2026届高三生物一轮复习课件07 DNA的粗提取与鉴定、琼脂糖凝胶电泳

选择性必修3 一轮复习 第07讲 DNA的粗提取与鉴定、琼脂糖凝胶电泳技术 1 一、知识网络 (1)基本思路 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 (2)实验原理 ①提取原理： b.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液中 a.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。 二、DNA的粗提取与鉴定 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 ②鉴定原理： 在一定温度下(沸水浴)，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 二、DNA的粗提取与鉴定 (3)实验选材 ①材料： DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 (3)实验选材 能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞做实验材料？ 不能， 哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 能否选用鸡血细胞做实验材料？ 能，鸡是鸟类动物，需加入3 g柠檬酸钠（抗凝剂），防止血液凝固 二、DNA的粗提取与鉴定 ②用具： 烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁,可直接吸水涨破(省去研磨步骤)，释放DNA。 二、DNA的粗提取与鉴定 (3)实验选材 ③试剂： a.研磨液: 含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl 研磨液 试剂 中文名称 作用 Tris 三羟甲基氨基甲烷 维持缓冲液pH值，稳定DNA：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态 EDTA 乙二胺四乙酸 抑制DNA水解酶，防止DNA被水解，是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA，从而保护DNA SDS 十二烷基硫酸钠 使蛋白质变性，与DNA发生分离，家用洗洁精含有SDS：洗衣粉含有蛋白酶和表面活性剂，可裂解细胞膜、使蛋白质变性。 Hcl 盐酸，浓度：2mol/l 将溶液调节pH至8 二、DNA的粗提取与鉴定 (3)实验选材 ③试剂： b.体积分数为95%的酒精： 析出DNA c.2mol/L 的NaCl溶液： 溶解DNA d.二苯胺试剂： 鉴定DNA 二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 研磨的目的：破碎细胞，释放DNA，使核物质容易溶解在研磨液中。若 研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的 DNA含量。 ①通过研磨释放 DNA 称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液（破坏细胞，释放出细胞内的物质），充分研磨（可加入少量石英砂助研）。 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 研磨时间不宜太长：防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：研磨效果好（有利于充分研磨） 研磨不宜太用力 9 ②提取上清液 用纱布可以减少DNA损失，不可用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行的原因：低温时，抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解，抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出。 上清液中可能含有DNA、RNA、蛋白质、脂质、糖类。 离心或过滤研磨液的目的：使细胞碎片沉淀，获得含有DNA的上清液。 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 纱布过滤，在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。 可以向上清液中加入嫩肉粉(含木瓜蛋白酶)，并在适宜温度的水浴中加热以加快反应，促使部分蛋白水解。 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2-3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。（如果不是白色，可能混有杂质可能是核蛋白、多糖等。） 用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分，或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 实验中的预冷、低温处理目的:抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解,抑制分子运动,使DNA易形成沉淀析出、低温有利于增加DNA分子的柔韧性,减少其断裂。 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 ③冷却酒精析出DNA DNA的析出中搅拌时应轻缓、并沿一个方向：减少DNA断裂,以便获得较完整的DNA分子 试管编号 A（对照组） B（实验组） 步骤1 2 mol/L的NaCl溶液5mL 2 mol/L的NaCl溶液5mL 步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物 步骤3 加入4mL二苯胺试剂，混匀 加入4mL二苯胺试剂，混匀 步骤4 沸水浴5 min 沸水浴5 min 实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色 实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 ④DNA的鉴定 ④DNA的鉴定 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 实验组 对照组 水浴加热 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 实验组：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺（现配现用）试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液变成蓝色（冷却后观察）。 对照组：2mol/L的NaCl溶液中加入二苯胺（现配现用）试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液不变成蓝色（冷却后观察）。 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关 13 析出DNA DNA的鉴定 研磨 称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 过滤取上清液 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。 取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 DNA鉴定的结果 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 ⑤总结归纳 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中 过滤 （或离心） 除去细胞膜等不溶杂质，得到与蛋白质等杂质结合在一起的溶解于滤液（或上清液）的DNA 搅拌（或离心）析出DNA 加入预冷的酒精溶液，蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，将DNA和蛋白质等杂质分离 溶解 用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在 二、DNA的粗提取与鉴定 (4)方法步骤 ⑤总结归纳 为除去粗提取的DNA中的蛋白质可用___________________________________ 酶解法（蛋白酶水解）、高温 为除去粗提取的DNA中的RNA可用____________________________________ 酶解法（RNA酶） 二、DNA的粗提取与鉴定 ⑥提纯DNA (4)方法步骤 (5)实验结果不明显的可能原因 ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 二、DNA的粗提取与鉴定 (6)结果分析与评价 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多，可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功。如果不呈现蓝色，可能的原因：研磨不充分，材料中的核物质没有充分释放出来，所提取的DNA含量低。 ①以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 ②加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。 ③析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：1）可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。2）抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出。3）低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂（同4℃冰箱）。 ④实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA，玻璃棒不能直插烧杯底部。 ⑤粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。 ⑥为减少DNA的损失，过滤过程一般使用纱布过滤。 ⑦二苯胺试剂要现用现配，否则会影响鉴定的效果。 二、DNA的粗提取与鉴定 (7)注意事项 二、DNA的粗提取与鉴定 (7)注意事项 ⑧加入洗涤剂的目的是溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物。加入食盐的目的是使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出 DNA 分子，并使 DNA 分子充分溶解于浓NaCI溶液中。 ⑨由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。 ⑩鸟类和哺乳动物的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA ⑪利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 ⑫加入研磨液后，必须充分研磨，破碎细胞应彻底充分。否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。 ⑬有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 二、DNA的粗提取与鉴定 (7)注意事项 ⑭提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳。作用是溶解杂质和析出DNA。 ⑮加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 ⑯久置的实验材料、DNA易被降解，实验现象不明显 ⑰细菌细胞提取DNA可用溶菌酶预处理 ⑱沸水浴后冷却再比色，主要是因为：高温时颜色不稳定，冷却过程能让颜色充分显现，防止烫手和损坏仪器。 ⑲对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。 ⑳高速离心或长时间离心会导致DNA断裂，使DNA也沉淀（原理：大分子杂质与DNA形成复合物一同沉淀）。低速离心或短时间离心使细胞碎片、多糖等未彻底去除。 二、DNA的粗提取与鉴定 (7)注意事项 (8)进一步探究 ①方法一： 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质,用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 ②方法二： 可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开,随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液,可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。 二、DNA的粗提取与鉴定 ③方法三： 由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 22 A-❆二苯胺试剂的配制 ① 称取1.5g二苯胺，溶于100mL冰乙酸中。 ② 在溶液中加入1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。 ③ 临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1 mL体积分数为0.%的乙醛溶液。 B-❆ DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者再和二苯胺试剂作用呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关，可以加入适量乙醛，以提高反应的灵敏度。 C-❆DNA与二苯胺试剂反应后的溶液对波长为595nm的光有最大吸收峰，并且DNA的含量在一定范围时，吸光度的值与DNA的含量成正比，利用这个原理可以测定DNA的含量。 二、DNA的粗提取与鉴定 (9)拓展 D-❆研磨液的配制方法 ① 将 10.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)加入50 mL蒸馏水中，使其溶解。 ② 用 2 mol/L 的 HCl 溶液调节pH至8.0。 ③ 在溶液中加入 8.76 gNaCl、37.2gEDTA(乙二胺四乙酸)、20gSDS(十二烷基硫酸钠)，待药品全部溶解后，用蒸馏水定容至1000mL。 二、DNA的粗提取与鉴定 (9)拓展 A-利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够______________的仪器，一次PCR一般要经历____次循环。 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了___________________的原理。 DNA半保留复制 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (1)原理 B-DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些__________会向着__________________的电极移动，这个过程就是________。 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过____________________来鉴定。 ④在凝胶中DNA分子的迁移速率与__________________、__________________和_____等有关 ③凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的________下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (1)原理 DNA分子在一定pH的缓冲液（pH8.0）中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (1)原理 B-DNA片段电泳鉴定的原理 ①凝胶浓度：制成的琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。 ②DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。因此，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大， 离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同大小的DNA分子分离开来。 ③DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体和用于向加样孔中添加相应样液） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (2)材料用具 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (2)材料用具 (2)材料用具 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液[TAE(乙酸盐)或TBE(硼酸盐),加有EDTA(一种螯合剂，能与Mg2+结合)],主要作用是维持合适的pH，以及使溶液具有一定的导电性以利于DNA的迁移。 ⑧凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）,PCR产物与其混合后再进行加样。 ⑩核酸染料（常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。） ⑨琼脂糖：琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 ❆DNA片段的扩增 ①移液 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ（使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸） 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ（使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸） 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL 为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 ❆DNA片段的扩增 ②离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） ③扩增 将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。 预变性： 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 1.为什么最后1次变性时间延长？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。 2.PCR的产物是什么？ 3.如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 ❆DNA片段的扩增 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 ❆DNA片段的电泳鉴定 ①配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 ②制备凝胶 A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔（加样孔处连接负电极）。 C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜，电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。 B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 ③加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝，有颜色，可以标记样品的位置并帮助监测电泳进程）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。DNA Marker是已知的DNA分子大小的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小。 ④电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1-5V/cm。待指示剂（①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。)前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑤观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 ❆DNA片段的电泳鉴定 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 梳子 模具 点样孔 电泳槽 样品 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (3)实验步骤 38 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ③该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ②在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (4)注意事项 ④PCR扩增不能随意加大试剂用量。 ⑤在向微量离心管中添加反应组分时，用微量移液枪小心加入点样孔内，枪头不可刺穿凝胶。每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ⑥电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢，DNA的相对分子量越小，迁移速率越快,离加样孔越远。　 ⑦若想让分子量大的迁移速度变快可适当加大电压、降低琼脂糖凝胶浓度。 ⑧琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，凝胶的浓度越大，迁移速率越慢。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (4)注意事项 ⑨电泳一般需要Marker（标记），为一组已知分子量的标准DNA片段，在电泳中作为未知样品大小的参照物。如D2000plus DNA Ladder含有9条双链DNA分子其分子量为100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000 bp。比对样本与Marker电泳后的位置分布和条带粗细来初步判断目标DNA分子的大小和浓度。 ⑩加样时DNA可能会飘散到电泳缓冲液或流入附近加样孔造成交叉污染，故可向凝胶载样缓冲液中加入甘油或蔗糖等成分以增加样品密度，保证每个样品都容易沉入各自的加样孔中防止飘散。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (5)结果分析与评价 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。分布代表扩增产物的类型，亮度代表代表扩增产物量的多少。 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 未出现扩增条带可能的原因有： TaqDNA聚合酶失活 引物出现质量问题 变性时温度低，变性时间短,模板DNA链未打开。双链DNA没有解聚为单链，导致模板DNA失效。 Mg2+浓度过低（DNA聚合酶需要Mg2+激活） 漏加了PCR的反应成分 各反应成分的用量不当 PCR程序设置不当等 …… 出现非特异性扩增条带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ③DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高，Mg2+浓度过高(影响酶)和复性温度过低会过度稳定非特异性结合的引物-模板复合物。 ⑤模板DNA出现污染 ⑥引物浓度过高 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (5)结果分析与评价 ①你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ②DNA片段电泳鉴定的原理是什么？ DNA分子带负电，在电场力的驱动下，从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中蠕动，核酸染料带正电，在电场力的驱动下，从正极向负极运动，遇到DNA就嵌入其中完成染色，但这个颜色可见光下看不到，需要紫外光激发。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (5)结果分析与评价 ③电泳过程中，溴酚蓝和核酸染料分别什么作用？ 电泳时溴酚蓝是指示剂，指示泳动的位置，判断是否终止电泳，核酸染料是 DNA染色剂，嵌入DNA分子中，在紫外光下显色。 ④指示剂移动速率比DNA更快，当指示剂迁移至凝胶边缘时，提示应及时停止电泳，避免目标分子跑出凝胶。 三、琼脂糖凝胶电泳与鉴定 (6)拓展：聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它___________________以及_____________等因素。 所带净电荷的多少 分子的大小 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小。 SDS的作用： ①SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成_____________ ②SDS能与各种蛋白质（肽链）形成_________，SDS所带负电荷的量____________蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的____________，使电泳迁移率完全取决于____________。 单条肽链 复合物 大大超过 电荷差别 分子的大小 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得换算，可以测定未知蛋白质的分子量。 Lavf58.51.100 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $