2026届高三生物一轮复习讲义限制酶的选择微专题

基因工程中限制酶的选择 专项练习 1.1酶切位点在目的基因两侧和载体上必须都存在 ①构建基因表达载体时，所选限制酶的酶切位点应该在目的基因两侧。 ②在载体上同样需要有一致的酶切位点，使后续DNA连接能正常进行。 ③如果目的基因两侧无法形成相应序列，可在其两侧添加与载体上酶切位点相匹配的限制酶识别序列。 1.2 酶切不能破坏载体的复制原点、启动子及终止子等特殊序列 ①切割载体所选的限制酶不能切割载体的复制原点、启动子、终止子等序列。 ②当某种限制酶的切割位点不在上述序列中，但在载体上有两个或以上的切割位点时，也要谨慎选择，防止切割重组后重组载体丢失含有复制原点或启动子、终止子的序列，导致重组载体进入受体细胞后无法自主复制或无法正常表达。 例1：（2021·辽宁·高考真题）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。 (1) 图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。 1.3 善用“双酶切”，注意方向性 在试题中，目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，即“双酶切法”。其优点和作用是:(1)防止目的基因、载体自身环化;(2)避免目的基因与载体反向连接。 1.4 巧用“同尾酶 同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶。同尾酶产生的黏性末端连接后的产物往往失去原有的限制酶的切点。 ①数种同尾酶的识别序列具有包含关系时，如因为有部分相同的序列，选用识别序列短的限制酶会将识别序列更长的限制酶对应的位点一并切割，因此需依题意进行选择。 ②当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 例2：青蒿素是治疗疟疾的特效药，主要从青蒿植物中提取，但提取量受种植周期和气候条件严重制约。为解决这一难题，科学家利用基因工程，成功重构了酵母细胞的代谢通路，使其能高效生产青蒿素的前体——青蒿酸。青蒿细胞中青蒿素的合成途径为FPP青蒿酸前体→青蒿酸→青蒿素，其中FPP是合成青蒿素的必需物质，它在青蒿和酵母细胞中都存在，但酵母细胞缺乏合成青蒿素的酶。请回答下列问题： (1)为使酵母细胞产生ADS酶，以图中质粒为载体，进行转基因并筛选出酵母菌菌株。要构建酵母菌的基因表达载体应使用限制酶 切割图中质粒，含ADS基因的DNA片段使用限制酶 切割，以获得能正确表达ADS基因的重组质粒。ADS基因转录的模板链是 。 1.5 合理对标记基因进行酶切 (1)若载体上只有1个标记基因，一般不能破坏其结构，否则无法在导入重组载体后对重组DNA分子进行筛选或发挥相应作用。 (2)若载体上有两个及以上的标记基因，可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 例3 课本P98-复习与提高 1题 1.6 利用酶切产物鉴定目的基因正向插入载体 【练习】 1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 2．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 3．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。       下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 4．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 5．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 6． （2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。   (1)如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 7． （2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 8．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。    9．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 10． （2024·全国甲卷·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。 11．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 12．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 基因工程中限制酶的选择 专项练习 答案 例1.（1） EcoRI PvitⅡ T4DNA连接酶 例2： Mfe Ⅰ、Hind Ⅲ EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 乙链 1.B 2.D 3.C 4.(1) 4种脱氧核苷酸 延伸 (2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ 5.(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。(2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 6.(1) Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 7.(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp 8.(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 9.(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR 10.(2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶 11(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2)卡那霉素 Sac Ⅰ ④ 12. SalI EcoRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 学科网（北京）股份有限公司 $