2026届高三生物一轮复习讲义限制酶的选择微专题

基因工程中限制酶的选择

专项练习

1.1酶切位点在目的基因两侧和载体上必须都存在

①构建基因表达载体时，所选限制酶的酶切位点应该在目的基因两侧。

②在载体上同样需要有一致的酶切位点，使后续DNA连接能正常进行。

③如果目的基因两侧无法形成相应序列，可在其两侧添加与载体上酶切位点相匹配的限制酶识别序列。

1.2 酶切不能破坏载体的复制原点、启动子及终止子等特殊序列

①切割载体所选的限制酶不能切割载体的复制原点、启动子、终止子等序列。

②当某种限制酶的切割位点不在上述序列中，但在载体上有两个或以上的切割位点时，也要谨慎选择，防止切割重组后重组载体丢失含有复制原点或启动子、终止子的序列，导致重组载体进入受体细胞后无法自主复制或无法正常表达。

例1：（2021·辽宁·高考真题）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。

(1)   图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入         和            两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用          （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。

1.3 善用“双酶切”，注意方向性

在试题中，目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，即“双酶切法”。其优点和作用是:(1)防止目的基因、载体自身环化;(2)避免目的基因与载体反向连接。

1.4 巧用“同尾酶

同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶。同尾酶产生的黏性末端连接后的产物往往失去原有的限制酶的切点。

①数种同尾酶的识别序列具有包含关系时，如因为有部分相同的序列，选用识别序列短的限制酶会将识别序列更长的限制酶对应的位点一并切割，因此需依题意进行选择。

 

 

 

②当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。

例2：青蒿素是治疗疟疾的特效药，主要从青蒿植物中提取，但提取量受种植周期和气候条件严重制约。为解决这一难题，科学家利用基因工程，成功重构了酵母细胞的代谢通路，使其能高效生产青蒿素的前体——青蒿酸。青蒿细胞中青蒿素的合成途径为FPP青蒿酸前体→青蒿酸→青蒿素，其中FPP是合成青蒿素的必需物质，它在青蒿和酵母细胞中都存在，但酵母细胞缺乏合成青蒿素的酶。请回答下列问题：

 

 

 

 

(1)为使酵母细胞产生ADS酶，以图中质粒为载体，进行转基因并筛选出酵母菌菌株。要构建酵母菌的基因表达载体应使用限制酶        切割图中质粒，含ADS基因的DNA片段使用限制酶        切割，以获得能正确表达ADS基因的重组质粒。ADS基因转录的模板链是        。

1.5 合理对标记基因进行酶切

(1)若载体上只有1个标记基因，一般不能破坏其结构，否则无法在导入重组载体后对重组DNA分子进行筛选或发挥相应作用。

(2)若载体上有两个及以上的标记基因，可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。

例3 课本P98-复习与提高 1题

1.6 利用酶切产物鉴定目的基因正向插入载体

【练习】

1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ）

A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇

B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI

C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段

D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶