2026届高三生物一轮复习讲义基因表达载体的构建方法

基因表达载体的构建方法 一、限制酶的选择技巧 1.根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 （1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 （2）为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 2.根据质粒的特点选择限制酶(如图) 3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 二、基因表达载体的构建过程(如图) 1．Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 2．CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 3．In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 【典例1】（2025•陕西、山西、宁夏、青海四省卷）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 （1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。 （2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-________-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 （3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【典例2】（2025•黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古卷）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 （1）可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' （4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【典例3】（2025•河北卷）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 【典例4】（2026•成都模拟）胃幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能指导合成其特有的Ipp20蛋白，科研人员培育出转Ipp20基因山羊（将Ipp20基因导入山羊受精卵）利用乳腺生物反应器制备Hp疫苗。所用质粒和Ipp20基因两端序列以及相关限制酶识别序列如下图所示，已知Ipp20基因内部不含MfeⅠ酶切序列而外部两端含有，回答下列问题： 限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ HindⅢ MfeⅠ 识别序列和切割位点(5′—3′) G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT C↓AATTG （1）利用PCR技术扩增目的基因片段，PCR的每次循环包括______和延伸3个阶段，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是______，能够破坏该化学键的酶是______（写出1种即可）。 （2）构建基因表达载体时，一般不选用MfeⅠ对质粒和目的基因进行切割，原因是________________________，如果选择EcoRⅠ和HindⅢ两种酶对目的基因和质粒进行切割，需要在两种引物上分别添加两种限制酶的识别序列，从而扩增出两端带有两种限制酶识别序列的Ipp20基因。依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5′—____________—3′（写出其中1种即可）。 （3）将构建好的基因表达载体通过__________________技术注入到受精卵中，再将受精卵培养成早期胚胎移入受体获得转基因羊，进而培育成转基因羊，转基因羊成功的标志为__________________。 【典例5】（2026•西安模拟）胡杨中的PeCPK7基因能提高植物的耐盐碱性，现将该基因导入拟南芥，从而获得耐盐碱的拟南芥新品种。先从胡杨细胞中提取得到PeCPK7基因的mRNA，通过实时荧光定量PCR（qPCR）进行扩增，过程见图1，图2为获取的PeCPK7基因、搭载目的基因的Ti质粒及相关限制酶的识别序列和切割位点，已知潮霉素抗性基因只能在真核细胞中表达。回答下列问题： （1）由PeCPK7基因的mRNA获得目的基因，需要在反应液中添加________酶。图1中的过程1为PCR过程中的_________，由图可知，酶X的功能为_________。若某次PCR反应共产生64个产物，则需加入___个Taqman探针。 （2）为了保证PeCPK7基因与Ti质粒的正确连接，PCR时需在引物___（填“1”或“2”）的5’端添加限制酶______的识别序列，在引物____（填“3”或“4”）的5’端添加限制酶______的识别序列，经DNA连接酶连接后导入添加了______的培养基中培养的土壤农杆菌，然后使土壤农杆菌侵染拟南芥，将拟南芥细胞置于添加_______的培养基上培养，最终培育出耐盐碱的拟南芥植株。 【典例6】（2026•北京海淀模拟）结肠癌是发病率高的癌症之一，血管生成与肿瘤的发生发展密切相关，研究人员针对结肠癌的血管生成机制做了如下研究。 （1）研究表明，M蛋白可以诱导细胞凋亡，通过抑制异常的血管平滑肌细胞增殖和迁移影响血管生成。M蛋白在核糖体合成，经内质网和高尔基体加工后分泌至细胞外，研究人员发现结肠癌患者血清中的M蛋白含量显著降低。据此推测，M基因可能是一种________基因。 （2）研究人员利用数据库筛选到一种可促进M基因转录的E蛋白。推测E蛋白通过与M基因启动子区域结合，促进M基因的表达。将相应质粒分别转入两组相同的细胞中，一段时间后收集细胞裂解液，检测荧光强度。结果显示甲组荧光强度明显高于乙组，从而证实推测。下列选项中，转入甲组细胞的表达载体有________，转入乙组细胞的表达载体有________。 A. B. C. D. E. F. 注：组成型启动子可持续启动基因转录 （3）EMSA实验可在体外验证DNA和蛋白质的相互作用，其原理是将蛋白质和用放射性同位素标记的DNA探针一同保温，电泳时探针和蛋白质相互作用形成的复合物比游离的探针移动的慢，处理后标记可显色。为了证实（2）中的结论，按下图所示的加样顺序进行实验，则探针P的碱基序列应与________相同。实验中设置组3和组4的作用是为了证明_______的结合具有特异性，而组5的作用则是为了证明_______。 （4）将血管内皮细胞接种于培养液，待其贴壁生长一段时间后，根据显微镜下观察到的“毛细血管”数量即可判断血管内皮细胞的血管形成能力。接种数量相同的血管内皮细胞后，经E蛋白处理的细胞形成“毛细血管”的数量低于未经E蛋白处理的。此实验结果能否证实“E蛋白通过M蛋白抑制血管生成”？理由是_______。 【典例7】（2026•四川绵阳模拟）多环芳烃是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌导入重组质粒，制备多环芳烃生物传感器，为环境污染治理提供新方法。部分信息如图所示。 （1）nahR和mrfp的转录模板链______（填“是”“不是”）DNA分子的同一条链。除图1标出的结构外，重组质粒还需具备的组件有________________（答出2点即可）。 （2）环境中存在多环芳烃时，nahR基因表达产物与之结合形成_________激活启动子_______，启动基因mrfp表达，菌体发出红色荧光。 （3）环羟基化双加氧酶基因（baaA）编码的环羟基化双加氧酶可以降解多环芳烃，baaA与mrfp连接成融合基因，则可利用同一个启动子同时驱动两个基因的表达，实现对多环芳烃的动态检测和清除。现欲通过PCR判定两基因是否融合成功，应选择图2中的引物组合是________。 （4）工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但大肠杆菌菌株本身会造成水源安全隐患。已知Bc1基因表达毒蛋白可使工程菌致死，Bc2基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效。科学家将Bc1、Bc2两个基因插入原有序列中，使多环芳烃被耗尽时菌株即启动“自毁”。则Bc1、Bc2两个基因分别插入图3中的________、________位点。 ‍ 【典例8】（2026•济宁模拟）植物基因启动子分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。科研人员发现GbGAI4基因参与海岛棉体细胞胚胎发生的过程。为探究GbGAI4启动子属于组成型启动子还是组织特异性启动子，科研人员做了以下实验。 （1）克隆获得GbGAI4启动子序列 利用PCR技术克隆GbGAI4启动子时需要两种引物的原因是______。PCR产物常采用______进行鉴定。 （2）构建植物融合表达重组载体 ①研究人员欲利用无缝克隆In-Fusion技术构建植物融合表达重组载体，In-Fusion酶能够识别任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，据此实现目的基因和载体的连接，过程如图1所示。与双酶切法构建植物融合表达重组载体比较，该技术的优点有______。（写出两点） ②利用无缝克隆技术构建植物融合表达重组载体，首先获得了线性载体、GbGAI4启动子序列、GUS基因3种DNA分子（如图2），GUS基因是一种报告基因，其表达的产物能使无色物质K呈现蓝色。要实现3种DNA分子的有序连接，首先分别在3种DNA分子两侧添加相应的序列便于In-Fusion酶能够识别。已知在引物1的5'端添加的序列与序列a相同，则引物3的5'端添加的序列与______相同，引物2添加的序列与引物4的序列______（填“相同”或“互补”）。 （3）农杆菌的转化及GbGAI4启动子GUS活性的检测 研究人员利用农杆菌转化法分别将重组载体导入根、茎、叶及胚性愈伤组织细胞、球形胚中，暗培养24h后，进行染色、观察。阳性对照组导入的是已知的组成型启动子与GUS的融合载体，阴性对照组导入的是______。GUS活性检测结果显示，实验组与阳性对照组的根、茎、叶及胚性愈伤组织细胞、球形胚中均呈现蓝色，而阴性对照组不呈现蓝色，该结果表明GbGAI4启动子属于______。 注：镉离子对渗透压的影响忽略不计 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 参考答案 1.【答案】（1）4种脱氧核苷酸 延伸 （2）5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ （3）栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化 【解析】（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 （2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 2.【答案】（1）基因数据库（或序列数据库） Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 （2）试剂 1 目的基因N大小为2.3kb （3）GCC （4）香树脂醇 【解析】（1））GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有试剂污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延申后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延申后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 3.【答案】（1） 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 （3）细胞表面发出黄色荧光 降低 （4）基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 （5）① ④ 【解析】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞外比野生型衣藻细胞外的镉离子含量低，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞外镉离子含量降低。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和④。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；④衣藻吸附的镉可被合理转运，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 4.【答案】（1）变性、复性 氢键 解旋酶（或RNA聚合酶） （2）目的基因和载体可能自身环化以及反向连接 AAGCTTATGGGC（或GAATTCCTAGTG） （3）显微注射 转基因山羊乳汁中含有Ipp20蛋白 【解析】（1）利用PCR技术扩增目的基因片段，PCR的每次循环包括变性、复性和延伸3个阶段。引物通过碱基互补配对与模板链DNA结合，因此引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。解旋酶能破坏碱基对之间的氢键（在基因转录时，RNA聚合酶与一段DNA结合，使DNA双链解开，因此，RNA聚合酶也能破坏碱基对之间的氢键）。 （2）同种限制酶切割目的基因和质粒，会使目的基因两端的黏性末端和切割后质粒两端的黏性末端都相同，而发生目的基因和质粒的自身环化以及目的基因和质粒的反向连接。根据Ipp20基因两端序列可知，Ipp20基因两端没有EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列，设计引物时需要在引物的5，端加上限制酶的识别序列，以便PCR扩增目的基因后能够被切割质粒的同种限制酶切割形成相同的黏性末端，结合图中目的基因转录的方向和限制酶识别序列的方向，图中目的基因左侧5，的单链做模板时，引物结合在模板链的3，端，与模板链碱基配对的引物序列为5，—CTAGTG—3，，5，端加上限制酶EcoRⅠ的识别序列5，—GAATTC—3，，最终为5，—GAATTC CTAGTG—3，，同理，目的基因右侧5，的单链做模板时，引物结合在模板链的3，，与模板链碱基配对的引物序列为5，—ATGGGC—3，，5，端加上限制酶Hind Ⅲ的识别序列5，—AAGCTT—3，，最终为5，—AAGCTT ATGGGC—3，。 （3）将重组质粒导入受精卵中，即受体细胞为动物细胞，应使用显微注射技术。转基因成功的标志是目的基因在受体细胞中成功表达，即通过转录、翻译合成蛋白质，因此转基因羊成功的标志为转基因山羊乳汁中含有Ipp20蛋白。 5.【答案】（1）逆转录 延伸 催化合成DNA子链，同时水解Taqman探针的核苷酸序列 63 （2）1 EcoR I 4 Xho I 氨苄青霉素 潮霉素 【解析】（1）从mRNA获得目的基因需在反应液中添加逆转录酶。图1中的过程1中引物与模板结合后，子链DNA延伸，为PCR过程中的延伸。由图可知，酶X的功能为催化合成DNA子链，同时水解Taqman探针的核苷酸序列。若某次PCR反应共产生64个产物，即2n=64，说明至少扩增了6次，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子生成，就需要一个荧光探针，由于每次扩增只有一条链结合探针，因此需加入26-1=63个Taqman探针。 （2）据图可知，Sal I和Nhe I会破坏目的基因，MunI有两个酶切位点，因此选择限制酶EcoR I和Xho I切割图2中的Ti质粒，PCR的延伸方向为模板链的3'端到5'端，为了保证PeCPK7基因与Ti质粒的正确连接，PCR时需要在引物1的5'端添加EcoR I的识别序列，在引物4的5'端添加Xho I的识别序列，经DNA连接酶连接后导入添加了氨苄青霉素的培养基中培养的土壤农杆菌（土壤农杆菌为原核生物，潮霉素抗性基因不表达），然后使土壤农杆菌侵染拟南芥，将拟南芥细胞置于添加潮霉素的培养基上培养（拟南芥细胞为真核细胞，潮霉素抗性基因表达），最终培育出耐盐碱的拟南芥植株。 6.【答案】（1）抑癌 （2）AC AF （3）M基因的启动子序列 某种细胞核蛋白与探针P 与探针P结合的确实是E蛋白 （4）不能，此实验只能证明E蛋白抑制血管的生成，而不能证明是通过蛋白M抑制血管生成 【解析】（1）抑癌基因是一类存在于正常细胞内可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，根据题意，研究人员发现结肠癌患者血清中的M蛋白含量显著降低，说明癌细胞增殖与M蛋白含量降低有关，因此，M蛋白的作用可能是抑制细胞分裂，因此M基因可能是一种抑癌基因。 （2）根据题意：E蛋白通过与M基因启动子区域结合，促进M基因的表达，将相应质粒分别转入两组相同的细胞中，一段时间后收集细胞裂解液，检测荧光强度。结果显示甲组荧光强度明显高于乙组，因此转入甲组细胞的表达载体有含有组成型启动子和M基因，而转入乙组细胞的表达载体只含有突变型的M基因启动子，此外都要转入E基因和荧光素酶基因，因此转入甲组细胞的表达载体有AC，而转入乙组细胞的表达载体有AF。 （3）根据题意，EMSA实验可在体外验证DNA和蛋白质的相互作用，其原理是将蛋白质和用放射性同位素标记的DNA探针一同保温，电泳时探针和蛋白质相互作用形成的复合物比游离的探针移动的慢，处理后标记可显色，根据（2）中的结论，是E蛋白通过与M基因启动子区域结合，促进M基因的表达，因此探针P的碱基序列应与M基因启动子的序列相同。实验3与2组相比加了无标记的探针P，电泳结果中组3只有游离的有标记的探针P一个条带，说明细胞核蛋白提取物中的E蛋白全部与无标记的探针P结合，未能与有标记的探针P结合，因此没有出现相对分子质量更大的组2中的那个条带。实验4组中加入了无标记的突变探针P，实验3、4组无标记的探针不会出现显色条带，故设置组3和组4的作用是说明细胞核蛋白提取物中的某种细胞核蛋白与探针P的结合是具有特异性的，而5组加入了E蛋白的抗体，使E蛋白不能与M基因启动子结合，电泳图中没有出现组2中的上面条带，说明与探针P结合的确实是E蛋白。 （4）根据题意：接种数量相同的血管内皮细胞于某基底上后，一段时间后在显微镜下观察，经E蛋白处理的细胞形成小管的数量低于未经E蛋白处理的，该实验只能证明E蛋白抑制血管的生成,不能证实E蛋白通过M蛋白抑制血管生成，因为E蛋白的抑制作用是否通过蛋白M无法证明。 7.【答案】（1）不是 标记基因、复制原点 （2）多环芳烃-调控蛋白复合物 Ps（多环芳烃诱导型） （3）引物1和3 （4）B F 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因的转录mRNA，从图中可以看到，nahR和mrfp转录方向相反，所以转录的模板链不是DNA分子的同一条链。重组质粒除图中标出的结构外，还应具备复制原点（保证重组质粒能在宿主细胞中自我复制）、标记基因（便于筛选含有重组质粒的受体细胞，如抗生素抗性基因等）。 （2）由图可知，环境中存在多环芳烃时，会与nahR基因表达的调控蛋白结合，形成多环芳烃-调控蛋白复合物从而激活Ps启动子，mrfp基因表达，使菌体发出红色荧光。 （3）转录是从融合基因模板链3'→5'进行，因此baaA基因需要颠倒180°后再拼接到mrfp基因上，保证两者模板链在同一侧。PCR技术要求引物与模板链的3'端互补配对，且DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链，要判定baaA基因与mrfp基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合，引物1和引物3可以分别与融合基因中baaA基因的 3' 端和mrfp基因的 3' 端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3。 （3）Bc2基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在多环芳烃存在时工程菌正常生存，Bc2应插入在Ps启动子之后，即图中的F位点，这样在多环芳烃存在时，Ps启动子启动，Bc2基因表达抗毒素蛋白，Bc1基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当多环芳烃被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，Bc1应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B位点。 8.【答案】（1）DNA（启动子）是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向（3'端）开始 琼脂糖凝胶电泳 （2）可以不受限制酶切位点的限制；可以把目的基因插入到质粒上的任何位点；避免目的基因和质粒的反向连接和自身环化；可以把多个目的基因插入质粒上；避免限制酶切割位点对质粒功能区的破坏；操作简便，无缝连接效率高 d 互补 （3）空载体（或已知无启动子活性的载体） 组成型启动子 【解析】（1）因为DNA（启动子）是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向（3'端）开始，故利用PCR技术在体外扩增GbGAI4启动子时需要两种引物。扩增完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。 （2）①据题干信息和题图分析可知，双酶切法构建表达重组载体可以避免目的基因和载体分别发生自身环化以及目的基因与质粒的反向连接，提高连接的有效性；由于In-Fusion酶能够识别任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，据此实现目的基因和载体的连接，所以采用In—Fusion技术进行转基因重组载体的构建时，可以不受限制酶切位点的限制；可以把目的基因插入到质粒上的任何位点；避免目的基因和质粒的反向连接和自身环化；可以把多个目的基因插入质粒上；避免限制酶切割位点对质粒功能区的破坏；操作简便，无缝连接效率高；构建周期短。故与双酶切法构建植物融合表达重组载体比较，无缝克隆In-Fusion技术更具优势。 ②要实现线性载体、GbGAI4启动子序列、GUS基因这三种DNA分子的有序连接，需要在它们两端添加能够被In−Fusion酶识别的序列。据图2中GbGAI4启动子的的启动方向和GUS基因转录方向可知，进行In-Fusion反应时，GbGAI4启动子的右侧序列与GUS基因的右侧序列会连接在一起。已知引物1的5′端添加的序列与序列a相同，这意味着引物1扩增出的GbGAI4启动子序列的一端将带有与序列a相同的识别序列，从而可以与线性载体的一端连接。由于GUS基因需要连接到GbGAI4启动子序列的后面，因此引物3的5′端添加的序列必须与GbGAI4启动子序列连接后线性载体的另一端序列相同，即与序列d相同。这样，当GbGAI4启动子序列与线性载体连接后，GUS基因就可以通过其5′端的识别序列与线性载体的另一端连接，形成完整的融合表达重组载体。引物2用于扩增GbGAI4启动子序列的另一端，因此其3′端添加的序列需要与线性载体的序列d相同，以便与线性载体连接。而引物4用于扩增已经连接了GbGAI4启动子序列和GUS基因的DNA片段的。因此，引物4的3′端添加的序列需要与引物2扩增出的GbGAI4启动子序列末端的识别序列互补，以确保整个DNA片段的连贯性。 （3）在农杆菌的转化及GbGAI4启动子GUS活性的检测实验中，阳性对照组导入的是已知的组成型启动子与GUS的融合载体，这是为了验证实验体系的可靠性和准确性。阴性对照组则导入的是空载体（或已知无启动子活性的载体），这是为了排除非特异性反应的可能性。GUS活性检测结果显示，实验组与阳性对照组的根、茎、叶及胚性愈伤组织细胞、球形胚中均呈现蓝色，这说明这些细胞中存在GUS基因的表达。而阴性对照组不呈现蓝色，说明阴性对照组中的细胞没有GUS基因的表达。因此，该结果表明GbGAI4启动子能够在根、茎、叶及胚性愈伤组织细胞、球形胚中驱动基因表达，所以GbGAI4启动子属于组成型启动子。 1 学科网（北京）股份有限公司 $