核心考点 DAY 08 基因工程-1-2026年高考生物总复习核心考点通关8天必背

2026年高考核心考点填空(一轮•二轮均可使用) 只为蜕变清晰 核心考点 DAY 08 姓名： 日期： 班级： 《基因工程》-1专题 1.DNA的粗提取和鉴定 (1)提取DNA的原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA,去除 其他成分。 如：①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在NaCI溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCI溶液中的溶解度不同，它能溶于 的NaCl溶液。 (2)鉴定DNA的原理：在一定温度下( 加热)，DNA遇二苯胺试剂会呈现 。 （2025·江苏·节选）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： 研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① ，加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR 2.DNA的电泳鉴定 （1）原理 电泳原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过 电泳来鉴定 迁移速率 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的 、DNA分子的 和 等有关 DNA检测 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的 灯下被检测出来 （2）步骤 注入 将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶(凝胶中含 )的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm,待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 （3）知识延伸 DNA标准参照物 一种用于确定目的DNA片段大小的标准参照物，具有特定的DNA分子大小，一般置于第一个点样孔中，标识样品的DNA大小 核酸染料和指示剂 指示剂 是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA分子，但 （与/不与）DNA结合，指示剂在电泳时移动较快且 （能/不能）被肉眼观察到，用于指示样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚蓝(蓝紫色)和二甲苯青(蓝色)。 核酸染料 核酸染料是一类 （能/不能）够与DNA或RNA分子结合，并在特定条件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的 。 （2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（   ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小  B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置  C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快  D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 3.基因工程的定义：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 （1）原理: 。 （2）操作对象: 。 （3）操作水平: 水平。 （4）操作环境: 生物 （体内/体外）进行。 （5）结果： 。 （6）优点：① 。（与诱变育种相比） ② 等。（与杂交育种相比） （7）不同生物的DNA能够链接成功的原因是 。 4.基因工程的工具酶 （1）功能 原理 能够识别 分子的 序列,并使每一条链中特定部位的 断开。 特点 限制酶的 和 具有特异性（限制性，专一性），使用不同的限制酶可以切割不同的核苷酸序列。 类型 黏性末端（如：EcoR I） 平末端(如：Sma I) 在中轴线（图中虚线）的两侧，限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，碱基正好互补配对，因此称这些片段为 。 不产生单链的黏性末端。 应用 ①限制酶一般用于切断DNA片段，获取 ，为目的基因连接表达载体做准备。 ②由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA连接时具有特异性，因此在实验设计中，通常选择切割后形成 末端的酶，而避免使用切割后形成 末端的酶。 思考 ①原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 答：原核生物中限制酶的作用是切割 （内源/外源）DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 ②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 答：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中 或 。 （2）特殊限制酶 同裂酶 异裂酶 同尾酶 识别 序列，切割 位点，产生相同的黏性末端（但反应条件可能不同） 识别 序列，但切割 位点。 识别 序列，产生 的黏性末端。 Sph I Bbu I Sma I Xma I 异端同尾酶 异长同尾酶 Bam I Bgl II Sau 3A I 【教材深挖】选择性必修3P74，拓展应用，1 1.有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1) 哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的 DNA片段相连接?为什么? (2) 不同的限制酶切割可能产生相同的 黏性末端，这在基因工程操作中有什 么意义? 答：同尾酶使构建载体时，切割位点的选 择范围 （缩小/扩大）。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好没有该限制酶的识别序列，这时可以考虑用合适的 酶（目的基因的核苷酸序列中不能有该酶的识别序列）来获取目的基因。 例1.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是(　　) A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接 C.a酶与b酶切断的化学键不相同 D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序列会明显增多 (2)DNA连接酶（连接两个DNA片段） E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接 （黏性末端/平末端/黏性末端和平末端）。但E.coli DNA连接酶连接双链DNA片段的平末端效率远比T4 DNA连接酶的效率 （低/高）。 例3.说出下列过程参与的酶（写在箭头下面） 例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（　　） ① ② ③ ④ A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ 、 。 方法：将某一个黏性末端旋转 度。 提升：理解重组质粒和反义质粒 （3） 运载体： ①基因在细胞中的稳定复制需要有 ，基因的表达则需要 和 ，在研究中一般通过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的是 ，其他运载体有 （病毒具有特异性） ②质粒 定义 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞 DNA之外，并具有自我复制能力的环状 （单链/双链）DNA分子 原理 将目的基因插人质粒中，并导入 细胞，可以在受体细胞内稳定 和 来源 来自细菌或酵母菌，天然质粒 （需要/不需要）人工改造 种类 根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体 。此外，有些载体还能起到基因编辑、 基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。 结构 功能 复制原点 复制起始位点，使目的基因稳定遗传 启动子和终止子 促进目的基因的表达 标记基因 多个酶切位点 方便对基因进行插入或其他操作 标记基因的 类型 标记基因是质粒上目的基因之外的另外一个基因，可以控制一些易于筛选和检测的性状，便于重组DNA分子的筛选。基因工程中常用的标记基因有四种，分别是抗生素抗性基因、荧光基因、营养物质合成基因、LacZ基因。 抗性 基因 将抗生素抗性基因的载体导人 （敏感型/抗性型）的宿主细胞中，并在培养基中添加抗生素或除草剂，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗性可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、 四环素抗性基因(TetR)及卡那霉素抗性基因(KanR)等 影印法：例5.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr 或Tetr 中会导致相应的基因失活（Ampr 衣示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH l酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 未被转化的大肠杆菌； 含有质粒载体的大肠杆菌； 含有环状目的基因的大肠杆菌； 含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 (1） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅 含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 (2） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中， 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含 培养基。图中 （菌落号数）就是插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 荧光 基因 荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激发出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因转入各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成功。 例6. （2021年6月浙江选考试题）采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（   ） A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液 B．基因编辑处理的受精卵在体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达EGFP的小鼠 C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠 D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎 例7.（2023年6月浙江选考试题,T19）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（    ） A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合 营养物质合成 基因 用营养缺陷型的微生物作为转基因的 时，可以使用营养物质合成基因作为标记基因，例如，与野生型相比，亮氨酸合成缺陷型酵母菌在 (含/不含）亮氨酸的培养基中不能生存，将亮氨酸合成基因作为标记基因导入亮氨酸合成缺陷型酵母菌，在不含亮氨酸的培养基上转入成功的酵母菌可以形成菌落，转入失败的酵母菌不能生存。 没有找到病毒作为运载体的题目，以缺陷型细菌的筛选为例了解一下营养合成缺陷基因。 例7. 菌种M和茵种N在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状的融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种M为组氨酸依赖(组氨酸合成相关基因突变为B-),菌种N为色氨酸依赖(色氨酸合成相关基因突变为A-),下列分析错误的是( ) A.菌种M和N可通过人工诱变和选择性培养选获得 B.用PEG诱导融合之前需要去除菌种M和N的细胞壁 C.在培养基X中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌 D.从培养基X中分离出的杂种融合菌P对两种氨基酸均不依赖 LacZ基因（显色法），常用蓝白斑筛选法 LacZ基因（显色法），常用蓝白斑筛选法 图示中,菌落1、2、5、6呈蓝色，是导入 的受体菌。 【教材深挖】选择性必修3P98，复习与提高，1 例8.1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。回答问题： 【我们假设：在②步中使用单酶切】 （1）在②步中，应怎样选择限制酶？ 答：第一，应选择用 （相同/不同）的限制酶或切割能产生 （相同/不同）末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段； 第二，注意限制酶的切割位点 （能/不能）位于目的基因的内部，以防破坏目的基因,限制酶也不能破坏质粒的 、 、 、复制原点等结构。 （2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质? （3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势? 答：该质粒便于进行 筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了 的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈 色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈 色。 （4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什!么颜色?为什么? 答：有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因插入 了LacZ基因的结构，使其不能正常表达成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。 附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连接，为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是 。 ③病毒载体：动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载体。如腺病毒载体、慢病毒载体等，但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌体载体也是常用工具之一。 图示中,菌落1、2、5、6呈黑色，是 的受体菌。 图示中,菌落3呈蓝色，是导入 的受体菌。 慢病毒是一种RNA逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA上，从而实现稳定的遗传 腺病毒是一种DNA病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA进行转基因、基因编辑、基因沉默等操作 λ噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA上，经过改造的 λ 噬 菌 体 可 以 不 裂解宿主细胞，从而作为基因载体 没有找到病毒作为运载体的题目，以噬菌体的筛选为例了解一下双层平板法。 例8.双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%的培养基熔化并冷却至45-48℃,然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体，根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是( ) A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择 培养基选择出噬菌体的宿主细胞 B.加入混合液后，使用灭菌后的涂 布器将混合液均匀地涂布在培养基表面 C.上层培养基中琼脂浓度较高，因 此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 D.双层平板法获得的噬菌斑不易 发生上下重叠现象 5. 目的基因的筛选与获取 （1）真核生物、原核生物基因的结构和表达 （2）目的基因的筛选与获取 随着 技术的发展，以及 （如GenBank）、 （如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 ① 从基因文库中直接获取 文库的构建 部分基因文库（如cDNA文库）构建 基因组文库 cDNA文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间的基因交流 ② 人工合成 前提：基因比较 （大/小）、核苷酸序列 （未知/已知） 方法：通过 用化学方法直接合成目的基因 逆转录法 即以 作为模板，在 酶的作用下合成 ，若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构的特点是 。 化学合成法(蛋白质工程) P94 A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是 → → → 。 B. 化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？ 。 C.若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能有 （一种/多种）；理由是 。 D.化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求 ③ 利用PCR获取和扩增目的基因 A. RCR概念：PCR是 的缩写，是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对 进行 的技术。 B. 条件: 前提条件： 。 一定的缓冲溶液(含 )、DNA模板、 种引物、4种 （dNTP）、 的DNA聚合酶、控制温度使DNA复制在 反复进行 a.引物： 【定义】引物是 （单链DNA或单链RNA）。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸的 。 【设计原则】 ; ; 。 【作用】2种，引物的 端分别与两条模板链 端结合，为DNA聚合酶提供了游离的 端，使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。 b.4种脱氧核苷酸：合成DNA子链的原料(dNTP，包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP),又提供 。 c.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。 d.模板DNA 条母链:提供DNA复制的模板 e.耐高温的DNA聚合酶（ ）:催化合成DNA子链。 f.高温：断开氢键，打开DNA双链。（体内进行DNA复制时需要 断开氢键。） C. 过程：P78 变性：温度上升到 ℃以上，双链 DNA解聚为 复性：当温度下降到 ℃左右时， 种引物通过碱基互补配对与 条单链DNA结合。 延伸：温度上升到 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下合成新的DNA链。 B B B B A A A A B B B B B B B B B B A A A A A A A A A A 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第N次 DNA总数 21 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链DNA 【等长的DNA分子数（目的基因）】 含引物A(或B)的DNA 6. 基因工程的核心—— 构建基因表达载体的目的是：让目的基因在受体细胞中 存在, 并且 给下一代；使目的基因能够 和 作用。 （1）启动子 ①本质：一段有特殊序列结构的 片段 ②功能： ③诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活 或抑制目的基因的表达。 ④启动子具有物种和组织 性：即只有使用受体生 物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。 如：利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。 科学家将药用蛋白基因与 的启动子 等调控元件重组在一起，通过 的方法导入哺乳动物的 中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入 期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为 或乳房生物反应器。 又如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 。 （2）终止子： ①本质：一段有特殊序列结构的 片段 ②功能：使 在所需要的地方停下来。 综上可知目的基因必须插入 和 之间。 （4） 复制原点：使能完成自主 。 （2025年四川，保证载体能在XX细胞中能正常复制） 单酶和双酶切割比较: 单酶切：获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上 述情况发生，可采取的措施是 。 双酶切的优点：①防止质粒自身环化 ②防止目的基因自身环化 使质粒和目的基因正确（正向）连接 ③避免目的基因和质粒的随意连接 （详见：第4页的重组质粒和反义质粒） 提升：正向连接质粒和反向连接的质粒的筛选 方法一：酶切法 例8.(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。 例9.（2025·山东·21节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 方法二：PCR 例10.(高考题节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 。 【能力提升】：重点难点·透析（基因表达载体的构建） 1.限制酶的选择 (1)目的基因 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶 。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择 和 两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 (2)质粒 (3)Ti质粒的T－DNA片段 T- DNA上也要有标记基因，筛选 。 例11.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 (1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。 例12.（2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1-4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 例13.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 2.注意教材上的两句话 （1）P72，在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。 （2）P82，基因表达载体的构建的方法也不是千篇一律的。 例13.（2025·周测8）MseⅠ（GAAT↓TAATTC）、PstⅠ（C↓TGCAG）、EcoRⅠ（G↓AATTC）三种限制酶的识别序列及切割位点,下图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。 若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ） A. 限制酶PstⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶 B. 限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶 C. 限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶 D. 限制酶PstⅠ、限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶 例14.（2025·周测8）研究人员利用Ti质粒构建p—H5/H3共表达重组质粒（如下图)。设计思路是：获得H5基因和H3基因，先将H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有 NheⅠ和 XhoⅠ酶切位点）上，再将H3基因插入，获得重组质粒。为达到实验目的，需在H5基因两端分别引入___________和_________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR过程中，通过设计使其出现在_______中，进而出现在H5基因中。 3.启动子 （1）启动子具有物种和组织特异性(选择性必修3P90)。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。 （2）诱导型启动子（选择性必修3P80） 例15.（2024年河北卷，T22）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 例16.（2024年广东五校联考）利用细菌靶向给药在肿瘤治疗领域受到广泛关注。科研人员改造大肠杆菌，制造出能定点、可控表达治疗性抗体的工程菌。回答下列问题： (1) 聚焦超声能使肿瘤部位的温度从37℃提升至42℃，可作为工程菌的“温度开关”。研究人员筛选出3种转录抑制蛋白，37℃时，转录抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制下游绿色荧光蛋白（GFP）基因的转录；42℃时，转录抑制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结合。 ①研究人员构建了下图所示表达载体，以筛选最佳感温元件。除图中所含元件外，表达载体还必须具有             和氨苄青霉素抗性基因、限制酶酶切位点等元件。长时间培养时在培养液中加入氨苄青霉素，其作用是            。（写出两点即可） ②检测导入不同转录抑制蛋白基因的大肠杆菌在不同温度下的荧光强度，结果如下图所示。最终选择转录抑制蛋白 （填“A”或“B”或“C”）来构建工程菌，理由是 。 (2)上述表达载体仅在42℃时表达，而肿瘤治疗需要长期进行。科研人员继续对表达载体进行如下图所示改造，整合酶可将P7序列进行一次永久性翻转。请预测以下培养条件下改造后的工程菌菌落的颜色：Ⅰ.37℃培养 ；Ⅱ.42℃培养 ；Ⅲ. 42℃处理1h后，37℃培养 。（填“无色”或“绿色”） (2) 为得到可用于肿瘤治疗的工程菌，需进一步改造上述工程菌。请选择下图中 X、Y、Z三个位点中的一个作为治疗性抗体编码基因的插入位点 。 例17.（2025·广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 4 4 .Ti质粒 例18.(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则： (1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。 (3) 已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ， 图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ， 依据是 。 例19.（CS周练18，6）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。农杆菌的Ti质粒的T-DNA上含有抗甘草磷除草剂基因，相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 （1）利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为                         。 （2）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是 。 例20.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 7. 将目的基因导入受体细胞 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 和 的过程。实质是 (变异类型) 导入至植物细胞 花粉管通道法 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 农杆菌转化法 1. 农杆菌特点：易感染 叶植物和 植物，对大多数 叶植物没有感染能力（人工添加 化合物可以解决）。 2. 原理：农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。 3. 过程： ①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是 将 拼接到 上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T−DNA拼接到受体细胞的染色体DNA 上；//第一次导入是导入 ，第二次导入（非人工操作）是将含目的基因的T−DNA导入 。 ②导入的目的基因可能存在于细胞质中（具体位置是 、 ），也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA 上的目的基因有可能通过 传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 ③T-DNA上也要有标记基因，筛选导入成功的受体细胞。 ④植物的受体细胞是 或 。 导入至动物细胞 法 1. 受体细胞 。 2. 过程：构建基因表达载体并提纯→利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中→ → （移植到同期发情的母畜子宫内）→获得具有新性状的动物（也叫 ） 膀胱生物反应器：利用转基因的动物的尿液来获得目的蛋白，一般采用工程化膀胱上皮细胞生产特定的蛋白并分泌进入尿液；膀胱生物反应器具有一定的优点：如尿液产量大、收集方便；膀胱生物反应器 （无/有）周期和性别的限制, 在任何时期, 雌雄动物均可通过尿液收集目的蛋白；从尿中提取蛋白更容易, 因为尿液中含有的蛋白种类及其他杂质相对较少易于纯化。 导入至微生物 细胞 法（感受态细胞法） 1. 常用菌: 。 2. 微生物作为受体细胞的原因是 。 3. 过程：Ca2+处理细胞→ →表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 8. 目的基因的检测与鉴定 类型 检测内容 方法 水平检测 受体细胞的染色体DNA上是否插入了 ; 目的基因是否转录出 。 、分子杂交等技术。 1. PCR技术检测 （1）受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因： 例如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因。 提取棉花细胞 →Bt基因的特异性引物进行PCR扩增→对扩增产物进行检测（如：琼脂糖凝胶电泳检测） （2）PCR技术检测受体细胞的目的基因是否转录出了mRNA。 方法：提取转基因生物的 ，在 酶作用下合成 ，再用与目的基因特异性结合的引物进行PCR扩增，检测是否有扩增产物。 2. 分子杂交技术 探针：是一种带有放射性同位素、荧光染料或其他化学物质标记的 （单/双）链核酸序列，可以是DNA或RNA，用来检测样品中的特定核酸序列。探针能够通过分子杂交的方式与目标序列结合，从而实现对目标序列的检测。 延伸 延伸 变性→复性 受体细胞的目的基因是否翻译成 1. 方法： 2. 原理： 3. 过程：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体与提取的蛋白质进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则说明目的基因已成功翻译。 生物学水平的鉴定 鉴定生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度（活性鉴定） ①抗虫：做抗虫接种实验（饲喂害虫），观察 （害虫/植物体）的生存状况。 ②抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/植物体）的生存状况。 ③抗盐：将转基因植物移栽到 ，观察其生长状况。 ④抗寒：将转基因植物移栽到 环境中，观察其生长状况。 （2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 （2025·山东·节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 9.蛋白质工程 （1）为什么要通过基因改造或基因合成来完成蛋白质工程，而不是直接对蛋白质进行改造？ ①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。 ②蛋白质是由基因编码的，改造了基因，可以间接改造蛋白质。 ③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。 （2）定义：是以 作为基础，通过 对现有的蛋白质进行改造，或制造一种 ，以满足人类的生产和生活需要。 （3）蛋白质工程和基因工程的比较 基因工程 蛋白质工程 操作环境 生物体外 生物 （体内/体外） 操作核心 基因 操作起点 目的基因 基本过程 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 结果 生产自然界已存在的蛋白质 改造天然蛋白质或创造出自然界 （不存在/存在）的蛋白质 联系 蛋白质工程最终还是要回到基因工程上来，因为蛋白质的合成由基因控制，所以说蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第 代基因工程 （2025·河南·节选）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (4) 已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。 第 1 页 学科网（北京）股份有限公司 $2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 核心考点DAYO8 姓名： 日期： 班级： 《基因工程》-1专题 1.DNA的粗提取和鉴定 (I)提取DNA的原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA,去除 其他成分。 如： ①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于」 但某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在NaCI溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCI溶液中的溶解度不同，它能溶于 的NaCI溶液。 (2)鉴定DNA的原理：在一定温度下( 加热)，DNA遇二苯胺试剂会呈现 (2025·江苏·节选)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展 了以下研究。请回答下列问题： 研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① 加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 引物、样本DNA、含有Mg+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR 2.DNA的电泳鉴定 (1)原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的H下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电 电泳原理 场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳 PCR的产物一般通过 电泳来鉴定 迁移速率 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的 、 DNA分子的 和 等有关 DNA检测 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的 灯下被检测出来 (2)步骤 将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合 注入 液缓慢注入凝胶（凝胶中含 的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标 准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5VCm,待 前 沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 (3)知识延伸 DNA标准 种用于确定目的DNA片段大小的标准参照物，具有特定的DNA分子大小，一般置于第一 参照物 个点样孔中，标识样品的DNA大小 是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA分子，但 (与/不与)DNA 核酸染料 指示剂 结合，指示剂在电泳时移动较快且 (能不能)被肉眼观察到，用于指示 和指示剂 样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚蓝（蓝紫色）和二甲苯青（蓝色） 核酸染料 核酸染料是一类 (能/不能)够与DNA或RNA分子结合，并在特定条 件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的 第1页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清豳 (2024·黑吉辽)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是() A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 3.基因工程的定义：指按照人们的愿望，进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物 以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DA分子水平上 进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 (1)原理 (2)操作对象： (3)操作水平： 水平。 (4)操作环境： 生物 (体内体外)进行。 (5)结果： (6)优点：① (与诱变育种相比) ② 等。（与杂交育种相比） (7)不同生物的DNA能够链接成功的原因是 4.基因工程的工具酶 (1)功能 原理能够识别 分子的 序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 特点 限制酶的 和 具有特异性（限制性，专一性），使用不同的限制酶可以切割不同 的核苷酸序列 黏性末端（如：EcoR I) 平末端（如：SmaI) 切割位置：识别序列的中心轴线两侧 切割位置：识别序列的中心轴线处 EcoR I 5'CAATTC3'G Sma I AATTC 5'CCCGGG3'CCC GGG (在G与 (在G与 类型 A之间 3'CTT:AAG5'CTTAA C之间 3'GGG:CCC5'GGG CCC 切割) 切割) 中轴线 中轴线 在中轴线（图中虚线）的两侧，限制酶在切断 DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，碱 不产生单链的黏性末端。 基正好互补配对，因此称这些片段为 ①限制酶一般用于切断DNA片段，获取 为目的基因连接表达载体做准备。 应用 ②由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA连接时具有特异性，因此在实验设计中， 通常选择 切割后形成 末端的酶，而避免使用切割后形成 末端的酶 ①原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 答：原核生物中限制酶的作用是切割」 (内源/外源)DNA以保证自身安全，防止外来病 思考 原物的危害。 ②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 答：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中 或 第2页 2026年高考核心考点填空（一轮。二轮均可使用） 只为蜕变清晰 (2)特殊限制酶 同裂酶 异裂酶 同尾酶 识别 序列，切割 位点，产生相同 识别 序列，但切割 位点。 识别 序列，产生 的黏性末端。 的黏性末端（但反应条件 可能不同) 异端同尾酶 异长同尾酶 SphI Bbu I SmaI XmaI BamI BglII Sau3A I 5GCATGCG 5'GCATGCO @ccc6Gco 5 CCCGGG® 5GGATCCO 5AGATCTO 5GATC⊙ 3CGTACG5 3CGTACGS ®GGGCCC5 GGGCCC5 OCCTAGG5 号TCTAGA5 ⊙CTAG5 个 【教材深挖】选择性必修3P74,拓展应用，1 L.有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、Xbal、 EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA SpeI 5'-ACTAGT-3'EcoRV 5'-GATATC-3 片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的 DNA片段相连接？为什么？ 3-TGATCA-5 3-CTATAG-5 HindⅢ 5-AAGCTT-3 XhoI 5'-CTCGAG-3 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的 3-TTCGAA-5' 3-GAGCTC-5' 黏性末端，这在基因工程操作中有什 么意义？ XbaI 5'-TCTAGA-3' 答：同尾酶使构建载体时，切割位点的选 3'-AGATCT-5 择范围 (缩小扩大) 例如我们选择了用某种限制酶切割载体如果且的基因的核苷酸序列中恰好没有该限制酶的识别序 列、这时可以考虑用合适的 酶（且的基因的核苷酸序列中不能有该酶的识别序列）来获取且 的基因。 例1.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp),先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶切割，得到 的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( a酶 b酶 a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp) 1600;1100: AGATCT- -GGATCC- 300 800;300 -TCTAGA- -CCTAGG- A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接 C.a酶与b酶切断的化学键不相同 D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， -TCTAGG- -AGATCC- 序列 会明显增多 (2)DNA连接酶（连接两个DNA片段） m 酶1 Πd TI E.coli DNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接 (黏性末端平末端/黏性末端和 Π 酶2 T 平末端)。但E.coli DNA连接酶连接双链DNA片段 的平末端效率远比T4DNA连接酶的效率 (低 酶4 TT 酶3 高)。 例3.说出下列过程参与的酶（写在箭头下面） 酶5 I 第3页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用】 只为蜕变清晰 例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的() AATTCI AATTG TTAA TTAAG G C G C ① ② ③ ④ A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ 方法：将某一个黏性末端旋转 度。 D AATTG LVY C 提升：理解重组质粒和反义质粒 启动子 限制酶切点 启动子 复制 质粒 单酶切 复制 目的基因 原点 原点 质粒 3 =8 终止 止子 转录方向一 标记基因 标记基因 1.相对于正向连接，反向连接形成 反义质粒时，目的基因要旋转180° 启动子 启动子 (b销 2.重组质粒和反义质粒转录形成的 mRNA会发生碱基互补配对形成双 复制 重组 复制 反义 链，使重组质粒形成的mRNA无法 原点 质粒 原点 质粒 进行翻译。 子 3.相同限制酶或能产生相同末端的 终 标记基因 标记基因 终山 不同限制酶同时切割质粒和含目的 基因的DNA片段。 (3)运载体： ①基因在细胞中的稳定复制需要有 基因的表达则需要 和 在研究中一般通 过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的是 其他运载体 有」 (病毒具有特异性) ②质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞 DNA之外，并 定义 具有自我复制能力的环状 (单链/双链)DNA分子 原理 将目的基因插人质粒中，并导入 细胞，可以在受体细胞内稳定 和 来源 来自细菌或酵母菌，天然质粒 (需要不需要)人工改造 根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体。此外，有些载体还能起到 种类 基因编辑、 基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。 结构 功能 -目的基因 启动子 复制原点 复制起始位点，使目的基因稳定遗传 启动子和终止子 促进目的基因的表达 表达载体 终止子 标记基因 复制原点 多个酶切位点 方便对基因进行插入或其他操作 标记基因 第4页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用】 只为蜕变清晰 标记基 标记基因是质粒上目的基因之外的另外一个基因，可以控制一些易于筛选和检测的性状 因的 便于重组DNA分子的筛选。基因工程中常用的标记基因有四种，分别是抗生素抗性基因、 类型 荧光基因、营养物质合成基因、LacZ基因 将抗生素抗性基因的载体导人 (敏感型/抗性型)的宿主细胞中，并在培养基中 添加抗生素或除草剂，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗 性可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有氨苄 青霉素抗性基因(Amp、四环素抗性基因(Tet及卡那霉素抗性基因(Ka等 影印法：例5.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Amp或Te中会导致相应的基因失活 抗性 Amp衣示氨苄青霉素抗性基因，Te表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切 基因 后，与用BamH IE酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物 直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种， 分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 未被袭化的大肠杆菌： 启动子 一BamH I 含有环状目的基因的大肠杆茵： 复制原点1 含有质粒载体的大肠杆菌： 含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 (1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选 在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅 含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 含甲培养基 含甲培养基 2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， B 在上述四种大肠杆菌细胞中， 和 含乙培养基 含乙培养基 的细胞也是不能区分的，其原因是 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使 用含 培养基。图中 (菌落号数)就是插入了目的基因的重组 质粒的大肠杆菌。 荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激发 a.来源：水母 荧光 出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因转入 b.作用：提示标记基因 基因 各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成功。 mRNA→绿色荧光蛋白 例6. (2021年6月浙江选考试题)采用CRISPR/Cs9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGF P)基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小 鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是() A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液 B.基因编辑处理的受精卵在体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获 得表达EGFP的小鼠 C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠 D.通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎 第5页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清豳 例7.(2023年6月浙江选考试题，T19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基 因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌 雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的 基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增， PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的 是( 启动 Gata3 师入前5于区 编码区 非编码区 1 启动 Gata3 GEP 大片段 子x 编码区 引物1 编码X:非编码区 插入后 31 3 小片段 引物3 引物2 A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合 用营养缺陷型的微生物作为转基因的 HindIII 目的 时，可以使用营养物质合成基因作 四环素抗 基因 为标记基因，例如，与野生型相比，亮氨酸 质粒 性基因 重组 不含氨 含 质粒 基酸A 环素 合成缺陷型酵母菌在 (含不含)亮氨 目的基因 合成氨基酸A的基因 影印 酸的培养基中不能生存，将亮氨酸合成基因 导入 作为标记基因导入亮氨酸合成缺陷型酵母 不含氨 受体细胞不能 受体 接种 基酸A 菌，在不含亮氨酸的培养基上转入成功的酵 合成氨基酸A 细胞 母菌可以形成菌落，转入失败的酵母菌不能 菌落2、3、4中的菌体 影印 营养物生存 是导入目的基因的受体 质合成 没有找到病毒作为运载体的题目，以缺陷型细菌的筛选为例了解一下营养合成缺陷基因。 基因 例7.菌种M和茵种在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状的 融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种为组氨酸依赖（组氨酸合成相关基因突变为B),菌种 N为色氨酸依赖（色氨酸合成相关基因突变为A),下列分析错误的是( M A+B PEG N 培养基X 菌种p A-B A.菌种M和N可通过人工诱变和选择性培养选获得 B.用PEG诱导融合之前需要去除菌种M和N的细胞壁 C,在培养基X中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌 D.从培养基X中分离出的杂种融合菌P对两种氨基酸均不依赖 LacZ(B半乳糖苷酶)基因在受体菌中表达的产物在诱导剂IPTG的作用下 将无色的5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷(X-gal)底物水解成蓝色产物。 LacZ基 HindIⅢ 月的基因 图示中，菌落1、2、5、6呈蓝色， 因（显 是导入 的受体菌。 色法) LacZ 质粒 重组 导入 受体 细胞 常用 质粒 目的基因 接种 含X-gal、IPTG 蓝白斑 和氨苄青霉素 筛选法 氨苄青霉素抗性基因 菌落3、4、7呈白色， 是导入目的基因的受体菌 第6页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 【教材深挖L选择性必修3P复习与提高、1 例8.1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保 存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作 步骤如下图所示。回答问题： LacZ基因 【我们假设：在②步中使用单酶切】 (1)在②步中，应怎样选择限制酶？ 基因 酶切位点 答：第二应选择用 (相同不同)的限制酶或 质粒 ②用限制酶处理 LacZ基切割能产生 (相同不同)末端的限制酶切割质 ①获取质粒和含有目 质粒和含有目的 因（显粒和含有且的基因的DNA片段： 的基因的DNA片段 基因的DNA片段 色法) 第二、注意限制酶的切割位点 (能不能) 常用位于且的基因的内部以防破坏且的基因限制酶也不 目的基因 ③连接质粒 蓝白斑能破坏质粒的 复制原 含有目的基因 和目的基因 筛选法 点等结构 的动物细胞 (2)在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连 接， 还需要在混合物中加入哪种物质？ 空大肠杆菌 目的基因环化 (3)选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有 ④将连接产物 哪些优势？ 导入大肠杆菌 答：该质粒便于进行 筛选。标记基因AmpR基 大肠杆菌 因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导 人了 的大肠枉菌才能在添加了青霉素的培养 ⑤在添加了青需素、X-gal 基上生长。而由于LacZ基因的效应、这些生长的菌落 等成分的培养基上培养大肠杆 菌，直到形成菌落 可能出现两种颜色：含有空质粒（没有连接且的基因的 质粒)的大肠杆菌菌落呈 色；含有重组质粒的大 肠杆菌菌落呈 色。 (4)含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什！么颜 其中一个细菌的纯培养物 色？为什么？ 答：有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为且的基 注：LaCZ基因码产生的B-半乳糖苷酶可以分解X-ml 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色：否则首落为白色。 因插人 了LacZ基因的结构、使其不能正常表达成 B-半乳糖苷酶.底物X-盟也就不会被分解。 附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连 接， 为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是 ③病毒载体：动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒 。 病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载体。如 腺病毒载体、慢病毒载体等， 但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌体载体也是 常用工具之 酶切 LacZ 目的基因 图示中，菌落1、2、5、6呈黑 XDNA载体 目的基因 重组入DNA 色，是 的受 体外包装 体菌。 图示中，菌落3呈蓝色，是导 入载体和重组入DNA都 λ噬菌体 导入 受体 可以包装到λ噬菌体中。 细胞 的受体菌。 含X-gal、 IPTG 接种 白色噬菌斑（噬菌斑4、7）中的噬 ① 2 菌体为含有重组λDNA的噬菌体。 第7页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用）】 只为蜕变清晰 慢病毒是一种RNA逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA上，从而实现稳定的遗 传 腺病毒是一种DA病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色 体外，不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA进行转基因、基因编辑、基因沉默等 操作 λ噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA上，经过改造的入噬菌体可以不 裂解宿主细胞，从而作为基因载体 没有找到病毒作为运载体的题目，以噬菌体的筛选为例了解一下双层平板法。 例8.双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具 体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%的 培养基熔化并冷却至45-48℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒 入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿 主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体，根据噬菌斑的数 目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是( A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择 培养基选择出噬菌体的宿主细胞 培养皿皿盖 0 B.加入混合液后，使用灭菌后的涂 菌落聚集体 0 0 布器将混合液均匀地涂布在培养基表面 噬菌斑 0 C.上层培养基中琼脂浓度较高，因 )上层琼脂 此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 底层琼脂 培养基 D.双层平板法获得的噬菌斑不易 培养基 培养皿皿底 发生上下重叠现象 5.目的基因的筛选与获取 (1)真核生物、原核生物基因的结构和表达 真核生物基因： ☐非基因（没有遗传效 应的DNA片段) DNA ■基因 外显子 内含子 非编码区 表观遗 编码区 非编码区 3 5模板链 传调控： DNA 5 3'编码链 特录 DNA甲基化 启动子 转录（编码区转录） 终止子 组蛋白修饰 3'成熟mRNA 前体mRNA !加工如将内含子的转绿序列剪切掉 L加工非编码RNA 5 3!成熟mRNA 成熟mRNA 核糖体 翻译 翻译非编码RNA 3- 3!成熟mRNA 多肽 多肽链 加工 NH2端 蛋白质 结构蛋白 启动子：RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA。 蛋白质 性状 终止子：使转录终止。 酶→细胞代谢 第8页 2026年高考核心考点填空（一轮。二轮均可使用】 只为蜕变清晰 原核生物基因： 35 5 ☐非基因（没有遗传效 DNA 应的DNA片段) ■基因 非编码区 编码区 :非编码区 3 5?模板链 5 启动子 转绿 “3)编码链 终止子 5 3'成熟mRNA 厨译 核糖体 3 多肽链 NH2端 结构蛋白 蛋白质 性状 酶◆细胞代谢 启动子：RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出RNA。 终止子：使转录终止。 (2)目的基因的筛选与获取 逆转录法 筛 人工合成 从相关的已知结 选 化学合成法 构和功能清晰的 基因中进行筛选 基因组文库 获 从基因文库中获得（应用较少） 取 部分基因文库 的 利用PCR技术扩增目的基因 方 用PCR技术扩 增 L利用PCR技术编辑并扩增目的基因（见PCR专题） 随着 技术的发展，以及 (如GenBank) (如BLAST)等的 应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能 提取基因年 提取某种生物的全部DNA 切成片段 用适当的限制酶切割 文 多个一定大小的DNA片段 5 库的构建 DNA片段 插入载体 将DNA片段与载体连接，导 入受体菌中储存 导入受 ① 体细 构建 从基 基因组文库 因文 库中 某种生物的单链mRNA 基因组文库 CDNA文库 直接 逆转录酶催化 文库大小 获取 单链互补cDNA 基因中启动子 部分基因 DNA聚合酶催化 基因中内含子 文库（如 双链cDNA片段 基因多少 CDNA文 与载体连接 物种间的基因交流 库)构建 导入受体菌中储存 构建 cDNA文库 第9页 2026年高考核心考点填空（一轮。二轮均可使用】 只为蜕变清豳 即以 作为模板，在 酶的作用下合成 若要 前提：基 逆转 运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 细胞中提取到 因比较 录法 胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 (大小) 上述方法获得的胰岛素基因(cDN 核苷酸 A)在基因结构的特点是 序列 A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是 ② (未知/已 人工 知) 化学 合成 方法：通 合成 B.化学法合成的目的基因 (含不含)内含子、启动子和终止子？ 过 法蛋 用化学方 白质 C,若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能 法直接合 工程) 有 (一种/多种)；理由是 成目的基 P94 因 D.化学合成法 (能不能)合成自然界不存在的新基因，使生物产 生新的性状以满足人类的要求 A. RCR概念： PCR是 的缩写，是 C. 过程：P78 项根据 的原理，在 提供参与 变性：温度上升到℃以上，双链 DNA复制的 与 对 DNA解聚为 进行 的技术。 复性： 当温度下降到℃左右时， B.条件：前提条件 0 种引物通过碱基互补配对与 一定的缓冲溶液（含。 )、DNA模板、 种引物 条单链DNA结合。 、4种 (dNTP) 的DNA 延伸：温度上升到 ℃左右时，溶液 聚合酶、控制温度使DNA复制在 反复进行 中的4种脱氧核苷酸在 a.引物： 的作用下合成新的 【定义】引物是 DNA链. 51 (单链DNA或单链RNA)。用于PCR的引物长度通 5 3 ③ 常为20-30个核苷酸的 利用 【设计原则】 PCR 获取 和扩 增目 【作用】2种，引物的 端分别与两条模板链端 的基 结合，为DNA聚合酶提供了游离的_端，使耐高 因 温的DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱 氧核苷酸。 DNA母链1 5 31 DNA母链1 s'mmmT 3 引物1 3x4 引物2 3' DNA母链2 5 wwwLl s DNA母链2 b.4种脱氧核苷酸：合成DNA子链的原料(NTP, 包括 ：dATP、dTTP、dGTP、dCTP),又提供 C.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活 5'B 因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加」 B .d.模板DNA 条母链：提供DNA复制的模板 第10页2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 核心考点DAYO8 姓名： 日期： 班级： 《基因工程》-1专题 1.DNA的粗提取和鉴定 (I)提取DNA的原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA,去除 其他成分。 如：①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在NaCI溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCI溶液中的溶解度不同，它能溶于2molL的 NaCI溶液， (②)鉴定DNA的原理：在一定温度下（沸水浴加热），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 (2025·江苏·节选)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展 了以下研究。请回答下列问题： 研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①上清液，加入乙醇 ②溶解DNA 在沉淀物中加入纯水 将③4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg+缓冲液、超纯水等加 扩增DNA 入PCR管中，进行PCR 2.DNA的电泳鉴定 (1)原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的H下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电 电泳原理 场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 迁移速率 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 DNA检测 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为3O0nm的紫外灯灯下被检测出来 (2)步骤 将扩增得到的P℃R产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液 注入 缓慢注入凝胶（凝胶中含核酸染料）的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准 参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V1Cm,待指示剂前 沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 (3)知识延伸 DNA标准 一种用于确定目的DNA片段大小的标准参照物，具有特定的DNA分子大小，一般置于第一 参照物 个点样孔中，标识样品的DNA大小 是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA分子，但 (与/不与)DNA 结合，指示剂在电泳时移动较快且（能不能）被肉眼观察到，用于指示 核酸染料 指示剂 和指示剂 样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚蓝（蓝紫色）和二甲苯青（蓝色）。 核酸染料 核酸染料是一类 (能/不能)够与DNA或RNA分子结合，并在特定条 件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的位置。 第1页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 (2024·黑吉辽)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是() A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离 的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶， 因为它们需要更大的孔径来有效迁移.。而对于较小的DNA片段，比如PC产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的 琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确： B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚蓝到凝胶23处时( 可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的 迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为3OOnm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A 3基因工程的定义：指按照人们的愿望，进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物 以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上 进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 (1)原理：基因重组。 (2)操作对象：基因。 (3)操作水平：DNA分子水平。 (4)操作环境：生物 (体内体外)进行。 (⑤)结果：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (6)优点：①定向改造生物的性状（且的性强）。（与诱变育种相比） ②克服远缘杂交不亲和的障碍等。（与杂交育种相比） (7）不同生物的DNA能够链接成功的原因是DNA都是由脱氧核苷酸组成和规则的双螺旋结构、并且遵 循碱基互补配对原则。 4.基因工程的工具酶 (1)功能 原理能够识别双链DA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 特点 限制酶的识别和切割具有特异性（限制性，专一性），使用不同的限制酶可以切割不同的 核苷酸序列。 黏性末端（如：EcoR I) 平末端（如：SmaI) 切割位置：识别序列的中心轴线两侧 切割位置：识别序列的中心轴线处 EcoR I 5'CAATTC3'G Sma I AATTC 5'CCCGGG3'CCC GGG (在G与 (在G与 类型 A之间 3'CTT:AAG5'CTTAA C之间 3'GGG:CCC5'GGG CCC 切割) 切割) 中轴线 中轴线 在中轴线（图中虚线）的两侧，限制酶在切断 DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，碱 不产生单链的黏性末端。 基正好互补配对，因此称这些片段为黏性末端 ①限制酶一般用于切断DNA片段，获取且的基因，为目的基因连接表达载体做准备 应用 ②由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA连接时具有特异性，因此在实验设计中，通常选择 切割后形成黏性末端的酶，而避免使用切割后形成平末端的酶 思考 ①原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 第2页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 答：原核生物中限制酶的作用是切割 (内源外源)DNA以保证自身安全，防止外来病 原物的危害。 ②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 答：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的迟别序列或识别 序列被修饰。 (2)特殊限制酶 同裂酶 异裂酶 同尾酶 识别相同序列，切割 相同位点，产生相同的 识别相同序列，但切割 黏性末端（但反应条件可 不同位点。 识别不同序列，产生相同的黏性末端。 能不同) 异端同尾酶 异长同尾酶 SphI BbuI SmaI XmaI Bam I BglIl Sau3A I 5GCATGCO 5GCATGCO 5CCCGGGO 5CCCGGGO 5GGATCCO 5AGATCTO 5GATCO 3CGTACG5 CGTACG5 GGGCCC5 GGGCCC5 OCCTAGG5 TCTAGASI ⊙CTAG5l 个 【教材深挖】选择性必修3P74,拓展应用，1 l.有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、 EcoR V:和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的 SpeI 5-ACTAGT-3 EcoR V 5'-GATATC-3' 3-CTATAG-5 DNA片段相连接？为什么？ 3-TGATCA-5 XhoI hoI和SpeI切割DNA产生相同的黏性末端 HindⅢ 5'-AAGCTT-3 XhoI 5-CTCGAG-3 ②)不同的限制酶切割可能产生相同的 3'-TTCGAA-5 3-GAGCTC-5' 黏性末端，这在基因工程操作中有什 么意义？ Xbal 5'-TCTAGA-3 答：同尾酶使构建载体时，切割位点的选 3'-AGATCT-5 择范围 (缩小扩大) 例如、我们选择了用某种限制酶切割载体，如果日的基因的核苷酸序列中恰好没有该限制酶的识别序 列.这时可以考虑用合适的同尾酶（且的基因的核苷酸序列中不能有该酶的识别序列）来获取且的 基因。 例1.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp,先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到 的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( a酶 b酶 a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp) 1600;1100; -AGATCT- -GGATCC- 300 800;300 -TCTAGA- -CCTAGG- ↑ A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接 C.a酶与b酶切断的化学键不相同 TCTAGG- D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，AGATCC:序列 会明显增多 【解析】A.在该线性DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有2个和2个，D.由图可知，经a酶和b 酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，重组后的DNA分子没有这两种酶 的识别序列，所以两种限制酶都不能识别重组DNA分子，不能将其切割成片段，D正确。 第3页 2026年高考核心考点填空（一轮·二轮均可使用） 只为蜕变清晰 (2)DNA连接酶（连接两个DNA片段） TT 酶1 T Π E.coli DNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接 (黏性末端/平末端/黏性末端和 酶2 T Tt 平末端)。但E.coli DNA连接酶连接双链DNA片段 的平末端效率远比T4DNA连接酶的效率 (低 T 酶3 酶4 高) 。 例3.说出下列过程参与的酶（写在箭头下面） 酶5 例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的(D AATT AATTGI TTAAC TTAAG G G ① ② ③ ④ A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？①③、②④。 方法：将某一个黏性末端旋转180度。 AATTG LVY C 提升：理解重组质粒和反义质粒 启动子 限制酶切点 启动子 复制 单酶切 复制 目的基因 原点 质粒 终止子 原点 质粒 + 标记基因 标记基因 终业 转录方向一 1.相对于正向连接，反向连接形成 反义质粒时，目的基因要旋转180° 启动子 启动子 b锁 2重组质粒和反义质粒转录形成的 mRNA会发生碱基互补配对形成双 复制 重组 反义 链，使重组质粒形成的mRNA无法 原点 质粒 原点 质粒 进行翻译。 子 3相同限制酶或能产生相同末端的 不同限制酶同时切割质粒和含目的 标记基因 标记基因 基因的DNA片段。 (3)运载体： ①基因在细胞中的稳定复制需要有复制原点，基因的表达则需要启动子和终止子，在研究中一 般通过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的是质粒，其他运载 体有噬菌体、动植物病毒（病毒具有特异性） ②质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外， 并 定义 具有自我复制能力的环状 (单链/双链)DNA分子 原理 将目的基因插人质粒中，并导入受体细胞，可以在受体细胞内稳定遗传和表达 来源 来自细菌或酵母菌，天然质粒 (需要不需要)人工改造 根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体。此外，有些载体还能起到 种类 基因编辑、基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。 第4页 2026年高考核心考点填空（一轮。二轮均可使用） 只为蜕变清晰 结构 功能 目的基因 启动子 复制原点 复制起始位点，使目的基因稳定遗传 启动子和终止子 促进目的基因的表达 表达载体 终止子 标记基因 将含有目的基因的重组质粒筛选出来 复制原点 多个酶切位点 方便对基因进行插入或其他操作 标记基因 标记基 标记基因是质粒上目的基因之外的另外一个基因，可以控制一些易于筛选和检测的性状 因的 便于重组DNA分子的筛选。基因工程中常用的标记基因有四种，分别是抗生素抗性基因、 类型 荧光基因、营养物质合成基因、LacZ基因。 将抗生素抗性基因的载体导人 (敏感型/抗性型)的宿主细胞中，并在培养基中 添加抗生素或除草剂，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗 性可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有氨苄 青霉素抗性基因(Amp、四环素抗性基因(Tet及卡那霉素抗性基因(Kan等 影印法：例5.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Amp或Tet中会导致相应的基因失活 抗性Amp衣示氨苄青霉素抗性基因，Te表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切 基因 后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物 直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种， 分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 未被转化的大肠杆菌； 启动子 一BamH1 含有环状目的基因的大肠杆菌： 复制原点■ 含有质粒载体的大肠杆菌； 含有播入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选 在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅 含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 含甲培养基 含甲培养基 二者均不含氨苄青霉素抗性基因、在该培养 基上均不能生长 2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中，含有质粒载体和 含乙培养基 含乙培养基 含有插人了且的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含氨苄青霉素抗 性基因，在该培养基上均能生长。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使 用含四环素培养基。图中12、3、6、9（菌落号数） 就是插入了目的基因的重组质粒的 大肠杆菌 荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激发 a来源：水母 荧光 出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因转入 b.作用：提示标记基因 基因 各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成功。 >mRNA→绿色荧光蛋白 例6. (2021年6月浙江选考试题)采用CRISPR/Cs9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGF P)基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小 鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是(B) A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液 第5页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用】 只为蜕变清晰 B.基因编辑处理的受精卵在体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获 得表达EGFP的小鼠 C. 分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠 D.通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎 【解析】：在桑椹胚或囊胚进行胚胎移植。 例7.(2023年6月浙江选考试题，T19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基 因整合到野生型小鼠Gta3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌 雄小鼠各1只，交配以期获得Gta3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的 基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的 是( 启动 Guta3 插入前5于X 编码区 非编码区 3 1 2 3 启动 Gata3 GFP 子x 策码x引物1 大片段 编码引区：非编码区 插入后 3' 51 小片段 引物3 引物2 分 A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合 【解析】分析题图甲可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动 转录后，可以使GFP基因转录，Gta3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动 子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为上5'3'H,刚好是翻译的方向， 所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误 ；用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3 基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 用营养缺陷型的微生物作为转基因的 HindIII 目的 宿主（受体细胞）时，可以使用营养物质 四环素抗 基因 合成基因作为标记基因，例如，与野生型相 质粒 性基因 重组 含四 不含氨 质粒 环素 基酸A 比，亮氨酸合成缺陷型酵母菌在 (含 目的基因 合成氨基酸A的基因 影印 不含)亮氨酸的培养基中不能生存，将亮 导) 氨酸合成基因作为标记基因导入亮氨酸合 不含氨 受体细胞不能 受体 接种 基酸A 成缺陷型酵母菌，在不含亮氨酸的培养基上 合成氨基酸A 细胞 转入成功的酵母菌可以形成菌落，转入失败 菌落2、3、4中的菌体 影印 营养物的酵母菌不能生存 是导入目的基因的受体 质合成 没有找到病毒作为运载体的题目，以缺陷型细菌的筛选为例了解一下营养合成缺陷基因。 基因 例7.菌种M和茵种在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状的 融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种M为组氨酸依赖（组氨酸合成相关基因突变为B),菌种 N为色氨酸依赖（色氨酸合成相关基因突变为A),下列分析错误的是( M A*B N 培养基X 菌种P A-B A.菌种M和N可通过人工诱变和选择性培养选获得 第6页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 B.用PEG诱导融合之前需要去除菌种M和N的细胞壁 C.在培养基X中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌 D.从培养基X中分离出的杂种融合菌P对两种氨基酸均不依赖 【解析】：融合的细胞A+A-B+B-可以在缺少色氨酸和组氨酸的培养基上生长 LacZ(B半乳糖苷酶)基因在受体菌中表达的产物在诱导剂1PTG的作用下 将无色的5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷(X-gal)底物水解成蓝色产物。 LacZ基 HindIII 图示中，菌落1、2、5、6呈蓝色， 目的基因 因（显 是导入质粒的受体菌。 色法) -LacZ 质粒 重组 导入 受体 细胞 常用 质粒 目的基因 含X-gal、IPTG 蓝白斑 接种 和氨苄青霉素 筛选法 氨苄青霉素抗性基因 2 菌落3、4、7呈白色 是导入目的基因的受体菌 【教材深挖L选择性必修3P,复习与提高.1 例8.1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保 存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作 步骤如下图示。回答问题： LacZ基因 【我们假设：在②步中使用单酶切】 Amp (1)在②步中，应怎样选择限制酶？ 基因 酶切位点 答：第二应选择用 (相同不同)的限制酶或 质粒 ②用限制酶处理 LacZ基切割能产生 (相同不同)末端的限制酶切割质 ①获取质粒和含有目 质粒和含有目的 因（显粒和含有且的基因的DNA片段： 的基因的DNA片段 基因的DNA片段 色法) 第二，注意限制酶的切割位点 (能不能) 常用位于且的基因的内部.以防破坏目的基因限制酶也不 目的基因 ③连接质粒 蓝白斑能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复 含有目的基因 和目的基因 筛选法制原点等结尥。 的动物细胞 (2)在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连 接，还需要在混合物中加入哪种物质？ DNA连接酶 空大肠杆菌 目的基因环化 (3)选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有 ④将连接产物 哪些优势？ 导入大肠杆菌 答：该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmDR基 一大肠杆菌 因可用于检测质粒是否导人了大肠杆菌、一般只有导 人了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基 ⑤在添加了青需素、X-l 上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可 等成分的培养基上培养大肠杆 菌，直到形成菌落 能出现两种颜色：含有空质粒（没有连接且的基因的质 粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆 菌菌落呈白色 ● (4)含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜 其中一个细菌的纯培养物 色？为什么？ 答：有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为且的基 注：LacZ基因编码产生的B-半乳糖苷酶可以分解X-al 产生蓝色物质，使酋落呈现蓝色：否则菌落为白色。 因插人且的基因了LacZ基因的结构、使其不能正常 表达成B-半乳糖苷酶、底物X-gal也就不会被分解。 附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连 接，为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是用两种不同的限 制酶（产生不同的末端）同时切割含且的基因的DNA片段和质粒。 第7页 2026年高考核心考点填空（一轮二轮均可使用） 只为蜕变清晰 ③病毒载体：动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒 病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载体。如 腺病毒载体、慢病毒载体等，但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌体载体也是 常用工具之 酶切LacZ 目的基因 图示中，菌落1、2、5、6呈黑 入DNA载体 目的基因 重组入DNA 色，是未转化的受体菌。 体外包装 图示中，菌落3呈蓝色，是导 λ载体和重组入DNA都 入噬菌体 导入 受体 入入DNA载体的受体菌 可以包装到入噬菌体中。 细胞 含X-gal、 IPTG 1接种 白色噬菌斑（噬菌斑4、7）中的噬 ① 菌体为含有重组入DNA的噬菌体。 慢病毒是一种RNA逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA上，从而实现稳定的遗 传 腺病毒是一种DNA病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色 体外，不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA进行转基因、基因编辑、基因沉默等 操作 入噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA上，经过改造的入噬菌体可以不 裂解宿主细胞，从而作为基因载体 没有找到病毒作为运载体的题目，以噬菌体的筛选为例了解一下双层平板法， 例8.双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具 体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%的 培养基熔化并冷却至45-48℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒 入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿 主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体，根据噬菌斑的数 目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是(B) A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择 培养基选择出噬菌体的宿主细胞 培养皿皿盖 B.加入混合液后，使用灭菌后的涂 菌落聚集体 0 0 布器将混合液均匀地涂布在培养基表面 噬菌斑 0 C.上层培养基中琼脂浓度较高，因 上层琼脂 此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 底层琼脂 培养基 D.双层平板法获得的噬菌斑不易 培养基 培养皿皿底 发生上下重叠现象 【解析】：B项与题干矛盾。 底层平板起到支撑上层平板，是上层平板保持平整，是菌落更清晰。 第8页 2026年高考核心考点填空（一轮，二轮均可使用） 只为蜕变清晰 5.·目的基因的筛选与获取 (1)真核生物、原核生物基因的结构和表达 真核生物基因： 口非基因（没有遗传效 应的DNA片段) 3 DNA ■基因 5 ■外显子 内含子 表观遗 非编码区 编码区 3 :非编码区 5?模板链 传调控： 5 启动子 3'编码链 DNA 特录 DNA甲基化 转录（编码区转录） 终止子 组蛋白修饰 5 3'成熟mRNA 前体mRNA 1加工（如将内含子的转录序列剪切掉 加工非编码RNA 5 3'成熟mRNA 成熟mRNA 核糖体 翻译 潮译 非编码RNA 5 多肽链 -r 3成熟mRNA 多肽 加工 NH2端 蛋白质 结构蛋白 启动子：RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA。 蛋白质 →性状 终止子：使转录终止。 酶◆细胞代谢 原核生物基因： ☐非基因（没有遗传效 35 DNA 应的DNA片段) ■基因 3 非编码区： 编码区 :非编码区 5?模板链 51 启动子 终止子 3编码链 转绿 5 3'成熟mRNA 翻译 核糖体 5 3 多肽链 NH,端 -rr 结构蛋白 蛋白质 性状 酶◆细胞代谢 启动子：RNA聚合酶识别和结合位点， 驱动基因转录出mRNA。 终止子：使转录终止。 (2)目的基因的筛选与获取 逆转录法 筛 人工合成 从相关的已知结 化学合成法 选 构和功能清晰的 基因中进行筛选 基因组文库 获 从基因文库中获得（应用较少) 取 部分基因文库 利用PCR技术扩增目的基因 方 L利用PCR技术扩 增 L利用PCR技术编辑并扩增目的基因（见PCR专题） 随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank)、序列比对工具（如BLAST)等的应 用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 第9页 2026年高考核心考点填空（一轮。二轮均可使用） 只为蜕变清晰 提取基因组 提取某种生物的全部DNA 酶切成片段 用适当的限制酶切割 基因组 多个一定大小的DNA片段 文库的构 DNA片段 建 插人载体 将DNA片段与载体连接，导 入受体菌中储存 导入受 ① 体细 构建 从基 基因组文库 因文 库中 某种生物的单链mRNA 基因组文库 cDNA文库 直接 逆转录酶催化 文库大小 大 小 获取 单链互补cDNA 基因中启动子 有 无 部分基因 DNA聚合酶催化 基因中内含子 有 无 文库（如 双链cDNA片段 基因多少 全部 部分 cDNA文 与载体连接 物种间的基因交流 可以 库)构建 部分可以 导入受体菌中储存 构建 cDNA文库 即以总mRNA作为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA,若要运用 前提：基 因比较 逆转 该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的胰岛B细胞中提取到胰岛素的 (大小) 录法 RNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是胰岛素基因只会在胰岛B细胞中 、核苷酸 表达其他细胞不表达。上述方法获得的胰岛素基因(cDNA)在基因结 序列」 构的特点是只包含了编码区的外显子序列没有非编码区和内含子。 (未知/已 A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是 ② 人工 知) 预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→ 方法：通 化学 推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列 合成 过DNA 合成 B.化学法合成的目的基因 (含不含)内含子、启动子和终止子？ 法（蛋 参与翻译的mRNA序列是由编码序列转录而来的。 合成仪 用化学方 白质 C,若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能 法直接合 工程) 有 (一种/多种)；理由是遗传密码具有简并（一种氨基酸可由多 成目的基 P94 个密码子编码)。 D.化学合成法 因 (能/不能)合成自然界不存在的新基因，使生物产 生新的性状以满足人类的要求 A. RCR概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写，是 C.过程：P8 项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与 变性：温度上升到90℃以上，双链 ③ DNA复制的各种组分与反应条件，对且的基因的 业 DNA解聚为单链 利用 核苷酸序列进行大量复制的技术。 复性：当温度下降到50℃左右时，2 PCR B. 条件：前提条件：已知且的基因的核苷酸序列。 种引物通过碱基互补配对与两 获取 一定的缓冲溶液（含Mg)、DNA模板、2种引物、4 条单链DNA结合。 和扩 种脱氧核苷酸（或dNTP)、耐高温的DNA聚合酶 延伸：温度上升到72℃左右时 增目 、 控制温度使DNA复制在体外反复进行 溶液中的4种脱氧核苷酸在耐 的基 a.引物： 高温的DNA聚合酶的作用下合 因 【定义】引物是一小段能与DNA母链的一小段碱 成新的DNA链。 基序列互补配对的短单链核酸（单链DNA或单链 RNA)。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷 第10页核心考点08 基因工程-1 8 2026届•高考•生物学一轮复习 教师：鱼票月半 课节： 微信 公众号 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)基本思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取 (2)实验原理： ①提取原理： b.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液中 a.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。 鳔 鳔 鳔 (2)实验原理： ②鉴定原理： 在一定温度下(沸水浴)，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 (3)实验选材： ①材料： DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 【思考】能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞做实验材料？ 不能， 哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 【思考】能否选用鸡血细胞做实验材料？ 能，鸡是鸟类动物 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (3)实验选材： ②试剂： 二苯胺试剂要现配现用 用棕色瓶保存 a.研磨液: b.体积分数为95%的酒精： c.2mol/L 的NaCl溶液： d.二苯胺试剂： 含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA 研磨液成分 作用 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA EDTA 抑制DNA酶 SDS(洗涤剂) 使蛋白质变性 研磨液： · 溶/瓦解细胞膜 · 使蛋白质变性与DNA分离 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (4)实验步骤： ①研磨材料：新鲜洋葱，加研磨液充分研磨。 目的：破碎细胞膜，释放DNA。若研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量。 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁,可直接吸水涨破(省去研磨步骤) 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (4)实验步骤： ②提取上清液：纱布过滤，在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。 用纱布可以减少DNA损失，不可用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行的原因：低温时，DNA酶的活性较低，抑制DNA降解 上清液中可能含有DNA、RNA、蛋白质、脂质、糖类 离心或过滤研磨液的目的：使细胞碎片沉淀，获得含有DNA的上清液。 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (4)实验步骤： ③析出DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 实验中的预冷、低温处理目的:抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解,抑制分子运动,使DNA易形成沉淀析出、低温有利于增加DNA分子的柔韧性,减少其断裂 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (4)实验步骤： ③析出DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 DNA的析出中搅拌时应轻缓、并沿一个方向：减少DNA断裂,以便获得较完整的DNA分子 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (4)实验步骤： ④溶解DNA 将丝状物或沉淀物溶解在2mol/L的NaCl溶液中 ⑤DNA的鉴定 实验组：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺（现配现用）试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液变成蓝色（冷却后观察） 对照组：2mol/L的NaCl溶液中加入二苯胺（现配现用）试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液不变成蓝色（冷却后观察） 为除去粗提取的DNA中的蛋白质可用_______________________ 酶解法（蛋白酶水解）、高温 为除去粗提取的DNA中的RNA可用_______________________ 酶解法（RNA酶） 1.DNA的粗提取与鉴定： 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 （2025·江苏·节选）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更 好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： 研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：   实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① ，加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR 上清液      4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 溶解DNA 鳔 鳔 鳔 解析（3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。 鳔 鳔 鳔 (1)原理： ①DNA的热变性原理，即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 2.DNA片段的扩增 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (2)材料用具： ①PCR扩增仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（置于PCR扩增仪中，实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） 2.DNA片段的扩增 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (2)材料用具： 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑥PCR反应体系的配方 ⑤4种脱氧核苷酸等量混合液(实际为dNTP)、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水 2.DNA片段的扩增 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (3)实验步骤： ①准备： ②移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 ③混合： ④离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 离心的目的是使挂在管壁上的液体全部甩下。 2.DNA片段的扩增 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 ⑤反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 预变性： (3)实验步骤： 2.DNA片段的扩增 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (1)原理： a.DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 b.PCR的产物一般通过_________________来鉴定 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子在一定pH的缓冲液中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (1)原理： d.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 c.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 速度：环状>线性>开环 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 ①微量移液器（用于向加样孔中添加相应样液） ②一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ③电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） ④电泳缓冲液 ⑤凝胶载样缓冲液 ⑥琼脂糖 ⑦核酸染料 (2)材料用具： （内含指示剂——溴酚蓝） （常用核酸染料如EB即溴化乙锭） 作用：指示DNA的迁移的位置（非具体） 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (2)材料用具： 加样孔 负电极 运动方向 电泳缓冲液 正电极 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 ①配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ②制备凝胶 a.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔 c.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 b.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内 梳子孔为加样孔， 加样孔侧连电极负极 (3)实验步骤： 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 (3)实验步骤： ③加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker) 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 ⑤观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 marker中就是不同长度的双链DNA标准品混合物，通过对比可以知道帮助我们知道样品DNA大小 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ④电泳 非紫外灯下 紫外灯下 (3)实验步骤： 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 ①如果只扩增目的基因，那么是否成功扩增出DNA片段的判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果，进行电泳鉴定的结果应该是一条条带 该图示目的基因片段大小约为750bp (4)实验结果： 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 ②如果只扩增目的基因，电泳结果理应只有一个条带，如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 未出现扩增条带可能的原因有： ①TaqDNA聚合酶失活； ②引物出现质量问题； ③变性时温度低，变性时间短； ④Mg2+浓度过低 出现非特异性扩增条带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②模板DNA出现污染 ③复性时的温度过低 ④DNA聚合酶的活性低 3.DNA片段的电泳鉴定 实验1.DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 鳔 鳔 鳔 【2024 吉林高考】关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（       ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小  B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置  C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快  D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 鳔 鳔 鳔 解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； 凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误； 琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为 300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 鳔 鳔 鳔 1.概念辨析： 指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 ①原理: 。 ②操作对象: 。 ③操作水平: 。 ④操作环境: 生物 进行 ⑤结果： 。 ⑥优点： a. 。 b. 等。 基因重组 DNA分子水平 基因 体外 创造出符合人们需要的生物类型和生物产品 定向改造生物性状（目的性强） 克服远缘杂交不亲和的障碍 (与杂交育种相比) (与诱变育种相比) 例如，通过转基因技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是 ，受体细胞是 ，目的基因的表达产物是 。 人胰岛素基因 大肠杆菌 人胰岛素 考点1.基因工程 鳔 鳔 鳔 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 考点1.基因工程 2.基因工程的发展历程 鳔 鳔 鳔 不同生物的DNA能够拼接的原因是： DNA都是由脱氧核苷酸组成和规则的双螺旋结构，并且遵循碱基互补配对原则。 答题规范： 鳔 鳔 鳔 DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具” 工具 限制酶 DNA连接酶 分子手术刀 分子缝合针 分子运输车 载体 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 鳔 鳔 鳔 1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 （1）来源： 主要从原核生物中分离纯化来的 （2）种类： 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 （3）特点 : 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 专一性 鳔 鳔 鳔 （4）识别序列长度: 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量 （5）结果： 产生黏性末端或平末端 识别位点也可能在识别序列外部 限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，碱基正好互补配对，因此称这些片段为黏性末端。 1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 C G A A 3´ 5´ T T 简图： G CTTAA 5´ 3´ 3´ 5´ AATTC G 黏性末端 黏性末端 黏性末端 黏性末端 G 5´ C T T 3´ A A EcoRⅠ 的识别序列 识别序列的特点: 两条单链从5´—3´的碱基排列顺序是一样的，即回文序列。 直观理解： 鳔 鳔 鳔 【思考】结合下图，该限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水 2 2 2 2 【思考】将1个基因从DNA分子上切割下来需要切___处，同时产生___个黏性末端或平末端。 2 4 鳔 鳔 鳔 【思考】原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 答：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 【思考】限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 答：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 教材深挖：选择性必修3P71 鳔 鳔 鳔 教材深挖：选择性必修3P74，T2. 鳔 鳔 鳔 【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 同种限制酶切割产生的黏性末端相同，不同限制酶可能会形成相同的黏性末端 鳔 鳔 鳔 有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段 产生的DNA片段能与限制 酶SpeI切割A片段产生的 DNA片段相连接?为什么? 教材深挖：选择性必修3P74，T2. XbaⅠ 因为 XbaⅠ与 SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 鳔 鳔 鳔 有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的 黏性末端，这在基因工程操作中有什 么意义? 教材深挖：选择性必修3P74，T2. 同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好没有该限制酶的识别序列，这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。 鳔 鳔 鳔 某线性DNA分子含有3000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是（　　） A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B．a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接 C．a酶与b酶切断的化学键不相同 D．用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作， 若干循环后， 序列会明显增多 校本资料 P251 T7 D 鳔 鳔 鳔 技巧：判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。 解析：由图可知，经Ⅰ和Ⅰ切割出的 片段，具有相同的黏性末端，可形成重组分子，重组后的 分子没有这两种酶的识别序列，所以两种限制酶都不能识别重组 分子，不能将其切割成片段，D正确。 鳔 鳔 鳔 2.DNA连接酶 能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （1）作用： 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 作用 区别 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶连接双链DNA片段的平末端效率远比T4 DNA连接酶的效率低。 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 （2）种类： 2.DNA连接酶 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（　　） ① ② ③ ④ 图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ 、 。 D A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 ①② ③④ 解析：将DNA旋转180度 鳔 鳔 鳔 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链(DNA片段)的3’-OH末端 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA水解酶 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 DNA分子 DNA分子 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对中的氢键 不需要模板 （3）与DNA有关的几种酶的比较 2.DNA连接酶 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 酶1 酶2 酶4 酶3 酶5 酶1:限制酶 酶2:DNA连接酶 酶3:解旋酶 酶4:DNA聚合酶 酶5:DNA水解酶 识图：说出下列过程参与的酶 鳔 鳔 鳔 （1）种类： 最常用：质粒 其他：噬菌体、动植物病毒等（病毒具有特异性） （2）作用： 作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中，在受体细胞内对目的基因进行复制和表达 不同载体的来源不同，在_____、______、_________以及可以插入外源DNA片段的______上也有很大差别。 大小　 　结构　 复制方式 大小 （3）质粒： ①本质：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 （小型环状DNA分子） 可来源于细菌和酵母菌等 3.运载体 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）质粒： ②特点： a.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞内进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________ 自我复制 d.必须是安全的，对受体细胞无害、易分离。 b.有一个或多个限制酶切割位点。供外源DNA片段（目的基因）插入其中。 c.经人工改造后，这些质粒上常有特殊的标记基因，将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等 3.运载体 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 ③注意： a.载体不等于质粒。并非所有质粒均适合作为载体，有许多质粒未必完全符合作为载体的条件（如没有合适的标记基因） b.载体不等于膜载体。基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。 （3）质粒： 3.运载体 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 目的基因和质粒通常要用相同的限制酶进行切割，从而产生相同的黏性末端，进而DNA连接酶发挥作用 。 ①质粒有几个游离的磷酸基团？ 0 ②对质粒用不同限制酶切割两次会得到几个产物(片段)？ 2 ③ 4 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 (1)切割含目的基因的DNA片段时： 。 (2)切割质粒时： 。 能切下目的基因且不破坏目的基因 至少保留一个完整的标记基因，还要保留启动子、终止子和复制原点等 甲 乙 ①单酶切构建基因表达载体选限制酶： 。 ②双酶切构建基因表达载体选限制酶： 。 Ⅰ Ⅰ和EcoR I 1．限制酶的选择原则: 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 2．单酶和双酶切割比较: (1)单酶切 获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。 目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒随意连接 分别使用两种限制酶去切割目的基因和质粒 为了产生相同的黏性末端，便于连接 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 ①防止质粒自身环化 ②防止目的基因自身环化③避免目的基因和质粒的随意连接 （2）双酶切的优点: 2．单酶和双酶切割比较: 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 ①用图2中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原是 。 ②构建重组质粒时，最好选择限制酶 处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。 SmaI会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因 确保目的基因与质粒的定向连接 BamHⅠ、HindⅢ 鳔 鳔 鳔 3.标记基因的作用： (1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 (2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。 将含有重组质粒的受体细胞筛选出来 能力提升：重点难点·透析 ▒▒▒▒影印法：双抗性基因筛选▒▒▒▒ 鳔 鳔 鳔 含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌 （全国卷）某一质粒载体如图，外源DNA插入到Amp r或Tet r中 会导致相应的基因失活（Ampr衣示氨苄青霉素抗性基因，Tet r表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用Bam H l酶切后，与用Bam H I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进 行连接反应，用得到的混合物直接转化 大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化， 有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种， 分别是含有环状目的基因、 含有质粒载体、 含有插入了目 的基因的重组 质粒的大肠杆 菌。 未被转化的大肠杆菌； 含有环状目的基因的大肠杆菌 含有质粒载体的大肠杆菌 鳔 鳔 鳔 (1）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种 大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 。 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长 鳔 鳔 鳔 (2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌 细胞中， 和 的细胞也是不能区分的，其原因是_________________________________________ 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含 培养基。 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒 二者均含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。 四环素 就是插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌 1、2、3、6、9 鳔 鳔 鳔 启动子 复制原点 BamH I BamH I Tetr Ampr ? 如何筛选 酶切法； PCR 鳔 鳔 鳔 组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________。 (高考题节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 乙和丙 目的基因反向连接 鳔 鳔 鳔 如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还 是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。 鳔 鳔 鳔 （2025年广东五校9月联考节选）下图为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的 片段示意图。图中为氨苄青霉素抗性基因，为四环素抗性基因， 为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物 转化成蓝色物质，使大肠杆菌的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。Ⅰ、 Ⅰ为两种限制酶，质粒上限制酶后的括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。（参照点是复制原点）请回答： 利用酶切法鉴定目的基因的连接方式 鳔 鳔 鳔 （2）据图分析，质粒A、C不能作为目的基因D的载体，理由分别是_____ __________________________________________________。 将目的基因D与质粒B进行重组，应该选用限制酶______和 连接酶。 质粒A缺少标记基因、质粒C复制原点会被限制酶切割 Ⅰ 鳔 鳔 鳔 解析 由题图可知，质粒A缺乏标记基因，质粒C复制原点会被限制酶切割，故不能 选择质粒A、C作为目的基因的载体。目的基因的两端都有 Ⅰ的切割位点，而 Ⅰ会破坏目的基因，故要获取目的基因，应该选用限制酶Ⅰ，再用 连 接酶将目的基因D与质粒B的黏性末端进行连接。 鳔 鳔 鳔 （3）在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因D是否重组到质粒中，使用 Ⅰ处理重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为 和 ，或者____和____ 的片段，则可判断质粒B已与目的基因D重组成功。 0.6 4.1 鳔 鳔 鳔 解析 目的基因和载体用一种酶进行切割，重组质粒（含2个 Ⅰ酶切位点）会出现 正向连接和反向连接两种类型，质粒B中Ⅰ酶切位点与 Ⅰ酶切位点之间的距离 为，重组质粒中2个Ⅰ酶切点之间的最短距离可能是 或 ，重组质粒长度为， ， ，故Ⅰ酶切后，电泳图谱中出现长度为和 片段或 和 的片段，说明重组质粒构建成功。 鳔 鳔 鳔 3.标记基因的作用： 荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激发出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因转入各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成功 将含有重组质粒的受体细胞筛选出来 能力提升：重点难点·透析 ▒▒▒▒荧光蛋白基因筛选▒▒▒▒ 鳔 鳔 鳔 （2021年6月浙江选考试题）采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（   ） A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液 B．基因编辑处理的受精卵在体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达EGFP的小鼠 C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠 D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎 B 解析：在桑椹胚或囊胚进行胚胎移植。 鳔 鳔 鳔 （2023年6月浙江选考试题,T19）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（    ） 鳔 鳔 鳔 叙述正确的是（    ） A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合 B 鳔 鳔 鳔 解析：分析题图甲可知，启动子在左侧，基因整合在 基因 的右侧，启动子启动转录后，可以使基因转录， 基因的 启动子能控制 基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的 方向向右，合成的从左向右为 ，刚好是翻译的方向， 所以翻译时先合成蛋白，再合成蛋白，B正确；整合 基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是 基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和 引物3进行扩增，杂合子和 基因纯合子均能扩增出 条带，仅有 基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯 合子，D错误。 鳔 鳔 鳔 3.标记基因的作用： 营养缺陷型的微生物作为转基因的 时，可以使用营养物质合成基因作为标记基因，例如，与野生型相比，亮氨酸合成缺陷型酵母菌在 (含/不含）亮氨酸的培养基中不能生存，将亮氨酸合成基因作为标记基因导入亮氨酸合成缺陷型酵母菌，在不含亮氨酸的培养基上转入成功的酵母菌可以形成菌落，转入失败的酵母菌不能生存。 将含有重组质粒的受体细胞筛选出来 能力提升：重点难点·透析 ▒▒▒▒营养合成缺陷基因筛选▒▒▒▒ 就是插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌 2、3、4 鳔 鳔 鳔 菌种M和茵种N在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状的融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种M为组氨酸依赖(组氨酸合成相关基因突变为B-),菌种N为色氨酸依赖(色氨酸合成相关基因突变为A-),下列分析错误的是(     ) A.菌种M和N可通过人工诱变和选择性培养选获得 B.用PEG诱导融合之前需要去除菌种M和N的细胞壁 C.在培养基X中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌 D.从培养基X中分离出的杂种融合菌P对两种氨基酸均不依赖 C 鳔 鳔 鳔 解析：融合的细胞A+A-B+B-可以在缺少色氨酸和组氨酸的培养基上生长 鳔 鳔 鳔 3.标记基因的作用： 将含有重组质粒的受体细胞筛选出来 能力提升：重点难点·透析 ▒▒▒▒蓝白斑法筛选▒▒▒▒ 鳔 鳔 鳔 1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。回答问题： 【我们假设：在②步中使用单酶切】 教材深挖：选择性必修3P98，T1. 鳔 鳔 鳔 （1）在②步中，应怎样选择限制酶？ 应选择用相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因,限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。 鳔 鳔 鳔 （2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质? DNA连接酶 鳔 鳔 鳔 （3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势? 该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。 鳔 鳔 鳔 （4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什!么颜色?为什么? 有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因插入破环了LacZ基因的结构，使其不能正常表达成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。 鳔 鳔 鳔 附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连接，为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是 。 用两种不同的限制酶（产生不同的末端）同时切割含目的基因的DNA片段和质粒 鳔 鳔 鳔 （4）病毒载体： 动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载体。如腺病毒载体、慢病毒载体等，但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌体载体也是常用工具之一。 3.运载体 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 3.运载体 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌 体进行检测的常用方法。具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%的培养基熔化并冷却至45~48℃,然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体，根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是(     ) 鳔 鳔 鳔 下列叙述正确的是(     ) A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择培养基选择出噬菌体的宿主细胞 B.加入混合液后，使用灭菌后的涂布器将混合液均匀地涂布在培养基表面 C.上层培养基中琼脂浓度较高，因此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 D.双层平板法获得的噬菌斑不易发生上下重叠现象 B 解析：B项与题干矛盾。 底层平板起到支撑上层平板，是上层平板保持平整，是菌落更清晰。 鳔 鳔 鳔 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 (核心) 将目的 基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 考点3.基因工程的基本操作程序 鳔 鳔 鳔 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 人工合成 逆转录法 化学合成法 从基因文库中获得（应用较少） 利用PCR技术扩增 筛选与获取的方法 利用PCR技术扩增目的基因 利用PCR技术编辑并扩增目的基因（见PCR专题） 基因组文库 部分基因文库 鳔 鳔 鳔 （1）目的基因： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 ①概念： ②实例： 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （1）目的基因 ③基因结构： 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （1）目的基因 ③基因结构： 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？ 不同，cDNA没有内含子、启动子、终止子 鳔 鳔 鳔 提取某种生物的全部DNA 多个一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存 用适当的 限制酶切割 基因组文库 构建 I.基因组文库的构建 ①从基因文库中直接获取： （2）获取目的基因的方法： 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 某种生物的单链mRNA 单链互补cDNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与载体连接 cDNA文库 逆转录酶催化 DNA聚合酶催化 构建 II.部分基因文库（如cDNA文库）构建 ①从基因文库中直接获取： 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 DNA合成仪 I.前提： II.方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 ②人工合成： （3）获取目的基因的方法： 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： II.RCR概念： PCR是_______________的缩写，是一项根据________________ 的原理，在_____提供参与DNA复制的_________与_________，对______________________进行_________的技术 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 原理 操作环境 目的 全称 PCR扩增仪 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： 已知基因的核苷酸序列 前提条件： 一定的缓冲溶液(Mg2＋)、DNA模板、2种引物、4种脱氧核糖核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、控制温度使DNA复制在体外反复进行 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： a.引物： 定义： 引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（单链DNA或单链RNA）。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。 它是以 为模板，在 酶的作用下合成的 DNA单链 引物 设计原则： 引物自身不能环化； 两种引物之间不能互补配对； 引物长度不宜过短，防止引物随机结合,产生非特异性条带，不可过长，导致扩增效率低。。 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： a.引物： 2种，引物的5′端分别与两条模板链3′端结合，为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 作用： 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： b.4种脱氧核苷酸： 合成DNA子链的原料(dNTP),又提供能量。 包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP c.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 d.模板DNA两条母链:提供DNA复制的模板 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）获取目的基因的方法： ③利用PCR获取和扩增目的基因： III.条件： e.耐高温的DNA聚合酶:催化合成DNA子链 f.高温： 断开氢键，打开DNA双链 或 Taq 酶 体内进行DNA复制时需要解旋酶断开氢键。 1.目的基因的筛选与获取 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 引物 断开氢键，形成单链DNA ③利用PCR获取和扩增目的基因： IV.过程： 鳔 鳔 鳔 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 第二轮循环的产物 第三轮的产物 完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 ③利用PCR获取和扩增目的基因： IV.过程： 鳔 鳔 鳔 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 引物A 引物B 第一次扩增 第一轮循环结束：获得2个DNA分子（4条链）。得到的DNA片段只有一种引物，且比所需DNA片段长 V.PCR相关计算： ③利用PCR获取和扩增目的基因： 鳔 鳔 鳔 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 第二次扩增 第二轮循环结束：获得四个DNA分子（ 8条链）。才出现所需DNA片段，这样的片段存在两种引物。 ③利用PCR获取和扩增目的基因： V.PCR相关计算： 鳔 鳔 鳔 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链DNA______个 2 （等于上一轮中长链数，中长链每扩增一次，会增加两条） 即含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数（目的基因） ③利用PCR获取和扩增目的基因： V.PCR相关计算： 鳔 鳔 鳔 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链 DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n ③利用PCR获取和扩增目的基因： 等长的DNA分子数（目的基因） 含引物A(或B) 的DNA 1 3 7 15 2n-1 鳔 鳔 鳔 类型 体内DNA复制 PCR 时期 细胞分裂前的间期 人工控制，随时进行 场所 细胞内（主要在细胞核内） 细胞外 是否需要ATP 需要 不需要（能量由dNTP（原料）提供 解旋方式 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温解聚，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 耐高温的DNA聚合酶 VI.PCR技术与体内DNA复制过程比较 鳔 鳔 鳔 类型 体内DNA复制 PCR 合成 子链 一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接或两条链均连续合成 （半保留半不连续全链复制） 分别从两种引物的3′端开始延伸，都是连续合成（半保留全连续局部区域复制） 过程 VI.PCR技术与体内DNA复制过程比较 鳔 鳔 鳔 类型 体内DNA复制 PCR 循环次数 受生物体自身控制 一般要经历30次 产物 完整DNA 大量的界于两种引物之间的DNA片段 相同点 (1)都需要提供DNA模板；(2)都需要在一定环境中进行，原料相同，都需要能量，都有酶的参与，都遵循碱基互补配对原则；(3)DNA合成方向都是从子链的5′端向3′端延伸 VI.PCR技术与体内DNA复制过程比较 鳔 鳔 鳔 (1)构建基因表达载体的目的: （2）基因表达载体的构成及作用: ①让目的基因在受体细胞中稳定存在, 并且遗传给下一代； ②使目的基因能够表达和发挥作用。 除了目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点等。 终止子 启动子 目的基因 标记基因 复制原点 基因表达载体 —基因工程的核心： 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 2.基因表达载体的构建 鳔 鳔 鳔 启动子: 一段有特殊序列结构的_____片段 ①本质: DNA ②功能: RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 ③诱导型启动子: ④启动子具有物种和组织特异性：即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。 如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 。 水稻胚乳细胞启动子 2.基因表达载体的构建 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 终止子: ①本质: 一段有特殊序列结构的_____片段 DNA ②功能: 使转录在所需要的地方停下来。 标记基因: ①作用: 用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞。 ②常见类型: 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 复制原点: 使能完成自主复制。 综上可知目的基因必须插入 之间。 启动子和终止子 2.基因表达载体的构建 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 重组DNA分子 限制酶 （3）基因表达载体的构建过程 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 DNA连接酶 基因表达载体构建模式图 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 相同限制酶或能产生相同末端的不同限制酶 2.基因表达载体的构建 鳔 鳔 鳔 项目 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合部位，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 　启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别 易错提醒： 鳔 鳔 鳔 (1)目的基因 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 1.限制酶的选择 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 (2)质粒 1.限制酶的选择 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 (3)Ti质粒的T－DNA片段 1.限制酶的选择 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 例1.(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是________________ __________________________________________________________________________________________________________________________。 正向连接的重组 DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) 鳔 鳔 鳔 例2.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 (1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。 Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 鳔 鳔 鳔 解析：根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。 鳔 鳔 鳔 例3.（2025·山东·21节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒 的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个 种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。 小麦基因组序列信息已知。 鳔 鳔 鳔 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 复制原点 复制原点     XbaI     DNA聚合酶     SmaI和SpeI     550bp Xba I DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550 鳔 鳔 鳔 解析 （1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复 制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末 端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且 无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种 限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为 该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末 端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组 质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合 酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶 切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含 有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录 的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现 一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为 200bp。 鳔 鳔 鳔 例6.MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是: GAAT↓TAATTC, C↓TGCAG, G↓AATTC,下图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。 若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ） 2.注意教材上的两句话 （1）P72，在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然 质粒的基础上进行人工改造的。 （2）P82，基因表达载体的构建的方法也不是千篇一律的。 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 例7.若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（） 2.注意教材上的两句话 （1）P72，在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然 质粒的基础上进行人工改造的。 （2）P82，基因表达载体的构建的方法也不是千篇一律的。 A. 限制酶PstⅠ、DNA连接酶、 DNA聚合酶 B. 限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶、 DNA聚合酶 C. 限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶 D. 限制酶PstⅠ、限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶 B 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 -Mse I 鳔 鳔 鳔 例8.研究人员利用Ti质粒构建p—H5/H3共表达重组质粒（如下图)。设计思路是：获得H5基因和H3基因，先将H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有NheⅠ和XhoⅠ酶切位点）上，再将H3基因插入，获得重组质粒。为达到实验目的，需在H5基因两端分别引入___________和 __________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR过程中，通过设计使其出现在_______中，进而出现在H5基因中。 NheⅠ ClaⅠ、XhoⅠ 引物 鳔 鳔 鳔 3.启动子 （1）启动子具有物种和组织特异性(选择性必修3P90)。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。 （2）诱导型启动子（选择性必修3P80） 例8（2024年河北卷，T22）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 图1 在胚乳中特异性表达的 终止转录 HindIII EcoRI 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 例9（CS周练17）利用细菌靶向给药在肿瘤治疗领域受到广泛关注。科研人员改造大肠杆菌，制造出能定点、可控表达治疗性抗体的工程菌。回答下列问题： (1)聚焦超声能使肿瘤部位的温度从37℃提升至42℃，可作为工程菌的“温度开关”。研究人员筛选出3种转录抑制蛋白，37℃时，转录抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制下游绿色荧光蛋白（GFP）基因的转录；42℃时，转录抑制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结合。 ①研究人员构建了下图所示表达载体，以筛选最佳感温元件。除图中所含元件外，表达载体还必须具有             和氨苄青霉素抗性基因、限制酶酶切位点等元件。长时间培养时在培养液中加入氨苄青霉素，其作用是                 。（写出两点即可） 终止子和复制原点 防止杂菌污染 将含有目的基因的受体细胞筛选出来 鳔 鳔 鳔 ②检测导入不同转录抑制蛋白基因的大肠杆菌在不同温度下的荧光强度，结果如下图所示。最终选择转录抑制蛋白 （填“A”或“B”或“C”）来构建工程菌，理由是 。 C 37℃时荧光强度低，安全性高；42℃荧光提高倍数最大，灵敏度高 鳔 鳔 鳔 (2)上述表达载体仅在42℃时表达，而肿瘤治疗需要长期进行。科研人员继续对表达载体进行如下图所示改造，整合酶可将P7序列进行一次永久性翻转。请预测以下培养条件下改造后的工程菌菌落的颜色：Ⅰ.37℃培养 ；Ⅱ.42℃培养 ；Ⅲ. 42℃处理1h后，37℃培养 。（填“无色”或“绿色”） 无色 绿色 绿色 鳔 鳔 鳔 (3)为得到可用于肿瘤治疗的工程菌，需进一步改造上述工程菌。请选择下图中 X、Y、Z三个位点中的一个作为治疗性抗体编码基因的插入位点 。 X 鳔 鳔 鳔 【详解】（1）①质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，而表达载体没有进入的细菌没有，长时间培养时在培养液中加入氨苄青霉素，其作用是去除丢失质粒的细菌，抑制杂菌生长。②由图可知，37℃下荧光强度很低，安全性高，42℃下荧光强度提高倍数最大，灵敏度高，所以最终选择转录抑制蛋白C来构建工程菌。（2）Ⅰ. 在37°C培养时，转录抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制整合酶基因表达，P7序列不能翻转，下游绿色荧光蛋白（GFP）基因无法转录表达，所以工程菌菌落无色。 Ⅱ. 在42°C培养时，转录抑制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结合，整合酶基因表达，使P7序列翻转，GFP基因可以转录表达，工程菌菌落为绿色。Ⅲ. 在42°C处理1h后，P7序列被整合酶永久性翻转，之后在37°C培养时，由于P7序列翻转后的结构变化，使得GFP基因可以持续表达，工程菌菌落为绿色。 （3）将治疗性抗体编码基因插入X位点，可实现机体正常部位不表达，仅当肿瘤部位升温至42℃后，才激活并持续表达，实现长期、定点的肿瘤治疗，所以择图5中X位点作为治疗性抗体编码基因的插入位点。 鳔 鳔 鳔 4.标记基因 : 将含有目的基因的受体细胞筛选出来. 例10.(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是____________ _________________________________ _______；图中氨苄青霉素抗性基因是 一种标记基因，其作用是___________ _________________________________ _______________________。 终止子 启动子 RNA聚合酶 识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 4.Ti质粒 例12.(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是____________ _________________________________ _______；图中氨苄青霉素抗性基因是 一种标记基因，其作用是___________ _________________________________ _______________________。 终止子 启动子 RNA聚合酶 识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 能力提升：重点难点·透析 鳔 鳔 鳔 例13.(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则： (1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________ ________________________________ 农杆菌细胞内含有Ti质粒， Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递 送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 ___________________________________________________。 鳔 鳔 鳔 (2)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是______ ________________________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是___________________________，依据是_____________ _______________________________________________________________________。 荧光 检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 PDS缺失会导 鳔 鳔 鳔 例14. （CS周练18，6）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为                         。 BclI和SmaI 鳔 鳔 鳔 (3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是 . 先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞 鳔 鳔 鳔 解析:（2）利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamHI，会降Ti质粒上的复制原点切掉，剩下的部分在启动子和终止子之间没有限制酶的切割位点，故选择BclI和SmaI。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3'端序列可以与④5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与①5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为①④。（3）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。 鳔 鳔 鳔 3.将目的基因导入受体细胞 植物 花粉管通道法 农杆菌转化法 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的 过程。 ①自然条件下不能转化单子叶植物,人工 添加酚类化合物可以解决 ②T-DNA能整合到植物细胞的染色DNA 上(随机整合)。 ③转化叶片：转入体细胞，经植物组织 培养获得转基因植物。 ④转化花序：转入受精卵，获得种子经 筛选获得转基因植物。 动物 : 显微注射 原核 ; 大肠杆菌用Ca2+处理大肠杆菌细胞 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 例15.(2024年甘肃卷，T21)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 落叶覆盖的腐殖土 纤维素降解细菌 高产纤维素酶菌株X 菌株X基因组DNA 酶A基因 酶B基因 酶C基因 质 粒 载 体 质粒载体-酶A基因 质粒载体-酶B基因 质粒载体-酶C基因 受 体 细 胞 重组酶A 重组酶B 重组酶C ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 能吸收周围环境中DNA分子 鳔 鳔 鳔 （1）导入至植物细胞的方法： ①花粉管通道法： 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 我国科学家独创 3.将目的基因导入受体细胞 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （1）导入至植物细胞的方法： ②农杆菌转化法： I.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 II.农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 III.原理： 目前用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 3.将目的基因导入受体细胞 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现出新性状的植物 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 目的基因插入 Ti质粒的T-DNA上 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体DNA上 表达 转入 农杆菌 IV.过程： 鳔 鳔 鳔 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内） 获得具有新性状的动物 （2）导入至动物细胞的方法： ②方法：显微注射法 ①受体细胞：受精卵 3.将目的基因导入受体细胞 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 （3）导入至微生物细胞的方法： ①常用法: . ②常用菌： 。 ③微生物作为受体细胞的原因是 。 ④过程： Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA Ca2+处理法(感受态细胞法) 大肠杆菌 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 3.将目的基因导入受体细胞 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 4.目的基因的检测与鉴定： 目的基因在受体细胞中稳定遗传的关键是目的基因要整合到受体细胞中的染色体DNA 上。 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性 (1)目的： 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR/分子杂交等技术 目的基因是否翻译成蛋白质（检测目的基因是否表达） 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状（检测转基因生物是否培育成功） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 (2)类型： 原理：抗原-抗体的特异性结合 4.目的基因的检测与鉴定： 考点2.基因工程(重组DNA技术)的基本工具 鳔 鳔 鳔 1.PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 提取DNA PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 抗虫棉 PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系； 例如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因 提取棉花细胞染色体DNA Bt基因的特异性引物进行PCR扩增 对扩增产物进行检测 （如：琼脂糖凝胶电泳检测） 1：阳性质粒（重组质粒作标准对照） 2：原始品系 （空白对照） 鳔 鳔 鳔 2.PCR技术检测受体细胞的目的基因是否转录出了mRNA 方法： 提取转基因生物的总mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，再用与目的基因特异性结合的引物进行PCR扩增，检测是否有扩增产物。 Bt M3 C0 T-9 T-2 T-51 T-5 T-23 T-11 T-20 T-21 T-34 T-10 提取mRNA PCR操作 是否扩增出目的基因cDNA 电泳操作 抗虫棉 10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录 逆转录 产生cDNA 鳔 鳔 鳔 3.抗原-抗体杂交检测受体细胞的目的基因是否翻译成蛋白质 ①上述杂交运用的原理是： ②方法： 抗体与抗原的结合具有特异性 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体与提取的蛋白质进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则说明目的基因已成功翻译。 以检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白为例 （Bt毒蛋白作抗原） 鳔 鳔 鳔 4.抗虫接种实验、病原体感染法等从个体水平鉴定生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。 ①抗虫：做抗虫接种实验（饲喂害虫），观察 （害虫/植物体）的生存状况。 ②抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/植物体）的生存状况。 ③抗盐：将转基因植物移栽到 ，观察其生长状况。 ④抗寒：将转基因植物移栽到 环境中，观察其生长状况。 含有较高盐的土壤中 害虫 植物体 低温（寒冷） 鳔 鳔 鳔 (1)培育方法：将由 基因构建的表达载体导入到 中，以提高动物的生长速度 (2)若利用精子载体法 （将构建好的表达载体与精子混合培养，使外源基因进入精子内），可将草鱼生长激素基因导入鲤鱼受精卵细胞，与显微注射法相比，精子载体法对受精卵中核的影响会更小，理由是 。 生长激素 受精卵 不需要穿过核膜，雌雄原核自动融合（通过受精作用完成整合），对受精卵中的核影响更小 1.提高动物的生长速率 考点3.基因工程的应用 鳔 鳔 鳔 2.对动物细胞进行基因改造生产药物(用转基因动物生产药物） (1)乳腺（乳房）生物反应器： 。 (2)具体做法：将 基因与 等调控组件重组在一起，通过 方法，导入哺乳动物的 中，将其送入母体，使其发育成转基因动物。 转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需药品 药用蛋白 乳腺中特异性表达的基因启动子 显微注射技术 受精卵 药用蛋白基因 乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 基因表达载体 受精卵 泌乳期 分泌乳汁 转基因动物 药物蛋白 显微注射 发育 胚胎移植前进行性别鉴定 考点3.基因工程的应用 鳔 鳔 鳔 动物基因工程还有另外一个作用，就是用转基因动物生产药物，也就是我们之前提过的乳腺生物反应器，那么什么是乳腺生物反应器呢？那我们知道，正常动物。。。那么我们应该怎样做，才能使这个动物的乳汁含有所需的药品呢？也就是我们应该如何实现用乳房生物反应器来生产药物？那同学们再思考一下，为什么我们要用这个乳腺来作为基因药物的表达产所，用血液不行吗？ 3.用转基因动物做器官移植的供体 (1)供体动物： 。 (2)存在难题：存在 反应。 (3)解决办法：将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制 的表达，或设法除去 ，再结合 技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 猪 免疫排斥 抗原决定基因 抗原决定基因 猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似 猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物 克隆技术 考点3.基因工程的应用ç 鳔 鳔 鳔 1.蛋白质工程概念 蛋白质工程是以 作为基础，通过 对现有的蛋白质进行改造，或制造一种 ，以满足人类的生产和生活需要。 蛋白质分子的结构规律与生物功能的关系 基因改造或合成基因 新的蛋白质 与基因工程的关系: 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 天然蛋白质的不足： 天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 考点4.蛋白质工程的原理及应用（P93-95） 鳔 鳔 鳔 目的基因 预期功能 生物功能 设计 推测 改造或合成 行使 折叠 翻译 转录 蛋白质 （三级结构） 多肽链 mRNA 蛋白质工程运的基本途径是 → .→ → 。→ .。 或 。→ . 预期蛋白质的功能 设计预期蛋白质结构 推测应有氨基酸序列 找到并改变对应的脱氧核苷酸序列 合成新的基因 获得所需要的蛋白质 新基因来源：人工合成目的基因或基因定点突变技术等 鳔 鳔 鳔 思考： 1.化学法合成的目的基因 （含或不含）内含子、启动子和终止子？ 不含 参与翻译的mRNA序列是由编码序列转录而来的，而内含子、启动子和终止子属于非编码序列 2.对天然蛋白质进行改造,可通过对基因操作来实现的理由是： ① ； ② ； ③ 。 基因可以控制蛋白质的合成，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造 基因可以遗传给下一代，但是蛋白质没法遗传 对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作,难度要小得多 2.蛋白质工程的基本原理(P94) 考点4.蛋白质工程的原理及应用（P93-95） 鳔 鳔 鳔 3.蛋白质工程的应用 （1）研发速效胰岛素类似物 ①天然胰岛素的不足： 易形成二聚体或六聚体，需要经历长时间才能解离为单体，见效慢。 阻碍胰岛素从注射部位进入血液，延缓了降血糖作用 胰岛素B链第20~29位的氨基酸是胰岛素分子形成多聚体的关键区域. ②改造过程： 通过改造胰岛素基因，使B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置,从而有效抑制了胰岛素的聚合。 考点4.蛋白质工程的原理及应用（P93-95） 鳔 鳔 鳔 （2）延长干扰素体外保存时间 ①天然干扰素的不足： 体外保存困难 ②改造方法： 通过改造干扰素基因，使半胱氨酸替换为丝氨酸，在一定条件下，可以延长保存时间。 考点4.蛋白质工程的原理及应用（P93-95） 鳔 鳔 鳔 【背景问题】小鼠产生的单克隆抗体直接作为治疗药物注射到患者（人）体内会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低. 鼠源抗体人源化的过程 【解决办法】: 通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域(即可变区)“嫁接”到人的抗体(即恒定区)上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。 （3）改造抗体 考点4.蛋白质工程的原理及应用（P93-95） 鳔 鳔 鳔 （4）改进酶的性能或开发新的工业用酶 ①蛋白质工程被广泛用于改进____ _的性能或开发新的工业用酶。 酶 如枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。 ②科学家正在尝试改造某些参与调控___________的酶,以提高植物光合作用的效率,增加粮食的产量;科学家利用_____________的思路来设计优良微生物农药,通过改造微生物蛋白质的结构,使它防治病虫害的效果增强。 光合作用 蛋白质工程 考点4.蛋白质工程的原理及应用（P93-95） 鳔 鳔 鳔 克隆 生殖性克隆 治疗性克隆 ：通过克隆技术产生独立生存的新个体。 ：利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。 我国禁止生殖性克隆人 四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖克隆人实验。 对于治疗性克隆，同样重视所涉及的伦理问题，主张进行有效监控和严格审查 1.对比生殖性克隆人和治疗性克隆人 考点5.关注生殖性克隆人和禁止生物武器 鳔 鳔 鳔 设计试管婴儿： 试管婴儿： 不经过遗传学诊断（基因检测） 胚胎移植前先进行遗传学诊断，符合需求再移植 进行特定基因检测 2.试管婴儿和设计试管婴儿的比较 考点5.关注生殖性克隆人和禁止生物武器 鳔 鳔 鳔 类型 试管婴儿 设计试管婴儿 技术手段 不需进行__________ 胚胎移植前需进行__________ 实践应用 解决 问题 用于 等疾病的治疗 联系 二者都是体外受精，经体外 ，再进行 ，在生殖方式上都为_________ 遗传诊断 遗传诊断 不孕不育 白血病、贫血病 早期胚胎发育 胚胎移植 有性生殖 2.试管婴儿和设计试管婴儿的比较 考点5.关注生殖性克隆人和禁止生物武器 鳔 鳔 鳔 (1)在Ⅰ的图示中， 是试管婴儿的培育过程， 是设计试管婴儿培育的过程(填图中序号)。 (2)试管婴儿与设计试管婴儿技术的主要区别是什么？ 　设计试管婴儿多了胚胎移植前的遗传学诊断过程。 ①②③ ①②④⑤ (3)试管婴儿技术与克隆技术在技术环节上的主要差异是什么？ 　前者需经过体外受精，后者需用到细胞核移植技术。 (4)试管婴儿技术与克隆技术分别属于哪种生殖方式？ 　试管婴儿技术属于有性生殖，克隆技术属于无性生殖。 鳔 鳔 鳔 (5)治疗性克隆与生殖性克隆过程中胚胎的处理方式相同吗？ 　不同。治疗性克隆获得的早期胚胎主要用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的特定的组织、细胞和器官； 在生殖性克隆过程中，获得的胚胎通过胚胎移植进入母体的子宫内，由母体孕育出婴儿。 鳔 鳔 鳔 鳔 谢谢支持 Enter your title related content here, control the font size and line spacing, keep the language short and to the point, made by globa, Enter your title related content here, control the font size and line spacing $2026年高考核心考点填空(一轮•二轮均可使用) 只为蜕变清晰 核心考点 DAY 08 姓名： 日期： 班级： 《基因工程》-1专题 1.DNA的粗提取和鉴定 (1)提取DNA的原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA,去除 其他成分。 如：①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于 酒精 ，但某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在NaCI溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCI溶液中的溶解度不同，它能溶于 2mol/L 的NaCl溶液。 (2)鉴定DNA的原理：在一定温度下( 沸水浴 加热)，DNA遇二苯胺试剂会呈现 蓝色 。 （2025·江苏·节选）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： 研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① 上清液 ，加入乙醇 ② 溶解DNA 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR 2.DNA的电泳鉴定 （1）原理 电泳原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 相反 的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过 琼脂糖凝胶 电泳来鉴定 迁移速率 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的 浓度 、DNA分子的 大小 和 构象 等有关 DNA检测 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的 紫外灯 灯下被检测出来 （2）步骤 注入 将扩增得到的PCR产物与 凝胶载样缓冲液 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶(凝胶中含 核酸染料 )的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm,待 指示剂 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 （3）知识延伸 DNA标准参照物 一种用于确定目的DNA片段大小的标准参照物，具有特定的DNA分子大小，一般置于第一个点样孔中，标识样品的DNA大小 核酸染料和指示剂 指示剂 是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA分子，但 （与/不与）DNA结合，指示剂在电泳时移动较快且 （能/不能）被肉眼观察到，用于指示样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚蓝(蓝紫色)和二甲苯青(蓝色)。 核酸染料 核酸染料是一类 （能/不能）够与DNA或RNA分子结合，并在特定条件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的 位置 。 （2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（   ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小  B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置  C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快  D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 3.基因工程的定义：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 （1）原理: 基因重组 。 （2）操作对象: 基因 。 （3）操作水平: DNA分子 水平。 （4）操作环境: 生物 （体内/体外）进行。 （5）结果： 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 。 （6）优点：① 定向改造生物的性状（目的性强） 。（与诱变育种相比） ② 克服远缘杂交不亲和的障碍 等。（与杂交育种相比） （7）不同生物的DNA能够链接成功的原因是 DNA都是由脱氧核苷酸组成和规则的双螺旋结构，并且遵循碱基互补配对原则 。 4.基因工程的工具酶 （1）功能 原理 能够识别 双链DNA 分子的 特定核苷酸 序列,并使每一条链中特定部位的 磷酸二酯键 断开。 特点 限制酶的 识别 和 切割 具有特异性（限制性，专一性），使用不同的限制酶可以切割不同的核苷酸序列。 类型 黏性末端（如：EcoR I） 平末端(如：Sma I) 在中轴线（图中虚线）的两侧，限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，碱基正好互补配对，因此称这些片段为 黏性末端 。 不产生单链的黏性末端。 应用 ①限制酶一般用于切断DNA片段，获取 目的基因 ，为目的基因连接表达载体做准备。 ②由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA连接时具有特异性，因此在实验设计中，通常选择切割后形成 黏性 末端的酶，而避免使用切割后形成 平 末端的酶。 思考 ①原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 答：原核生物中限制酶的作用是切割 （内源/外源）DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 ②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 答：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中 不存在该酶的识别序列 或 识别序列被修饰 。 （2）特殊限制酶 同裂酶 异裂酶 同尾酶 识别 相同 序列，切割 相同 位点，产生相同的黏性末端（但反应条件可能不同） 识别 相同 序列，但切割 不同 位点。 识别 不同 序列，产生 相同 的黏性末端。 Sph I Bbu I Sma I Xma I 异端同尾酶 异长同尾酶 Bam I Bgl II Sau 3A I 【教材深挖】选择性必修3P74，拓展应用，1 1.有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1) 哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的 DNA片段相连接?为什么? Xho I Xho I和Spe I切割DNA产生相同的黏性末端 (2) 不同的限制酶切割可能产生相同的 黏性末端，这在基因工程操作中有什 么意义? 答：同尾酶使构建载体时，切割位点的选 择范围 （缩小/扩大）。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好没有该限制酶的识别序列，这时可以考虑用合适的 同尾 酶（目的基因的核苷酸序列中不能有该酶的识别序列）来获取目的基因。 例1.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是(　　) A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接 C.a酶与b酶切断的化学键不相同 D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序列会明显增多 【解析】 A.在该线性DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有2个和2个，D.由图可知，经a酶和b酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，重组后的DNA分子没有这两种酶的识别序列，所以两种限制酶都不能识别重组DNA分子，不能将其切割成片段，D正确。 (2)DNA连接酶（连接两个DNA片段） E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接 （黏性末端/平末端/黏性末端和平末端）。但E.coli DNA连接酶连接双链DNA片段的平末端效率远比T4 DNA连接酶的效率 （低/高）。 例3.说出下列过程参与的酶（写在箭头下面） 例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（　D　） ① ② ③ ④ A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ ①③ 、 ②④ 。 方法：将某一个黏性末端旋转 180 度。 提升：理解重组质粒和反义质粒 （3） 运载体： ①基因在细胞中的稳定复制需要有 复制原点 ，基因的表达则需要 启动子 和 终止子 ，在研究中一般通过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的是 质粒 ，其他运载体有 噬菌体、动植物病毒 （病毒具有特异性） ②质粒 定义 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞 拟核 DNA之外，并具有自我复制能力的环状 （单链/双链）DNA分子 原理 将目的基因插人质粒中，并导入 受体 细胞，可以在受体细胞内稳定 遗传 和 表达 来源 来自细菌或酵母菌，天然质粒 （需要/不需要）人工改造 种类 根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体 。此外，有些载体还能起到基因编辑、 基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。 结构 功能 复制原点 复制起始位点，使目的基因稳定遗传 启动子和终止子 促进目的基因的表达 标记基因 将含有目的基因的重组质粒筛选出来 多个酶切位点 方便对基因进行插入或其他操作 标记基因的 类型 标记基因是质粒上目的基因之外的另外一个基因，可以控制一些易于筛选和检测的性状，便于重组DNA分子的筛选。基因工程中常用的标记基因有四种，分别是抗生素抗性基因、荧光基因、营养物质合成基因、LacZ基因。 抗性 基因 将抗生素抗性基因的载体导人 （敏感型/抗性型）的宿主细胞中，并在培养基中添加抗生素或除草剂，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗性可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、 四环素抗性基因(TetR)及卡那霉素抗性基因(KanR)等 影印法：例5.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr 或Tetr 中会导致相应的基因失活（Ampr 衣示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH l酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 未被转化的大肠杆菌； 含有质粒载体的大肠杆菌； 含有环状目的基因的大肠杆菌； 含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 (1） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅 含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养 基上均不能生长 (2） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中，含有质粒载体和 含有插入了目的基因的重组质粒 的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含 四环素 培养基。图中 1、2、3、6、9 （菌落号数）就是插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 荧光 基因 荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激发出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因转入各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成功。 例6. （2021年6月浙江选考试题）采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ B  ） A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液 B．基因编辑处理的受精卵在体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达EGFP的小鼠 C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠 D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎 【解析】：在桑椹胚或囊胚进行胚胎移植。 例7.（2023年6月浙江选考试题,T19）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（    ） A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合 【解析】 分析题图甲可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为├ 5′→3′┤ ，刚好是翻译的方向， 所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP 基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3−GFP 基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3−GFP 基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3 基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 营养物质合成 基因 用营养缺陷型的微生物作为转基因的 宿主（受体细胞） 时，可以使用营养物质合成基因作为标记基因，例如，与野生型相比，亮氨酸合成缺陷型酵母菌在 (含/不含）亮氨酸的培养基中不能生存，将亮氨酸合成基因作为标记基因导入亮氨酸合成缺陷型酵母菌，在不含亮氨酸的培养基上转入成功的酵母菌可以形成菌落，转入失败的酵母菌不能生存。 没有找到病毒作为运载体的题目，以缺陷型细菌的筛选为例了解一下营养合成缺陷基因。 例7. 菌种M和茵种N在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状的融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种M为组氨酸依赖(组氨酸合成相关基因突变为B-),菌种N为色氨酸依赖(色氨酸合成相关基因突变为A-),下列分析错误的是( ) A.菌种M和N可通过人工诱变和选择性培养选获得 B.用PEG诱导融合之前需要去除菌种M和N的细胞壁 C.在培养基X中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌 D.从培养基X中分离出的杂种融合菌P对两种氨基酸均不依赖 【解析】：融合的细胞A+A-B+B-可以在缺少色氨酸和组氨酸的培养基上生长 LacZ基因（显色法），常用蓝白斑筛选法 LacZ基因（显色法），常用蓝白斑筛选法 图示中,菌落1、2、5、6呈蓝色，是导入 质粒 的受体菌。 【教材深挖】选择性必修3P98，复习与提高，1 例8.1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。回答问题： 【我们假设：在②步中使用单酶切】 （1）在②步中，应怎样选择限制酶？ 答：第一，应选择用 （相同/不同）的限制酶或切割能产生 （相同/不同）末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段； 第二，注意限制酶的切割位点 （能/不能）位于目的基因的内部，以防破坏目的基因,限制酶也不能破坏质粒的 启动子 、 终止子 、 标记基因 、复制原点等结构。 （2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质? DNA连接酶 （3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势? 答：该质粒便于进行 双重 筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了 质粒 的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈 蓝 色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈 白 色。 （4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什!么颜色?为什么? 答：有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因插入 目的基因 了LacZ基因的结构，使其不能正常表达成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。 附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连接，为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是 用两种不同的限制酶（产生不同的末端）同时切割含目的基因的DNA片段和质粒 。 ③病毒载体：动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载体。如腺病毒载体、慢病毒载体等，但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌体载体也是常用工具之一。 图示中,菌落1、2、5、6呈黑色，是 未转化 的受体菌。 图示中,菌落3呈蓝色，是导入 λ DNA载体 的受体菌。 慢病毒是一种RNA逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA上，从而实现稳定的遗传 腺病毒是一种DNA病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA进行转基因、基因编辑、基因沉默等操作 λ噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA上，经过改造的 λ 噬 菌 体 可 以 不 裂解宿主细胞，从而作为基因载体 没有找到病毒作为运载体的题目，以噬菌体的筛选为例了解一下双层平板法。 例8.双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%的培养基熔化并冷却至45-48℃,然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体，根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是( B ) A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择 培养基选择出噬菌体的宿主细胞 B.加入混合液后，使用灭菌后的涂 布器将混合液均匀地涂布在培养基表面 C.上层培养基中琼脂浓度较高，因 此形成的噬菌斑较大，更有利于计数 D.双层平板法获得的噬菌斑不易 发生上下重叠现象 【解析】：B项与题干矛盾。 底层平板起到支撑上层平板，是上层平板保持平整，是菌落更清晰。 5. 目的基因的筛选与获取 （1）真核生物、原核生物基因的结构和表达 （2）目的基因的筛选与获取 随着 测序 技术的发展，以及 序列数据库 （如GenBank）、 序列比对工具 （如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 ① 从基因文库中直接获取 基因组 文库的构建 部分基因文库（如cDNA文库）构建 基因组文库 cDNA文库 文库大小 大 小 基因中启动子 有 无 基因中内含子 有 无 基因多少 全部 部分 物种间的基因交流 部分可以 可以 ② 人工合成 前提：基因比较 （大/小）、核苷酸序列 （未知/已知） 方法：通过 DNA合成仪 用化学方法直接合成目的基因 逆转录法 即以 总mRNA 作为模板，在 逆转录 酶的作用下合成 cDNA ，若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 胰岛B 细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 胰岛素基因只会在胰岛B细胞中表达，其他细胞不表达 。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构的特点是 只包含了编码区的外显子序列，没有非编码区和内含子 。 化学合成法(蛋白质工程) P94 A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是 预期的蛋白质功能 → 设计预期的蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到对应的脱氧核苷酸序列 。 B. 化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？ 参与翻译的mRNA序列是由编码序列转录而来的 。 C.若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能有 （一种/多种）；理由是 遗传密码具有简并（一种氨基酸可由多个密码子编码）。 D.化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求 ③ 利用PCR获取和扩增目的基因 A. RCR概念：PCR是 聚合酶链式反应 的缩写，是一项根据 DNA半保留复制 的原理，在 体外 提供参与DNA复制的 各种组分 与 反应条件 ，对 目的基因的核苷酸序列 进行 大量复制 的技术。 B. 条件: 前提条件： 已知目的基因的核苷酸序列 。 一定的缓冲溶液(含 Mg2+ )、DNA模板、 2 种引物、4种 脱氧核苷酸 （或dNTP）、 耐高温 的DNA聚合酶、控制温度使DNA复制在 体外 反复进行 a.引物： 【定义】引物是 一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸 （单链DNA或单链RNA）。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸的 DNA 。 【设计原则】 引物自身不能环化 ; 两种引物之间不能互补配对 ; 引物长度不宜过短，防止引物随机结合,产生非特异性条带，不可过长，导致扩增效率低 。 【作用】2种，引物的 5′端分别与两条模板链 3′ 端结合，为DNA聚合酶提供了游离的 3′ 端，使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的 3′ 端开始连接脱氧核苷酸。 b.4种脱氧核苷酸：合成DNA子链的原料(dNTP，包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP),又提供 能量 。 c.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 Mg2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 Mg2+ 。 d.模板DNA 两 条母链:提供DNA复制的模板 e.耐高温的DNA聚合酶（ Taq酶 ）:催化合成DNA子链。 f.高温：断开氢键，打开DNA双链。（体内进行DNA复制时需要 解旋酶 断开氢键。） C. 过程：P78 变性：温度上升到 90 ℃以上，双链 DNA解聚为 单链 复性：当温度下降到 50 ℃左右时， 2 种引物通过碱基互补配对与 两 条单链DNA结合。 延伸：温度上升到 72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 耐高温的DNA聚合酶 的作用下合成新的DNA链。 B B B B A A A A B B B B B B B B B B A A A A A A A A A A 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第N次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 2 2 2 2 2 中长链-短链DNA 0 2 4 6 2(n-1) 短链-短链DNA 【等长的DNA分子数（目的基因）】 0 0 2 8 2n-2n 含引物A(或B)的DNA 1 3 7 15 2n-1 6. 基因工程的核心—— 基因表达载体的构建 构建基因表达载体的目的是：让目的基因在受体细胞中 稳定 存在, 并且 遗传 给下一代；使目的基因能够 表达 和 发挥作用 作用。 （1）启动子 ①本质：一段有特殊序列结构的 DNA 片段 ②功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出 mRNA 。 ③诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活 或抑制目的基因的表达。 ④启动子具有物种和组织 特异 性：即只有使用受体生 物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。 如：利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。 科学家将药用蛋白基因与 乳腺细胞中特异表达的基因 的启动子 等调控元件重组在一起，通过 显微注射 的方法导入哺乳动物的 受精卵 中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入 泌乳 期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为 乳腺生物反应器 或乳房生物反应器。 又如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子 。 （2）终止子： ①本质：一段有特殊序列结构的 DNA 片段 ②功能：使 转录 在所需要的地方停下来。 综上可知目的基因必须插入 启动子 和 终止子 之间。 （4） 复制原点：使能完成自主 复制 。 （2025年四川，保证载体能在XX细胞中能正常复制） 单酶和双酶切割比较: 单酶切：获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 为了产生相同的黏性末端，便于连接 。但是使用该法缺点是容易发生 目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒随意连接 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 分别使用两种限制酶去切割目的基因和质粒。 双酶切的优点：①防止质粒自身环化 ②防止目的基因自身环化 使质粒和目的基因正确（正向）连接 ③避免目的基因和质粒的随意连接 （详见：第4页的重组质粒和反义质粒） 提升：正向连接质粒和反向连接的质粒的筛选 方法一：酶切法 例8.(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) 。 例9.（2025·山东·21节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1) Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 【答案】(1) 复制原点 Xba I DNA聚合酶 Sma I和Spe I 550bp 【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据Sma I限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用Sma I酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamH I，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择Xba I和Sma I进行酶切，Xba I酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时Pst I酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个Spe I酶切位点，可以选择用Sma I和Spe I进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 方法二：PCR 例10.(高考题节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 乙和丙 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是 目的基因反向连接 。 【解析】如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。 【能力提升】：重点难点·透析（基因表达载体的构建） 1.限制酶的选择 (1)目的基因 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶 Sma I 。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择 Pst I 和 EcoR I 两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 (2)质粒 (3)Ti质粒的T－DNA片段 T- DNA上也要有标记基因，筛选 将T-DNA片段整合到宿主细胞染色体DNA上的受体细胞筛选出来 。 例11.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 (1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。 【答案】Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 【解析】根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。 例12.（2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1-4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 XhoⅠ XbaⅠ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加XbaⅠ、引物1 5'端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 例13.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 【答案】(2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ 【详解】（2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 2.注意教材上的两句话 （1）P72，在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。 （2）P82，基因表达载体的构建的方法也不是千篇一律的。 例13.（2025·周测8）MseⅠ（GAAT↓TAATTC）、PstⅠ（C↓TGCAG）、EcoRⅠ（G↓AATTC）三种限制酶的识别序列及切割位点,下图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。 若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ） A. 限制酶PstⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶 B. 限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶 C. 限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶 D. 限制酶PstⅠ、限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶 【详解】 例14.（2025·周测8）研究人员利用Ti质粒构建p—H5/H3共表达重组质粒（如下图)。设计思路是：获得H5基因和H3基因，先将H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有 NheⅠ和 XhoⅠ酶切位点）上，再将H3基因插入，获得重组质粒。为达到实验目的，需在H5基因两端分别引入___________和_________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR过程中，通过设计使其出现在_______中，进而出现在H5基因中。 【详解】 3.启动子 （1）启动子具有物种和组织特异性(选择性必修3P90)。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。 （2）诱导型启动子（选择性必修3P80） 例15.（2024年河北卷，T22）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 【答案】水稻胚乳中特异性表达的基因的 使转录终止 Hind Ⅲ和EcoRⅠ 【解析】利用水稻细胞培育能表达r2HN 的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的基因的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos 为终止子，终止子可以终止转录。KpnⅠ破坏了启动子序列，Sac Ⅰ位于终止子序列，均不能选用，且r2HN 基因内部不含载体的限制酶识别位点，则为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对r2HN 基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 例16.（2024年广东五校联考）利用细菌靶向给药在肿瘤治疗领域受到广泛关注。科研人员改造大肠杆菌，制造出能定点、可控表达治疗性抗体的工程菌。回答下列问题： (1) 聚焦超声能使肿瘤部位的温度从37℃提升至42℃，可作为工程菌的“温度开关”。研究人员筛选出3种转录抑制蛋白，37℃时，转录抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制下游绿色荧光蛋白（GFP）基因的转录；42℃时，转录抑制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结合。 ①研究人员构建了下图所示表达载体，以筛选最佳感温元件。除图中所含元件外，表达载体还必须具有             和氨苄青霉素抗性基因、限制酶酶切位点等元件。长时间培养时在培养液中加入氨苄青霉素，其作用是            。（写出两点即可） ②检测导入不同转录抑制蛋白基因的大肠杆菌在不同温度下的荧光强度，结果如下图所示。最终选择转录抑制蛋白 （填“A”或“B”或“C”）来构建工程菌，理由是 。 (2)上述表达载体仅在42℃时表达，而肿瘤治疗需要长期进行。科研人员继续对表达载体进行如下图所示改造，整合酶可将P7序列进行一次永久性翻转。请预测以下培养条件下改造后的工程菌菌落的颜色：Ⅰ.37℃培养 ；Ⅱ.42℃培养 ；Ⅲ. 42℃处理1h后，37℃培养 。（填“无色”或“绿色”） (2) 为得到可用于肿瘤治疗的工程菌，需进一步改造上述工程菌。请选择下图中 X、Y、Z三个位点中的一个作为治疗性抗体编码基因的插入位点 。 【答案】（1）终止子和复制原点 防止杂菌污染、将含有目的基因的受体细胞筛选出来 37℃时荧光强度低，安全性高；42℃荧光提高倍数最大，灵敏度高 （2）无色 绿色 绿色 （3）X 【详解】（1）①质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，而表达载体没有进入的细菌没有，长时间培养时在培养液中加入氨苄青霉素，其作用是去除丢失质粒的细菌，抑制杂菌生长。②由图可知，37℃下荧光强度很低，安全性高，42℃下荧光强度提高倍数最大，灵敏度高，所以最终选择转录抑制蛋白C来构建工程菌。（2）Ⅰ. 在37°C培养时，转录抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制整合酶基因表达，P7序列不能翻转，下游绿色荧光蛋白（GFP）基因无法转录表达，所以工程菌菌落无色。 Ⅱ. 在42°C培养时，转录抑制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结合，整合酶基因表达，使P7序列翻转，GFP基因可以转录表达，工程菌菌落为绿色。Ⅲ. 在42°C处理1h后，P7序列被整合酶永久性翻转，之后在37°C培养时，由于P7序列翻转后的结构变化，使得GFP基因可以持续表达，工程菌菌落为绿色。 （3）将治疗性抗体编码基因插入X位点，可实现机体正常部位不表达，仅当肿瘤部位升温至42℃后，才激活并持续表达，实现长期、定点的肿瘤治疗，所以择图5中X位点作为治疗性抗体编码基因的插入位点。 例17.（2025·广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 【答案】(1)荧光 (2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中 【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。 4 .Ti质粒 例18.(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则： (1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。 (3) 已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ， 图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ， 依据是 。 【答案】(1)农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (2)检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 例19.（CS周练18，6）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。农杆菌的Ti质粒的T-DNA上含有抗甘草磷除草剂基因，相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 （1）利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为                         。 （2）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是 。 【答案】(1)Bcl I和Sma I (2)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞 【解析】（2）利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamHI，会降Ti质粒上的复制原点切掉，剩下的部分在启动子和终止子之间没有限制酶的切割位点，故选择BclI和SmaI。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3'端序列可以与④5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与①5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为①④。（3）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。 例20.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【答案】(3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化 【解析】（3）T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 7. 将目的基因导入受体细胞 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 稳定 和 表达 的过程。实质是 基因重组 (变异类型) 导入至植物细胞 花粉管通道法 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 农杆菌转化法 1. 农杆菌特点：易感染 单子叶 叶植物和 裸子 植物，对大多数 叶植物没有感染能力（人工添加 酚类 化合物可以解决）。 2. 原理：农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 T-DNA 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 染色体DNA 上。 3. 过程： ①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是 将 目的基因 拼接到 Ti质粒的T−DNA 上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T−DNA拼接到受体细胞的染色体DNA 上；//第一次导入是导入 农杆菌 ，第二次导入（非人工操作）是将含目的基因的T−DNA导入 受体细胞 。 ②导入的目的基因可能存在于细胞质中（具体位置是 线粒体 、 叶绿体 ），也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA 上的目的基因有可能通过 花粉 传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 ③T-DNA上也要有标记基因，筛选导入成功的受体细胞。 ④植物的受体细胞是 受精卵 或 体细胞 。 导入至动物细胞 显微注射 法 1. 受体细胞 受精卵 。 过程：构建基因表达载体并提纯→利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中→ 早期胚胎培养 → 胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）→获得具有新性状的动物（也叫 生物反应器 ） 膀胱生物反应器：利用转基因的动物的尿液来获得目的蛋白，一般采用工程化膀胱上皮细胞生产特定的蛋白并分泌进入尿液；膀胱生物反应器具有一定的优点：如尿液产量大、收集方便；膀胱生物反应器 （无/有）周期和性别的限制, 在任何时期, 雌雄动物均可通过尿液收集目的蛋白；从尿中提取蛋白更容易, 因为尿液中含有的蛋白种类及其他杂质相对较少易于纯化。 导入至微生物 细胞 Ca2+处理 法（感受态细胞法） 1. 常用菌: 大肠杆菌 。 微生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 。 2. 过程：Ca2+处理细胞→ 感受态细胞 →表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 8. 目的基因的检测与鉴定 类型 检测内容 方法 分子 水平检测 受体细胞的染色体DNA上是否插入了 目的基因 ; 目的基因是否转录出 mRNA 。 分子杂交 、分子杂交等技术。 1. PCR技术检测 （1）受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因： 例如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因。 提取棉花细胞 染色体DNA →Bt基因的特异性引物进行PCR扩增→对扩增产物进行检测（如：琼脂糖凝胶电泳检测） （2）PCR技术检测受体细胞的目的基因是否转录出了mRNA。 方法：提取转基因生物的 总mRNA ，在 逆转录 酶作用下合成 cDNA ，再用与目的基因特异性结合的引物进行PCR扩增，检测是否有扩增产物。 2. 分子杂交技术 探针：是一种带有放射性同位素、荧光染料或其他化学物质标记的 （单/双）链核酸序列，可以是DNA或RNA，用来检测样品中的特定核酸序列。探针能够通过分子杂交的方式与目标序列结合，从而实现对目标序列的检测。 延伸 延伸 变性→复性 受体细胞的目的基因是否翻译成 蛋白质 1. 方法： 抗原-抗体杂交 2. 原理： 抗体与抗原的结合具有特异性 3. 过程：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体与提取的蛋白质进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则说明目的基因已成功翻译。 个体 生物学水平的鉴定 鉴定生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度（活性鉴定） ①抗虫：做抗虫接种实验（饲喂害虫），观察 （害虫/植物体）的生存状况。 ②抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/植物体）的生存状况。 ③抗盐：将转基因植物移栽到 含有较高盐的土壤中 ，观察其生长状况。 ④抗寒：将转基因植物移栽到 低温（寒冷） 环境中，观察其生长状况。 （2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 香树脂醇 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 （2025·山东·节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【解析】突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 9.蛋白质工程 （1）为什么要通过基因改造或基因合成来完成蛋白质工程，而不是直接对蛋白质进行改造？ ①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。 ②蛋白质是由基因编码的，改造了基因，可以间接改造蛋白质。 ③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。 （2）定义：是以 蛋白质分子的结构规律与生物功能的关系 作为基础，通过 基因改造或合成基因 对现有的蛋白质进行改造，或制造一种 新的蛋白质 ，以满足人类的生产和生活需要。 （3）蛋白质工程和基因工程的比较 基因工程 蛋白质工程 操作环境 生物体外 生物 （体内/体外） 操作核心 基因 基因 操作起点 目的基因 蛋白质预期功能 基本过程 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 预期蛋白质的功能→设计预期蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列→获得所需要的蛋白质 结果 生产自然界已存在的蛋白质 改造天然蛋白质或创造出自然界 （不存在/存在）的蛋白质 联系 蛋白质工程最终还是要回到基因工程上来，因为蛋白质的合成由基因控制，所以说蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第 二 代基因工程 （2025·河南·节选）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (4) 已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。 【答案】(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 【详解】（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 第 1 页 学科网（北京）股份有限公司 $