第52讲 基因的基本操作程序①

第52讲 基因工程的基本操作程序 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建(核心) ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测和鉴定 重组DNA分子 基因工程的基本操作程序 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测和鉴定 00 重组DNA分子 ①目的基因的筛选与获取 目的基因的筛选与获取【P329】 01 ①目的基因： 在基因工程的设计和操作中， 用于改变 或获得 等的基因。 主要是指 的基因。 ▲实例：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 ②筛选方法： 从相关的 和 的基因中进行筛选是较为有效的方法。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 不一定；也可以是一些具有调控作用的因子。 目的基因一定是指编码 蛋白质的基因吗？ 思考 已知结构 功能清晰 （一）如何筛选合适的目的基因？ 目的基因的筛选与获取【P331】 01 方法①： 目的基因； 方法②：从 中获取目的基因； 方法③：利用 获取和扩增目的基因。 人工合成 基因文库 PCR （二）如何获取目的基因？ 目的基因的筛选与获取·①人工合成目的基因 01 1.逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。 它以目的基因的 为模板，借助 酶合成双链DNA， 2.化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其 ， 然后直接合成目的基因。(工具：DNA合成仪) mRNA 逆转录 基因序列 目的基因的筛选与获取·②从基因文库中获取目的基因 01 1.概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段, 导入到受体菌的群体中储存, 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 2.分类： 本质 将某种生物体内所有基因， 与载体连接后储存在 一个受体菌的群体中。 将生物的某个发育时期的mRNA逆转录产生的互补DNA(cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌的群体中。 特点 包括包括编码区.非编码区. 启动子.终止子等结构。 由于基因的选择性表达，cDNA文库只有一部分基因，且只有编码区,没有其他结构. 基因组文库 cDNA文库 注：基因文库中的相应基因，是储存在受体菌中的。 目的基因的筛选与获取·②从基因文库中获取目的基因 01 【思考】cDNA(互补DNA)的合成过程： ①逆转录酶以 为模板合成一条与RNA互补的 链， 形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的 链，使之变成单链DNA； ③以单链 为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的 链， 形成双链DNA分子，即cDNA。 mRNA DNA RNA DNA DNA 1.概念：PCR是 (全称)的缩写。 它是一项根据 的原理， 在 (操作环境)提供参与DNA复制的 与 ， 对 进行大量复制的技术(目的/优点)。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 目的基因的核苷酸序列 PCR扩增仪(PCR仪) 比较体内DNA复制和PCR 有什么相同点和不同点？ 思考 各种组分 反应条件 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 比较项目 体内DNA复制 PCR 相同点 都利用 的原理，利用 原则， 合成具有相同遗传信息的子代DNA分子。 不同点 场所 细胞核.拟核.叶绿体.线粒体等 次数 细胞分裂一次，DNA复制一次 模板 基因组DNA 原料 4种游离的脱氧核苷酸 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 引物 引物酶合成的RNA引物(2种) DNA半保留复制 碱基互补配对 PCR扩增仪(PCR仪) 一次PCR一般要经历30次循环 目的基因 dNTP① 耐高温的DNA聚合酶② 人工合成的DNA片段(2种) 注：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 补充说明：①dNTP 01 【资料】 dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写， N是指A、T、G、C四种含氮碱基， 包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 P P P ～ ～ N 脱氧核糖 A T G C 脱氧核苷酸 即可作原料，又可提供能量。 在PCR过程中实际加入的原料为dNTP，有什么优点？ 思考 补充说明：②耐高温的DNA聚合酶 01 【资料】 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活。 真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活。 因此，PCR反应缓冲液中一般还需要添加什么物质？ 思考 Mg2＋. 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 ① ： 当温度 时， 双链DNA 为单链。 ② ： 当温度下降到 时， 通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合。 ③ ： 当温度上升到 时， 溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下， 根据 原则合成 新的DNA链。 变性 超过90℃ 解聚 复性 50℃左右 两种引物 延伸 72℃左右 耐高温的DNA聚合酶 碱基互补配对 2.过程：在 中自动完成。 PCR仪 注：不需要解旋酶，高温断开氢键。 注:子链延伸方向都是 5’端→3’端。 第二轮循环的产物 第三轮循环的产物 第一轮循环的 . 作为第二轮反应的 ， 经过 、 . 和 三步产生 第二轮循环的产物。 产物 模板 变性 复性 延伸 第二轮循环的 . 作为第三轮反应的 ， 经过 、 . 和 三步产生 第三轮循环的产物。 产物 模板 变性 复性 延伸 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 3.PCR的结果： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板， 因而每一次循环后目的基因的量可以增加 倍。即成 形式扩增。 （约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 4.PCR产物的鉴定:常采用 来鉴定PCR的产物。 一 指数 2n 琼脂糖凝胶电泳 提示：由于DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。 所以，复制的DNA片段，其长度是由 决定的。 引物的位置 复制的DNA片段，其长度是有什么决定的？ 思考 目的基因的筛选与获取·③利用PCR获取和扩增目的基因 01 【素养提升①】引物的设计 01 1.设计引物的依据： 。 注：两种引物都结合在DNA模板链的 端； 脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。 2.使用的一对引物的序列 ， 因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。 3.要保证目的基因能与载体相连接， 要在两种引物的 端分别添加上 限制酶的酶切位点。 目的基因两端的核苷酸序列 不相同 5’ 3’ 3’ 【素养提升①】引物的设计【P330】 01 4.某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分析原因： 第1组不合理的原因： 。 第2组不合理的原因： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ’自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效 【小结】设计引物的要求： ①两种引物之间: ； ②每种引物内部: ； 不能在局部发生碱基互补配对 不能在局部发生碱基互补配对 只要引物是过量的，模板与引物配对结合的概率就特别高，就能保证复性时是引物和模板链配对结合。 【素养提升②】获得所需的目的基因 01 一 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 目的片段 第一轮 【思考】第几轮PCR循环结束时，可出现两条单链等长的目的片段？ 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 1.若两条引物均从DNA分子端部结合， 则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 【素养提升②】获得所需的目的基因 01 2.若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合， 则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 第一轮 第二轮 目的片段 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 二 5' 3' 5' 3' 5' 3' 目的片段 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 【素养提升②】获得所需的目的基因 01 3.若两条引物均从DNA分子中间部位结合时， 则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 第一轮 第二轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 目的片段 5' 3' 目的片段 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 第三轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 三 【素养提升③】PCR中的数量关系 01 设n为扩增循环的次数，即DNA复制次数。 1.DNA分子数： 。 2.含引物的DNA分子数： 。 3.含其中一种引物的DNA分子数： 。 4.同时含两种引物的DNA分子数： 。 5.消耗引物的数量： ①经过n轮循环，共消耗引物的数量： 。 ②第n轮循环，共消耗引物的数量： 。 第三轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 2n 2n 2n－1 2n－2 2n+1－2 2n 考向 结合PCR技术的相关计算，考查科学思维【P335】 01 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是（　　） A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个 B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个 C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因(⑤) D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 C 【解析】DNA分子数：2n， 等长DNA分子公式：2n-2n， 则第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)。 【实验】DNA片段的扩增及电泳鉴定 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C 目的要求： 1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳 鉴定PCR的产物。 23 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定【P339】 实验原理 实验一：DNA片段的扩增 1.利用 可以在体外(PCR仪)进行DNA片段的扩增。 2.PCR利用了DNA的 原理，通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合。 注:一次PCR一般要经历 次循环。每次循环包括 、 和 三步。 热变性 温度 30 PCR PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 变性 复性 延伸 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定【P339】 实验原理 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 1.电泳：DNA分子具有 的基团，在一定的pH下， 这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下， 这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动， 这个过程就是电泳。 2.鉴定：PCR的产物一般通过 来鉴定。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 等有关。 注：①凝胶浓度越大，迁移速度越 ； ②DNA的相对分子质量越大，迁移速度越 。 可解离 慢 慢 相反 一般情况下， DNA分子带负电，可以向正极移动。 凝胶的浓度 DNA分子的大小和构象 琼脂糖凝胶电泳 1.用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书， 在 中依次加入各组分。 2.待所有组分都加入后，盖严 的盖子。 将微量离心管放入 里，离心约 ，使反应液集中在管的 。 3.参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入 中进行反应。 加样 离心 反应 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验一：DNA片段的扩增 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min 微量移液器 微量离心管 离心机 10s 底部 提高反应速率 PCR仪 离心管 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验一：DNA片段的扩增 使DNA充分变性(断开氢键)，以利于引物更好地和模板结合。 注：可根据目的片段长度适当调整延伸时间。 预变性的目的是什么？ 思考 最后一次循环通常在72℃维持10分钟，目的是什么？ 思考 使子链充分延伸。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 4.根据待分离DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液。 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 稍冷却后，加入适量的 混匀。 5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的 梳子，以形成 。 6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子， 取出凝胶放入 内。 制备凝胶 融化 倒模 凝固 电泳缓冲液 0.8%～1.2% 核酸染料 加样孔 电泳槽 增加导电性；维持pH 溴化乙锭，简称EB 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 10.取出凝胶置于 下观察和照相。 7.将 加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶 为宜。 8.将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂) 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。 留一个加样孔加入 。 9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 V/cm。待 迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 电泳缓冲液 1mm 凝胶载样缓冲液 加样孔 指示分子大小的标准参照物（Marker） 1～5 指示剂前沿 进行电泳 加液 加样 电泳 观察鉴定 300nm 紫外灯 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 【名师解读】 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和 蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须 ，避免试剂的污染。 3.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 高压灭菌 更换 注意 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 结果 如图所示： 进行电泳鉴定的结果为 条条带，该片段大小约为 bp(碱基对)。 一 750 分布 成功扩增出DNA片段的判断依据是： 紫外灯下直接观察到DNA条带的 ① (代表扩增产物的类型); ② (代表扩增产物量的多少)。 粗细程度 DNA分子越小， 迁移速度越快。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 用PCR可以扩增mRNA吗？ 思考 mRNA不可以直接扩增， 需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 通过电泳条带能否确定扩增产物一定是所需的DNA片段？为什么 思考 不能确定；因为电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度， 不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现碱基序列。 考向 结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究【P338】 D 3.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉，后用同样的非特异性核酸酶处理，则得到长度随机的DNA片段。据此分析，下列有关叙述错误的是( ) A.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用 C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸和氨基酸 D.当DNA分子处于不同构象时，其在琼脂糖凝胶中的移动速率是一样的 电泳的实验原理，√； 不同处理，实验结果不同→染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用，√； 染色质←核小体←DNA和蛋白质←基本单位是脱氧核苷酸和氨基酸，√； 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，×； 考向 结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究【P338】 4.（2024·黑吉辽卷，7）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验， 下列叙述正确的是（　　） A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率，√； 凝胶载样缓冲液指示剂的作用是指示电泳进度，×； DNA片段越长，迁移速率越慢，×； 琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后， 才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，×； A Lavf58.12.100 $