第3章 基因工程 章末达标检测-【精讲精练】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程知能达标训练（人教版）

(满分：100分) 一、选择题(本题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个选项符合题目要求。) 1．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是(　　) A．基因工程又叫重组DNA技术，所用的工具酶是限制性内切核酸酶 B．所有的限制性内切核酸酶识别同一种特定的核苷酸序列 C．形成重组质粒时，用DNA连接酶将碱基通过氢键连接 D．基因工程常用的运载体有噬菌体、动植物病毒和质粒 解析　基因工程又叫DNA拼接技术或重组DNA技术，所用的工具酶是限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A错误；不同的限制性内切核酸酶识别的特定核苷酸序列不同，B错误；形成重组质粒时，用DNA连接酶将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；基因工程常用的运载体有噬菌体、动植物病毒和质粒，D正确。 答案　D 2．(2024·洛阳一中高二期末)下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是(　　) A．通常情况下，a与d需要用同一种限制酶进行切割 B．b能识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开 C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对 D．b代表的是限制性内切核酸酶，c代表的是RNA聚合酶 解析　b是限制性内切核酸酶，能识别特定的核苷酸序列并使DNA分子的每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，而不是使氢键断开，B错误；c是DNA连接酶，能连接两个DNA片段，C、D错误。 答案　A 3．科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．农杆菌的T­DNA与番木瓜基因发生重组 B．构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D．转基因抗病毒番木瓜不具有卡那霉素抗性 解析　构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病毒番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病毒番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。 答案　A 4．进行基因编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某二倍体生物B基因进行定点编辑的过程，用sgRNA可指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的切割位点。下列说法错误的是(　　) A．基因定点编辑前，需要设计与片段Ⅱ两端碱基序列配对的sgRNA B．Cas9通过断裂脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键实现对片段Ⅱ切除 C．通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因的功能 D．通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因不是等位基因 解析　sgRNA可指引限制酶Cas9结合到特定位点进行切割，因此基因定点编辑前需要设计与被切割基因的两端碱基序列配对的sgRNA，A正确；Cas9切断的是DNA片段，所以Cas9切断的是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，来实现对片段Ⅱ切除，B正确；通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因原有的功能，C正确；通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因由于位于同源染色体的相同位置，所以它们是等位基因，D错误。 答案　D 5．如图是RT­PCR过程示意图，①和②表示逆转录酶催化的逆转录过程，③表示PCR过程。据图分析下列说法错误的是(　　) A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力 B．③过程只需要引物b C．RT­PCR不可直接检测基因表达水平 D．RT­PCR可检测新型冠状病毒等RNA病毒 解析　逆转录酶能催化合成DNA，即具有DNA聚合酶的能力，A正确；③表示PCR过程，需要引物a、b，B错误；RT­PCR可检测基因的转录情况，从而推知基因的表达水平，不可直接检测基因表达水平，C正确；RT­PCR过程是先由RNA逆转录得到cDNA，再通过PCR扩增，故可用于检测新型冠状病毒等RNA病毒，D正确。 答案　B 6．科学家将含有人溶菌酶基因的基因表达载体注射到鸡胚中获得转基因鸡，目的基因在鸡输卵管细胞中特异性表达，并能在鸡蛋中收集溶菌酶。下列说法错误的是(　　) A．可从基因文库获取人溶菌酶基因 B．RNA聚合酶识别鸡输卵管细胞中特异性表达的基因的启动子 C．可通过农杆菌转化法将人溶菌酶基因导入鸡胚 D．鸡输卵管细胞可将人溶菌酶分泌到细胞外 解析　可从基因文库中获取人溶菌酶基因，A正确；目的基因在输卵管细胞中特异性表达，说明RNA聚合酶识别鸡输卵管细胞中特异性表达的基因的启动子，B正确；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，而农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，C错误；能在鸡蛋中收集溶菌酶，说明鸡输卵管细胞可将人溶菌酶分泌到细胞外，D正确。 答案　C 7．(2025·阜新期末)下列关于几种酶作用的叙述，不正确的是(　　) A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接 B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因 D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链 解析　DNA连接酶可以使连接DNA分子片段之间的磷酸二酯键得以形成，即使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，A正确；RNA聚合酶能与基因的特定位点(启动子)结合，催化遗传信息的转录，B正确；通常情况下，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，C错误；DNA分子复制时，DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，D正确。 答案　C 8．利用基因工程技术，将T­DNA片段插入A基因中导致A基因突变，可获得突变体。为获知T­DNA插入位置，可用PCR技术进行扩增，应从下图选择的引物组合是(　　) A．引物Ⅰ与引物Ⅱ B．引物Ⅰ与引物Ⅲ C．引物Ⅱ与引物Ⅳ D．引物Ⅲ与引物Ⅳ 解析　引物Ⅰ与引物Ⅱ延伸方向向右，引物Ⅲ与引物Ⅳ延伸方向向左，引物组合只能是Ⅰ与Ⅲ、Ⅰ与Ⅳ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅱ与Ⅳ。为获知T­DNA插入位置，扩增序列应该包括T­DNA和A基因片段，故C正确。 答案　C 9．下列关于基因工程的应用的叙述，正确的是(　　) A．水稻细胞内检测到耐盐基因的表达产物，说明育种成功 B．向植物体内转入Bt毒蛋白基因可培育转基因抗病植物 C．转入胰岛素基因的大肠杆菌直接合成的胰岛素不具有生物活性 D．乳腺生物反应器只有乳腺细胞中含有目的基因 解析　水稻细胞内检测到耐盐基因的表达产物，并不能说明育种已成功，还要进一步检测该水稻在盐碱地中的生长状况，A错误；向植物体内转入Bt毒蛋白基因可培育转基因抗虫植物，B错误；具有正常生物活性的胰岛素需要内质网和高尔基体进行加工，而大肠杆菌(原核细胞)没有内质网和高尔基体，故转入胰岛素基因的大肠杆菌直接合成的胰岛素不具有生物活性，C正确；乳腺生物反应器各个细胞都含有目的基因，但目的基因只在乳腺细胞中选择性表达，D错误。 答案　C 10．下列有关基因工程和操作工具的叙述，正确的是(　　) A．质粒常被用作载体的原因之一是质粒上具有标记基因 B．RNA聚合酶能与信使RNA的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．利用显微注射法将人的生长激素基因直接导入小鼠的受精卵，培育超级小鼠 D．DNA探针可用于检测苯丙酮尿症和21三体综合征 解析　因质粒上具有标记基因，所以质粒常被用作载体，将目的基因导入受体细胞；RNA聚合酶能与基因的启动子相结合，催化遗传信息的转录；利用显微注射法将重组DNA导入小鼠的受精卵，目的基因才能够得以表达；DNA探针可用于检测苯丙酮尿症，但不能用于检测21三体综合征。 答案　A 11．(2025·合肥质检)科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列说法正确的是(　　) A．将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，可以用花粉管通道法 B．人的生长激素基因只存在于小鼠的膀胱上皮细胞中 C．进行基因转移时，通常要将外源基因转入受精卵中 D．采用抗原—抗体杂交技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组 解析　花粉管通道法用于将目的基因导入植物细胞，A错误；小鼠的体细胞是由同一个受精卵分裂和分化来的，核遗传物质相同，故小鼠的体细胞几乎都含有人的生长激素基因，B错误；由于受精卵的全能性最高，所以进行基因转移时通常将外源基因转入受精卵中，C正确；检测外源基因是否插入了小鼠的基因组通常采用PCR等技术，D错误。 答案　C 12．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，可以用于治疗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析下列叙述错误的是(　　) A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能 B．图中新的干扰素基因必须插入到质粒上的启动子和终止子之间才能表达 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中各过程并没有涉及基因工程技术 解析　构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能，A正确；新的干扰素基因必须插入到质粒上的启动子和终止子之间才能表达，B正确；改造干扰素结构的实质是对干扰素基因的结构进行改造，C正确；题图中从“人工合成DNA”到“在受体细胞中表达”的过程运用了基因工程技术，D错误。 答案　D 13．α1­抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1­抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。 下列关于该过程的叙述，错误的是(　　) A．载体上绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的作用是便于筛选含有目的基因的受体细胞 B．将目的基因导入羊膀胱细胞中，将会更加容易得到α1­抗胰蛋白酶 C．培养的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖产生的后代也都能产生α1­抗胰蛋白酶 D．目的基因与载体重组过程需要DNA连接酶的催化作用 解析　载体上绿色荧光蛋白基因作为标记基因，可用于筛选含目的基因的受体细胞；将目的基因导入羊膀胱细胞中可制得膀胱生物反应器，获取产品将不受性别和发育时期的限制；基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶；转基因羊有性生殖产生的后代会发生性状分离，有的子代不再具有转基因生物的特性。 答案　C 14．运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的不符的是(　　) A．用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体 B．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌 C．可用PCR技术大量扩增目的基因 D．用Ca2＋处理大肠杆菌使其易于转化 解析　限制酶不能破坏目的基因，也不能破坏质粒上的标记基因，且应该用不同的限制酶进行切割，以防止质粒和目的基因自身的黏性末端连接或防止目的基因与载体反向连接，所以构建图示的重组质粒的酶切位点应该选BamHⅠ、PstⅠ，用DNA连接酶将重组基因连接，A不符合题意；载体和导入目的基因的载体上都存在氨苄青霉素抗性基因，因此不能依此来确定筛选出的是否为导入目的基因的细菌，B符合题意；可用PCR技术大量扩增目的基因，C不符合题意；用Ca2＋处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，易于转化，D不符合题意。 答案　B 15．(2024·天津卷)胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物生产等历程。有关叙述错误的是(　　) A．动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞 B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C．用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子 D．利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物 解析　胰岛素在动物体内由胰岛B细胞合成后，经过胞吐作用释放出细胞，A正确；胰岛素属于蛋白质类激素，所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸，B正确；用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素不需要使用相同的启动子，因为两者属于不同的表达系统，大肠杆菌是原核生物表达系统，而乳腺生物反应器属于真核生物表达系统，启动子要求不同，C错误；利用蛋白质工程技术可以对胰岛素进行改造，生成具有不同作用特性的胰岛素类似物，包括速效胰岛素，D正确。 答案　C 二、选择题(本题共5小题，每小题3分，共15分。每小题有一个或多个选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。) 16．B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如图所示的实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，正确的是(　　) A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录 B．可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列 C．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上 D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光 解析　启动子是与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因获取途径之一就是从cDNA文库中获得，B正确；检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该用DNA分子杂交法，C错误；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。 答案　ABD 17．(2025·本溪期中)下图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR扩增出T­DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T­DNA插入的具体位置。下列有关说法正确的是(　　) A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T­DNA存在于其Ti质粒上 B．若扩增循环n次，需要2n－2个引物 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T­DNA的插入位置 解析　农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，A错误；扩增循环n次，得到2n个DNA分子，只有最初的两条母链不需要引物，共需要2n＋1－2个引物，B错误；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T­DNA 的插入位置，D正确。 答案　D 18．下列哪些方法能用于检测目的基因是否成功导入或表达(　　) A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因 B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因 C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测 D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性 解析　检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因。 答案　BCD 19．(2025·扬州高二模拟)我国科学家利用了XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图所示是相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法正确的是(　　) A．一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增6次共产生52个等长片段 B．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法 C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株 D．使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段 解析　一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增6次共产生26－2×6＝52个DNA，A正确；将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法、花粉管通道法，B正确；目的基因插入两个限制酶酶切位点之间，对卡那霉素抗性基因和新霉素抗性基因都无影响。之所以不能用卡那霉素筛选，是因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T­DNA片段，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了目的基因的678个碱基对，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500 bp的新片段，D正确。 答案　ABD 20.(2025·天津一中期末)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述错误的是(　　) A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞 解析　将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因，目的基因—质粒片段、质粒—片段质粒片段三种类型，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的具有相同黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端也不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。 答案　ABD 三、非选择题(本题共5小题，共55分) 21．(10分)(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________。 将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是_______________________________________ ________________________________________________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： 图1 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是____________________________________，随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是___________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 图2 注：虚线长度代表氨基酸间的空间距离 解析　(1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)E.coli DNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 答案　(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释 (2)BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 (4)44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 22．(10分)下图为培育转基因奶牛获得人血清白蛋白(HSA)的流程。回答下列问题： (1)PCR扩增HSA基因使用的酶是__________，反应体系中需要加入两种引物，原因是__________________，一个DNA分子经过三轮复制以后，同时含有两种引物的DNA分子有________个。 (2)过程①常用的方法是________。在过程②进行之前，需对早期胚胎进行性别鉴定，可取胚胎细胞进行DNA分析，其采用的基因探针来自________(填“X”或“Y”)染色体。 (3)检测牛奶中是否含有HSA，可采用________技术，如果在转基因牛乳汁中没有检测到HSA的存在，从构建基因表达载体的角度分析，最可能的原因是位于目的基因前后的__________________设计不理想，导致目的基因不能正常表达。 (4)有人另辟蹊径，成功培育出能生产HSA的转基因酵母菌。试指出利用转基因酵母菌生产人血清白蛋白的两点优势：________；________。 解析　(1)PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶；利用PCR技术扩增HSA基因时，需要加入两种引物，原因是耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增，该酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，一个DNA分子经三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有6个。(2)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；在过程②胚胎移植进行之前，需对早期胚胎进行性别鉴定，采用的基因探针来自性染色体，其中Y染色体是雄性特有的，因此采用的基因探针来自Y染色体。(3)检测牛奶中是否含有HSA，可采用抗原—抗体杂交技术。基因表达载体的组成包括启动子、目的基因、标记基因和终止子等，如果在转基因牛乳汁中没有检测到HSA的存在，从构建基因表达载体的角度分析，最可能的原因是位于目的基因前后的启动子和终止子设计不理想，导致目的基因不能正常表达。(4)利用转基因酵母菌生产人血清白蛋白的优势：酵母菌繁殖快、易培养、成本低；可以工业化生产、生产不受季节、气候、地域限制。 答案　(1)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)　DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增　6　(2)显微注射法　Y　(3)抗原—抗体杂交　启动子和终止子　(4)酵母菌繁殖快、易培养、成本低　可以工业化生产、生产不受季节、气候、地域限制 23．(13分)(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是________________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 ________________________________________________________________________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_________________ ________________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。 解析　(1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，从而使N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C、A—U、A—T。(3)由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。结合题图分析可知P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。(4)焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。 答案　(1)磷酸二酯键　片段甲含有启动子和终止子　(2)A—U、A—T　(3)菌株B2的基因组DNA　无扩增产物　(4)实现废物利用，减少环境污染(合理即可) 24．(10分)(2025·黑吉辽内蒙古卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从________________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是______________________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′ b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′ c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′ d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的______含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 解析　(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从DNA序列数据库或基因序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5′端含有引物1序列，而编码链的5′端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5′端添加XbaⅠ、引物1 5′端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质粒pYL大小为7.2 kb，重组质粒大小约9.5 kb，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小为二者的差值，约为2.3 kb(2～2.3 kb)，结合图2电泳结果可知，实验组1的电泳条带大小约为2300 bp，说明实验组1的质粒中成功插入了基因N。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，根据a引物5′端首位GCA为240位，则c引物5′端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 (4)题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案　(1)基因序列数据库或DNA序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶 (2)外源DNA(或外源基因、基因N)　1　基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL大小的差值，约为2.3 kb，对应实验组1的电泳条带(或实验组1电泳条带大小加质粒pYL大小约等于重组质粒大小) (3)GCC (4)香树脂醇 25．(12分)(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 注：LB/RB表示T－DNA的边界序列；Kanr表示卡那霉素抗性基因；bp表示碱基对 甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和______对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由T－DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为______(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 注：P1、P2表示引物 乙　基因组DNA酶切后含T－DNA的片段 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 解析　(1)Ti质粒含有复制原点，使其在农杆菌细胞中能进行自我复制。质粒上含有的酶切位点有XbaⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和BamHⅠ，BamHⅠ酶切会破坏质粒上的终止子，故不能选择BamHⅠ对质粒进行酶切。由于目的基因应插入在启动子和终止子之间，所以应选择XbaⅠ和SmaⅠ(或PstⅠ和SmaⅠ)对Ti质粒进行完全酶切。由于抗除草剂基因X使用SmaⅠ对其进行完全酶切，两端均为平末端，为构建基因表达载体，Ti质粒被XbaⅠ或PstⅠ酶切产生的黏性末端需要被补平，如图表示XbaⅠ或PstⅠ酶切产生的黏性末端： 由上图可知，只有XbaⅠ酶切产生的黏性末端能被补平，故应选择XbaⅠ和SmaⅠ对Ti质粒进行完全酶切。DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA链的3′端，因此，将黏性末端补平时使用的酶是DNA聚合酶。根据抗除草剂基因X的转录方向，构建基因表达载体的正向连接和反向连接的示意图如下： 由上图可推知，应选择限制酶SmaⅠ和SpeⅠ对重组质粒进行酶切并电泳检测。若重组质粒为正向连接，则电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550 bp。 (2)本实验目的为证明这两个突变体是由T－DNA插入小麦基因组中同一基因导致的。实验步骤：提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段，由于后续PCR难以扩增大片段DNA，因此，在对基因组DNA酶切过程中，应使用识别序列为4个碱基对的限制酶(且T－DNA不含该酶的酶切位点)，因为识别序列越短，基因组DNA可能存在的限制酶酶切位点越多，获得较短DNA片段的概率越大。分析图乙，因为引物P1和P2向外侧延伸，利用引物P1和P2扩增未知序列，应先将该DNA片段连成环状。PCR扩增出未知序列后，可通过测序和序列比对来判断2条片段的未知序列是否属于同一个基因，琼脂糖凝胶电泳只可判断2条片段未知序列的大小，不能确定两者的碱基排列顺序。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含野生型基因的表达载体转入突变植株，如果能在突变植株内检测到野生型基因，但野生型未必可以正常表达，故不能确定该植株的表型是否为野生型。 答案　(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550 (2)4　连接(或环化)　测序和序列比对 (3)不能 学科网（北京）股份有限公司 $