3.2 基因工程的基本操作程序 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，以转基因抗虫棉培育为情境主线，系统呈现目的基因筛选与获取、表达载体构建、导入受体细胞及检测鉴定四步核心流程，通过问题链设计串联PCR原理、限制酶作用等关键知识点，辅以思考讨论与知识小结搭建学习支架。 其特色在于深度融合核心素养，以Bt基因功能分析强化结构与功能观（生命观念），通过PCR扩增机制推导培养逻辑推理能力（科学思维），设置DNA扩增及电泳鉴定实验提升动手技能（探究实践）。资料采用情境导入-问题驱动-实验验证-总结升华的教学逻辑，助力学生构建完整知识体系，也为教师提供兼具科学性与实用性的教学资源。

第2节 基因工程的基本操作程序 目录 CONTENTS 01 第一步：目的基因的筛选与获取 02 第二步：基因表达载体的构建 03 第三步：将目的基因导入受体细胞 04 第四步：目的基因的检测与鉴定 05 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 学习目标 专题内容 01 学习目标 1. 通过对基因工程流程的学习，建构起基因操作与性状表达的内在联系，形成结构与功能相统一的观念。 2. 通过分析PCR扩增原理、基因表达载体构建逻辑，概括基因工程的核心思路，提升逻辑推理能力。 3. 通过完成PCR扩增及电泳鉴定实验，掌握PCR操作与电泳鉴定的基本技能。 4. 通过了解转基因抗虫棉的培育与应用，认同基因工程的价值，树立科学评估生物技术风险的意识。 课堂导入 专题内容 01 课堂导入 20世纪90年代，我国棉花产业曾因棉铃虫肆虐遭受重创，常规农药难以有效防控，且易造成环境污染。1997年，我国自主培育的转基因抗虫棉成功推广，棉铃虫危害得到有效遏制。为何这种棉花能抗虫？它的培育需要经过哪些关键步骤？科学家又是如何精准获取并转移抗虫相关基因的？ 第一步：目的基因的筛选与获取 专题内容 01 情境展示 转基因抗虫棉可自主产生抗虫蛋白抵御棉铃虫侵害，减少农药使用量。培育该棉花需先筛选并获取苏云金杆菌中的Bt基因，再通过特定技术大量扩增该基因，最终完成转基因操作。 思考讨论 问题1 从基因功能与应用的角度分析，筛选培育转基因抗虫棉的目的基因时，需优先考量哪些核心要素？ 提示： 结合教材中Bt基因的筛选逻辑，从基因的功能明确性、产物作用特性、研究基础等角度推导。 参考答案： 需优先考量以下核心要素：第一，基因功能明确，能编码具有预期效应的产物，如Bt基因可编码破坏特定害虫消化系统的Bt抗虫蛋白；第二，基因产物的作用具有特异性，不会对非目标生物产生不利影响；第三，具备一定的研究基础，如已知基因序列信息、产物作用机制，可降低后续操作的技术难度。 问题2 根据DNA复制的原理，推测PCR技术能实现目的基因指数扩增的关键机制是什么？ 提示： 联系体内DNA半保留复制的特点，结合教材中PCR循环过程的描述进行分析。 参考答案： 关键机制为PCR的每一轮循环都会以上一轮循环合成的DNA产物作为新的模板，同时通过变性、复性、延伸三步的重复，使每一轮循环后目的基因的数量翻倍，最终实现 （ 为循环次数）的指数扩增。 观察PCR反应过程示意图，分析三轮循环后，产物中出现仅包含目的基因序列的DNA片段的原因是什么？ 图3-5 PCR反应过程示意图 提示： 结合图中每一轮循环的模板变化、引物结合位置的特异性进行推导。 参考答案： 第一轮循环以原始DNA为模板，合成的DNA片段包含目的基因序列及引物外侧的序列；第二轮循环以第一轮的产物为模板，引物结合位置仍为目的基因两端的互补序列，合成的DNA片段长度进一步向目的基因靠拢；第三轮循环时，以第二轮中合成的包含部分目的基因序列的DNA为模板，引物结合后进行延伸，最终得到仅包含目的基因序列的DNA片段，且该类片段的数量会随循环次数增加快速上升。 问题3 问题4 结合PCR技术的反应条件，分析该技术能否直接扩增mRNA，并说明理由。 提示： 对比PCR反应的模板要求与mRNA的分子结构，结合教材中PCR的核心原理进行判断。 参考答案： 不能直接扩增mRNA。PCR技术的原理是DNA的半保留复制，反应过程需要以DNA单链作为模板，而mRNA为核糖核酸，其分子组成与结构均与DNA不同，无法直接作为PCR的模板。若要基于mRNA获取目的基因，需先通过逆转录过程合成对应的cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 知识小结 （一）目的基因的筛选 1. 目的基因的定义： 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物的基因，主要指编码蛋白质的基因。 2. 筛选思路： 优先从结构与功能清晰的已知基因中筛选，可借助基因序列数据库、序列比对工具完成；筛选需满足功能匹配、研究基础充分等条件。 （二）PCR技术扩增目的基因 1. 核心原理： 基于DNA半保留复制的原理，在体外模拟DNA复制的条件，实现目的基因的指数扩增。 2. 反应条件： 需在缓冲液中进行，反应体系包含目的基因DNA模板、2种特异性引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，同时需精准控制温度完成循环过程。 3. 循环过程： 每轮循环分为三步 变性：温度升至90℃以上，双链DNA解聚为单链； 复性：温度降至50℃左右，引物与单链DNA的互补序列结合； 延伸：温度升至72℃左右，耐高温DNA聚合酶以单链为模板，将脱氧核苷酸添加到引物的3'端，合成新的DNA链。 4. 扩增特点： 每轮循环后目的基因数量翻倍，呈 （ 为循环次数）的指数形式增长。 第二步：基因表达载体的构建 专题内容 01 情境展示 转基因抗虫棉可通过自身合成的毒蛋白抵御棉铃虫危害，减少农药使用量。培育转基因抗虫棉需将 基因导入棉花细胞，而 基因需依托特定结构才能在棉花细胞中稳定遗传、正常表达，该特定结构为基因表达载体。 思考讨论 问题1 培育转基因抗虫棉时，为何需构建基因表达载体而非直接将 基因导入棉花细胞？ 提示： 从目的基因在受体细胞中的遗传稳定性、表达有效性角度分析。 参考答案： 直接导入的 基因无法在棉花细胞中稳定存在并遗传给下一代，且缺乏驱动其转录、终止转录的关键序列，无法正常表达发挥作用。基因表达载体可保证目的基因在受体细胞中稳定遗传、正常表达。 问题2 启动子和终止子在基因表达过程中分别发挥何种核心作用？二者的序列特征及位置有何共性？ 提示： 结合启动子与 聚合酶的关系、终止子的转录终止功能，以及教材中二者的位置、结构描述分析。 参考答案： 启动子是 聚合酶识别和结合的部位，可驱动目的基因转录出 ；终止子可使转录在特定位置停止。二者共性为均为具有特殊序列结构的 片段，分别位于基因的上游和下游。 问题3 构建抗虫棉基因表达载体时，为何需用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割载体和含目的基因的 片段？ 提示： 从 连接酶的作用前提、重组 分子的形成逻辑分析。 参考答案： 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶可切割出互补的黏性末端或相同的平末端，保证目的基因与载体的末端能够互补配对，便于 连接酶将二者拼接，形成重组 分子。 分析基因表达载体构建的完整流程，结合图示明确各环节的核心操作。 图3-6 基因表达载体构建模式图 提示： 按照切割载体、切割目的基因片段、拼接重组的顺序梳理流程。 参考答案： 第一步，用限制酶切割载体，使其产生切口；第二步，用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含 基因的 片段；第三步，利用 连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，形成重组 分子。 问题4 知识小结 （一）基因表达载体构建的地位与作用 1. 地位：培育转基因抗虫棉的核心工作。 2. 作用：保证目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 （二）基因表达载体的组成及各组分功能 1. 目的基因： 编码人类所需蛋白质的基因，如抗虫棉培育中的 基因。 2. 标记基因： 用于筛选含重组 分子的受体细胞。 3. 启动子： 位于基因上游，为具有特殊序列的 片段，是 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出 ；可构建诱导型启动子，通过诱导物调控目的基因的表达。 4. 终止子： 位于基因下游，为具有特殊序列的 片段，使转录在特定位置终止。 （三）基因表达载体的构建流程 1. 用限制酶切割载体，使其产生切口。 2. 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的 片段。 3. 利用 连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，形成重组 分子。 图3-6 基因表达载体构建模式图 （四）基因表达载体构建模式图 第三步：将目的基因导入受体细胞 专题内容 01 情境展示 我国科学家利用独创的花粉管通道法将 基因导入棉花细胞，培育出了抗虫棉；科研人员还借助农杆菌转化法将目的基因整合到植物细胞的染色体 上，成功培育出转基因水稻、玉米等作物。这些转基因作物的培育离不开目的基因向受体细胞的导入，不同导入方法的原理和应用场景各有不同。 思考讨论 问题1 花粉管通道法和农杆菌转化法都能实现目的基因向植物细胞的导入，从作用途径分析两种方法的核心区别是什么？ 提示： 结合教材中两种方法的操作原理，分析目的基因进入细胞的依赖途径差异。 参考答案： 花粉管通道法借助植物受粉后形成的花粉管通道，让目的基因直接进入胚囊内的细胞；农杆菌转化法则依赖农杆菌侵染植物细胞的特性，将携带目的基因的 质粒 - 转移并整合到植物细胞的染色体 上。 问题2 农杆菌原本只对多数双子叶植物有侵染能力，现在却能成功转化水稻、玉米等单子叶植物，这一突破体现了生物技术发展的什么特点？ 提示： 结合教材中农杆菌转化法的拓展应用，思考生物技术对生物固有特性的利用与改造。 参考答案： 体现了生物技术可以通过对生物特性的深入研究，突破生物固有生理限制，拓展技术的应用范围，实现对不同类群生物的基因操作。 问题3 若要将目的基因导入某双子叶植物细胞，优先选择农杆菌转化法的主要依据是什么？ 提示： 从农杆菌的侵染特性和转化后目的基因的存在状态分析。 参考答案： 农杆菌能自然侵染双子叶植物，且可将携带目的基因的 - 整合到植物细胞的染色体 上，使目的基因能在受体细胞中稳定遗传和表达，转化效率较高。 问题4 结合农杆菌转化法的操作流程，推测转化完成后需要进行筛选、鉴定的原因是什么？ 提示： 从农杆菌侵染的随机性和目的基因表达的不确定性角度分析。 参考答案： 农杆菌对植物细胞的侵染并非100%成功，部分细胞未整合目的基因；即使目的基因进入细胞，也可能无法稳定表达。因此需要通过筛选、鉴定，从大量细胞或个体中筛选出成功导入并能稳定表达目的基因的受体细胞或植株。 知识小结 （一）目的基因导入受体细胞的核心意义 构建好的基因表达载体需通过特定方式进入受体细胞，才能实现目的基因的稳定存在和表达，这是转基因技术的关键步骤之一。 1. 花粉管通道法 操作原理：借助植物受粉后形成的花粉管通道，将含目的基因的 溶液导入胚囊，使目的基因进入植物细胞。 操作方式：可通过微量注射器将 溶液注入子房，或在受粉后剪去柱头，将 溶液滴加在花柱切面上。 2. 农杆菌转化法 农杆菌的特性：能自然侵染多数双子叶植物和裸子植物，细胞内的 质粒含可转移的 - ，侵染植物细胞后可将 - 整合到受体细胞的染色体 上。 操作原理：将目的基因插入 质粒的 - 片段中，通过农杆菌的侵染作用，使目的基因进入植物细胞并整合到染色体 上。 转化操作：根据受体植物不同，可采用叶片小片与农杆菌共培养、花序浸没在农杆菌溶液中等方式。 技术拓展：目前该方法已成功应用于水稻、玉米等部分单子叶植物的基因转化。 （二）植物细胞常用的目的基因导入方法 （三）转化的概念 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 第四步：目的基因的检测与鉴定 专题内容 01 情境展示 转基因抗虫棉是基因工程应用的典型成果，培育完成后需通过一系列检测确定其是否具备抗虫特性。类似的，利用基因工程培育抗病害动物、生产药用蛋白等过程中，也都需要对目的基因的导入和表达情况进行检测，以此判断转基因操作是否成功。 思考讨论 问题1 为什么目的基因导入受体细胞后，必须进行检测与鉴定才能确定转基因操作成功？ 提示： 结合目的基因在受体细胞中的可能状态分析，思考导入过程是否存在不确定性。 参考答案： 目的基因导入受体细胞后，可能无法稳定整合到受体细胞的基因组中，或无法正常完成转录、翻译过程，只有通过检测与鉴定，才能确认目的基因是否稳定维持并表达其遗传特性，以此判断转基因操作是否达到预期目标。 问题2 分子水平的三项检测技术，分别从哪个层面验证目的基因的表达情况？ 提示： 结合教材中分子水平检测的具体内容，梳理不同检测技术对应的遗传信息传递环节。 参考答案： 检测受体细胞染色体 上是否插入目的基因，是从基因存在的层面进行验证；检测目的基因是否转录出 ，是从遗传信息转录的层面进行验证；通过抗原-抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质，是从遗传信息翻译的层面进行验证。 问题3 个体生物学水平鉴定与分子水平检测相比，有怎样的独特作用？ 提示： 对比两种检测水平的对象和结果，思考个体水平鉴定的实际应用价值。 参考答案： 分子水平检测仅能验证目的基因是否存在及完成转录、翻译，个体生物学水平鉴定可以直接检测目的基因表达产物是否使受体生物获得预期的性状及性状的表现程度，是对转基因成果的最终功能性验证。 将目的基因导入不同类型的受体细胞，方法为何存在差异？ 提示： 结合动植物、微生物细胞的结构和生理特性分析，参考教材中不同导入方法的描述。 图3-8 研究人员正在进行显微注射操作 参考答案： 不同受体细胞的结构、生理特性不同，如动物受精卵体积较大，适合显微注射法；植物细胞有细胞壁，需采用农杆菌转化法等；微生物细胞（如大肠杆菌）需经 处理提升通透性，因此针对不同受体细胞需采用适配的导入方法，以保证目的基因能成功进入细胞。 问题4 知识小结 （一）目的基因检测与鉴定的必要性 目的基因进入受体细胞后，无法直接确定其是否稳定维持和表达遗传特性，检测与鉴定是判断转基因操作是否成功的核心步骤。 （二）检测与鉴定的两个水平 1. 分子水平检测 检测目的基因的整合：通过 等技术，检测受体细胞染色体 上是否插入目的基因； 检测目的基因的转录：检测受体细胞中是否存在目的基因转录形成的 ； 检测目的基因的翻译：从受体细胞中提取蛋白质，通过抗原-抗体杂交技术，检测是否存在目的基因表达的蛋白质。 2. 个体生物学水平鉴定 通过观察或实验检测转基因生物是否表现出预期的性状，以此验证目的基因的功能表达。 图3-7 基因工程的基本操作流程 1. 获取载体与目的基因：获取质粒、噬菌体等载体，筛选并获取目标目的基因； 2. 构建基因表达载体：用限制酶切割载体和含目的基因的 片段，再用 连接酶连接，形成重组表达载体； 3. 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞的类型（植物、动物、微生物）选择适配的导入方法； 4. 目的基因的检测与鉴定：从分子和个体水平检测目的基因的整合、转录、翻译情况及性状表达。 （三）基因工程的基本操作程序 （四）不同受体细胞的目的基因导入特点 1. 动物受体细胞：常用受精卵作为受体细胞，最常用的导入方法为显微注射法； 2. 微生物受体细胞：常用大肠杆菌作为受体细胞，需先用 处理细胞，提升其吸收 分子的能力，再导入重组表达载体。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 专题内容 01 实验目的 1. 了解PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定的基本原理。 2. 掌握PCR的基本操作技术，并能用电泳鉴定PCR扩增产物。 实验器材 1. 器具：PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（含电泳仪、电泳槽）、离心机、沸水浴装置/微波炉、紫外灯。 2. 试剂：4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、 DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料。 图1 总容积为0.2mL（左）和0.5mL（右）的微量离心管 图2 微量移液器 图3 琼脂糖凝胶电泳装置 实验准备 一、PCR反应体系配制与扩增 1. 加样操作：用微量移液器按照配方，在微量离心管中依次加入无菌水、扩增缓冲液、4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、模板DNA、 DNA聚合酶，确保各组分添加量准确。 图4 PCR加样操作 2. 离心集液：盖严离心管盖子，将微量离心管放入离心机中离心约10s，使反应液集中在管底。 3. PCR程序设置与反应：参照参数设置PCR仪的循环程序（预变性95℃、5min；变性95℃、30s，退火温度视引物设定、30s，延伸72℃、1min，循环30次；终延伸72℃、10min），将装有反应液的离心管放入PCR仪中启动反应。 实验步骤演示 1. 琼脂糖凝胶配制：根据待分离DNA片段大小，用电泳缓冲液配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，加热至琼脂糖完全熔化，稍冷却后加入适量核酸染料。 2. 凝胶制备：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，插入梳子形成加样孔，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽。 3. 加样操作：向电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过凝胶1mm；将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，留一个加样孔加入DNA分子大小标准参照物。 图5 向凝胶加样孔内加样的操作 4. 电泳与观察：接通电源，按1～5 V/cm（电泳槽两极间距）设定电压，待指示剂前沿接近凝胶边缘时停止电泳；取出凝胶置于紫外灯下观察结果。 图6 观察电泳鉴定结果 二、琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验现象记录与讨论 实验现象 1. PCR反应后：微量离心管内无明显肉眼可见变化。 2. 电泳后紫外灯观察：凝胶上出现数量不等的亮带，标准参照物呈现出已知大小的条带梯度。 问题链 1. 判断DNA片段是否成功扩增的依据是什么？ 2. 电泳鉴定中出现多条带的可能原因有哪些？ 3. 为什么PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水需要高压灭菌？ 4. 凝胶中DNA分子的迁移速率受哪些因素影响？ 参考答案 1. 若在紫外灯下观察到与预期大小相符的DNA条带，说明DNA片段成功扩增。 2. 出现多条带的可能原因包括：引物设计不合理导致非特异性扩增、PCR循环次数过多产生引物二聚体、模板DNA存在杂质等。 3. 高压灭菌可避免外源DNA污染，防止外源DNA干扰实验结果，保证PCR扩增的特异性。 4. 凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶浓度越高、DNA分子越大，迁移速率越慢。 实验结果分析 1. PCR扩增有效性分析：若紫外灯下出现对应大小的亮带，说明模板DNA在 DNA聚合酶、引物等组分的作用下，通过变性-退火-延伸的循环过程完成了片段扩增；若无条带，可能是引物设计错误、酶失活或加样量不足导致。 2. 电泳条带异常分析：出现多条非目标条带时，需从引物特异性、模板纯度、PCR程序参数等方面排查原因；条带模糊可能是凝胶浓度不当、电压过高或染色不充分导致。 知识总结 1. PCR技术原理与操作：PCR利用DNA热变性原理，通过调控温度实现DNA的变性、退火与延伸循环，可在体外快速扩增特定DNA片段；操作中需严格避免污染，确保各反应组分添加准确。 2. 琼脂糖凝胶电泳鉴定原理：DNA分子因带电性质在电场中向正极移动，迁移速率受凝胶浓度、分子大小和构象影响；通过与标准参照物对比，可判断扩增产物的大小与纯度。 3. 实验关键注意事项：实验器材的无菌处理、试剂的低温储存与规范取用，是保证PCR实验成功的关键；电泳过程中电压、凝胶浓度的合理设置，是获得清晰鉴定结果的重要条件。 课堂练习 专题内容 01 【题文】巢式PCR是一种通过两轮PCR反应提高扩增特异性和灵敏度的技术，其基本原理如图1所示。在畜牧业中，对家畜早期胚胎进行性别鉴定具有重要意义。为此，科研人员利用多重巢式PCR，同时扩增Y染色体上的雄性决定基因（SRY）与常染色体上的酪蛋白基因（CSN1S1），以实现胚胎性别的早期鉴定，并将鉴定后的胚胎进行移植。图2表示1~5号不同胚胎DNA样品经巢式PCR扩增后的电泳结果。下列分析错误的是（       ） A．从囊胚中获取用于性别鉴定的DNA时，通常从滋养层取样 B．图1中两次PCR反应分别进行可防止内引物在第一次PCR反应中发挥作用 C．若要培养高产奶牛，应当选择图2中的3号和5号 D．该技术可以提高优良母畜的繁殖效率，加速育种进程 【答案】C 课堂练习 【题文】科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（       ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 【答案】B 课堂练习 课堂练习 【题文】我国科学家利用天山雪莲的SikCDPK1基因(S基因)培育抗旱烟草时，为减少外源基因对植物正常生长的潜在影响，将组成型启动子(35S)替换为干旱诱导型启动子(RD29A)。下列分析错误的是 A．与35S启动子相比，RD29A启动子通常在干旱条件下才驱动S基因表达 B．可用农杆菌转化法将RD29A—SikCDPK1表达载体导入烟草细胞 C．若S基因成功导入，则能在烟草植株各部位的细胞中检测到对应的mRNA D．检测转基因烟草的抗旱性时，可测定其在干旱胁迫下的叶绿素含量 【答案】C 课堂总结 专题内容 01 基因工程基本操作程序 目的基因筛选与获取 筛选：从已知基因/数据库中选择（如Bt基因） 获取：PCR扩增（变性、复性、延伸三步循环） 基因表达载体构建 组件：目的基因、启动子、终止子、标记基因 操作：限制酶切割+DNA连接酶拼接 导入受体细胞 植物：花粉管通道法、农杆菌转化法 检测与鉴定 分子水平：PCR、抗原-抗体杂交 个体水平：抗虫饲喂实验 感谢聆听 Thank You $