保证了DNA复制的高度准确性和遗传信息传递的稳定性。 图15-5DNA聚合酶的5→3聚合活性 (1) DA pol1是由928个氨基酸残基组成的一条多肽链,其相对分子质量为110KD。 DNA pol I从其多肽链的N端→C端,依次具有5→3外切酶和5→3′聚合酶和3→5外切酶三种酶活性DNA pol I5→3聚合酶活性可催化DNA合成,但当DNA pol I基因失活时,并不严重影响细胞活性,表明 DNA pol I并非是主要的复制酶当新链延伸至一定长度后,需要切除引物,留的空隙由 DNA pol I的5′→3′外切酶和5′→3′聚合酶活性完成;当DNA分子损伤时,又可利用其5→3外切酶和5→3′聚合酶活性切除损伤DNA并进行修复合成。因此, DNA pol I是多功能酶,具有催化DNA合成和校读作用、还具有在复制中切除RNA引物、填补冈崎片段间的空隙、修复损伤DNA等多方面的作用。经特异的蛋白酶处理, DNA pol可水解为两个片段,氨基末端323个氨基酸的小片段具有5→3外切酶活性,羧基端604个氨基酸残基的大片段,称为 Klenow片段具有3′→5外切酶活性和DNA聚合酶活性, Klenow片段是实验室中合成DNA,进行 分子生物学研究常用的工具酶。 (2) DNA pol II为多亚基聚合体，尽管其具有5'→3' 聚合酶和3'→5'外切酶活性，但无5'→3’外切酶活性。当DNA polⅡ基因发生突变时，细菌依然能存活，表明DNA polⅡ也不是DNA复制的主要聚合酶。实验发现DNA polⅡ只是在没有DNA pol I和DNA polⅢ时才起作用，且DNA polⅡ对模板特异性不高,即使在已发生损伤的DNA模板上，也能催化核苷酸聚合。具体生物学功能目前不完全清楚。 (3) DNA polⅢ 是由10种近20个亚基构成的异源二聚体结构复杂，主要包含2个核心酶、滑动夹(1对β-亚基)和1个γ-复合物。DNA- polⅢ的聚合反应的活性比DNA polI高40倍以上，聚合速度最快。在DNA复制过程中,DNA polⅢ在γ-复合物辅助下，由2个核心酶发挥高效的5'→3'方向的聚合酶活性作用,每分钟可催化105多至个脱氧核苷酸发生聚合，是原核生物复制延长中主要的DNA复制酶。 E.coli三种DNA聚合酶的主要性质和功能见表15-1。 表15-1 酶活性及其作用 DNA pol Ⅰ DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ 5'→3'聚合酶活性 + + + 5'→3'核酸外切酶活性 + － － 3'→5'核酸外切酶活性 + + + 作用 切除引物 填补空隙 校读作用 DNA修复与重组 特殊的DNA 损伤修复 校读作用 主要复制酶 校读作用 2.常见的真核生物DNA聚合酶 已发现的真核生物DNA聚合酶最少15种，其中常见的有5种分别命名为DNA-polα、β、γ、δ、ε，见表15－2 酶活性及其作用 α β γ δ ε 5'→3'聚合酶活性 + + ++ ++ ++ 3'→5'聚合酶活性 － － + + + 细胞内定位 核 核 线粒体 核 核 作用 引物酶 应急修复 线粒体DNA合成 合成子链，错配修复 错配修复 真核生物染色体复制由DNA-polα和δ共同完成。DNA-polα中的大亚基具有聚合酶活性，两个小亚基具有引物酶活性，能催化RNA引物的合成，在合成的一小段RNA后还可聚合4~5个寡聚脱氧核糖核苷酸;DNA-polδ是真核生物DNA复制时链延长过程中主要起催化作用的聚合酶，有持续合成DNA链的能力.分别合成领头链和随从链又具有3’→5'外切酶活性(校正功能),相当于原核生物的DNA pol Ⅲ ；此外，DNA-polδ还具有解旋酶的活性。至于高等生物中是否具有独立的解旋酶和引物酶，目前还未确定。DNA-polβ 复制的保真性低，可能是参与应急修复复制的酶。DNA-pol ε在复制中起校对修复和填补切除引物留下的缺口，类似原核生物的DNADNA-pol Ⅰ。DNA-pol γ存在于线粒体中,参与线粒体DNA的复制。 (四) DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase) 催化相邻DNA链3'-OH末端和5' -P末端间生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA片段连成完整的链。连接酶只能连接双链中的单链缺口，对单独存在的DNA或RNA单链没有连接的作用(图15-6)。DNA连接酶催化的反应需要消耗ATP。除复制过程外，DNA连接酶还在DNA修复、重组、剪接中起连接缺口作用,是基因工程的重要工具酶之一。 三、原核生物DNA复制的过程 生物体在细胞分裂之前完成DNA复制。原核生物与真核生物不同的基因组结构决定了它们DNA复制的体系组成及复制过程均有所不同。复制是一个连续的过程，为方便描述人为分成起始延长和终止三个阶段。 (一)起始阶段 原核生物复制起始是以形成引发体、催化引物的生成为标志。复制起始时,多个DnaA蛋白( 一般为20~40个)辨认结合于9bp的重复序列区域，形成DNA-DnaA蛋白复合体。后者在ATP参与下促进其上游串联排列的13bp序列双链解开,随之，DnaB蛋白在DnaC蛋白的协同下，结合于解链区，借助水解ATP产生的能量,沿解链方向移动,继续打开双链至足够长度,并且逐步置换出DnaA蛋白,形成复制叉。进步结合引物酶形成含有DnaA、DnaB、DnaC、引物酶和DNA复制起始区的引发体。随着引发体在DNA链上沿着复制叉方向移动,引物酶按碱基配对原则，以4种NTP为原料，由5'→3'方向催化合成一小段RNA引物。RNA引物的3' -OH末端作为合成DNA新链的起始点,为后续的DNA复制做好准备。此过程中由于双链的局部解开导致DNA超螺旋的其他部分过度拧结而形成正超螺旋，此时需拓扑异构酶不断地进行切开旋转和再连接，消除解链产生的拓扑张力，实现DNA超螺旋的转型。另一方面 ，单链结合蛋白(SSB)参与稳定单链DNA,防止恢复双链构象。 （二）延长阶段 延长阶段主要在DNA聚合酶作用下，以RNA引物的3'- OH为起点,4种dNTP为原料,分别以DNA的两条链为模板,按5'→3’方向催化合成互补DNA新链。在一个复制起始点DNA双链解旋和松开后,形成两个方向相反的复制叉,进行双向复制。对于一个复制叉而言,领头链可以在RNA引物3 ’-0H基础上沿着复制叉前进的方向连续合成，而随从链的延长方向与复制叉行进方向相反需要等双链DNA解开至相当长度后，先合成引物RNA，再延长DNA 新链。因此随从链的合成滞后于领头链。但是，领头链和随从链的合成是在同一DNA聚合酶Ⅲ复合体的两个核心酶催化下进行的。其中一个核心酶催化领头链合成，另一个核心酶催化随从链合成。其复制过程可能是在γ-复合物的辅助下，通过随从链的模板DNA做180°的回转，绕成一个突环，与领头链的合成点处在DNA聚合酶Ⅲ核心酶的催化位点上。随从链的一个冈崎片段合成约1000个核苷酸长度后回环解开。随后，随从链的模板DNA再作180°回转，引物酶催化合成RNA引物，DNA聚合酶Ⅲ再催化合成另一冈崎片段。随从链冈崎片段的合成需要不断合成RNA引物，聚合反应一直进行到另一个RNA引物的5’端为止。 (三)终止阶段 在复制过程中，两条子代DNA链(即领头链和随从链)都是在RNA引物基础上不断延伸。在终止阶段先由DNA聚合酶Ⅰ作用，切除引物RNA以DNA取代填补空隙。最后的缺口由DNA连接酶在毗邻的5’-P和3’-0H之间形成一个磷酸二酯键的连接，构成完整的DNA新链。环状DNA最后复制的3’-0H端继续延长，与另一方向复制叉的DNA链5’-P末端连接，形成完整的环状，完成基因组DNA的复制过程。环状DNA复制双向等速，从起点开始，两个复制叉各进行了180°移动，在终止位点上相遇而停止复制。复制终点在起点对侧的终止区域内含有多个约22bp的终止子( ( terminator)。有些生物两个方向复制是不等速的，起始点和终止点不一定把基因组DNA分为两个等份。 四、真核生物DNA复制的特点 真核生物基因组比原核生物的大得多，其DNA分子以染色质、染色体等复杂结构存在，因此复制也比原核生物的复制过程复杂得多。真核生物DNA是线性双链分子，含有许多复制起始点、采取多点双向复制、两个复制起始点之间构成一个复制单位，称复制子( replicon)。复制子以分组方式有序激活而不是同步起动，说明复制有时序性。单个复制子的复制起始过程与原核生物相似，催化DNA复制的原理基本相同，也是打开双链，形成复制叉，组装成引发体和合成RNA引物，以4种dNTP为底物Mg2+激活，以亲代DNA3’→5’方向的两条链为模板合成新链，延伸方向为5’→3’。在各DNA聚合酶协同作用下，完成半保留复制、校读、切除引物、填补空隙等作用过程。 由于真核生物DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体结构，复制过程需要解开和重新组装核小体以克服其造成的空间障碍，因此复制又前进速度慢、合成的冈崎片段短，需要引物合成频率高。但真核生物通过多复制子双向复制，可大大提高复制的速度，使总体速度并不慢，DNA合成后立即组装成核小体。真核生物复制的详细机制目前尚未完全清楚。 五、端粒与端粒酶 真核细胞染色体DNA是双链线性结构，且复制的方向只能沿着5’→3’方向DNA聚合酶都是在RNA引物3'-OH上起始复制的。在模板链3'-0H末端，新生子链最后复制的引物RNA去除后留下的空缺，因没有3'-OH作为DNA聚合酶的起点而无法填补，末端单链存在的DNA母链就会被核内 DNase酶解，在遗传信息代代相传过程中，可能会造成染色体DNA链末端逐渐缩短的现象，称为线性染色体末端复制问题。研究表明正常生理状况下染色质的复制是可以保持应有长度的，线性染色体末端复制问题由染色体末端特殊的结构端粒来解决。 (一)端粒与端粒酶的概念 端粒( telomere)是覆盖在真核生物染色体线性DNA分子两个末端膨大成粒状的特殊结构，它是由许多富含T-G重复序列串联而成，并与端粒结合蛋白紧密结合，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名。端粒是由端粒酶催化合成的，端粒酶( telomerase)是由蛋白质和RNA构成的复合体，是一种自带模板RNA的逆转录醇。端粒酶可染色体DNA3'-OH为起点，以自身携带的RNA链为模板，催化合成端粒的数百个串联重复序列“5’- GGGTTT-3'"”，以维持端粒一定长度。因此，端粒酶具有提供RNA模板和催化逆转录的功能。 1997年人类端粒酶被克隆成功，经鉴定由三部分组成:端粒醇RNA( human telomerase RNA.JTR)约150个核苷酸，富含CA;端粒酶协同蛋白1（human telomerase transcriptase，hTRT）;端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTRT）。端粒酶可能通过一种称为为爬行模型（inchworm model）的机制合成端粒结构，瑞粒结构对维持柒色体的稳定性以及DNA复制的完整性具有重要作用。 (二)端粒酶与衰者及肿瘤发生的关系 端粒与端粒酶对细胞的生长及肿痛的发生有非常重要的意义。由于端粒酶的存 在，端粒酶催化端粒DNA链延长，避免复制过程中子代DNA链的缩短，增加了染色体DNA的稳定性。如果端粒酶活性下降或丧失，将会导致细胞染色体末端的端粒DNA逐渐缩短，短到定程度即引起细胞生长停止、衰老或凋亡。研究发现培养的人成纤维细胞端粒随着分裂次数的增加，长度变短。生殖细胞端粒长于体细胞，成年细胞的端粒比胚胎细胞的短。如把端粒酶注人衰老细胞中，可弥补端粒的缺损，确实可以延长细胞的寿命。这说明细胞水平的老化可能与端粒酶活性的下降有关。然而，如果端粒酶被过度激活，染色体DNA不发生进行性缩短，使DNA复制失去制约而使细胞“永生”，可能会引发肿瘤，甚至恶性肿瘤的发生。对于端粒、端粒酶与人类体细胞衰老或肿瘤的发生之间的关系，相关的探索性研究具有重要意义。 第二节逆转录 一、 逆转录酶催化合成cDNA 1970年Temin和Balimorne 分别从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成双链DNA的酶，称为逆转录酶(everse taneriptase)e，， 又称为依赖RNA的DNA聚合酶(RNA dependent DNA polymerase ， RDDP)，是多功能酶。 逆转录酶可以RNA为模板，4种dNTP为原料，按碱基互补配对原则，合成互补DNA(complementary DNA.CDNA)。 在逆转录酶催化下合成cDNA双链包括三大步骤:首先逆转录酶以病毒基因组RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA/DNA杂化双链，然后催化杂化双链中RNA被逆转录酶中的RNbse活性的组分水解后，降解去除而留下eDNA单链；再以RNA分解后剩下的cDNA单链为模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链，即cDNA双链(图15-9)。 由上可见，逆转录酶有三种催化活性:①RNA指导的DNA聚合酶活性；②降解RNA-DNA杂合分子中RNA的RnA酶活性；③DNA指导的DNA聚合酶活性。 二、逆转录酶与病毒 逆转录酶及其催化的遗传信息从RNA传递至DNA的逆转录现象是分子生物学研究中的重大发现，进步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。大多数致癌病毒是RNA病毒，含有逆转录酶。病毒RNA通过逆转录先形成cDNA，然后整合人宿主细胞染色体DNA中，借助宿主细胞酶系表达病毒蛋白质。这些病毒蛋白质能使正常细胞发生癌变。 1983年，发现人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是-类反转录病毒，可引起获得性免疫缺陷综合(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)。 绝大多数反转录病毒侵人细胞后，并不杀死宿主细胞而是发生病毒基因组的整合，与宿主细胞DNA-起复制。但是HIV却不同，它感染宿主细胞后不引起癌变，而是杀死宿主细胞(主要是淋巴细胞)，造成宿主机体免疫系统抑制，引起AIDS。1987 年获美国FDA首批的抗HIV药物叠氮胸苷(azidothymidine ，AZT)，属于核苷类反转录酶抑制剂。AZT能进人受HIV感染的T淋巴细胞，在反转录酶作用下使AZT插人正在延伸的RNA链3'末端，以中止病毒RNA的合成，治疗AIDS。AZT 的副作用是对骨髓细胞有毒性，使患者发生贫血。 第三节DNA的损伤与修复 一、DNA突变 生物进化过程中 ，遗传物质的保真性是维持物种相对稳定的主要因素，因内外环境中各因素的影响使基因组DNA的组成与结构发生改变，称为突变( mutation)，也称为DNA损伤。DNA损伤可使DNA结构发生永久性改变，也可导致DNA失去作为复 制和(或)转录的模板功能。突变分为自发突变和人工诱变。在体内DNA复制过中偶尔也可能留下错配碱基而引起的突变称为自发突变，自发突变率般非常低。外界的物理或化学因素等引走外界的突变称为人工诱变。例如紫外线损伤会产生嘧啶二聚体，电离辐射生成自由基引起DNA损伤或DNA双链断裂，碱基修饰剂可以通过对DNA碱基的修饰作用而改变其配对性质，如亚硝酸盐能去除腺嘌呤的氨基，使之成为次黄嘌呤(I),它与胞嘧啶配对,而不是与原来的胸腺嘧啶配对;汉如烷化剂不仅能使碱基修饰，而且能引起DNA分子链内或链间发生共价交联等。若发生的突变有利于生物的生存而被保留下来,这就是进化;若不适应于自然选择则被淘汰;还有一些基因的突变则导致了疾病的发生;尤其动物细胞中突变的积累和癌瘤的发生有着紧密的相关性。 1. 突变的类型 DNA碱基序列发生任何异常变化都会产生突变，一般有下列几种突变类型。 1. 点突变 DNA分子上单个碱基发生变异，称为点突变(point mutation)可分为:①转换(transition):同型碱基变异,即嘌呤与嘌呤之间或嘧啶与嘧啶之间的互换，比如A替换G或者C替换T;②颠换(transversion):异型碱基变异,是指嘌呤与嘧啶之间的互换,比如C替换A。自然界中转换多于颠换。点突变如发生在基因的编码区,通过基因表达，可使蛋白质中原来的氨基酸被其他氨基酸取代，从而改变蛋自质的结构域功能,导致分子病。如镰状细胞贫血(图15-10),患者与编码血红蛋白β链的N端第六个氨基酸残基相对应的基因碱基序列T颠换为A,经转录生成的RNA碱基序列GAA颠换为GUA,以致合成的血红蛋白B链中的酸性谷氨酸转变为中性缬氨酸,导致红细胞变形呈镰状，易破裂、溶血。 （二）框移突变 由于一个或多个碱基(非三倍数)插入(insertion)或缺失(deletion), 而引起该突变你点后编码蛋白质的开放阅读框果发生改变，称为框移实变(frameshift）根移突变也可能使终止密码子提前出现，引起翻译的提前终止。 （三）重排 DNA分子内较大片段发生交换,称为重排((rearrangement) 交换的DNA片段可在新位点上反向排，可在您色体之间发生交换重组。地中南血就是由于血红蛋白B链和链的基因重排而引起的。 三．DNA损伤的修复 许多因素可引起DNA损伤，如果不及时修复，则可能对生命造成威胁。DNA修复(DNA repair) 是机体维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定的重要环节。生物体内有多种类型的修复系统，及时修复损伤DNA,以维持DNA正常结构与功能，使细胞存活。 1. 光修复 通过光修复（light repairing）酶催化完成的。紫外线可引起DNA链上相邻两个胸腺嘧啶碱基发生共价连接形成胸腺嘧啶二聚体。可见光（300-500nm）可激活光修复酶；使胸腺嘧啶二聚体共价键打开，恢复到损伤前的结构状态。光修复酶普遍存在于各种生物，但哺乳动物作用不大（图15-11） 1. 切除修复 是机体内最普遍、最有效的修复方式。切除修复（excision repairing）是指在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损部分切除，并以另一条完整链为模板进行修补合成，取代被切去的部分，使DNA恢复正常结构与功能。有碱基切除修复（base excision repair，BER）和核苷酸切齿修复（nuleotide excision repair，NER）两种形式。①BER：当遇到单个碱基受损时，常见的有C脱氨形成U，或A脱氨形成X,这些异常的碱基U或X被DNA糖基化酶识别并切除，使DNA骨架中产生无嘌呤位点（apurinic site）或无嘧啶位点( pinidinin site，称此为AP位点然后由AP核酸内切酶切割留下的脱氧核糖-5磷酸,产生的切口由DNA聚合酶I修补和DNA连接酶封口。②NER:当DNA损伤引起双螺旋告构变异时，如紫外线照射产生胸腺嘧啶二聚体享共价修饰导致DNA损伤，则需要系列酶包舌紫外特异的核酸内切酶、外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的协同作用进行修复(图15-12)声。着色性干皮病(xeroderma pigmentosum, XP)已被证实的DNA修复缺陷引起的遗传病，这患者有多个与核苷酸切除修复相关的基因突。XP患者对阳光或紫外线极为敏感，任何暴于阳光下的皮肤都会出现色斑等损伤，极易患肤癌和过早死亡。XP惠者对香烟中的致癌物有很高敏感性。 (三) SOS修复 当DNA损伤范围大而严重时,原有的DNA聚合酶受抑制，进行Sos修复时，细胞可诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶I，DNA聚合酶II能跨越损伤部位进行修复。这种DNA修复精确度差，突变率高,但细胞可生存，称此为应急修复或SOS修复。与精确的切除修复相比较,SOS修复对碱基的识别、选择性较差,保留的错误信息较多，可能会导致较广泛而持久的突变。实验发现大多数能在细菌中诱导产生SOS修复的作用剂，对高等动物都是致癌性的，如x射线、紫外线、烧化剂及黄曲霉素等。 第四节 RNA的生物合成 DNA碱基序列中储存着遗传信息，它通过转录和翻译而得到表达，实现对生命现象的控制。转录是指以生物体DNA为模板合成RNA的过程，是基因表达的关键环节。 一、参与转录的主要物质及其作用 转录过程的本质是由酶值化的核苷酸之间的聚合反应，需要有DNA模板、RNA聚合酶、4种NTP和一些蛋白质因子及Mg+和Mn2+的参与，合成方向为5’→ 3’，核苷酸间的连接方式为3’，5’- 磷酸二酯键。 (一)模板 转录以DNA为模板，但细胞内DNA全长序列井不是同时转录，而是按不同的发育阶段，生存条件和生理需要，选择性地进行区段转录。能转录生成RNA的DNA区段,称为结构基因(structural gene）。结构基因的DNA双链中只有一条链可被转录，通常将能够转录为RNA的条链称为模板链(template strand)相对应的不被转录的另一条链称为编码链（coding strand）。因此，RNA的生物合成称为不对称转录（asymmetric transcription)。它有两方面的含义：一是在DNA分子双链上，只有模板链转录，编码链不转录；二是模板链并非总是在同-条链上。DNA编码链和转录产物RNA碱基序列除了T和U不同，其他与编码链一致。 文献刊物登载基因碱基序列时，为了避免繁琐又方便查对遗传密码，一般只书写编码链,方向从5’→ 3’。 (二)原料 转录所需原料包括ATP、GTP、CTP、UTP 4种核糖核苷三磷酸(NTP)，作为RNA聚合酶的底物。 (三) RNA聚合酶 催化转录的酶是RNA聚合酶(RNA polymerase，RNA pol)，能以DNA为模板催化合成RNA，故又称DNA指导的RNA聚合酶。它以DNA的一条链或一节段为模板,4种NTP为原料,Mg+/Mn2+为辅助因子，按A=U、CmC碱基配对规则。催化合成5’→ 3’方向的RNA链。原核生物和真核生物的RNA聚合酶均能在模板链的转录起始部位，催化两个与模板链配对的NTP形成磷酸二酯键启动转录，因此转录不需引物。 细菌体内几乎所有的mRNA、rRNA和tRNA的合成都由一种RNA聚合酶催化合成。E.coli RNA聚合酶是由α、α、β、β'和ω共五个亚基组成的核心酶(core enzyme)，与亚基(又称σ因子)疏松结合构成的全酶（holoenzyme）。其中σ因子可以辨认DNA模板上的转录起始点，带动全酶解开DNA局部双链，促进转录启动，故又称为起始因子。核心酶（α2ββ’ω )单独不具有起始合成RNA的能力，只能使已经开始合成的RNA链延长。因此，细胞内转录需要以全酶形式由σ亚基启动，而转录延长阶段仅需要核心酶。 真核生物的RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种，其结构比原核生物的RNA聚合酶更复杂。它们位于细胞核的不同位置，分别催化不同基因的转录，对鹅膏覃碱的反应也不同，具体见表15-3。 表15-3 真核生物RNA聚合酶的种类和性质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 定位 核仁 核质 核质 转录产物 45S rRNA hnRNA Trna,5S rRNA,snRNA 对鹅膏覃碱的敏感性 不敏感 敏感 不同物种敏感性不同 ɑ-鹅膏覃碱是种致命的毒素，存在于名为伞形毒草的毒菇中。误服含有ɑ-鹅膏覃碱的毒蘑菇，最初会出现轻微的胃肠道症状，大约2天后，会出现广泛的肝坏死。其原因在于ɑ-鹅膏覃碱可以抑制人RNA聚合酶Ⅱ的活性，进而抑制mRNA以及蛋白质的合成，导致肝坏死。受此启发，临床应用利福霉求抑制结核分枝杆菌RNA聚合酶活性、杀灭细菌，而对于结构有较大差异的哺乳动物RNA聚合酶无明显毒副作用。因此，采用利福霉素治疗结核病时，具有良好效果,对患者不会产生明显的毒副作用。 (四)终止因子 1969年J.Raherts在大肠杆菌中发现能终止转录的一种蛋白质,定名为终止因子（rho factor，p) 。p因子作用是协助RNA聚合酶辨认终止点并终止转录。 二、转录过程 转录过程包括起始、延长和终止三个阶段。 (一)起始阶段 原核生物转录起始就是RNA聚合酶结合在DNA模板的转录起始部位,形成转录起始复合体，促使DNA双链局部解开，促使第一个核苷酸连接上去，启动转录。 转录起始发生在模板DNA的特殊部位，这个在模板链上能被RNA聚合酶特异结合,促使转录起始的部位称为启动子(promoter)。通常将开始转录的第一个碱基定为+1,其上游5'端碱基序列用负值表示，下游3端碱基序列用正值表示。原核基因启动子位于转录起始点的上游区域，经过对百种以上原核生物不同基因的启动子进行分析，发现启动子碱基序列具有下列共同特点：在-10bp处，有一段富含AT的保守序列（TATAAT），这是RNA聚合酶的结合位 点，由Pribnow首次发现，又称为Pribnow盒；在-35bp处还有一个含6个碱基的保守序列(其共有序列为TTGACA)，是σ因子识别位点。转录起始时，在σ因子特异识别下,RNA聚合酶以全酶形式结合于DNA启动子处，覆盖75-80bp范围(-55p-+20bp) (图15-13)。 转录起始前,RNA聚合酶与DNA双链结合并滑动，在σ因子作用下迅速寻找启动子。σ亚基辨认转录起始点，带动RNA聚合以全酶形式与启动子-35区结合，形成疏松的复合物；继而RNA聚合酶移向-10区并跨过转录起点，因Pribnow盒高含AT易被局部解开；当DNA双链解开约17pb时，按照DNA模板链碱基序列的指导，启动RNA链的合成。新合成RNA的5’端第一个 核苷酸往往是嘌呤核苷酸(ATP或GTP),尤以GTP为常见。然后第二个核苷酸进入,并与第一个NTP之间形成磷酸二酯键,释放PPi。σ亚基随之从核心酶上解离下来,与另一核心酶结合重复使用。 真核细胞启动子也有类似于原核启动子的保守序列,如-25bp处含有TATA盒，被称为Hogness盒,可看作启动子的核心序列;在其上游更远端(约-30～+110bp区域)还有CAAT盒和GC盒等保守序列。真核启动子需要多种转录因子参与下才能被RNA聚合酶辨认结合,形成转录前起始复合物。 (二)延伸阶段 该阶段由核心酶沿着DNA模板链3'→5'方向,催化合成5'→3'方向的RNA链。 σ因子脱落后核心酶构象变得松弛,有利于酶在DNA模板链上沿3’→5’方向滑动,根据DNA模板链碱基序列的指导,相应NTP的5’磷酸不断与前方核苷酸的3’-OH形成磷酸二酯键,使RNA链沿5’→3’方向延长。在此过程中,转录生成的RNA先与模板链形成暂时的8bp的RNA-DNA杂化链,然后向外伸出。随着RNA聚合酶沿DNA模板链3’→5’方向滑动,其前方不断的解链,后方又重新缠绕成双螺旋。这样,在转录的局部区域由RNA聚合酶、DNA模板链和转录产物RNA一起形成的转录复合物被形象化地称为转录泡( transcription bubble)(图15-14)。 (三)终止阶段 当结构基因区的信息全部被转录为RNA以后,RNA聚合酶在DNA模板链上停止滑动,转录产物RNA链停止延长并从转录复合物上脱落下来,转录终止。原核生物的转录终止主要有两种机制:依赖ρ因子和非依赖ρ因子两类。 1.依赖ρ因子的转录终止 p因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质,具有ATP酶和解旋酶双重活性。当转录产物RNA链3’端出现富含C的碱基序列时, ρ因子借助其ATP酶活性所提供的能量移动到该特殊碱基序列部位并与之结合,进而引起ρ因子和RNA聚合酶都发生构象变化,暂停RNA聚合酶的作用; ρ因子又可借助其解旋酶活性使 DNA-RNA杂化双链拆离,释放RNA链,并使RNA聚合酶与ρ因子一起从DNA模板链上解离下来,转录终止。 2.依赖ρ因子的转录终止 即依赖茎环结构的转录终止。DNA模板上靠近终止区域处有一段富含GC的回文序列(两段序列可以自身互补)及此后的AT密集区等特殊碱基序列，其转录产物RNA链的3‘端能够通过GC序列互补配对形成特殊的“茎环”结构(图15-15)。在茎环底部3’端往往出现4~6个连续的U序列。茎环结构的形成促使RNA聚合酶构象改变而暂停转录作用。同时,由于转录产物的(U)n与模板链的(dA)n组成的 RNA-DNA杂化链间碱基配对力相对较弱而易解离,进而释放转录产物RNA链,转录泡关闭,转录终止。 RNA生物合成(转录)与DNA生物合成(复制)比较,见表15-4。 表15-4 DNA和RNA生物合成的比较 三、转录后加工 原核生物无细胞核,转录与翻译耦联进行,mRNA初始转录产物无需加工即可作为翻译的模板。而tRNA和rRNA都要经过一系列的加工才能成为活性分子。但是真核生物RNA初始转录产物都要加工改变才能成为具有功能的成熟RNA,这一过程 P281-282 1.mRNA 前体的加工真核生物由 RNA 聚合酶Ⅱ催化生成的 mRNA 前体分子，即 初始转录产物被称为核内不均一 RNA(heterogeneous RNA,hnRNA)。hnRNA 一般只含 一个基因，其中编码多肽链的碱基序列并不连续排列，往往内含不编码的“插入序列”。 这些不编码的“插入序列”称为内含子(intron)，而能编码多肽链氨基酸的碱基序列被称 为外显子(exon)。因此，真核生物基因往往是由外显子和内含子间隔排列的断裂基因 (split gene)。在 RNA 初始转录生成后必须进行剪接(splicing)加工，即切除内含子、连接 外显子；而且在剪接之前，还需进行首尾修饰加工，即 5'端加“帽”、3'端加“尾”。 以鸡卵清蛋白 mRNA 前体分子的加工为例，首先进行首尾修饰加工：在鸟苷酸转 移酶和甲基化酶催化作用下，使 hnRNA 的 5'端加上一个特殊的帽子结构—-7-甲基 鸟嘌呤核苷三磷酸(m'GpppN)，然后在多聚核苷酸聚合酶作用下，使 hnRNA3'端连接 上一个多聚腺苷酸(polyA)尾，大约有 100~200 个腺苷酸。然后进行剪接加工：先是 hnRNA 分子中内含子区域弯成“套索”(lariat)状结构，使相邻外显子序列彼此接近而 利于剪切，然后在 RNA 酶作用下切除内含子、连接外显子。通过上述修饰和剪接等转 录后加工过程，使 hnRNA 转变成为成熟的 mRNA(图 15-16）。 2.tRNA 前体的加工由 RNA 聚合酶Ⅲ催化合成的 tRNA 初始转录产物，需要 在多种核酸酶作用下，切除 5'端多余的核苷酸，形成反密码环；在核苷酸转移酶作用 下，在 3'端除去个别碱基后接上 CCA 一 OH；通过碱基修饰 tRNA 分子上形成稀有碱基， 如 DHU、Ψ等。 3.rRNA 前体的加工真核生物 RNA 聚合酶 I 催化生成相对分子质量较大的 45SrRNA 前体分子，它是三种 rRNA 的前身。45SrRNA 经剪接后分出属于核糖体小 亚基的 18SrRNA，余下部分再剪接成 28S 和 5.8S 的 rRNA；5SrRNA 不需加工。TRNA 成熟后，在核仁上以数种 rRNA 与数十种蛋白质结合在一起装配成核糖体运至胞浆， 作为蛋白质生物合成的场所（见第十六章） 学习小结 1. 学习内容 1. 学习方法 归纳比较参与两类核酸(DNA 和 RNA）生物合成所需的主要物质和酶类的作用 基本过程，围绕遗传信息传递的中心法则重点掌握复制、转录、翻译、基因表达、反转 录等基本概念，了解 DNA 损伤及其修复相关概念。 第十五章 核酸的生物合成 复习思考题 1.参与复制和转录过程 呈的酶类和蛋白质因子有哪些? 它们如何参与 DNA或RNA的生物合成? 2 真核生物转录后的产物如何加工修饰? p284 第十六章 蛋白质的生物合成 学习目的 通过学习蛋白质生物合成体系的组成及其作用、蛋白质生物合成的基本过程等相关知 识,进一步理解临床运用抗生素和干扰素阻断细菌、病毒体内蛋白质合成的作用机制。 学习要点 三种RNA在蛋白质生物合成过程中的作用及其特点,蛋白质生物合成的基本过程和化 学性质。 蛋白质是生命活动的主要执行者,按照中心法则,遗传信息从DNA->RNA一>蛋 白质的传递,蛋白质生物合成与DNA分子中所蕴藏的遗传信息密切相关。DNA通过 转录将遗传信息传递给 mRNA,再以mRNA 为模板指导蛋白质的合成,从而将mRNA 分子中的核苷酸序列转变成为蛋白质分子中的氨基酸序列,这一过程称为蛋白质的 生物合成,也称为翻译(translation)。 在细胞的各种生物合成中,蛋白质的合成机制最 为复杂,约有300多种生物大分子参与了蛋白质的生物合成,而蛋白质合成过程中消 耗的能量约占细胞合成代谢总能量的90%,相关各种成分约占细胞干重的35%. 第一节 参与蛋白质生物合成的三种RNA 参与蛋白质生物合成的主要物质有:20种氨基酸(作为原料),mRNA(信息模板), tRNA(氨基酸的“搬运工具”),核糖体(合成场所),ATP,GTP(提供能量),氨基酰LRNA 合成酶,辅助因子Mg2+,K+,以及其他相关的酶及蛋白因子等。 一,mRNA 与遗传密码 (-)mRNA 的作用 mRNA 是在细胞核内以 DNA 为模板转录生成的,其核苷酸碱基排列顺序来自 DNA的遗传信息,进人胞质后作为蛋白质合成的信息模板,指导蛋白质生物合成。原 核与真核细胞基因结构及mRNA 转录产物有不同的特点。 在原核生物中,多个功能 上相关联的结构基因常常串联在一起被转录成一个mRNA,进而翻译成功能相关的几 种蛋白质,这种mRNA 被称为多顺反子m RNA(polycistronic mRNA). 原核基因转录 生成的 mRNA一般不需加工即可直接作为模板进行翻译,所以转录与翻译可以耦联 进行。而真核生物结构基因转录生成的mRNA基本上只编码一种蛋白质多肽链，成为单顺反子mRNA( monocistronic mRNA)。真核生物mRNA转录生成后需要一个加工成熟、穿过核膜进入胞质的过程，才能作为翻译的模板。 DNA分子中储存的遗传信息通过mRNA传递给蛋白质，实现对生命现象的控制。联系mRNA和蛋白质之间的纽带是遗传密码。mRNA线性单链分子上，每3个相邻核苷酸碱基编码一种氨基酸，这3个核苷酸被称为密码子( codon)，或称三联体遗传密码( genetic code)(图16-1)。 mRNA 5’...AUG......CAA CGU CAC ACA AUG AUA CAA UUU......UAG...3’ 起始......Cln....Arg...GIn... Thr... Met... Ile.... Phe......终止 密码子 密码子 图16-1 mRNA分子中的三联体遗传密码 1. 遗传密码的种类 蛋白质分子中的氨基酸排列顺序是由mRNA分子中的三联体遗传密码决定的。mRNA的4种核苷酸碱基——A、G、C、U，经排列组合可构成64个密码子,其中61个是编码合成人体所有蛋白质的20种氨基酸；AUG除代表甲硫氨酸外，还可作为多肽链合成的起始信号，称为起始密码子( initiation codon)，位于mRNA分子的5’端；3个密码子（UAA、UAG、UGA）不编码任何氨基酸，作为肽链合成的终止信号，称为终止密码子 （termination codon），位于mRNA分子编码区的3’端。具体的64种遗传密码见表16-1。 第一个核苷酸碱基（5’端） 第二个核苷酸碱基 第三个核苷酸碱基（3’端） U C A G U 苯丙 （Phe）苯丙 （Phe） 亮 （Leu）亮 （Leu） 丝 （Ser）丝 （Ser）丝 （Ser）丝 （Ser) 酪 （Tyr）酪 （Tyr）UAA终止信号UAG终止信号 半胱 （Cys）半胱 （Cys）UGA终止信息色 （Trp） U C A G C 亮 （Leu）亮 （Leu）亮 （Leu）亮 （Leu） 脯 （Pro）脯 （Pro）脯 （Pro）脯 （Pro） 组 （His）组 （His）谷胺 （Gln）谷胺 （Gln） 精 （Arg）精 （Arg）精 （Arg）精 （Arg） U C A G A 异亮 （Ile）异亮 （Ile）异亮 （Ile）甲硫 (Met） 苏 （Thr）苏 （Thr）苏 （Thr）苏 （Thr） 天胺 （Asn）天胺 （Asn）赖 （Lys）赖 （Lys） 丝 （Ser）丝 （Ser）精 （Arg）精 （Arg） U C A G G 缬 （Val）缬 （Val）缬 （Val）缬 （Val） 丙 （Ala）丙 （Ala）丙 （Ala）丙 （Ala） 天冬 （Asp）天冬 （Asp）谷 （Glu）谷 （Glu） 甘 （Gly）甘 （Gly）甘 （Gly）甘 （Gly） U C A G （三）遗传密码的特性 1.遗传密码的方向性 mRNA分子中三联体遗传密码的排列具有方向性,起始密码子总是位于mRNA编码区的5’端,终止密码子位于mRNA编码区的3’端。在mRNA阅读框架中,遗传密码从5’→3’方向的排列决定了翻译生成的蛋白质氨基酸从N端→C端的排列顺序。 2.遗传密码的连续性 mRNA分子中的三联体遗传密码既无间断也无重叠,翻译从mRNA编码区的5’端起始密码子开始,按5’→3’方向,每3个核苷酸一组的阅读框进行连续阅读,直至终止密码子出现。也就是说,三联体密码子是连续的,起始密码子决定了所有后续密码子的位置。所以,当mRNA分子插入或缺失一个碱基时,会引起mRNA的阅读框的移位,称为移码（frame shift）,造成翻译产物氨基酸顺序的改变。 3.遗传密码的简并性 由4种碱基组合成的64个密码子,其中61个代表20种不同的氨基酸。除了色氨酸和甲硫氨酸只有1个密码子外,其余每一种氨基酸都含有2-6个密码子。一种氨基酸具有多个密码子编码的现象称为遗传密码的简并性(degeneracy)。为同一氨基酸编码的各密码子称为同义密码子(synonymous codon)。比较同义密码子可发现,密码子的第1、2位碱基大多相同,仅第3位碱基有一定差异。因此,第3位碱基发生变异或突变时一般对所翻译氨基酸的种类影响不大。遗传密码的简并性对于减少有害突变,保证遗传的稳定性具有一定的意义。 4.遗传密码的通用性 从原核生物(包括病毒、细菌等)到人类,几乎都共用同一套遗传密码,称之为遗传密码的通用性(universal)。但也有个别例外,如哺乳动物线粒体和植物叶绿体的有些密码子的编码方式有一定差异。如UAG不代表终止信号而代表色氨酸,而AGA与AGG则代表终止信号,AUA则代表甲硫氨酸(起始密码子)等,这是由于线粒体具有相对独立的蛋白质合成体系。但是,遗传密码子的通用性依然得到公认。 二、tRNA与氨基酸的转运 (一)tRNA的作用 在蛋白质生物合成过程中,mRNA的核苷酸序列与蛋白质的氨基酸序列之间没有直接联系,而是通过一种既能辨认mRNA分子上的遗传密码,又能与相应氨基酸结合的中介物,这种中介物称为tRNA分子,它不但是密码子翻译成氨基酸的接合体,还是将氨基酸准确运输至核糖体上的转运工具。细胞内有多种tRNA,其序列各有不同,但都具有共同的结构特征:tRNA的3’端都有-CCA-OH末端,反密码环上有1个反密码子。tRNA与氨基酸的识别依赖于其分子中3’-CCA-0H末端,与mRNA密码子的识别取决于反密码环上的反密码子。在氨基酰-tRNA合成酶催化下,将特定氨基酸共价连接到tRNA分子的3’-CCA-0H末端上形成氨基酰-tRNA,然后tRNA通过其反密码子按碱基互补配对原则辨认mRNA分子的密码子,从而将特定氨基酸按密码子指令转运到核糖体上“对号入座”,参与蛋白质多肽链的合成。 氨基酰-tRNA合成酶具有高度专一性,对氨基酸和tRNA这两种底物都能高度特异地识别。其催化氨基酸的羧基与tRNA的3’-CCA-0H以酯键相连形成活化的氨基酰-tRNA,每个氨基酸活化需要消耗2个高能磷酸键。总反应为： 氨基酰RNA合成酶 氨基酸+ATP+tRNA 氨基酰-LRNA+AMP+PPi Mg2+tRNA分子的反密码子辨认mRNA分子上的密码子时,按5'-3'方向进行。其中,密码子的第3位碱基和反密码子的第1位碱基互补配对时,有时并不严格遵守碱基配对原则,这种现象被称为摆动配对(wobble pairing)(表 16-2)。 摆动配对可使携带特定氨基酸的一种tRNA识别mRNA序列中的多种简并密码子,避免有害突变的发生。如酵母丙氨酸tRNA 的反密码子为5'-IGC-3',可识别mRNA 上的3个同义密码子5'-GCU-3',5'-GCC-3'和5'-GCA-3'.表16-2 密码子与反密码子的摆动配对 tRNA 反密码子的第1个碱基 mRNA密码子的第3个碱基 I A,C,U U A,G G C,U (二)氨基酰-tRNA表示法各种氨基酸用三个英文字母表示,与之对应的tRNA.结合形成的氨基酰-tRNA可以表示如下:Pro-tRNAPro,Ala-tRNAAla等。前面的三个字母代表已结合的氨基酸,右上角的三个字母代表tRNA对某一氨基酸的特异性。如前述,AUG既可代表起始密码子又可代表甲硫氨酸的密码子。 在原核生物中,起始密码子代表甲酰化的甲硫氨酸(formyl-methionine,fMet),被一种起始tRNA(initiatortRNA)携带,表示为fMet-tRNAifMet.真核生物中起始tRNA携带的甲硫氨酸未被甲酰化,用Met-tRNAiMet表示。 三. rRNA与核糖体核糖体是由几种rRNA与数十种蛋白质共同构成的超大分子复合体。 在蛋白质生物合成过程中,核糖体是将氨基酸连接成为多肽链的“装配机”,即作为蛋白质生物合成的场所。(一)核糖体的组成与结构核糖体由大小两个亚基组成,大亚基约为小亚基相对分子质量的两倍。 每个亚基包含一个主要的rRNA分子和多种不同功能的蛋白质分子。 原核生物的核糖体为70S,由30S小亚基与50S大亚基组成;真核生物的核糖体为80S,由.40S小亚基与60S大亚基组成(图16-2).不同生物核糖体的组成见表16-3. 核糖体 大亚基 小亚基 rRNA 蛋白质 rRNA 蛋白质 原核生物 70S 23S,5S 34种 16S 21种 真核生物 80S 28S,5.8S,5S 49种 18S 33种 细胞质中的核糖体有两类,一类附着于粗面内质网,主要参与清蛋白、胰岛素等分泌性蛋白质的合成;另一类游离于胞质内,主要参与细胞固有蛋白质的合成。 (ニ)核糖体的主要功能部位 作为蛋白质合成场所,核糖体包括多个活性部位:1结合氨基酰-tRNA的氨基酰部位(aminoacyl site),简称 A位;2结合或接受肽酰-tRNA的肽酰部位(peptidyl site),简称P位;3空载tRNA 的出 口部位(exit site), 简称 E 位;4转肽酶(transpeptidase)活性部位;5mRNA结合部位;6一些重要蛋白因子(起始因子、延长因子和释放因子等)结合部位。其中A位和P位分布于大小亚基相结合的表面,转肽酶位于大亚基部位,而mRNA则与小亚基结合。 除了上述活性部位之外,原核生物核糖体小亚基16S-rRNA的3'端有一段富含嘧啶碱基的序列,如一UCCUCC-;而mRNA 5'端起始密码子AUG上游含有一段富含嘌呤碱基的序列,如一AGGAGG-,称为Shine-Dalgarno(S-D)序列。通过S-D序列与嘧啶碱基序列互补结合使mRNA起始密码子AUG在核糖体小亚基上精确定位,而AUG 可被具有起始作用的fMet-tRNAIfmet 识别并结合在P位。 第二节 蛋白质生物合成的过程 蛋白质的生物合成在细胞代谢中占有十分重要的地位。 蛋白质生物合成从核糖体大小亚基聚合在mRNA5'端AUG部位开始,沿着mRNA模板链5'-3'方向移动,由 tRNA 反密码子通过碱基互补配对“阅读”mRNA 三联体遗传密码并携带特定氨基酸在核糖体上“对号人座”,将氨基酸从N端一C端方向连接起来构成多肽链,直至核糖体在mRNA 3'端遇到终止信号而使大小亚基解离为止。 解离后的大小亚基又可以重新聚合在mRNA5'端AUG部位并开始另一条多肽链的合成,即进人下一轮循环。 蛋白质生物合成全过程可人为分为起始、延长和终止三个阶段。 一,起始阶段 原核生物蛋白质合成的起始需要核精体50S.和30S大小两类亚基,mRNA、起始fMet-IRNAifMet三种起始因子(initiation faclor,IF1,IF2.,IF3),Mg2+ 和 GTP, 在mRNA 编码区的5’端形成70S起始复合物。起始阶段又分以下三个步骤： 1.30S小亚基与mRNA结合 前一轮肽链合成完成后解体下来的30S小亚基，在起始因子IF1、IF3参与下，通过小亚基16 Sr RNA的富含啶碱基序列与 MRNA 5’端起始密码子AUG上游富含瞟呤碱基的SD序列配对结合形成复合物(30S小亚基-mRNA)，从而使起始密码子与翻译起始点(核糖体的P位)准确定位。 1. MEt-tRNAI.f met与mRNA起始密码子AUG结合 在IF2参与下，具有起始作用的MEt-tRNAI.f met过其反密码子辦认mRNA起始密码子AUG并互补结合，形成三元复合物(30S小亚基-mRNA-MEt-tRNAI.f met).此过程需GTP和Mg²+参与。 1. 70S起始复合物的形成 上述三元复合物一且形成，促使50s大亚基与该复合物结合，同时使结合在IF2上的GTP发生水解，释放出的能量驱使IF1、IF2、IF3，相继离开糖体，至此形成了70S起始复合物。此时，咬合在mRNA起始密码子AUG上 MEt-tRNAI.f met占据着核糖体的P位，A位空出并对应于下一组三联体密码子。70S复合物的形成，标志着蛋白质生物合成起始阶段的完成，接着可进入链延长阶段(图16-3) 1. 延长阶段 这一阶段在延长因子( elongation factor，EF)EF-T和EF-G的参与下，按照mRNA三联体密码子指令，由tRNA携带特定氨基酸（以氨基酰-tRNA形式)进人入核糖体A位。在转肽酶作用下延长肽链。此阶段包括进位、成肽和转位三个步骤的反复循环，并需要Mg²+及GTP供能。 1、进位 进位( entrance)是指特定的氨基酰-tRNA进入核糖体A位，70S起始 复合物形成后，随后的氨基酰 - tRNA携带何种特定的氨基酸是mRNA模板上的三联体密码子所决定，并需要EF-T和GTP的参与。 延长因子EF-T是由Tu和Ts两个亚基构成的二聚体（Tu-Ts）。首先EF-T以二聚体（Tu-Ts）形式与GTP结合并释放出Ts形成Tu-GDP;Tu-GDP进一步与氨基酰-tRNA结合构成氨基酰tRNA-Tu-CTP活性复合物；后者将氨基tRNA送入核糖体的A位上，而GTP随即被水解释放出pi形成Tu-GDP并从复合物上脱落下来。Tu-GDP在Ts作用下释放出GDP并重新形成Tu-Ts二聚体。后者进一步与 GTP在T作用下举出CGDP并重新GTP结合形成Tu-GTP进入下一轮循环。每循环一次，可将特定的氨基酰-tRNA送人核糖体A位(图16-4）。Tu-GTP只能结合并转运三联体密码子决定的氨基酰-tRNA，并将其送入核糖体A位。 2.成肽 成肽( peptide bond formation)是指转肽酶催化两个氨基酸间形成的反应。当核糖体P位和A位都被占据后，即具有起始作用的fMet-tRNAif Met占据P位，第二个氨基tRNA占据A位。在大亚基上的转肽酶催化下，可将P位上的起始 tRNA所携带的甲酰甲硫氨酰转移到A位，并与A位上tRNA所携带的氨基酰上的α--氨基形成第一个肽键(即二肽酰-tRNA)。核糖体大亚基上的转肽酶是一种特殊的核酶，由23SrRNA和蛋白质构成的复合体，原核生物核糖体大亚基中的23SrRNA具有肽基转移酶的活性，在真核生物中，该的活性中心位于大亚基的28SrRNA中，在核糖体上催化肽键的形成，在此过程需要Mg²+及K+的参与(图16-5)。当甲酰甲硫氨酰转移到A位后，核糖体P位上只留下空载的tRNA。 3.转位 转位（translocation）是指核糖体沿着mRNA 5’→3’方向移动一个密码子的距离方可阅读下一个密码子。在延长因子EF-G和GTP作用下，核糖体向mRNA 3’端方向移动一个密码子的距离，空载的tRNA移到E位被释放脱落下来，使核糖体P位暂时空出，而原来处于A位的二肽酰-tRNA连同其咬合的密码子被移位到P位，与此同时。mRNA上的第三组密码子进入A位对应处，准备接受第三个氨基酰-tRNA进位。转位的能量来自GTP的水解，此过程需要Mg²+和延长因子的参与。(图16-6) 随着核糖体沿着mRNA 5’→3’方向滚动，按照mRNA密码子指令，经过进位、成肽和转位三个步骤的反应过程，不断接受氨基院-RNA。此过程周而复始进行，可使 290 多肽链不断从N端向C端延长。 多肽链延长是一个耗能过程，其中进位和转位各消耗1分子GTP。由于每个氨基酸被tRNA结合形成活化的氨基酰-tRNA消耗2个高能磷酸键，故多肽链每延长一个肽键平均需消耗4高能磷酸键。 三、终止阶段 肽链合成的终止包括终止密码子的识别、肽链从肽酰-tRNA上水解释放、mRNA的分离和核糖体大小亚基的解体。这一阶段需要起终止作用的蛋白质因子——释放因子(release fator，RF)的参与。 在肽链延长过程中，当终止密码子(UAA、UAG或UGA)出现在核糖体的A位时，没有相应的氨基酰-tRNA可以和它们结合，即进人终止阶段。 此时，RF进人核糖体A位与终止密码子相结合，诱导转肽酶变构而转变为酯酶活性，使P位多肽酰与tRNA相连的酯键水解，释放多肽链。而后，核糖体与mRNA解离，tRNA脱落，各种蛋白因子释出，大小亚基解体，蛋白质生物合成终止，mRNA和各种蛋白因子及其他成分都可被重新利用。原核生物的RF有三种，RF1能识别UAG和UAA；RF2能识别UGA和UAA；RF3是依赖核糖体的GTPase，能促进RF1和RF2与核糖体结合。真核细胞只有一个释放因子（eRF），可识别所有终止密码子，具备原核生物各类RF的功能。 电镜观察发现，蛋白质生物合成过程中，在一条mRNA上可以同时附着三10-100个核糖体，依次结合起始密码子并沿着5'→3'方向读码移动，以不同进程合成多条同样的多肽链。 在蛋白质生物合成过程中，这种一条mRNA同时与多个核糖体结合进行肽链的合成，所形成的聚合物被称为多聚核糖体(polysome)(图16-7)。多聚核糖体合成肽链的效率甚高，每个核糖体一秒钟可翻译约40个密码子。每条mRNA结合的核糖体数目与生物种类和mRNA长度有关，一般说来mRNA每隔80个核苷酸即附着有一个核糖体。 第三节 翻译后加工 从核糖体刚释放出的新生肽链往往不具有生物活性，必须经过翻译后加工才能转变为具有特定构象和功能的蛋白质。 1. 一级结构的修饰 （一）N端fMet或Met的切除 由于起始密码子的原因，新生肽链的第一个氨基酸残基往往是甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。因此，在肽链合成完成后需要在氨基肽酶或脱甲酰基酶作用下水解去体多肽链N端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸残基。因此，在肽链合成完成后，需要在氨基肽酶或脱甲酰基酶作用下水解去除多肽链N端的甲硫氨酸或甲酰氨酸或甲酰甲硫氨酸残基。 （一)亚基聚合 对于多亚基构成的寡聚酶或寡聚蛋白，单个亚基形式不表现活性，只有多亚基聚合形成特定空间构象的聚合体形式才具有生物活性。如血红蛋白由2个a亚基第十六章 蛋白质的生物合成 (二)肽链的剪接 一些多肽链 合成后需要在特异蛋白水解酶的作用下，去除某些肽段或氨基酸残基。不少多肽类激素和酶的前体必须经过加工才能变为活性分子，如血纤维蛋白原，胰蛋白酶原的加工。新生的前胰岛素原，必须先切去N端信号肽，再切去C肽，然后形成二硫键，才转变为有活性的胰岛素。 (三)氨基酸残基的修饰 有些蛋白质肽链合成后，其氨基酸残基的侧链(R基团)需经一定的 化学修饰，包括甲基化，糖基化，磷酸化、羟基化羧基化、乙酰化等。如组蛋白的精氨酸残基可进行乙酰化和甲基化修饰，从而调节染色质的精细结构，调控基因表达。许多蛋白酶含有丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸，这些含羟基的氨基酸通过磷酸化修饰可以调节酶活性。许多多肽链内或链间含有一SH和 -S-S-的氧化还原互变，以影响蛋白质或酶的结构与功能。 二．高级结构的修饰 (一)辅基或辅酶的结合 结合蛋白酶都需要结合相应的辅基或辅酶构成全酶形式才具有活性。例如乙酰-CoA羧化酶需与生物素共价结合成全酶形式，才具有催化活性。 和2个β亚基构成，并结合4分子血红蛋白，形成特定构象的四聚体形式才具有携带氧的功能。 三．靶向输送 细胞内附着在内质网上的核糖体颗粒，合成的是分泌性蛋白质。多肽链合成后，必须在内质网腔和高尔基体内进行加工，通过定的机制 如经典的膜动运输等，被分泌到细胞外或整合在细胞膜中，即被定向输送到最终发挥生物学功能的靶部位，此过程称为蛋白质靶向输送(protein targeting)。 第四节影响蛋白质生物合成的物质 蛋白质的生物合成可受到许多种抗生素和干扰素的抑制。 一．抗生素 抗生素是微生物产生的能抑制或杀灭病原体的物质。常见的抗生素如嘌呤霉素，四环素，红霉素，氯霉素，卡那霉素和链霉素等。抗生素可以通过阻断病 抗生素(amibioice)是微生物产生的能抑制或杀灭病原体的物质。常见的抗生素原体内蛋白质生物合成的不同环节而起到杀天或抑制细菌。 如嘌呤霉素是氨基酰-tRNA的结构类似物，能够结合新生肽链形成肤酰嘌呤霉素。后者进一步结合在核糖体的A位上，竞争性抑制氨基酰-tRNA的进人。 由于肽酰嘌呤霉素与A位结合力较弱，容易从核糖体上解离，以致提前释放肤链，进而抑制 293 蛋白质的合成。嘌呤霉素可用于研究的蛋白质代谢调控机制。 又如四环素可以和原核生物核糖体30S亚基结合阻遏氨基酰-tRNA进入A位。红霉素能与原核生物核糖体50S亚基结合，阻止原核生物蛋白质的合成，抑制细菌的生长。四环素和红霉素都是广泛应用于治疗细菌感染的抗生素。 氯霉素能 与原核生物核糖体50S亚基结合，抑制肽酰转移酶活性，阻断蛋白质翻译的延长过程。高浓度的氯霉素对真核生物蛋白质合成也有抑制作用，因此对人体会产生毒性。链霉素和卡那霉素都能与原核生物核糖体小亚基结合改变其构象，导致链延伸阶段的mRNA被错读，使细菌蛋白失活。高浓度时还可抑制蛋白翻译的起始过程。 二．白喉毒素 白喉毒素(diphtheria toxin)， 是由白喉杆菌(Cory-nebacterium dphtheriae)产生的外毒素，由β-棒状杆菌噬菌体毒素基因编码，只有在噬菌体侵袭后，基因转导入细菌，才能编码产生白喉毒素。它是种单一多肽，分 子量为62000，等电点pI值4.1。完整的白喉毒素是一条大量含精氨酸的多肽链 ，经蛋白酶水解后，分为A和B两个片段，其中A片段具有酶活性，是主要致病因子，B片段能够介导A片段进人细胞内。 白喉毒素抑制真核生物蛋白质生物合成，可作用于EF-Ts，通过抑制移位反应，使得蛋白质延长受阻。白喉毒素是具有强烈的细胞毒作用，能抑制敏感细胞正常合成蛋白质，从而破坏细胞的正常生理功能，引起组织细胞变性坏死。 三、干扰素 干扰素(interferon，IF)是真核细胞被病毒感染后产生的一类具有抗病毒作用的蛋白质。干扰素可抑制病毒繁殖而保护宿主细胞，其原理:一是通过活化种蛋白激酶使起始因子elF-2发生磷酸化而失活，进而抑制病毒蛋白质的生物合成；二是间接活化一种特殊的核酸内切酶(2' -5'寡聚腺苷酸合成酶，2' -5' A)，2' -5' A再活化核酸酶RNaseL，使病毒mRNA降解，从而阻断病毒蛋白质的合成。 知识链接 滥用抗生素 人类最早发现的抗生素是青霉素，1928 年由英国伦敦大学的生物化学家、微生物学家Alexander Fleming在实验室中发现，后来英国生物化学家Ernst Boris Chain和药理及病理学家Howard Walter Florey进一步研究并应用于临床，三人于1945年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。青霉素的发现，在“二战”中拯救了无数受伤感染的士兵。至今已知抗生素的种类多达数千种，应用于临床的有几百种，使全球感染性染病的死亡率显著下降。然而，随着抗菌药物的广泛使用，滥用抗生素问题日益严重。 滥用抗生素指社会人群对抗生素及合成抗菌药物的非理性使用。 凡是不对症、不按标准、超时、超量使用抗生素都属于滥用抗生素，比如无指征的预防和治疗用药，品种、剂量的错误选择，给药途径、次数及疗程的不合理使用等。 滥用抗生素会产生严重的危害。 首先也是最严重的危害是细菌耐药性广泛面迅速的产生，由单类耐药发展为多重耐药。在应用抗生素过程中，病原微生物不断发生变异，至今几乎没有。 294 学科网（北京）股份有限公司 $