3.2基因工程的基本操作程序 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件围绕基因工程基本操作程序，系统涵盖目的基因筛选与获取、表达载体构建、导入受体细胞及检测鉴定等核心内容，通过普通棉花与转基因抗虫棉对比实例导入，以“问题链+讲解点+巩固练习”串联PCR技术、载体组成等知识点，辅以课前读背内容搭建学习支架。 其亮点在于以科学思维为核心，通过PCR原理分析、引物设计逻辑等培养逻辑推理能力；结合探究实践（DNA扩增及电泳操作步骤、注意事项）提升动手能力，视频辅助理解PCR循环次数等难点；以结构与功能观（如表达载体组成与功能对应）深化生命观念。学生能在理论与实践结合中构建知识体系，教师可借助系统资料高效实施教学。

课前读背内容(3min) 1.切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶,简称限制酶。主要从原核生物中提取。能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。经切割产生的末端有黏性末端和平末端两种。 2.连接DNA片段的工具是DNA连接酶。主要包括E.coliDNA连接酶(从大肠杆菌中分离)和T4DNA连接酶(从T4噬菌体分离)。能够将两个DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 3.基因进入受体细胞的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。需要具备①具有一个至多个限制酶切割位点②能够进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制③含有标记基因④对受体细胞无害等条件。 第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序 第1课时 普通棉花 转基因抗虫棉 从苏云金杆菌内获得Bt抗虫蛋白基因 与载体结合 转入棉花细胞 检查转基因抗虫棉是否培育成功 目的基因的 筛选与获取 基因表达载体的构建（核心） 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 从社会中来 基因工程的步骤—：目的基因的筛选与获取 自主预习教材p76—p79内容，独立思考并回答以下问题(7min) 1.什么是目的基因？其主要指什么基因？抗虫棉产生过程的目的基因是什么？ 2.筛选目的基因的主要方法是什么？ 3.用什么方法在短时间内获取和快速扩增目的基因？ 4.PCR反应的原理、场所、模板、原料、酶、引物分别是什么？ 5.PCR反应每次循环的三个步骤？反应温度是否相同？每个步骤如何进行？ 2、需要_____种引物，原因是_________________________________________________________________________________ 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 讲解点—引物 1、DNA复制为什么需要引物？ DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA子链。 2 DNA的两条链都作为模板，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被复制 3、体外DNA复制，设计引物要依据什么？有什么要求？ 根据一段已知的目的基因序列合成引物 要求：①引物自身不能发生碱基互补配对 ②2种引物之间不能发生碱基互补配对 防止引物自身折叠或引物之间配对，导致引物不能与模板链结合 DNA聚合酶都需要Mg2+激活 4种脱氧核苷酸（dNTP） 待扩增的DNA片段（模板） 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 一定的缓冲溶液（一般要添加Mg2+） 2种引物 PCR仪 模板、引物、4种脱氧核苷酸为原料、耐高温的DNA聚合酶 讲解点—PCR所需的条件 1）变性： 当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解聚为两条单链DNA。 待扩增的DNA片段 第一步：变性 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高。 讲解点—PCR反应的过程 2）复性： 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 第二步：复性 引物1 引物2 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 引物结合在模板链的什么位置？ 引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 3’ 3’ 讲解点—PCR反应的过程 3）延伸： 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 第三步：延伸 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 从 5’——>3’延伸 讲解点—PCR反应的过程 PCR重复多次后,DNA分子呈指数形式扩增（约为2n） 讲解点—PCR反应相关计算 经过n次PCR循环后： DNA分子数： 含引物的DNA分子数： 含两种引物的DNA分子数： 共消耗的引物数： 2n 2n 2n-2 2n+1-2 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 10 观看视频:PCR技术至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 巩固练习 1.基因工程中，获取目的基因的方法有很多种，可以直接利用PCR选择性地扩增目的基因。下列关于目的基因的扩增的叙述，正确的是( ) A.变性：利用DNA解旋酶破坏氢键，将目的基因的两条链解开 B.复性：降低温度，使目的基因的DNA恢复双螺旋结构 C.延伸：在DNA聚合酶的作用下，将4种核糖核苷酸加到引物的5‘端 D.引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的单链核酸 D 巩固练习 2.利用PCR扩增目的基因的过程中，子链延伸需要引物。有关引物设计的说法，错误的是( ) A.两种引物之间不能有互补性 B.每种引物自身不应存在互补性 C.设计引物时需要知道目的基因的全部碱基序列 D.引物的长度关系到PCR的特异性 C 巩固练习 3.蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1~4表示DNA上引物可能结合的位置，目前利用现代生物技术生产蜘蛛丝已取得成功。下列有关叙述正确的是（     ） A.若用PCR技术获取蛛丝蛋白基因,则设计的引物应分别结合在1、4部位 B.若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因,则会破坏2个磷酸二酯键 C.若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，则共消耗引物32个 D.在PCR仪中根据选定的引物至少需经过3次循环可获得等长蛛丝蛋白基因 D 第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序 第2课时 基因工程的步骤二：基因表达载体的构建 1.构建目的 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在 (2)能够遗传给下一代 (3)使目的基因能够表达和发挥作用 2.基因表达载体的组成 （3）终止子： ①本质： 一段有特殊序列结构的DNA片段 ②位置： 位于基因的下游 ③功能： RNA聚合酶识别和结合的位点，终止转录 （4）标记基因： ①作用： 便于重组DNA分子的筛选 （1）目的基因： ②常见类型： 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 （5）复制原点： 使重组DNA能完成自主复制 （2）启动子： ①本质： ②位置： ③功能： 一段有特殊序列结构的DNA片段 位于基因的上游 RNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因转录 （目的基因必须插在启动子和终止子之间） 2.基因表达载体的组成 概念辨析 DNA 3.基因表达载体的构建过程 拓展与应用 将图甲中的抗病基因插入图乙中的质粒中，写出限制酶的最佳选择 拓展与应用 下图为质粒的限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，bglB基因两端需要分别引入哪些 限制酶的识别序列？ 巩固练习 1.某实验小组利用下图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是（    ） A．图中的质粒用酶B切割后会产生4个游离的磷酸基团 B．在构建重组质粒时可用酶A和酶C切割质粒和目的基因 C．成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长 D．若用酶B和酶C切割可以避免质粒和目的基因反向连接 D 2.图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是（　　） A.图中质粒和外源基因DNA构建重组质粒时可用BamHI和HindⅢ限制酶切割 B.图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过三轮复制得到所需目的基因的分子数为8个 C.能在含有四环素的培养基上生存的细胞全部都是成功导入重组质粒的受体细胞 D.若通过PCR技术扩增该目的基因，以该选用引物a和引物c D 3.某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是( ) A.用限制酶HindIII和PstI切割质粒，可得到两个DNA片段 B.不能用限制酶AluI切割质粒和外源DNA的原因是限制酶Alu1会破坏目的基因 C.构建重组DNA时，需选择限制酶SmaI和PstI同时切割质粒和外源DNA D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长 C 3.2基因工程的基本操作程序前半部分读背内容(30min) 1.基因工程的四个主要步骤(会背,p76第一段) 2.目的基因的概念及主要指什么？(会背,p76第二段) 3.在体外获取和快速扩增目的基因的技术(会背,p77第四段) 4.PCR的名称、原理、场所、模板、原料、酶(会背,p77第五和六段) 5.PCR循环的三个步骤名称、温度及具体过程(会背,p78图3-5) 6.边角细节:①DNA复制为什么需要引物？②DNA聚合酶的激活需要哪种离子③利用PCR扩增目的基因需不需要知道其全部序列？④至少要经过几次循环才能获得目的基因？⑤用PCR可以扩增mRNA吗？⑥n次循环消耗引物数公式(熟读,p77-p79笔记) 7.基因工程的核心步骤是哪一步？(会背,p80第一段) 8.基因表达载体需要具备哪些结构？(会背,p80第二段) 9.什么是启动子和终止子？其位置和作用是什么？什么是复制原点？(会背,p80第二段) 10.启动子/终止子与起始密码子/终止密码子有何区别？(熟读,p80笔记) 课前读背内容(5min) 1.基因工程主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2.PCR根据DNA半保留复制的原理，在体外一定的缓冲液(加入Mg2+激活DNA聚合酶)中进行，需要提供DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。 3.PCR每次循环包括变性、复性、延伸三个步骤 ①变性：温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：温度下降到50℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：温度上升到72℃时，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 4.PCR至少经过三轮循环才会产生完整的目的基因。 5.基因表达载体具有目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等结构。 第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序 第3课时 基因工程的步骤三：将目的基因导入受体细胞 阅读教材p81—p82内容，思考并讨论以下问题： 1.将目的基因导入植物受体细胞的方法有哪些？ 2.将目的基因导入动物受体细胞的方法有哪些？一般导入动物的哪些细胞？ 3.将目的基因导入原核生物受体细胞的方法有哪些？用离子处理的目的是什么？ 4.农杆菌主要侵染哪些植物？对哪些植物没有侵染能力？农杆菌为什么具有侵染植物的能力？ 5.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入分别指什么？ 6.目的基因的检测和鉴定时，分子水平上的检测方法有哪些？个体水平上的鉴定方法有哪些？ 讲解点：花粉管通道法 1.适用生物：开花植物 ②在植物授粉后一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴在花柱切面,使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 2.操作方式： 讲解点：农杆菌转化法 该过程经过两次拼接、两次导入 ①第一次拼接：_______________________________ ②第二次拼接：_______________________________ ③第一次导入：__________________________________ ④第二次导入：__________________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞 1.分子水平检测 2.个体水平鉴定 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、抗性鉴定等 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 讲解点：目的基因的检测与鉴定 PCR技术 抗原-抗体杂交 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测 按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？ 31 检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 受体细胞 目的基因 引物 引物 检测目的基因是否转录出了mRNA 受体细胞 目的基因 引物 引物 巩固练习 1．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述错误的是（　　） A.目的基因进入受体细胞,并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化 B.可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使它能吸收周围环境中的DNA分子,有利于重组的基因表达载体导入其中 C.可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 D.农杆菌只能侵染单子叶植物和裸子植物 D 巩固练习 2．在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，下列叙述正确的是（ ） C A.导入植物细胞时均采用农杆菌转化法 B.转基因动物的获得多数采用基因枪法 C.大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2+处理 D.导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物 巩固练习 3.如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图.以下相关叙述,正确的是（　） A.①、②的操作中需要使用限制酶和DNA聚合酶参与 B.④→⑤的过程体现了植物细胞的全能性 C.③→④过程利用了膜的结构特性，重组Ti质粒整合到④的染色体上 D.④的染色体上若含有抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 B 课前读背内容(3min) 1.将目的基因导入植物受体细胞的方法:花粉管通道法和农杆菌转化法 2.将目的基因导入动物受体细胞的方法:显微注射法 3.将目的基因导入原核生物受体细胞的方法：Ca2+处理法。Ca2+处理可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 4.目的基因检测的方法： 利用PCR技术检测受体细胞DNA中是否插入目的基因 利用PCR技术检测受体细胞目的基因是否转录出mRNA 利用抗原-抗体杂交检测受体细胞是否翻译出蛋白质。 5.即使目的基因插入受体细胞DNA中,目的基因也不一定表达,还需要进行目的基因的鉴定。 第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序 第4课时 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、DNA片段的扩增 1.原理：PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 2.步骤： ①用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书在微量离心管中依次加入各种组分。 ②待所有的组分都加入后,盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里,离心约10s,使反应液集中在管的底部(注：有利于PCR反应进行)。 ③参照相关参数,设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的离心管放入PCR仪中进行反应。 3.注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。(防止试剂污染) ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 二、DNA片段的电泳鉴定 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.原理： ①DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。 ②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ④凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 凝胶浓度越低，迁移速率越快 DNA相对分子质量越小，阻力越小，迁移速率越快 环状DNA分子迁移速率大于线状DNA 2.过程： 4.结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 正常情况为一个条带 如果扩增不成功（没有条带）,可能的原因有漏加了PCR的反应成分,各反应成分的用量不当,PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理,它们与非目的序列结合;复性温度过低;DNA聚合酶的质量不好等。 巩固练习 1．下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，正确的是（　　） A．进行电泳时，带电分子会向与其所带电荷相同的电极移动 B．在凝胶中DNA分子的迁移速率主要取决于其大小和构象，与凝胶浓度无关 C．PCR通过调节温度来控制DNA双链的解聚和结合 D．在电泳鉴定过程中，凝胶中的DNA分子经过染色后可以被检测出来 C 2．研究人员从肺部症状病人的支气管肺泡灌洗液诊断标本中提取出DNA，其扩增产物a、b的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示，Maker为指示分子大小的标准参照物。下列叙述错误的是（    ） A.根据DNA的带电性质,可知该电泳图上端对应电极正极,下端对应电极负极 B.图中样品a、b的迁移速率与DNA分子的大小等有关，a样品中DNA的迁移速率快 C.图中样品a、bDNA分子的大小介于300-600bp D.待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时应停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中 A 3.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 电泳图的判断 Mark 样品1 样品2 样品3 样品4 100bp 200bp 300bp 500bp 600bp 700bp 800bp ①不同样品中DNA分子类型数判断 ②同一样品不同DNA的迁移速率判断 ③根据电泳图判断正负极位置 3.2基因工程的基本操作程序后半部分读背内容(25min) 1.基因工程的四个步骤(p76第一段) 2. 目的基因导入植物受体细胞的两种方法名称(p81) 3.农杆菌主要侵染的对象(p81资料卡第二段) 4.农杆菌转化法的原理(p81资料卡第二段) 5.检测目的基因的方法和具体检测对象(p82第二段) 6. 目的基因导入动物受体细胞的方法及对象(p82倒数第二段) 7. 目的基因导入原核生物受体细胞的方法及处理目的(p82倒数第二段) 8.PCR和电泳的原理(p84第一段和第二段) 9.凝胶浓度、DNA分子大小和构象对DNA分子的迁移速率的影响(p84笔记) 10.DNA带电情况及移动方向(p85最上边笔记) Lavf57.71.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $