题型13 基因工程（3大考向）（题型专练）（广东专用）2026高考生物二轮复习讲练测

题型13 基因工程 目录 第一部分 题型解码 高屋建瓴，掌握全局 第二部分 考向破译 微观解剖，精细教学 考向解读 方法透视 典例引领 变式演练 考向01 基因工程的基本工具 考向02 基因工程的基本操作程序 考向03 基因工程和蛋白质工程的应用 第三部分 新题演练 整合应用，模拟实战 高考真题（三年考情2023-2025） 命题点 常见设问/关键词 2025：江苏卷、云南卷、山东卷 2024：湖南卷、安徽卷、山东卷 2023：福建卷、重庆卷、湖北卷、广东卷、山西卷 基因工程的基本工具 DNA重组技术工具、DNA粗提取与鉴定；PCR扩增（原理+过程）、目的基因（获取+导入受体细胞）、基因表达载体构建、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定；蛋白质工程（原理+流程）、基因工程在农牧业/制药/环境的应用、基因诊断与基因治疗 2025：全国卷、广东卷、安徽卷、河北卷、河南卷、黑吉辽蒙卷、河北卷 2024：江西卷、浙江卷、山东卷、广东卷、吉林卷、湖南卷、天津卷、福建卷、重庆卷、贵州卷、北京卷、全国甲卷、新课标卷 2023：辽宁卷、广东卷、浙江卷、河北卷、江苏卷、山东卷 基因工程的基本操作程序 2025：全国卷、云南卷、广东卷、重庆卷、浙江卷 2024：天津卷、河北卷、上海卷 2023：天津卷、广东卷、北京卷 基因工程和蛋白质工程的应用 关键技巧 1. 工具区分：用“作用对象”区分工具（限制酶切割DNA、DNA连接酶连接 DNA片段、载体需含标记基因）； 2. 操作流程：按“目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定”梳理步骤，重点掌握“表达载体需含启动子、终止子、标记基因”； 3. PCR 技术：记住“变性（90℃）→退火（50℃）→延伸（72℃）”的温度与过程。 思维误区 1. 工具类：混淆“E・coli DNA 连接酶”与“T4 DNA 连接酶”（前者仅连黏性末端，后者可连平末端）； 2. 操作类：误将“启动子”视为“起始密码子”（启动子是DNA序列，调控转录；起始密码子是mRNA序列，调控翻译）； 3. 蛋白质工程：误认为“蛋白质工程是直接改造蛋白质”（实际是通过改造基因来改造蛋白质）； 4. 检测类：忽略目的基因的检测有三类（DNA水平、mRNA水平、蛋白质水平）。 考向01 基因工程的基本工具 核心命题点： 1. DNA重组技术工具（限制酶、DNA连接酶、载体）的作用； 2. DNA粗提取与鉴定的原理及操作（DNA与蛋白质的溶解性差异）。 命题规律： 题型：选择题、非选择题均有涉及。 形式：常结合“工具作用示意图”“实验操作步骤”命题，侧重工具的功能辨析与实验原理应用。 1. 提炼升华： （1）DNA的粗提取与鉴定： ①原理：利用 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取 DNA 并去除其他成分。 ②性质：DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA 能溶于 2 (mol・L⁻¹) 的 NaCl 溶液。 ③鉴定：在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 ④步骤：研磨→过滤（取上清液）→加入体积相等的、预冷的体积分数为 95% 的酒精，静置 2~3 min→搅拌（或离心）→取白色丝状物（或沉淀物）→溶解→鉴定 DNA。 2. 可视呈现： 基因工程的基本工具： 工具类型 核心要点 限制性内切核酸酶 作用：识别双链DNA特定核苷酸序列，切开特定部位的磷酸二酯键 结果：产生黏性末端或平末端 DNA连接酶 作用：缝合双链DNA片段，恢复磷酸二酯键 种类： ①E.coli DNA连接酶：连接黏性末端 ②T4 DNA连接酶：连接黏性末端+平末端 载体 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 必备条件：能自我复制；有1~多个限制酶切割位点；有特殊标记基因；对受体细胞无毒害 注意：①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同； ②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 1.（2023·广东·高考真题·T11）（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 1.某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 2.冬瓜果面有蜡粉可提高果实抗病、耐日灼和耐储性。为探究冬瓜果面蜡粉的遗传方式并对蜡粉基因（用“A”“a”表示）进行定位，科研人员进行了一系列杂交实验，结果如表。 群体 植株总数/株 果面有蜡粉株数/株 果面无蜡粉株数/株 P1 30 30 0 P2 30 0 30 F1 523 523 0 F2 574 430 144 注：F1为P1和P2杂交后代，F2为F1自交后代。 回答下列问题： (1)根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的 定律，依据是 。 (2)实验证明蜡粉性状的改变是由基因突变引起的，突变基因上出现了一个限制酶H的切割位点，可用于在苗期筛选出果实表面有蜡粉的植株，据此设计引物后进行植株基因型鉴定的步骤为：提取基因组DNA→ 目的DNA片段→限制酶H切割扩增产物→电泳。结果显示P1植株为1条条带，P2植株为2条条带，则F2中有蜡粉的植株为 条条带，限制酶H的切割位点位于 （填“A”“a”或“A和a”）上。 (3)用表中材料设计实验，验证（1）中得到的结论，写出所选材料及遗传图解。 考向02 基因工程的基本操作程序 核心命题点： 1. PCR扩增的原理与过程“变性→退火→延伸”三步骤及温度控制； 2. 基因工程四个操作步骤。 命题规律： 题型：选择题、非选择题均有涉及。 形式：常结合“操作流程示意图”“PCR扩增曲线”命题，侧重流程步骤与技术原理的结合。 1. 提炼升华： 基因工程的四个操作步骤： ①目的基因的筛选与获取：通过构建基因文库来获取；利用 PCR 获取和扩增目的基因。 ②基因表达载体的构建（核心步骤）：启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点 ·启动子、终止子：启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。 终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 ·目的基因插入位置：启动子与终止子之间。 ·利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。 ③将目的基因导入受体细胞： ·植物细胞： 常用方法：农杆菌转化法、花粉管通道法 受体细胞：受精卵、体细胞 ·动物细胞： 常用方法：显微注射技术 受体细胞：受精卵 ·微生物细胞： 常用方法：Ca²⁺处理法（感受态细胞法） 受体细胞：原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌） 注意：辨析农杆菌转化法中的“两个两次” ①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。 ②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T­DNA导入受体细胞。 ④目的基因的检测与鉴定： 基因工程中目的基因的检测与鉴定分为两个水平： ·分子水平 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上：方法（技术）为PCR等； 检测目的基因是否转录出mRNA：方法（技术）为PCR等； 检测目的基因是否翻译出蛋白质：方法为抗原-抗体杂交。 ·个体水平方法：抗虫或抗病接种实验等。 2. 可视呈现 PCR技术及应用： ①原理： PCR技术相关内容 具体说明 含义 聚合酶链式反应的缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术 原理 DNA半保留复制 条件 模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、缓冲液（含Mg²⁺）、耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 前提 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 扩增方向 DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸 引物 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 目的 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 （因DNA带负电荷，向正极方向移动）常采用琼脂糖凝胶电泳法 ②步骤： PCR步骤 温度条件 过程描述 变性 加热至90℃以上 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链（对应图示：双链DNA在高温下分离为3'—5'和5'—3'的两条单链） 复性 下降到50℃左右 温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合（对应图示：引物Ⅰ结合3'—5'单链，引物Ⅱ结合5'—3'单链） 延伸 上升到72℃左右 当温度上升到72℃左右时，Taq DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（从5'端向3'端延伸，对应图示：以引物为起点合成新的DNA互补链） 1.（2025·广东·高考真题·T7）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（    ） A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团 1.琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 2.γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ） A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 考向03 基因工程和蛋白质工程的应用 核心命题点： 1. 基因工程在农牧业、制药、环境领域的应用（如抗虫棉、胰岛素生产）； 2. 蛋白质工程的原理与流程（蛋白质工程的“从蛋白质功能逆推基因序列”的改造逻辑）； 3. 基因诊断与基因治疗的技术逻辑。 命题规律： 题型：选择题为主。 形式：常结合“应用实例”“技术流程”命题，侧重技术应用的实际价值与伦理考量。 1. 提炼升华： （1）蛋白质工程： ①操作手段：基因改造或基因合成 ②结果：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 ③设计流程： 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 （2）应用分析思路： 结合领域（如农牧业→抗逆作物），对应基因工程的核心操作（导入抗逆基因） 2. 可视呈现： 应用领域 技术实例 核心原理 农牧业 抗虫棉 导入Bt毒蛋白基因 制药 重组胰岛素 大肠杆菌表达人胰岛素基因 基因治疗 腺苷脱氨酶缺乏症治疗 导入正常腺苷脱氨酶基因 1.（2023·广东·高考真题·T2）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA分子）通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。下列叙述错误的是（    ） A．p53基因突变可能引起细胞癌变 B．p53蛋白能够调控细胞的生长和增殖 C．circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢 D．circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究 1.蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（    ） A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 1.（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 2.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 3.（2023·福建·高考真题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是（    ） A．实验I中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B．实验I中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA 4.（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 5.（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 6.（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 7.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 8.（多选·2025·河北·高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 9.（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 10.（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 11.（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ） A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 12.（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 13.（2024·天津·高考真题）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物生产等历程。有关叙述错误的是（    ） A．动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞 B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C．用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子 D．利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物 14.（2023·天津·高考真题）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体 才能获得后代。下图列举了几项技术成果。 下列叙述正确的是 （    ） A．经胚胎移植产生的后代与受体均保持一致 B．①需获得MII期的去核卵母细胞 C．②能大幅改良动物性状 D．③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良 15.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 16.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 17.（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 18.（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 19.（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 20.（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。 21.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 22.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 (1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ① ； ②将 分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。 (2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。 (3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是 。 1 学科网（北京）股份有限公司 $ 题型13 基因工程 目录 第一部分 题型解码 高屋建瓴，掌握全局 第二部分 考向破译 微观解剖，精细教学 考向解读 方法透视 典例引领 变式演练 考向01 基因工程的基本工具 考向02 基因工程的基本操作程序 考向03 基因工程和蛋白质工程的应用 第三部分 新题演练 整合应用，模拟实战 高考真题（三年考情2023-2025） 命题点 常见设问/关键词 2025：江苏卷、云南卷、山东卷 2024：湖南卷、安徽卷、山东卷 2023：福建卷、重庆卷、湖北卷、广东卷、山西卷 基因工程的基本工具 DNA重组技术工具、DNA粗提取与鉴定；PCR扩增（原理+过程）、目的基因（获取+导入受体细胞）、基因表达载体构建、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定；蛋白质工程（原理+流程）、基因工程在农牧业/制药/环境的应用、基因诊断与基因治疗 2025：全国卷、广东卷、安徽卷、河北卷、河南卷、黑吉辽蒙卷、河北卷 2024：江西卷、浙江卷、山东卷、广东卷、吉林卷、湖南卷、天津卷、福建卷、重庆卷、贵州卷、北京卷、全国甲卷、新课标卷 2023：辽宁卷、广东卷、浙江卷、河北卷、江苏卷、山东卷 基因工程的基本操作程序 2025：全国卷、云南卷、广东卷、重庆卷、浙江卷 2024：天津卷、河北卷、上海卷 2023：天津卷、广东卷、北京卷 基因工程和蛋白质工程的应用 关键技巧 1. 工具区分：用“作用对象”区分工具（限制酶切割DNA、DNA连接酶连接 DNA片段、载体需含标记基因）； 2. 操作流程：按“目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定”梳理步骤，重点掌握“表达载体需含启动子、终止子、标记基因”； 3. PCR 技术：记住“变性（90℃）→退火（50℃）→延伸（72℃）”的温度与过程。 思维误区 1. 工具类：混淆“E・coli DNA 连接酶”与“T4 DNA 连接酶”（前者仅连黏性末端，后者可连平末端）； 2. 操作类：误将“启动子”视为“起始密码子”（启动子是DNA序列，调控转录；起始密码子是mRNA序列，调控翻译）； 3. 蛋白质工程：误认为“蛋白质工程是直接改造蛋白质”（实际是通过改造基因来改造蛋白质）； 4. 检测类：忽略目的基因的检测有三类（DNA水平、mRNA水平、蛋白质水平）。 考向01 基因工程的基本工具 核心命题点： 1. DNA重组技术工具（限制酶、DNA连接酶、载体）的作用； 2. DNA粗提取与鉴定的原理及操作（DNA与蛋白质的溶解性差异）。 命题规律： 题型：选择题、非选择题均有涉及。 形式：常结合“工具作用示意图”“实验操作步骤”命题，侧重工具的功能辨析与实验原理应用。 1. 提炼升华： （1）DNA的粗提取与鉴定： ①原理：利用 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取 DNA 并去除其他成分。 ②性质：DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA 能溶于 2 (mol・L⁻¹) 的 NaCl 溶液。 ③鉴定：在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 ④步骤：研磨→过滤（取上清液）→加入体积相等的、预冷的体积分数为 95% 的酒精，静置 2~3 min→搅拌（或离心）→取白色丝状物（或沉淀物）→溶解→鉴定 DNA。 2. 可视呈现： 基因工程的基本工具： 工具类型 核心要点 限制性内切核酸酶 作用：识别双链DNA特定核苷酸序列，切开特定部位的磷酸二酯键 结果：产生黏性末端或平末端 DNA连接酶 作用：缝合双链DNA片段，恢复磷酸二酯键 种类： ①E.coli DNA连接酶：连接黏性末端 ②T4 DNA连接酶：连接黏性末端+平末端 载体 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 必备条件：能自我复制；有1~多个限制酶切割位点；有特殊标记基因；对受体细胞无毒害 注意：①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同； ②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 1.（2023·广东·高考真题·T11）（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 1.【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确； B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确； C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确； D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 故选D。 1.某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 1.【答案】B 【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。 【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 故选B。 2.冬瓜果面有蜡粉可提高果实抗病、耐日灼和耐储性。为探究冬瓜果面蜡粉的遗传方式并对蜡粉基因（用“A”“a”表示）进行定位，科研人员进行了一系列杂交实验，结果如表。 群体 植株总数/株 果面有蜡粉株数/株 果面无蜡粉株数/株 P1 30 30 0 P2 30 0 30 F1 523 523 0 F2 574 430 144 注：F1为P1和P2杂交后代，F2为F1自交后代。 回答下列问题： (1)根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的 定律，依据是 。 (2)实验证明蜡粉性状的改变是由基因突变引起的，突变基因上出现了一个限制酶H的切割位点，可用于在苗期筛选出果实表面有蜡粉的植株，据此设计引物后进行植株基因型鉴定的步骤为：提取基因组DNA→ 目的DNA片段→限制酶H切割扩增产物→电泳。结果显示P1植株为1条条带，P2植株为2条条带，则F2中有蜡粉的植株为 条条带，限制酶H的切割位点位于 （填“A”“a”或“A和a”）上。 (3)用表中材料设计实验，验证（1）中得到的结论，写出所选材料及遗传图解。 2.【答案】(1) 分离 F2中出现3:1的性状分离比，符合一对等位基因的遗传规律 (2) PCR扩增 1或3 a (3)选用材料：F1植株和P2植株 遗传图解 【分析】基因分离定律：在生物的体细胞中，控制同一性状的遗传因子成对存在，不相融合；在形成配子时，成对的遗传因子发生分离，分离后的遗传因子分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代。 【详解】（1）根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的分离定律，因为F1自交得到的F2中，果面有蜡粉株数与果面无蜡粉株数之比约为3：1（430：144≈3：1），符合基因分离定律中杂合子自交后代性状分离比3：1的比值。 （2）要进行植株基因型鉴定，在提取基因组DNA后，需要通过PCR扩增目的DNA片段。P1植株为1条条带，P2植株为2条条带，说明P1为纯合子且其基因不能被限制酶H切割（假设P1基因型为AA），P2为纯合子且其基因能被限制酶H切割（假设P2基因型为aa），限制酶H的切割位点位于a上。F1基因型为Aa，F2中有蜡粉的植株基因型为AA或Aa。AA只有1条条带（不能被切割），Aa会有3条条带（A不能被切割为1条，a被切割为2条），所以F2中有蜡粉的植株为1条或3条条带。 （3）验证分离定律，采用测交的方法，所选材料：F1Aa与P2aa（测交实验可以验证基因的分离定律）。 考向02 基因工程的基本操作程序 核心命题点： 1. PCR扩增的原理与过程“变性→退火→延伸”三步骤及温度控制； 2. 基因工程四个操作步骤。 命题规律： 题型：选择题、非选择题均有涉及。 形式：常结合“操作流程示意图”“PCR扩增曲线”命题，侧重流程步骤与技术原理的结合。 1. 提炼升华： 基因工程的四个操作步骤： ①目的基因的筛选与获取：通过构建基因文库来获取；利用 PCR 获取和扩增目的基因。 ②基因表达载体的构建（核心步骤）：启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点 ·启动子、终止子：启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。 终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 ·目的基因插入位置：启动子与终止子之间。 ·利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。 ③将目的基因导入受体细胞： ·植物细胞： 常用方法：农杆菌转化法、花粉管通道法 受体细胞：受精卵、体细胞 ·动物细胞： 常用方法：显微注射技术 受体细胞：受精卵 ·微生物细胞： 常用方法：Ca²⁺处理法（感受态细胞法） 受体细胞：原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌） 注意：辨析农杆菌转化法中的“两个两次” ①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。 ②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T­DNA导入受体细胞。 ④目的基因的检测与鉴定： 基因工程中目的基因的检测与鉴定分为两个水平： ·分子水平 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上：方法（技术）为PCR等； 检测目的基因是否转录出mRNA：方法（技术）为PCR等； 检测目的基因是否翻译出蛋白质：方法为抗原-抗体杂交。 ·个体水平方法：抗虫或抗病接种实验等。 2. 可视呈现 PCR技术及应用： ①原理： PCR技术相关内容 具体说明 含义 聚合酶链式反应的缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术 原理 DNA半保留复制 条件 模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、缓冲液（含Mg²⁺）、耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 前提 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 扩增方向 DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸 引物 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 目的 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 （因DNA带负电荷，向正极方向移动）常采用琼脂糖凝胶电泳法 ②步骤： PCR步骤 温度条件 过程描述 变性 加热至90℃以上 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链（对应图示：双链DNA在高温下分离为3'—5'和5'—3'的两条单链） 复性 下降到50℃左右 温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合（对应图示：引物Ⅰ结合3'—5'单链，引物Ⅱ结合5'—3'单链） 延伸 上升到72℃左右 当温度上升到72℃左右时，Taq DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（从5'端向3'端延伸，对应图示：以引物为起点合成新的DNA互补链） 1.（2025·广东·高考真题·T7）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（    ） A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团 【答案】C 【分析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。 【详解】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。 故选C。 1.琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 1.【答案】D 【分析】限制酶酶切其基本原理是利用限制酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确； B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确； C、电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确； D、甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。 故选D。 2.γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ） A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 2.【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法； （4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】 A、上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确。 B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误； C、E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误； D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用其他酶代替，D错误。 故选A。 考向03 基因工程和蛋白质工程的应用 核心命题点： 1. 基因工程在农牧业、制药、环境领域的应用（如抗虫棉、胰岛素生产）； 2. 蛋白质工程的原理与流程（蛋白质工程的“从蛋白质功能逆推基因序列”的改造逻辑）； 3. 基因诊断与基因治疗的技术逻辑。 命题规律： 题型：选择题为主。 形式：常结合“应用实例”“技术流程”命题，侧重技术应用的实际价值与伦理考量。 1. 提炼升华： （1）蛋白质工程： ①操作手段：基因改造或基因合成 ②结果：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 ③设计流程： 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 （2）应用分析思路： 结合领域（如农牧业→抗逆作物），对应基因工程的核心操作（导入抗逆基因） 2. 可视呈现： 应用领域 技术实例 核心原理 农牧业 抗虫棉 导入Bt毒蛋白基因 制药 重组胰岛素 大肠杆菌表达人胰岛素基因 基因治疗 腺苷脱氨酶缺乏症治疗 导入正常腺苷脱氨酶基因 1.（2023·广东·高考真题·T2）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA分子）通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。下列叙述错误的是（    ） A．p53基因突变可能引起细胞癌变 B．p53蛋白能够调控细胞的生长和增殖 C．circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢 D．circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究 1.【答案】C 【分析】人和动物细胞中的DNA上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。 【详解】A、p53基因是抑癌基因，这类基因突变可能引起细胞癌变，A正确； B、p53基因是抑癌基因，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或促进细胞凋亡，B正确； C、依据题意，circDNMT1通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，则circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变快，C错误； D、circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究，D正确。 故选C。 1.蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（    ） A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 1.【答案】A 【分析】蛋白质的空间结构易受外界条件影响，空间结构破坏可导致蛋白质失去生物活性，二硫键很容易被还原而断裂，断裂后可以再次氧化重新形成二硫键。 【详解】A、二硫键是连接不同半胱氨酸残基的化学键，属于蛋白质一级结构的一部分。若二硫键断裂，会破坏蛋白质的空间结构，导致其功能丧失，A错误； B、蛋白质的功能依赖其特定的空间结构，若空间结构改变（如高温、强酸强碱导致的变性），其功能通常也会受到影响，B正确； C、乙醇等有机溶剂可破坏蛋白质分子中的氢键，导致其空间结构改变而变性，C正确； D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或合成一种新的蛋白质，因此利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质，D正确。 故选A。 1.（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 1.【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 故选A。 2.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 2.【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 3.（2023·福建·高考真题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是（    ） A．实验I中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B．实验I中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA 3.【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、实验Ⅰ中，PCR实验所需的枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，A错误； B、实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，应先加样后接通电源，B错误； C、实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，由于DNA不溶于酒精溶液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA，C正确； D、实验Ⅱ中，将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用于鉴定DNA，D错误。 故选C。 4.（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 4.【答案】D 【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。 【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 故选D。 5.（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 5.【答案】B 【分析】E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A正确； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。 故选B。 6.（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 6.【答案】C 【分析】DNA连接酶： （1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。 （2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误； B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误； C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确； D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 故选C。 7.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 7.【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确； B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确； C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。 故选C。 8.（多选·2025·河北·高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 8.【答案】AB 【分析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。 【详解】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A错误； B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误； C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确； D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 故选AB。 9.（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 9.【答案】D 【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。 【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。 综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 故选D。 10.（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 10.【答案】A 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 11.（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ） A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 11.【答案】B 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。 【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 12.（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 12.【答案】B 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选B。 13.（2024·天津·高考真题）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物生产等历程。有关叙述错误的是（    ） A．动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞 B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C．用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子 D．利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物 13.【答案】C 【分析】胰岛素是由胰脏内的胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病。 【详解】A、胰岛素在动物体内由胰岛B细胞合成后，经过胞吐作用释放出细胞，A正确； B、胰岛素属于蛋白质激素，所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸，B正确； C、用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素不需要使用相同的启动子，因为两者属于不同的表达系统，大肠杆菌是原核生物表达系统，而乳腺生物反应器属于真核生物表达系统，启动子要求不同，C错误； D、利用蛋白质工程技术可以对胰岛素进行改造，生成具有不同作用特性的胰岛素类似物，包括速效胰岛素，D正确。 故选C。 14.（2023·天津·高考真题）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体 才能获得后代。下图列举了几项技术成果。 下列叙述正确的是 （    ） A．经胚胎移植产生的后代与受体均保持一致 B．①需获得MII期的去核卵母细胞 C．②能大幅改良动物性状 D．③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良 14.【答案】D 【分析】动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。 【详解】A、子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无关，A错误； B、核移植过程中需要处于MII中期的去核卵母细胞，而过程1是培育试管动物，需要培育到适宜时期（桑葚胚或囊胚等时期）进行胚胎移植，B错误； C、过程2得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C错误； D、过程2克隆技术可得到大量同种个体，为过程3提供了量产方式；过程3是转基因技术，转基因可导入外源优良基因，为过程1、2提供了改良性状的方式，D正确。 故选D。 15.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 15.【答案】(1)荧光 (2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。 16.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 16.【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序 抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 17.（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 17.【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 18.（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 18.【答案】(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 (2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ (3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 (4)排除PCR体系中外源DNA的污染 (5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 19.（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 19.【答案】(1) 磷酸二酯键 片段甲含有启动子和终止子 (2)A-T、U-A (3) 菌株B2的基因组DNA 无扩增产物 (4)实现废物利用，减少环境污染 【分析】信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对 RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A 利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆 产生废气少，分解后剩余的无机盐留在土壤中 实现废物利用，减少环境污染 【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子，保证N基因正常发表达。 （2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。 （3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组DNA；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3对应的模板序列未插入B1的基因组，实验结果是无扩增产物。 （4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是实现废物利用，减少环境污染。 20.（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。 20.【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 判断可遗传变异的来源 可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传 Sa是原核生物，没有染色体 简述基因表达载体构建过程 利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，质粒2上含有R基因上下游片段 筛选含质粒2的Sa菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2上有氯霉素抗性基因 筛选并获得不再含有质粒2的菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡 筛选R基因被敲除的Sa PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 21.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 21.【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 22.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 (1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ① ； ②将 分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。 (2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。 (3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是 。 22.【答案】(1) 克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因 目的基因与载体 氨基酸序列 (2)利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。 (3)树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择 【分析】基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析①为克隆树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白基因。②为将树鼩、其他哺乳动物TR1蛋白基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由(2)中展示的蛋白质之间的差异推测④为检测树鼩和其他哺乳动物TRI蛋白质的氨基酸序列。 （2）树鼩TRI蛋白第579位氨基酸为M，人和小鼠TR1蛋白第579位氨基酸为T，利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升高，则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TRI蛋白第579位氨基酸序列差异造成的。 （3）适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树嗣的食物来源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素类物质的植物。 1 学科网（北京）股份有限公司 $