核心考点 DAY 08 基因工程-2 核酸和PCR-2026年高考生物总复习核心考点通关8天必背

2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 核心考点DAYO8 姓名 日期 班级： 《基因工程》-2（核酸和PCR)专题 01.遗传物质（做题时注意：对象） (1)生物界（所有生物）：因为绝大多数生物的遗传物质是DNA,所以说 (2)具体生物：其遗传物质是 (只能是一种) 原核生物（如细菌）的遗传物质是 真核生物的遗传物质是 T2噬菌体的遗传物质是 。烟草花叶病毒的遗传物质是 HIV病毒的遗传物质是 02.基因：通常是 (1)以DNA为遗传物质的生物，基因是 (2)以RNA为遗传物质的生物，基因是 03.DNA的结构： 元素组成 C、H、O、N、P (1)一个双链DNA分子（链状）具有个游离的 此位置是氧，不是碳 磷酸基团，而环状DNA分子具有个游离的磷 磷酸 脱氧核糖 A:腺嘌呤 酸基团。1个脱氧核糖与」 个磷酸基团连 含 分子 基团 P 接。 贺 T:胸腺嘧啶 碱 C:胞嘧啶 (2)氢键的形成不需要酶，但断裂需 321 基 G:鸟嘌呤 或 处理 2'号碳连“一H”而不是“ OH” (3)G-C碱基对比例越大，DNA热稳定性越 体 脱氧核苷酸 (4种 含氮碱基不同)》 (4)相邻的碱基在DNA分子的一条单链中通过 游离的磷GC间3个氢键 酸基团 氢键 一脱氧核糖一磷酸一脱氧核糖一相连接，互补 磷酸 与 脱氧核 3 碱基在DNA的双链之间通过 相连 糖 交替连接，排列接 在外侧，构成基本骨 面结构 架， 碱基排列在 (⑤)下图表示DNA双螺旋结构的简化形式，其 内侧，通过氢键形成 中①是 ②是 解旋 C 碱基对，碱基互补配 酶作用于 部位，限制性内切核酸酶和 对原则是A与T配DNA连接酶作用于 部位。 A、T间2个氢键 对、G与C配对 ① 间结构 两条长链按反向平行方式 …GAATTC ②→1 盘旋成双螺旋结构 (6)核苷酸 OH OH 3 OH H OH 脱氧核苷酸 核糖核苷酸 双脱氧核苷酸 OH OH OH OH OH OH 0= O- OH OH OH OH OH H dNTP ddNTP:可用于DNA测序 第1页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用）】 只为蜕变清晰 ATP的结构 dATP的结构 OH OH OH OHOH OH O=P~0-P~0-P-O-CH2 腺嘌呤 0=P0-0-P-0- 腺嘌呤 OHOHOH OHOH OH 4 有两个特殊的化学键()： 有两个特殊的化学键(~)： 水解可释放出大量能量 水解可释放出大量能量 3 3 OH OH OH 棉 腺苷(A) DNA的基本单位之一 脱氧腺苷(A) 腺苷一磷酸(AMP) (腺嘌呤脱氧核苷酸) 脱氧腺苷一磷酸(dAMP) 腺苷二磷酸(ADP) 脱氧腺苷二磷酸(dADP) 腺苷三磷酸(ATP) 脱氧腺苷三磷酸(dATP) 04.DNA的复制和PCR技术 DNA复制 PCR技术 原理 解旋 场所 (真核)主要在 细胞外（在P℃R仪中） 也在 酶 普通的 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一 分别从两条链的端开始延伸，都是 条链 合成，再由 连接。 (连续不连续)合成。 过程 51 -54 5 文衫 3 边 边 产物 完整DNA 温度 细胞内温和条件 需控制」 在较 (高/低)温度下 引物 原料 脱氧核苷酸（或dNTP) 复制原点 0 一→复制方向（解旋方向） dNTP o-P-0 0 焦磷酸 0=P-0 0 0=P-0 0-P-0 0 3 子链 0-P0 5'® OH OH 0 A A A G T A G 3 模板链 3D©De5 DNA复制 引物 DNA复制：半保留复制、双向复制、多起，点复制、 半不连续复制、边解旋边复制 (1)引物： (选择性必修3P) (2)自然界中的DNA复制和PCR为什么都需要引物？原因是：DNA聚合酶：能够丛的 (3 '5')端开始连接脱氧核苷酸、子链的延伸方向为 。【DNA聚合酶只能将单个的dNTP 连接到已有片段（引物）的3'_端。】 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 第2页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用） 只为蜕变清晰 (4)在PCR过程中实际加入的为 (dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的 又可为DNA的合成提供 (故PCR过程中不用另外加入能量) (5)PCR (可以/不可以)扩增mRNA吗？原因是： (选择性必修3P9) RNA链DNA链 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 (RNaseH) 单链RNA 杂交双链 单链DNA 双链DNA (6)PCR技术的关键点：PCR技术是扩增 的DNA片段. 需将人工构建的限制酶识别序列添加到引物的 端（填：”5”、”3”） 不5 5'、 模板DNA 3T 目的基因 ◆3 3 2 例1.(2022，山东，节选)(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物I、Ⅱ，其 连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的() X 5' T T M立 A片段 A -A A }' A B C D 例2(2025届高三调研卷·广州零模卷，T21节选)(3)采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出 现正向连接（图中箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录） 两种情况。选用引物」 (填序号)进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是 引物① 引物② U启动子 向导RNA序列 T启动子 Cas9基因 引物③ 引物④ (7)PCR过程中，延伸时需要加入两种引物，原因是： 05.PCR技术专题 I.PCR技术“引物”归类分析 (1)引物的设计：两种引物的要求： ①引物自身不能 ②两种引物之间不能 ③引物长度不宜过短，防止引物 例3.（经典高考题节选）设计引物时需要避免引物之间发生 而造成引物自连。同理也要 避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且 的引物需 要设定更高的复性温度。 例4.(2020·山东，25节选)(1)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA,原因是 第3页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用） 只为蜕变清晰 (2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率 偏低，收获的目的基因较少，原因是 若对P℃R产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是 例5.(2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物 反应管 加入的单链DNA DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种 5-GCCGATCTTTATA-3 ① 脱氧核苷酸(CTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管 3-GACCGGCTAGAAA-5' ①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA ② 5-AGAGCCAATTGGC-3 区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9 ③ 5-ATTTCCCGATCCG-3 个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应 3-AGGGCTAGGCATA-5 管有( A.①② B.②③C.①④ D.③④ ④ 5-TTCACTGGCCAGT-3 (2)引物的修饰 例6.(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物 A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合 蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基 端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其 中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正 确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。 据图分析，出现该问题的原因是 修改扩增P基因时使用的带有EcoR I识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 EcoR BamH 重组载体 的部分结构启动】 P基因 终止子 笑」 编码FLAG的序列 EcoRI BamHI DNA编码ATG GAC·AAG GCG AAT TCA TGT GCA.GGA TCC 链氨基 Met AspLys Ala Asn Ser Cys Ala Gly Ser 酸序列 FLAG 注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补链。 (3)引物的结合方向 例7.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： P-ATGCCGTAAGTCCTAC A TGTAAGCCGTAGATCA-OH HO-TACGGCATTCAGGATG ACATTCGGCATCTAGT-① 扩增X蛋白基因所需的引物序列是 (4)引物的选择 例8.(2023·山东)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结 构如图甲所示，其中5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是 除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构 有 (答出2个结构即可). 第4页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用）】 只为蜕变清晰 (②)构建重组质粒后，为了确定基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PC检测，若仅用一对引物， 应选择图甲中的引物 。 已知基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达 水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 条带2所检出的蛋白 填“是”或“不是”)由重组质粒上的基因表达的。 例9.(2025浙江，1月)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵 母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gd)。采用的方案是：先通过第1 次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序 列，如图所示，回答下列问题： SalI Sal I 第2次PCR 引物枷1序列引物P2序列 引物P3序列 引物P4序列 第1次PCR Pst I 第2次PCR Pst I (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR,利用 凝胶电 泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取 不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是 A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstI和SalI单酶切基因组DNA后，各自用DNA连 接酶连接形成环形DNA,再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次 PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR,最后进行测序。用 于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 (A.P1和P2B.P3和P4C.P1和P4D.P2 和P3)。根据测序结果拼接获得完整的GPd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd 基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利 用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 (5)引物的数量计算 ①已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 引物1 ☐引物2 的结合位点如右图所示，在第轮循环产物中开始出现两 引物与DNA的结合位点图 条单链等长的目的片段。选择性必修3P7s,图3-5 ②已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 引物1 ☐引物2 的结合位点如右图所示，在第_轮循环产物中开始出现两 条单链等长的目的片段。 引物与DNA的结合位点图 ③已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如下图所示，在第_轮循环 产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 一个DNA分子n次扩增， 第5页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 A.子代DNA分子中等长链的 DNA分子数为个； 3mm'5 3′3 B.子代DNA分子中不等长链 3- 5吧 的DNA分子数为_个； 3m吗53 C.子代DNA分子中含模板链 5'吗 吧 3 DNA分子数为个； 3.5品吧 D.子代DNA分子中含引物A(或B)的 3加mmI0号 DNA分子数为 个 5会mwm:彩 品吧33 3 3 E.复制过程中共需引物 个 3' 5品mmg F.第n次复制需要引物 个。 mmm 一目标序列 -侧翼序列 3吧 --3 a吧53 口引物A 吧} 3 ▣引物B 循环1： 循环2： 循环3： 变性→复性+延伸变性→复性→延伸变性→复性→延伸 Ⅱ.PCR产物鉴定一琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的H下，这些基团可以带上_电荷或_电荷。在电场的作用 下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过 电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 和 等有关。凝 胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的 下被检测出来。 (2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴 定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指 示DNA分子的具体位置 2000 C.在同一电场作用下，DNA片段越长， 10 琼脂糖 向负极迁移速率越快 500 D琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 250 Lane 1:DL2000 DNA Marker 100 Lane2:gfp基因PCR对照 Lane3-6:各组PCR样品 绿色荧光蛋白(gfp)基因相对 分子质量量为750bp左右 Ⅲ.PCR技术的应用 (I)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 例10.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组 50b 50 bp 质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引 物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中 扩增出了400bp片段，原因是 (2)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 例11.如图为利用重叠延伸P℃R的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(AT碱基对变为G/C)的过程。该过 程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对， 但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说法不正确的是() 第6页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 A.PCR1所用引物应为引物A和B 引物B 引物D 3'八5 B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板 5 蛋白a基因 5 C.PCR3无需额外加入引物 引物A 引物C D.PCR4的作用是大量扩增突变基因 PCRI (3)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 PCR2 5 例12.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段 5入 连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2（利用融 3 PCR产物 合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位 混合后复性 点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重 入3 组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题： 3 5'八 3 基因A 基因B PCR3 Spe I 引物15引物2 引物3 引物4 启动手 中叶绿体同源 标记基因 PCR4 目的甚因 安 Sal 终止于 2重组基因2 新的蛋白a基因 Sal l 注：图中“A”为减基序列变化点 Kpn Sac I Spe I 定点整合 A.B融合基因 表达载体 ，1 引物4 Kpn I Sal I 图1 图2 (1)图1第一阶段中PCR至少进行 次循环，才能获得双链等长的DNA,第二阶段中引物2与引物3 部分碱基的 关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来 (②)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_种引物，其 中能够起着“搭桥”作用的引物有_种。 (3)图2中需使用 (填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中 定点整合表达载体上未标出的结构是 (4)利用反向P℃R技术扩增未知基因序列 例13.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简 染色体DNA 捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图（以ECoR I酶切为例)。请据图回答问题： I酶切ECoR IGAATTC】 CTTAAG (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些P℃R引物， 混合的DNA片段 步骤Ⅲ选用的引物必须是 (从表格引物①②③④中 5 3 选择，填编号)。 1未知序列已知序列未知序列 S片段F Ⅱ连接DNA连接酶 名称 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列 已知序列 吧 5 -AACTATGCGCTCATGA------GCAATGCGTAGCCTCT-3' PCR引物 环状DNA 序列3'-TTGATACGCGAGTACT--- CGTTACGCATCGGAGA-5 EcoR I 5'-AACTATGCGCTCATGA-3 Ⅲ扩增！Taq DNA聚合酶 25-GCAATGCGTAGCCTCT-3' 引物 PCR产物 35-AGAGGCTACGCATTGC-3 N测序、分析 45'-TCATGAGCGCATAGTT-3 5 3片段F的 完整序列 (2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单 反向PCR示意图 链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是 A.5'-AACTATGCG--- --AGCCCTT-3' 第7页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 B.5'-AATTCCATG ------CTGAATT-3' C.5'-GCAATGCGT- TCGGGAA-3 D.5-TTGATACGC- CGAGTAC-3' 例14.(2023·浙江)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR 扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示 下列叙述正确的是( Gata3 A.Gata3基因的启动子无法控制 启动子区 编码区 非编码区 插入前 5 3 GFP基因的表达 5 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合 虹 GFP 大片段 启动子区 5 编码区非编码区 .3 成GFP蛋白 插入后 小片段 3 C.2号条带的小鼠是野生型，4号 引物3 物2 图甲 图乙 条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 引物1 ® (⑤)实时荧光定量PCR 5' 例15.实时荧光定量PCR简称qPCR,灵敏度高特异性好，是 3' 光强度 目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman R☒ 引物2 探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环 中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在 5 特定光激发下发出荧光 3 (如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通 注：R表示荧光基因，Q表示淬灭基因。 过实时检测荧光信号强度，可得C值（该值与待测样本中目的 基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是() 12000 1 11000- A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团 B做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1 搭9000 种引物和1种Taqman探针 8(000 7(000 C,在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量 6(000 D荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明 5000 4000 含有的病变的概率越小 3000 2000 Ct值 阈值 (6)“双脱氧法”基因测序 1000 0+ 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3'-OH,因此 02468101214161820)2224202830323436384042 每当DNA链加入分子ddNTPI时，延伸便终止。(2)每一次DNA 循环次数 测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加 模板 TAGCAACT 5' 入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应 引物 FATCGTTGA 荧光 「引物延长和合成阻断 体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、 标记 1管 2管 3管 4管 ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点 dATP dATP dATP ATP+ddATP 相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 dGTP dGTPdGTP+ddGTP dGTP dCTP dCTP+ddCTP dCTP dCTP 出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取 dTTP+ddTTP dTTP dTTP dTTP DNA双链的碱基序列。 -ATCGTddT -ATddC -ATCGTddG -ATCGTTGddA -ATCGddT -ATCddG -ddA 例16.（双选）2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR -AddT 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸 产物：按长短排列 -ATCGTTGddA (ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时，双脱氧核 ATCGTTddG 电泳后 -ATCGTddT 的放射 苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为 -ATCGddT -ATCddG 自显影 例：若配对的为ddATP,延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三 -ATddC 5直读图 磷酸(ATP),继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该 -ddA 第8页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮.二轮均可使用） 只为蜕变清晰 方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 +ddATP+ddCTP+ddGTP+ddTTP+ddATP+ddCTP+ddGTP+ddTTP B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 A G h G 电 C.5'-CTACCCGTGAT--3'为对照个体的一段序列 泳 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 向 对照 患者 (7)不对称PCR 例17.(2025·广州市三模)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单DNA(SSDNA)的方法。加 入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。P℃R的最初的若干次 循环中，其扩增产物主要是双链DNA(sDNA),但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的SsDNA。不对 称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生SsDNA。下 列叙述错误的是()。 A.限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列 5' 来设计 3 甲 甲证限制性引物 B.据图可知，最后大量获得的SsDNA与图中甲链的碱基序列相同 5' 非限制性引物 C.上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的 山 3'端延伸 3 D.该不对称PCR过程中需要(2-1)a个限制性引物 (8)大引物PCR 重叠延伸PCR 大引物PCR 引物B 引物D 3入5 3 3 欲突变位点 目的基因 2' 5 5 5 ◆3 引物A 引物C PCR1(使用引物C和D) PCR1(使用引物A和B) 注：这一步与重叠延伸PCR类似 PCR2(使用弱I物C和D)I 但只扩增目的基因一端（一般扩增 突变位点距基因一端较近侧)。预 设突变位点位于引物中间位置， -3 5 5 3 5 3 5 PCR产物混合后退火 第一轮反应产物的一条链（大引物） 和目的基因另一端的引物，作为 下一轮引物，以原始DNA为模板。 3 5 54…3 5 …5 5 3 PCR3(3'端搭桥的两条链既是 3 模板，也是互补链的引物) 3 引物A 3 PCR2 5 PCR4(使用引物A和D) 3 特定位点突变了的目的基因 特定位点突变了的目的基因 注：预设诱变引物B和C的5端部分碱基互补（包括突变位点， 注：基本原理是通过两个端引物，和一个带有预设突变的 该技术还可以将两个DNA片段连接起来，构建融合基因。 内部诱变引物，获得定点突变产物 第9页共10页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 例18：下图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变，下列说法错误的是( 诱变引物 A.第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 第一轮PCR B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能 PCR产物用作大引物 进行转录和翻译 D.为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不 同的复性温度 第二轮PCR (9)巢式PCR 19.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段 为模板，用外引物1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板， 用内引物F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( A两对引物的碱基序列不相同，但均应为 F1 单链DNA片段 模板！ B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮 F2 ,第一次PCR扩增 PCR反应正确性的鉴定 中间产物 C.由于和两套引物都互补的靶序列较少， R2 该技术可大大提高扩增的特异性 第二次PCR扩增 D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于 目标产物日 内引物 巢式PCR工作原理示意图 (1O)不对称PCR 例20.不对称PCR是用一对含量不相等的引物来产生大量单链DNA(SsDNA)的技术。这两种引物一少一多， 比例一般为1：50~1：100，分别称为限制性引物与非限制性引物。另外，限制性引物的退火温度与非限制性 引物的退火温度不同，在最初的10~15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高，从而产生 大量单链SsDNA。下列说法错误的是() A.最初的10~15个循环中DNA分子数将会以指数形式增长 B.非限制性引物的退火温度应低于限制性引物的退火温度 C.限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响SSDNA的产量 D.所得SsDNA可通过电泳分离、回收，然后作为DNA探针使用 第10页共10页2026年高考核心考点填空(一轮•二轮均可使用) 只为蜕变清晰 核心考点 DAY 08 姓名： 日期： 班级： 《基因工程》-2（核酸和PCR）专题 01.遗传物质（做题时注意：对象） （1）生物界（所有生物）：因为绝大多数生物的遗传物质是DNA,所以说 DNA是主要的遗传物质 。 （2）具体生物：其遗传物质是 DNA或RNA 。(只能是一种) 原核生物（如细菌）的遗传物质是 DNA ，真核生物的遗传物质是 RNA ，T2噬菌体的遗传物质是 DNA 。烟草花叶病毒的遗传物质是 RNA 。HIV病毒的遗传物质是 RNA 。 02.基因：通常是 有遗传效应的DNA片段 。 （1）以DNA为遗传物质的生物，基因是 有遗传效应的DNA片段 。 （2）以RNA为遗传物质的生物，基因是 有遗传效应的DNA片段 。 03.DNA的结构： （1）一个双链分子(链状)具有 2 个游离的磷酸基团，而环状分子具有 0 个游离的磷酸基团。1个脱氧核糖与 1或2 个磷酸基团连接。 （2）氢键的形成不需要酶，但断裂需 解旋酶 或 高温加热 处理。 （3）碱基对比例越大，热稳定性越 稳定 。 （4）相邻的碱基在分子的一条单链中通过—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—相连接，互补的碱基在的双链之间通过 相连接。 （5）下图表示双螺旋结构的简化形式，其中①是 磷酸二酯键 ，②是 氢键 。解旋酶作用于②部位，限制性内切核酸酶和连接酶作用于①部。 （6）核苷酸 04.DNA的复制和PCR技术 DNA复制 PCR技术 原理 DNA半保留复制 解旋 解旋酶 高温 场所 （真核）主要在 细胞核 ， 也在 叶绿体 、 线粒体 。 细胞外（在PCR仪中） 酶 解旋酶 、普通的 DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链 不连续 合成，再由 DNA连接酶 连接。 分别从两条链的 3′ 端开始延伸，都是 （连续/不连续）合成。 过程 边 解旋 边 复制 变性 → 复性 → 延伸 产物 完整DNA DNA片段（两个引物之间的DNA片段） 温度 细胞内温和条件 需控制 温度 ，在较 （高/低）温度下 引物 RNA DNA 原料 脱氧核苷酸（或dNTP） dNTP 焦磷酸 子链 DNA复制 模板链 DNA复制：半保留复制、双向复制、多起点复制、 半不连续复制、边解旋边复制 （1）引物： 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 （选择性必修3P77） （2）自然界中的DNA复制和PCR 为什么都需要引物？原因是：DNA聚合酶：能够从引物的 3′（3′/5′）端开始连接脱氧核苷酸，子链的延伸方向为 5′ → 3′ 。【DNA聚合酶只能将单个的dNTP连接到已有片段（引物）的 3′ 端。】 （3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 Mg2+ 激活。因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加 Mg2+ 。 （4）在PCR过程中实际加入的为 dNTP (dATP、dGTP、dTTP、dCTP) ，既可作为合成DNA子链的 原料 ，又可为DNA的合成提供 能量 。（故PCR过程中不用另外加入能量） （5）PCR （可以/不可以）扩增 mRNA 吗？原因是： 不可以直接扩增mRNA,需将其逆转录为cDNA,再进行PCR扩增 。（选择性必修3P79） （6）PCR技术的关键点：PCR技术是扩增 两个引物之间 的DNA片段。 需将人工构建的限制酶识别序列添加到引物的 端（填 : “5′ ”、“3′ ”） 例1.（2022，山东，节选）(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（ ） 【答案】D 【解析】PCR技术是扩增两个引物之间的DNA片段。故选D 例2.（2025届高三调研卷·广州零模卷，T21节选）（3）采用单酶切后进行连接反应，T 启动子容易出现正向连接（图中箭头向右，目的 基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选用引物 （填序号）进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是 。 【答案】引物①和引物③ (或“引物②和引物④”)  正向连接时使用引物①和引物③进行PCR可获得预期产物，反向连接无法获得扩增产物。 （8）PCR过程中，延伸时需要加入两种引物，原因是: DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 。 05.PCR技术专题 Ⅰ.PCR技术“引物”归类分析 （1）引物的设计：两种引物的要求： ①引物自身不能 环化 。 ②两种引物之间不能 碱基互补配对 。 ③引物长度不宜过短，防止引物 与DNA随机结合，导致引物的特异性下降 。 例3.(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生 碱基互补配对 ，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且 G、C含量高 的引物需要设定更高的复性温度。 例4.(2020·山东，25节选)（1）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) 。 (2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是 引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性) 。 若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是 引物过短导致引物的特异性下降 。 例5. (2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( ) A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④ 【答案】D 【解析】制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①试管中的两种单链能错位配对　 ，但是配对后伸出来的游离的单链是3′末端，因缺乏模板，无法利用原料进行延伸，因此不能得到带有荧光标记的DNA探针，①不符合题意；③试管中的两种单链可以错位局部配对 ，配对后伸出来的游离单链是5′端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用碱基被荧光标记的dATP进行延伸的，③符合题意；②和④试管加的都是1种单链DNA，试管中存在两种可能：一是这条单链的3′端回折与自身一部分碱基配对，从而作为引物和模板，即 ，但是配对区只有5个碱基对，即使经过延伸最终只有8个碱基对，与题中“本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”这句话相矛盾；二是加入适量同种单链，2条相同单链之间可以反向互补配对成双链区。对于②试管，配对后： ，配对区大于9个碱基对，但因伸出来的模板链碱基是AGA，导致延伸时碱基被荧光标记的dATP无法掺入到子链合成中去，因此②不符合题意；对于④试管，配对后： ，配对区大于9个碱基对，且伸出来的模板链碱基是TTC，碱基被荧光标记的dATP必然可以掺入到子链合成中去，④符合题意。综上，故选D。 （2）引物的修饰 例6.(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 ，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。 据图分析，出现该问题的原因 P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 。修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基 。 【解析】融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 （3）引物的结合方向 例7.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是 5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′ ； 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′ 。 【解析】书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。 （4）引物的选择 例8.（2023·山东）科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是 RNA聚合酶 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 复制原点、标记基因 (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 F1和R2(或F2和R1) 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 J－V5融合蛋白 ，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 【解析】(2)据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 例9.（2025•浙江，1月）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 密码子序列 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 琼脂糖 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 更换微量移液器的枪头 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是 C 。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 冷却的95%酒精 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2   B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 调控 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 基因数据库 进行比对。将Gpd基因的编码区与 表达载体 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【解析】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A不符合题意； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B不符合题意； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C符合题意； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D不符合题意。 故选C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1与P2的序列从左向右为5’→3’，与图中下边的DNA链部分序互补配对，引物P3与P4的序列从左向右为3’→5’，与图中上边的DNA链部分序互补配对。 以环形DNA为模板进行第二次PCR时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P1和P4，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 （5）引物的数量计算 ①已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点如右图所示，在第 1 轮循环产物中开始出现两 条单链等长的目的片段。 选择性必修3P78,图3-5 ②已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点 如右图所示，在第 2 轮循环产物中开始出现两 条单链等长的目的片段。 ③已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如下图所示，在第 3轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 一个DNA分子n次扩增， A.子代DNA分子中等长链的 DNA分子数为 2n-2n 个； B.子代DNA分子中不等长链 的DNA分子数为 2n 个； C.子代DNA分子中含模板链 DNA分子数为 2 个； D.子代DNA分子中含引物A(或B)的 DNA分子数为 2n-1 个； E.复制过程中共需引物 2n+1-2 个； F.第n次复制需要引物 2n 个。 Ⅱ.PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上 正 电荷或 负 电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 相反 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过 琼脂糖凝胶 电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 大小 和 构象 等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的 紫外灯 下被检测出来。 (2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴 定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( A ) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指琼脂糖 示DNA分子的具体位置Lane 1:DL2000 DNA Marker Lane 2:gfp基因PCR对照 Lane 3-6:各组PCR样品 绿色荧光蛋白(gfp)基因相对 分子质量量为750 bp左右 C.在同一电场作用下，DNA片段越长， 向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测 出来 【解析】琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； 凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误； 琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为 300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 Ⅲ.PCR技术的应用 (1)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 例10.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 乙和丙 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 目的基因反向连接 。 【解析】如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。 (2)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 例11.如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说法不正确的是( B ) A.PCR1所用引物应为引物A和B B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板 C.PCR3无需额外加入引物 D.PCR4的作用是大量扩增突变基因 【解析】引物与模板的3′端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B，A正确； 由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误； 由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确； PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。 (3)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 例12.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题： (1)图1第一阶段中PCR至少进行 2 次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的 互补配对 关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计 8 种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有 6 种。 (3)图2中需使用 Spe Ⅰ、Sal Ⅰ (填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是 复制原点 。 【解析】（1）分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 （2）图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。 (3)图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2中需使用Spe Ⅰ、Sal Ⅰ和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。 (4)利用反向PCR技术扩增未知基因序列 例13.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题： (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是 ②④ (从表格引物①②③④中选择，填编号)。 (2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是 B 。 A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′ B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′ C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′ D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′ 【解析】(1)由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′，可根据已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，设计对应PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′， (2)对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。 例14.（2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（B） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 (5)实时荧光定量PCR 【解析】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。 故选B。 例15.实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光 (如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是( A ) A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团 B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman探针 C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量 D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 【解析】DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确； 做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误； 在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误； 若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。 (6)“双脱氧法”基因测序 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 例16.(双选)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ AC ） A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【解析】利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B错误；根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′-CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。 (7)不对称PCR 例17.(2025·广州市三模)不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR 的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a 个，6次循环后开始扩增产生ssDNA 。下列叙述错误的是( C ) 。 A.限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计 B.据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同 C.上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 D.该不对称PCR过程中需要(26−1)a 个限制性引物 【解析】 PCR 扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计，A正确；当限制性引物的浓度降低，甚至基本耗尽时，双链DNA 的合成速率显著下降，此时非限制性引物将继续引导单链DNA 的合成，非限制性引物与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初始DNA中一条链的拷贝（非限制性引物引导合成的单链），最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列一致，B正确；扩增时耐高温的DNA 聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3′端，C错误；PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA 分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR 过程中需要(26−1)a 个限制性引物，D正确。 （8）大引物PCR 注：基本原理是通过两个端引物，和一个带有预设突变的内部诱变引物，获得定点突变产物 例18.下图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变，下列说法错误的是( B ) A.第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能 进行转录和翻译 D. 为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不 同的复性温度 【解析】第二轮PCR所用的引物是需根据基因M的两侧重新设计引物。 （9）巢式PCR 19.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( D ) A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为 　单链DNA片段 B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮 　PCR反应正确性的鉴定 C.由于和两套引物都互补的靶序列较少， 　该技术可大大提高扩增的特异性 D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 【解析】A、两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链 DNA片段，以便与模板互补配 槲对，A 正确; 釆号计、第二轮 PCR 使内侧引物以第一轮 PCR 产物为模板进行再次扩增，第二轮 PCR 反应能否进行，是对第一轮 PCR 反应正确性的鉴定，B正确: C、由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确: D、如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D 错误。 故选 D。 （10）不对称PCR 例20.不对称PCR是用一对含量不相等的引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的技术。这两种引物一少一多，比例一般为1:50~1:100,分别称为限制性引物与非限制性引物。另外，限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同，在最初的10~15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高，从而产生大量单链ssDNA。下列说法错误的是( B ) A.最初的10~15个循环中DNA分子数将会以指数形式增长 B.非限制性引物的退火温度应低于限制性引物的退火温度 C.限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响ssDNA的产量 D.所得ssDNA可通过电泳分离、回收，然后作为DNA探针使用 【解析】PCR原理是DNA复制,最初的10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,DNA分子数将会以指数形式(2n)增长,A正确。在PCR反应的最初10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当限制性引物消耗完后,非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA,结合题干信息“在最初的10~15个循环中使用较低的退火温度,随后将退火温度提高”说明非限制性引物的退火温度应高于曠限制性引物的退火温度,B错误。单链DNA(SSDNA)的产牛肾需要用一对含量不相等的限制性引物与非限制性引物,限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同,因此限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响sSDNA的产量,C正确。所得到的sSDNA为单链DNA,探针也是单链DNA,因此可通过电泳分离、回收sSDNA,然后将其作为 DNA 探针使用.D正确。 第 11 页 共 73 页 学科网（北京）股份有限公司 $2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 核心考点DAYO8 姓名： 日期 班级： 《基因工程》-2（核酸和PCR)专题 01.遗传物质（做题时注意：对象） (I)生物界（所有生物）：因为绝大多数生物的遗传物质是DNA,所以说DNA是主要的遗传物质。 (2)具体生物：其遗传物质是DNA或RNA。(只能是一种) 原核生物（如细菌）的遗传物质是DNA,真核生物的遗传物质是RNA,T2噬菌体的遗传物质是DNA 。烟草花叶病毒的遗传物质是RNA。HIV病毒的遗传物质是RNA。 O2.基因：通常是有遗传效应的DNA片段 (I)以DNA为遗传物质的生物，基因是有遗传效应的DNA片段。 (2)以RNA为遗传物质的生物，基因是有遗传效应的DNA片段。 03.DNA的结构： 元素组成 C、HONP (1)一个双链DNA分子（链状）具有2个游离的磷酸基 此位置是氧，不是碳 团，而环状DNA分子具有0个游离的磷酸基团。1个 磷酸 脱氧核糖 含 A:腺嘌呤 脱氧核糖与1或2个磷酸基团连接。 分子 基团 5 T:胸腺嘧啶 (2)氢键的形成不需要酶，但断裂需解旋酶或高温 41 1 碱 C:胞嘧啶 基 加热处理。 32 (G:鸟嘌呤 2'号碳连“一H”而不是“一0H” (3)G一C碱基对比例越大，DNA热稳定性越稳定。 体 脱氧核苷酸 (4种 含氮碱基不同) (4)相邻的碱基在DNA分子的一条单链中通过一脱氧 游离的磷G、C间3个氢键 核糖一磷酸一脱氧核糖一相连接，互补的碱基在DNA 酸基团 氢键 磷酸 与 脱氧核的双链之间通过 相连接 Q5: 糖交替连接，排列 (5)下图表示DNA双螺旋结构的简化形式，其中①是 C用G 平面结构 Q 在外侧，构成基本骨：磷酸二酯键 ②是氢键。解旋酶作用于②部位， AT 架， 碱基排列在 限制性内切核酸酶和DNA连接酶作用于①部。 内侧，通过氢键形成 碱基对，碱基互补配 ① 对原则是A与T配 3 .5 对、G与C配对 T T AT间2个氢键 ② 两条长链按反向平行方式 G 构 盘旋成双螺旋结构 (6)核苷酸 OH 碱基 0=R-0- 碱基 OH 3" 3 3 OH OH OH H 脱氧核苷酸 核糖核苷酸 双脱氧核苷酸 OH OH OH OH 碱基 0= ~O-P≈O-P 碱基 OH ● OH OH OH 4 3 OH dNTP ddNTP:可用于DNA测序 第1页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 ATP的结构 dATP的结构 OH OH OH OH OH OH 0=P0-P0-P-0-5 腺嘌呤 O=P~O-P~0-P-0-CH2 腺嘌呤 5 OHOH OH OH OH OH 有两个特殊的化学键()： 有两个特殊的化学键（~)： 水解可释放出大量能量 H 水解可释放出大量能量 H 3 3 OH OH OH RNA的基本单位之 腺苷(A) DNA的基本单位之一 脱氧腺苷(A) (腺嘌呤核糖核苷酸) 腺苷一磷酸(AMP) (腺嘌呤脱氧核苷酸) 脱氧腺苷一磷酸(dAMP) 腺苷二磷酸(ADP) 脱氧腺苷二磷酸(dADP) 腺苷三磷酸(ATP) 脱氧腺苷三磷酸(dATP) O4.DNA的复制和PCR技术 DNA复制 PCR技术 原理 DNA半保留复制 解旋 解旋酶 高温 场所 (真核)主要在细胞核， 细胞外（在PCR仪中） 也在叶绿体、线粒体。 酶 解旋酶、普通的DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶(Taq酶)】 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成； 分别从两条链的3'端开始延伸，都是 条链不连续合成，再由 (连续不连续)合成。 DNA连接酶连接。 过程 5 3 3m影 边角 变性→发性→延迪 产物 完整DNA DNA片段（两个引物之间的DNA片段） 温度 细胞内温和条件 需控制温度，在较 (高/低)温度下 引物 RNA DNA 原料 脱氧核苷酸（或dNTP) 复制原点 0 复制方向（解旋方向】 dNTP O-P-0- 3 0 焦磷酸 50 0=P-0 0 0=P-0 0=P-0 子链5'® ®315 0 3 5'® 50 门OHOH 0-P0 0 A 可 A [四 G To 3 模板链 3®DD®5 DNA复制 5 引物 DNA复制：半保留复制、双向复制、多起点复制、 半不连续复制、边解旋边复制 (1)引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（选择性必修3P) 第2页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮：二轮均可使用） 只为蜕变清晰 (2)自然界中的DNA复制和PCR为什么都需要引物？原因是：DNA聚合酶：能够丛引物的3'(3'5 ')端开始连接脱氧核苷酸子链的延伸方向为5→3'一。【DNA聚合酶只能将单个的NTP连接 到已有片段（引物）的3'端。】 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg。 (4)在PCR过程中实际加入的为dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料， 又可为DNA的合成提供能量。（故PCR过程中不用另外加入能量） (5)PCR (可以/不可以)扩增mRNA吗？原因是：不可以直接扩增mRNA需将其逆转录为 cDNA.再进行PCR扩增。 (选择性必修3P9) RNA链DNA链 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 (RNaseH) 单链RNA 杂交双链 单链DNA 双链DNA (6)PCR技术的关键点：PCR技术是扩增两个物之间的DNA片段。 需将人工构建的限制酶识别序列添加到引物的 端（填：“5”、 “3'”) 5 5 模板DNA TI 3 目的基因 3 L 3' 5 例1.(2022，山东，节选)（②）引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物I、Ⅱ，其 连接部位如图示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的() 5' x X I 仰 布 本 A片段 -A- —A —A —A 3' A D 【答案】D 【解析】PCR技术是扩增两个引物之间的DNA片段。故选D 例2.(2025届高三调研卷·广州零模卷，T21节选)(3)采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出 现正向连接（图中箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录） 两种情况。选用引物 (填序号)进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是 0 引物① 引物② U启动子 向导RNA序列 T启动子 Cas9基因 引物③ 引物④ 【答案】引物①和引物③（或“引物②和引物④”） 正向连接时使用引物①和引物③进行P℃R可获得预期产物，反向连接无法获得扩增产物。 (8)PCR过程中，延伸时需要加入两种引物，原因是：DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能丛引物3 '端延伸DNA链、用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 05.PCR技术专题 I.PCR技术“引物”归类分析 (1)引物的设计：两种引物的要求： ①引物自身不能环化。 ②两种引物之间不能碱基互补配对 ③引物长度不宜过短，防止引物与DNA随机结合、导致引物的特异性下降。 第3页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 例3.（经典高考题节选）设计引物时需要避免引物之间发生碱基互补配对，而造成引物自连。同理也要 避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且G、C含量高的引物需 要设定更高的复性温度。 例4.(2020·山东，25节选)(1)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA,原因是引 物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。 (2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率 偏低，收获的目的基因较少，原因是引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离影响 变性)。 若对P℃R产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是引 物过短导致引物的特异性下降。 例5.(2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要 模板、 引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓 反应管 加入的单链DNA 冲液、 HO和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记 5-GCCGATCTTTATA-3' ① 的dATP) 的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已 3-GACCGGCTAGAAA-5 知形成 的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条 ② 5-AGAGCCAATTGGC-3 件下不 能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光 ③ 5-ATTTCCCGATCCG-3' 标记的 DNA探针的反应管有( 3-AGGGCTAGGCATA-5' A.①② B.②③ C.14 D.③④ 5-TTCACTGGCCAGT-3' 【答案】D 【解析】制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①试管中的两种单链能错位配 GCCGATCTTTATA-3 对GACCGGCTACA 但是配对后伸出来的游离的单链是3'末端，因缺乏模板，无法利用原料进行延 伸，因此不能得到带有荧光标记的DNA探针，①不符合题意；③试管中的两种单链可以错位局部配对 5-ATTTCCCGATCCG-3 配对后伸出来的游离单链是5'端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用碱基 3-AGGGCTAGGCATA-5 被荧光标记的ATP进行延伸的，③符合题意；②和④试管加的都是1种单链DNA,试管中存在两种可能 一是这条单链的3'端回折与自身一部分碱基配对，从而作为引物和模板，即：c CCAGI3 AACCGAGA G T C A C T T S 但是配对区只有5个碱基对，即使经过延伸最终只有8个碱基对，与题中“本实验的温度条件下不能产 生小于9个连续碱基对的双链DNA区”这句话相矛盾；二是加入适量同种单链，2条相同单链之间可以反 向互补配对成双链区。对于②试管，配对后：ARCGOITAACC6As,配对区大于9个碱基对，但因伸出 来的模板链碱基是AGA,导致延伸时碱基被荧光标记的ATP无法参入到子链合成中去，因此②不符合题 意；对于④试管，配对后：TTCACTGGCCAGT- GACCGGTCACTT-5 配对区大于9个碱基对，且伸出来的模板链碱基是TT℃， 碱基被荧光标记的dATP必然可以掺入到子链合成中去，④符合题意。综上，故选D。 (2)引物的修饰 例6.(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物 A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合 蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基 端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 能与P基因模板链3'端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，为使P℃R产物能被限制酶切割，需在引 物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_一（填“3'端”或“5'端”）。 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其 中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正 确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同， 据图分析，出现该问题的原因P基因编码链的第一个碱基与EcoR I识别序列的最后两个碱基编码一个 氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。修改扩增P基因时使用的带有EcoR I识别序列的引物来解 决该问题，具体修改方案是在引物中的coRL迟别序列3'端添加1个碱基。 第4页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用）】 只为蜕变清晰 EcoR BamH 重组载体 的部分结构 启动》 P基因 终止子 放 编码LAG的序列 EcoRI BamHI DNA编码ATG GAC..AAG GCG AAT TCA TGT GCA.GGA TCC 链氨基 Met Asp..Lys Ala Asn Ser Cys Ala Gly Ser 酸序列 FLAG 注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补链。 【解析】融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对 应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列 对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序 列改变，可通过在EcoR I识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数， 这样能保证P基因转录出的RNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 (3)引物的结合方向 例7如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： -ATGCCOTAAGTCCTACTCTAAGCCCTAGATCA-OH HO-TACGGCATTCAGGATG ACATTCGGCATCTAGT-P) 扩增X蛋白基因所需的引物序列是5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3'; 5'-TGATCTACGGCTTACA-3 【解析】书写引物序列，一般从引物的5'端向3'端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5端磷 酸基团在左侧，3'端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5'端在右侧，3'端在左侧，引物序 列为5'-TGATCTACGGCTTACA-3'。同理推测另外一条引物的序列. (4)引物的选择 例8.(2023·山东)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结 构如图甲所示，其中5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。除图甲中 标出的 启动子基因V5编码序列终止子 结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有复制原点、 标记基 F2 F1 因（答出2个结构即可）。 a链 (2)构建重组质粒后，为了确定基因连接到质粒中且插入 ,b链 方向正 确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中 R1 R2 注：F1、F2、R1、R2表示引物。 的引物 F1和R2(或F2和R1)。已知基因转录的模板链位于b链， 甲 由此可 知引物F1与图甲中基因的」 (填“a链”或“b链” 相应部 分的序列相同。 条带1 条带1 ③)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和 条带2 抗V5抗 体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图 抗J蛋白抗体抗V5抗体 乙所示 其中，出现条带1证明细胞内表达了J-V5融合蛋白 之 条带2所 检出的蛋白_ (填“是”或“不是”)由重组质粒上 的基因 表达的 【解析】(2)据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或 F2和R1。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向 应该是3'→5'，非模板链(a链)是5'→3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5'3'，引物延伸的方 向也是5→3'，所以引物结合的单链延伸方向是3'→5'；图中℉1是前引物，在左侧，所以其配对的 单链是3'→5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表 达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J-V5融合 第5页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用）】 只为蜕变清晰 蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的 蛋白不是由重组质粒上的基因表达的。 例9.(2025浙江，1月)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵 母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gd)。采用的方案是：先通过第1 次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序 列，如图所示，回答下列问题： SalI Sal I 第2次PCR 引物伽1序列引物P2序列 圆 引物P3琼列引物P4序列 第1次PCR Pst I 第2次PCR PstI (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码 子序列，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR,利用琼脂糖凝 胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器 吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要更换微量移液器的枪头。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是C。 A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (③)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstI和SalI单酶切基因组DNA后，各自用DNA连 接酶连接形成环形DNA,再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入冷却的95%酒精沉淀环形DNA。根据 第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR,最后进行测 序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 (A.P1和P2B.P3和P4C.P1 和P4D.P2和P3)。根据测序结果拼接获得完整的GPd基因序列，其中的启动子和终止子具有调控功 能。 (4)为确定克隆获得的Gd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行比对。将 Gd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿 酒酵母高效合成甘油的目的， 【解析】(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应 的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化 目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪 头，以避免交叉污染。 (2)A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA,从而出现另外一条条带， A不符合题意： B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带， B不符合题意； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA,电泳时只会出现一个条带，C符合题意 D、在基因组中存在1个与Gd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另 外一条条带，D不符合题意。 故选C。 (3)DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷 的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1与P2的序列从左向右为5'3'，与图中下边的DNA链 第6页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮：二轮均可使用） 只为蜕变清晰 部分序互补配对，引物P3与P4的序列从左向右为3'5'，与图中上边的DNA链部分序互补配对。以 环形DNA为模板进行第二次PCR时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P1和P4 ，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能 (4)为确定克隆获得的Gd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二 者相同，则说明克隆获得的Gd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重 组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 (5)引物的数量计算 ①已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点如右图所示，在第1轮循环产物中开始出现两 引物1■ ☐引物2 条单链等长的目的片段。选择性必修3P8,图3-5 引物与DNA的结合位点图 ②已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点如右图所示，在第2轮循环产物中开始出现两 引物1一 ☐引物2 条单链等长的目的片段。 引物与DNA的结合位点图 ③已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如卜图所示，在第3轮循环产物 中开始出现两条单链等长的目的片段。 一个DNA分子n次扩增， A.子代DNA分子中等长链的 文3m吧5-3' 3m吗5 33 DNA分子数为2n-2n个； 3 5I马5 -3 5吧 B.子代DNA分子中不等长链 a吧 的DNA分子数为2n个； 3′- 5'吧 C.子代DNA分子中含模板链 +3.5品吗 DNA分子数为2个； m0加3 R吧3 D.子代DNA分子中含引物A(或B)的 3' 5会mnr2 DNA分子数为2m-1个； 3' smm 3 5'豆wmmnnr E.复制过程中共需引物21-2个： 一目标序列 吧53 3 F第n次复制需要引物2n个。 -侧翼序列 3m吗53' 口引物A 品吧 口引物B 循环1： 循环2： 循环3： 变性→复性·延伸变性→复性→延伸变性→复性→延伸 Ⅱ.PCR产物鉴定—琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的H下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下 这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。P℃R的产物一般通过琼脂糖 凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的 紫外灯下被检测出来。 (2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴 定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(A) A琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA片段的大小 2000 B凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指 1000 示DNA分子的具体位置 750 琼脂糖 C.在同一电场作用下，DNA片段越长， 500 250 Lane 1:DL2000 DNA Marker 向负极迁移速率越快 100 Lane2:gfp基因PCR对照 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测 Lane3-6:各组PCR样品 出来 绿色荧光蛋白(gfp)基因相对 分子质量量为750bp左右 第7页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用）】 只为蜕变清逝 【解析】琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据 所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低 浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶 切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； 凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示 DNA分子的具体位置，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢， DNA迁移方向为从负极向正极，C错误； 琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为 300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 Ⅲ.PCR技术的应用 (I)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 o bp 例10.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重 组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条 引物在正确重组质粒中的相应位置，P℃R鉴定时应选择的一对引 物是乙和陋。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质 dq oo 粒中扩增出了400bp片段，原因是且的基因反向连接 B 【解析】如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350b即片段，反向连接则不会出现；同 理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450bp片段。根据图B进行分析，若采用引物 甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400bp片段。 (2)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 引物B 物D 3'八5 3 例11.如图为利用重叠延伸P℃R的方法在蛋白a基因中部引入定点突变 蛋白a基因 (A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋 33 3 引物A 引物C 白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入 突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说 PCRI 法不正确的是(B) 入3 PCR2 A.PCR1所用引物应为引物A和B 5' 3 B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板 PCR产物 C.PCR3无需额外加入引物 混合后复性 D.PCR4的作用是大量扩增突变基因 5' 【解析】引物与模板的3'端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物 5入 3 5 应为引物A和B,A正确： PCR3 由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物 5 为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误； PCR4 新的蛋白a基因 由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确： 注：图中“入”为碱茶序列变化点 PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。 基因A 基因B Sac I (3)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 物1 引物 物3 Spe I 引物 启动子 中叶绿体同源 重组基树1 例12.融合PCR技术是采用具有互补末端 标记基因发 SpeI 口的基因 体叶绿体同源 的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的 终止 、2重组基因2 方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1 Sal l Sac 和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构 建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制 第 定点整合 酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点 A.B融合基因 表达载体 整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重 引物1 引物4 组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定 Kpn I Sal I 图1 图2 第8页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 位点上。请据图回答下列问题： (I)图1第一阶段中PCR至少进行2次循环，才能获得双链等长的DNA,第二阶段中引物2与引物3部分 碱基的互补配对关系使得两DA能成功“搭桥”连接起来。 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中 能够起着“搭桥”作用的引物有6种 (3)图2中需使用SDeL、SalL(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途 中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。 【解析】(1)分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增（循环），得到的含有引物2、 引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增（循环），才能获得双链等长的DNA。第二 阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 (2)图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“ 搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要 设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。 3)图2显示：启动子和终止子的两端分别有SpeI和SlI的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也 存在SpeI和SalI的识别位点，因此图2中需使用SpeI、SalI和DNA连接酶将两中间载体构建成定 点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。 (4)利用反向PCR技术扩增未知基因序列 例13.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简 染色体DNA 捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图（以ECoR I酶切为例)。请据图回答问题： I酶切EcoR1 GAATTC CTTAAG (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物， 混合的DNA片段 步骤Ⅲ选用的引物必须是②④（从表格引物①②③④中选 择，填编号)。 5木知序列已知序列 3 未知序列 占片段F Ⅱ连接 DNA连接酶 名称 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知序列 些 已知S'-AACTATGCGCTCATGA GCAATGCGTAGCCTCT-3 PCR引物 环状DNA 序列3'TTGATACGCGAGTACT---- -CGTTACGCATCGGAGA-5' EcoR I O5'-AACTATGCGCTCATGA-3' Ⅲ扩增，Tag DNA聚合酶 25'-GCAATGCGTAGCCTCT-3 PCR产物 引物 35-AGAGGCTACGCATTGC-3 N测序、分析 3片段F的 45-TCATGAGCGCATAGTT-3 完整序列 反向PCR示意图 (②)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单 链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是B。 A.5'-AACTATGCG------AGCCCTT-3' B.5'-AATTCCATG CTGAATT-3' C.5'-GCAATGCGT- 一一一 TCGGGAA-3' D.5'-TTGATACGC- -CGAGTAC-3' 【解析】(1)由于已知序列的外侧是未知序列（如图中待扩增的未知序列），因此无法设计引物。若要分 析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分 为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA,用DNA连接酶将其连接成环，即图中I酶切和I连 接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向 未知序列方向进行反向扩增，利用Tag DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA,即图中 Ⅲ扩增过程。采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5'→3'，可根据已知序列3 -AGTACTCGCGTATCAA-5'和3'-CGTTACGCATCGGAGA-'5,设计对应PCR引物是5 -TCATGAGCGCATAGTT-3'5-GCAATGCGTAGCCTCT-3', 第9页共13页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用）】 只为蜕变清晰 (2)对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，所以5'端应该是 AATTC,对应F片段的开头，故选B。 例14.(2023·浙江)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 Gta3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR 扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示 下列叙述正确的是(B) Gata3 非编码区 A.Gata3基因的启动子 启动子区 编码区 30 插入前 44 无法控 制GFP基因的表达 大片段 GFP B.翻译时先合成Gata3 启动子区 编码区|非编码区 3 蛋白，再 合成GFP蛋白 插入后 小片段 引物3 物2 C.2号条带的小鼠是野 生型，4 图甲 图乙 号条带的小鼠是 Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 (⑤)实时荧光定量PCR 【解析】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可 以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5'3'，刚好是翻译的方向，所以 翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只 有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。 故选B。 引物1 R 例15.实时荧光定量PCR简称qPCR,灵敏度高特异性好 3' 5荧 是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的 5' Tagman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的 ∑R☒ 引物2 热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶 切断，在特定光激发下发出荧光 (如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加， 通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（该值与待测样本中目 51 一3 的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是(A) 注：R表示荧光基因，Q表示淬灭基因。 A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团 12000 B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1 照11000 种引物和1种Tagman探针 宋10000 9000 C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能 8(000 量 7(000 D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明 60(0 5000 含有的病变的概率越小 4000 【解析】DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个 3000 2000 游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团， Ct值 阈值 1000 A正确： 0 做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引 02468101214161821022242628300323436384042 循环次数 物和1种Taqman探针，B错误； 在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误： 若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基 因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。 第10页共13页2026年高考核心考点填空(一轮•二轮均可使用) 只为蜕变清晰 核心考点 DAY 08 姓名： 日期： 班级： 《基因工程》-2（核酸和PCR）专题 01.遗传物质（做题时注意：对象） （1）生物界（所有生物）：因为绝大多数生物的遗传物质是DNA,所以说 。 （2）具体生物：其遗传物质是 。(只能是一种) 原核生物（如细菌）的遗传物质是______，真核生物的遗传物质是_____，T2噬菌体的遗传物质是 。烟草花叶病毒的遗传物质是______。HIV病毒的遗传物质是________。 02.基因：通常是 。 （1）以DNA为遗传物质的生物，基因是 。 （2）以RNA为遗传物质的生物，基因是 。 03.DNA的结构： （1）一个双链DNA分子(链状)具有 个游离的磷酸基团，而环状DNA分子具有 个游离的磷酸基团。1个脱氧核糖与 个磷酸基团连接。 （2）氢键的形成不需要酶，但断裂需 或 处理。 （3）G-C碱基对比例越大，DNA热稳定性越 。 （4）相邻的碱基在DNA分子的一条单链中通过—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—相连接，互补的碱基在DNA的双链之间通过 相连接。 （5）下图表示DNA双螺旋结构的简化形式，其中①是 ，②是 。解旋酶作用于 部位，限制性内切核酸酶和DNA连接酶作用于 部位。 （6）核苷酸 04.DNA的复制和PCR技术 DNA复制 PCR技术 原理 解旋 场所 （真核）主要在 ， 也在 、 。 细胞外（在PCR仪中） 酶 、普通的 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链 合成，再由 连接。 分别从两条链的 端开始延伸，都是 （连续/不连续）合成。 过程 边 边 → → 产物 完整DNA 温度 细胞内温和条件 需控制 ，在较 （高/低）温度下 引物 原料 脱氧核苷酸（或dNTP） dNTP 焦磷酸 子链 模板链 DNA复制 DNA复制：半保留复制、双向复制、多起点复制、 半不连续复制、边解旋边复制 （1）引物： （选择性必修3P77） （2）自然界中的DNA复制和PCR 为什么都需要引物？原因是：DNA聚合酶：能够从 的 （3′/5′）端开始连接脱氧核苷酸，子链的延伸方向为 → 。【DNA聚合酶只能将单个的dNTP连接到已有片段（引物）的 3′ 端。】 （3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加 。 （4）在PCR过程中实际加入的为 (dATP、dGTP、dTTP、dCTP) ，既可作为合成DNA子链的 ，又可为DNA的合成提供 。（故PCR过程中不用另外加入能量） （5）PCR （可以/不可以）扩增 mRNA 吗？原因是： 。（选择性必修3P79） （6）PCR技术的关键点：PCR技术是扩增 的DNA片段。 需将人工构建的限制酶识别序列添加到引物的 端（填 : ”5′ ”、”3′ ”） 例1.（2022，山东，节选）(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（ ） 例2（2025届高三调研卷·广州零模卷，T21节选）（3）采用单酶切后进行连接反应，T 启动子容易出现正向连接（图中箭头向右，目的 基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选 用引物 （填序号）进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是 。 （7）PCR过程中，延伸时需要加入两种引物，原因是: 。 05.PCR技术专题 Ⅰ.PCR技术“引物”归类分析 （1）引物的设计：两种引物的要求： ①引物自身不能 。 ②两种引物之间不能 。 ③引物长度不宜过短，防止引物 。 例3.(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。 例4.(2020·山东，25节选)（1）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________。 (2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是_____________________________________________。 若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。 例5.(2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( ) A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④ （2）引物的修饰 例6.(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。 据图分析，出现该问题的原因是_____________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________ ____________________________________________________________________________________。 （3）引物的结合方向 例7.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________；__________________________。 （4）引物的选择 例8.（2023·山东）科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 例9.（2025•浙江，1月）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 （5）引物的数量计算çç ①已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNAçç 的结合位点 如右图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两 条单链等长的目的片段。 选择性必修3P78,图3-5 ②已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点 如右图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两 条单链等长的目的片段。 ③已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如下图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 一个DNA分子n次扩增， A.子代DNA分子中等长链的 DNA分子数为________个； B.子代DNA分子中不等长链 的DNA分子数为_____个； C.子代DNA分子中含模板链 DNA分子数为_____个； D.子代DNA分子中含引物A(或B)的 DNA分子数为________个； E.复制过程中共需引物________个； F.第n次复制需要引物______个。 Ⅱ.PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上 电荷或 电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过 电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 和 等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的 下被检测出来。 (2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴 定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( ) A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指 示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，琼脂糖 向负极迁移速率越快 Lane 1:DL2000 DNA Marker Lane 2:gfp基因PCR对照 Lane 3-6:各组PCR样品 绿色荧光蛋白(gfp)基因相对 分子质量量为750 bp左右 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 Ⅲ.PCR技术的应用 (1)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 例10.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________。 (2)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 例11.如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说法不正确的是( ) A.PCR1所用引物应为引物A和B B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板 C.PCR3无需额外加入引物 D.PCR4的作用是大量扩增突变基因 (3)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 例12.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题： (1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。 (3)图2中需使用______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。 (4)利用反向PCR技术扩增未知基因序列 例13.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题： (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。 (2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。 A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′ B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′ C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′ D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′ 例14.（2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 (5)实时荧光定量PCR 例15.实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光 (如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是( ) A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团 B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman探针 C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量 D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 (6)“双脱氧法”基因测序 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 例16.(双选)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ） A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G (7)不对称PCR 例17.(2025·广州市三模)不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR 的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a 个，6次循环后开始扩增产生ssDNA 。下列叙述错误的是( ) 。 A.限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计 B.据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同 C.上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的 3′端延伸 D.该不对称PCR过程中需要(26−1)a 个限制性引物 （8）大引物PCR 注：基本原理是通过两个端引物，和一个带有预设突变的内部诱变引物，获得定点突变产物 例18：下图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变，下列说法错误的是( ) A.第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能 进行转录和翻译 D. 为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不 同的复性温度 （9）巢式PCR 19.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( ) A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为 　单链DNA片段 B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮 　PCR反应正确性的鉴定 C.由于和两套引物都互补的靶序列较少， 　该技术可大大提高扩增的特异性 D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 （10）不对称PCR 例20.不对称PCR是用一对含量不相等的引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的技术。这两种引物一少一多，比例一般为1:50~1:100,分别称为限制性引物与非限制性引物。另外，限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同，在最初的10~15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高，从而产生大量单链ssDNA。下列说法错误的是( ) A.最初的10~15个循环中DNA分子数将会以指数形式增长 B.非限制性引物的退火温度应低于限制性引物的退火温度 C.限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响ssDNA的产量 D.所得ssDNA可通过电泳分离、回收，然后作为DNA探针使用 第 1 页 共 10 页 学科网（北京）股份有限公司 $核心考点08：基因工程-2（核酸和PCR） 02 2026届•高考•生物学复习 教师：鱼票月半 课节： 微信 公众号 鳔 鳔 概念模型 深度扩展：PCR技术的理解和计算 第3轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，占所得DNA分子的比例为1/4。（等长的DNA数=2n-2n） 待扩增的DNA 引物2 引物1 样品DNA变性 在与引物结合 合成DNA 合成DNA 合成DNA DNA变性 在与引物结合 DNA变性 在与引物结合 鳔 鳔 方法指导： 关键点 : PCR技术是扩增两个引物之间的DNA片段。 （热稳定）DNA聚合酶：只能将单个的dNTP连接到引物的3′端。（子链的合成方向：5′→3′） 将人工构建的限制酶识别序列添加到引物的 端（填 : ”5′ ”、”3′ ”） 5′ 鳔 鳔 （2022，山东，节选）(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（ ） 在第一次PCR循环结束后，得到以引物Ⅱ延长得到的单链。在以后的PCR循环中，以引物Ⅱ所形成的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数倍数扩增，实验结束得到的绝大部分DNA片段是选项中的D。 D 鳔 鳔 （2025届高三调研卷·广州零模卷，T21节选）（3）采用单酶切后进行连接反应，T 启动子容易出现正向连接（图中箭头向右，目的 基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选 用引物____（填序号）进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是____。 引物①和引物③ (或“引物②和引物④”) （2分） 正向连接时使用引物①和引物③进行PCR可获得预期产物，反向连接无法获得扩增产物。 鳔 鳔 一 核心提炼 PCR技术的基础知识 Enter your title related content here, control the font size and line spacing, keep the language short and to the point, made by global 01. 鳔 Ⅰ.两种引物的要求： ①引物自身不能环化 ②两种引物之间不能互补配对 ③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 考点1.PCR技术的基础知识 1.PCR技术“引物”归类分析 （1）引物的设计 Ⅱ.延伸时需要加入两种引物，原因是: . DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 鳔 鳔 例1(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。 碱基互补配对 G、C含量高 鳔 鳔 例2.(2020·山东，25节选)（1）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是____________________________________ ____________________________________。 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合 成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是_______________________________________________________________。 若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。 引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性) 引物过短导致引物的特异性下降 鳔 鳔 例1.(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是____________________________________________ _____________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对 的短单链核酸 5′端 考点1.PCR技术的基础知识 1.PCR技术“引物”归类分析 （2）引物的修饰 鳔 鳔 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。 鳔 鳔 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。 据图分析，出现该问题的原因是___________________________________ _______________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________。 P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识 别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基 鳔 鳔 融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合 蛋白中FLAG的氨基酸序 列正确，但P基因对应的 氨基酸序列与P不同，说 明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 鳔 鳔 如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________________； ______________________________。 5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′ 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′ 书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推测另外一条引物的序列。 考点1.PCR技术的基础知识 1.PCR技术“引物”归类分析 （3）引物的结合方向 鳔 鳔 (2023·山东，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 F1和R2(或F2和R1) a链 考点1.PCR技术的基础知识 1.PCR技术“引物”归类分析 （4）引物的选择 鳔 鳔 据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引 物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 鳔 鳔 (2)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋 白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 J－V5融合蛋白 不是 鳔 鳔 重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细 胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 鳔 鳔 (1)如图：一个DNA分子n次扩增， ①子代DNA分子中等长链的 DNA分子数为________个； ②子代DNA分子中不等长链 的DNA分子数为_____个； ③子代DNA分子中含模板链 DNA分子数为_____个； ④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个； ⑤复制过程中共需引物________个； ⑥第n次复制需要引物______个。 2n－2n 2n 2 2n－1 2n＋1－2 2n 考点1.PCR技术的基础知识 1.PCR技术“引物”归类分析 （5）引物的数量计算 鳔 鳔 (2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 2 考点1.PCR技术的基础知识 1.PCR技术“引物”归类分析 （5）引物的数量计算 鳔 鳔 (2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( ) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳 鳔 鳔 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； 凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误； 琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为 300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 鳔 鳔 (2024·全国)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是（    ） A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤ B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带 C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同 D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2 D 鳔 鳔 【详解】A、由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A/a为上部两条带的等位基因，B/b为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1为AAbb，P2为aaBB，F1为AaBb，F2中①AaBB②Aabb都为杂合子，③AABb占F2的比例为1/8，⑤AABB占F2的比例为1/16，A正确； B、电泳图中的F2的基因型依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有3条带，B正确； C、③AABb和⑦aabb杂交后代为Aabb、 AaBb，其PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同，C正确； D、①AaBB自交子代为，AABB（1/4）、AaBB（1/2）、aaBB（1/4），其PCR产物电泳结果与④aaBB电泳结果相同的占1/4，D错误。故选D。 鳔 鳔 （2023·北京·节选）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。 (1)我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是___________。 (2)科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→___________→电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为___________条。 黄花叶 限制酶B处理 3 鳔 鳔 【详解】（1）野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，由此可以推测黄化叶是隐性性状。 （2）检测F2基因型的实验步骤为：：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳。野生型基因电泳结果有一条带，叶黄化的基因电泳结果有两条带，则F2中杂合子电泳条带数目应为3条。 鳔 鳔 （2024·江西·节选）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。 碱基对缺失 鳔 鳔 （2024·江西·节选）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 3 1 1：1 鳔 鳔 【详解】（1）图示为在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物，c基因是C基因突变而来，c基因两侧的碱基序列与C基因相同，PCR扩增也能扩增c基因，由图可知，泳道1是突变体Cer1，则扩增c基因时两引物间的长度为1100bp，泳道2是野生型（WT，纯合体），则扩增C基因时两引物间的长度为2000bp，说明c基因比C基因长度变短，是碱基对的缺失引起的突变。 （2）突变体Cer1为cc，纯合野生型为CC，则F1为Cc，F1与突变体Cer1杂交后代中Cc：cc=1：1，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道3和泳道1中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1：1； 鳔 鳔 应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_______ ___________。 为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相 (1)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 目的基 乙和丙 因反向连接 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 鳔 鳔 如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还 是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。 鳔 鳔 如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。 下列说法不正确的是( ) A.PCR1所用引物应为引物A和B B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板 C.PCR3无需额外加入引物 D.PCR4的作用是大量扩增突变基因 B 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 (2)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 鳔 鳔 引物与模板的3′端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B，A正确； 由图可知，PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCR1和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错误； 由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确； PCR4的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正确。 鳔 鳔 (3)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因 融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整 合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题： 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 鳔 鳔 (1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 2 互补配对 分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 鳔 鳔 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。 8 6 图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。 鳔 鳔 (3)图2中需使用______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。 Spe Ⅰ、Sal Ⅰ 复制原点 图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2中需使用Spe Ⅰ、Sal Ⅰ和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。 鳔 鳔 (4)利用反向PCR技术扩增未知基因序列 如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 鳔 鳔 请据图回答问题： (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。 名称 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 5′-AACTATGCGCTCATGA－－－－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′ 3′-TTGATACGCGAGTACT－－－－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′ 引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ ②④ 鳔 鳔 由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。 鳔 鳔 第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′→3′，可根据已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和 3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，设计 对应PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′， 鳔 鳔 (2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。 A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′ B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′ C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′ D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′ B 对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。 鳔 鳔 （2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 B 鳔 鳔 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。 故选B。 鳔 鳔 实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。 (5)实时荧光定量PCR 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 鳔 鳔 下列有关叙述正确的是( ) A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸 基团 B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的 核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman 探针 C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新 链的合成提供能量 D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循 环数越少，说明含有的病变的概率越小 A 鳔 鳔 DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确； 做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误； 在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误； 若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。 鳔 鳔 DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( ) A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④ (2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链 D 鳔 鳔 制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①试 管中的两种单链能错位配对　 　　　　　，但是配对后伸出来的游离的单链是3′末端，因缺乏模板，无法利用原料进行延伸，因此不能得到带有荧光标记的DNA探针，①不符合题意； ③试管中的两种单链可以错位局部配对 ，配对后伸出来的游离单链是5′端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用碱基被荧光标记的dATP进行延伸的，③符合题意； 鳔 鳔 ②和④试管加的都是1种单链DNA，试管中存在两种可能：一是这条单链的3′端 回折与自身一部分碱基配对，从而作为引物和模板，即 ，但是配对区只有5个碱基对，即使经过延伸最终只有8个碱基对，与题中“本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”这句话相矛盾；二是加入适量同种单链，2条相同单链之间可以反向互补配对成双链区。对于②试管，配对后： ，配对区 大于9个碱基对，但因伸出来的模板链碱基是AGA，导致延伸时碱基被荧光标记的dATP无法掺入到子链合成中去，因此②不符合题意； 鳔 鳔 对于④试管，配对后： ，配对区大于9个碱基 对，且伸出来的模板链碱基是TTC，碱基被荧光标记的dATP必然可以掺入到子链合成中去，④符合题意。综上，故选D。 鳔 鳔 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 (6)“双脱氧法”基因测序 鳔 鳔 (双选)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ） A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的 一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G AC 鳔 鳔 利用双脱氧测序法时，PCR反 应体系中加入的模板是待测的 单链DNA，故只需加入一种引 物，A正确； 电泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B错误； 根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′-CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。 鳔 鳔 (2024·广东茂名三模)不对称 是利用不 等量的一对引物来产生大量单链 的方法。加入的一对引物中含量较少的被称 为限制性引物，含量较多的被称为非限制性 引物。 的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链，但当限制 性引物消耗完后，就会产生大量的。不对称 的简单过程如图所示。假设模 板分子初始数量为 个，6次循环后开始扩增产生 。下列叙述错误的是 ( ) 。 考点1.PCR技术的基础知识 2.PCR技术的应用 (7)不对称PCR 鳔 鳔 下列叙述错误的是( ) 。 A.限制性引物和非限制性引物均需要依据模板 的碱基序列来设计 B.据图可知，最后大量获得的 与图中甲链的碱基序列相同 C.上述过程中子链分别沿限制性引物的端、非限制性引物的 端延伸 D.该不对称过程中需要 个限制性引物 C 鳔 鳔 [解析] 扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物 和非限制性引物均需要依据模板 的碱基序列来设计，A正确；当限制性引物的 浓度降低，甚至基本耗尽时，双链 的合成速率显著下降，此时非限制性引物将 继续引导单链 的合成，非限制性引物与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初 始中一条链的拷贝（非限制性引物引导合成的单链），最后大量获得的 与图中甲链的碱基序列一致，B正确；扩增时耐高温的 聚合酶将4种脱氧核苷酸 连接至引物的端，C错误；扩增时引物是新子链的一部分，假设模板 分子 初始数量为个，6次循环后产生个分子，因此该不对称 过程中需要 个限制性引物，D正确。 鳔 鳔 鳔 谢谢支持 Enter your title related content here, control the font size and line spacing, keep the language short and to the point, made by globa, Enter your title related content here, control the font size and line spacing $