专题14基因工程（3大要点+4大题型）（专题突破练）（江苏专用）2026年高考生物二轮复习讲练测

专题14 基因工程 目录 第一部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第二部分 核心要点提升 要点精析、能力提升 知识串联·核心必记 要点01核心工具与载体（基础必考点） 要点02核心操作程序（核心得分点） 要点03分子检测与应用（能力提升点） 专题拓展·能力提升 热点情境 基因编辑技术的应用与安全伦理思辨 第三部分 题型精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01基因工程核心工具与操作程序 题型02基因工程的应用与蛋白质工程 题型03基因工程相关实验技术与探究 题型04转基因生物的安全性与伦理问题 B组·增分能力练 第四部分 真题演练进阶 对标高考，感悟考法 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 核心工具与载体 （2025江苏卷）限制酶切割位点、基因突变分析 （2024江苏卷）融合蛋白载体元件、标记基因 （2023江苏卷）DNA 连接酶作用位点与类型区分 1.结合 CRISPR 等新技术，考查工具酶特异性与载体改造 2.新增基因治疗伦理、转基因生物安全相关情境，关联检测技术的实际应用价值 3. 强化实验设计与结果预测 ，要求规范描述检测流程与结果判定标准 核心操作程序 （2025江苏卷）农杆菌转化法、PCR 引物设计 （2024江苏卷）表达载体构建顺序、感受态制备 （2023江苏卷）cDNA 文库法、微生物导入 分子检测与应用 （2025江苏卷）DNA 分子杂交、抗原 - 抗体杂交 （2024江苏卷）分子杂交、乳腺生物反应器 （2023江苏卷）抗虫接种、分子检测结果 新风向演练 1.【新情境·融合蛋白】（2024·江苏连云港·一模）基因工程中，为方便纯化蛋白质，构建表达载体时可将目的基因序列与标签基因序列连接，表达含有标签的融合蛋白。下图为某质粒编码链（转录时的非模板链）的部分序列。下列相关叙述错误的是（　　） A．转录后的mRNA序列与图中DNA序列一致，仅T替换为U B．若目的蛋白中只保留组氨酸标签，选择酶切位点时优先考虑Nde I和Xho I（或Ava I） C．若目的蛋白中保留了组氨酸标签，翻译时标签下游的基因序列不编码氨基酸 D．以组氨酸标签的基因序列为模板设计下游引物，扩增导入成功的目的基因时，获得的序列可能比预期的序列短 2.【新情境·膀胱生物反应器】（2024·江苏南京·一模）研究人员制备了膀胱生物反应器，用其获得人体特殊功能蛋白S，基本过程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．步骤①需要在S基因编码区上游添加乳腺蛋白基因启动子 B．步骤②需要在高Ca2+-高pH条件下将S基因表达载体导入受精卵 C．步骤④可选择发育良好的囊胚，且代孕母体一般需要同期发情处理 D．与乳腺反应器不同的是膀胱生物反应器会受到转基因动物的性别和年龄的限制 3.【新情境·AI 技术】（2025·江苏淮安·二模）AI 技术通过大数据分析、机器学习、深度学习等方法，为生物医药研究、药物开发、临床诊断和治疗等带来革命性的变化。下列关于 AI 技术在生物医药领域的应用，下列叙述错误的是（　　） A．AI 技术对大量的蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于蛋白质工程技术 B．AI 技术通过智能穿戴设备和移动应用程序可实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和治疗建议 C．AI 技术对大量的基因组数据进行处理和分析，可以识别疾病相关的基因突变，为精准医疗 提供支持 D．AI 技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，且基因序列中不包含启动子和终止子 4.【新考法·科学实验】（2025·江苏南京·二模）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（　　） A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解 B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变 C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×（220-2）个引物 5.【新考法·DNA聚合酶】（2024·江苏南通·二模）在Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列相关说法正确的是（　　） A．细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2+ B．PCR技术中的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活 C．DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3'端延伸子链 D．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 知识串联·核心必记 要点01核心工具与载体（基础必考点） 类别 具体类型 作用 限制酶 如EcoRⅠ、BamHⅠ 1.识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 2.使每条链中特定部位的磷酸二酯键断裂 3.产生黏性末端或平末端 DNA连接酶 1.E·coliDNA连接酶 2.T₄ DNA连接酶 1.连接两个DNA片段的磷酸二酯键 2.E·coliDNA 连接酶：只能连接黏性末端 3.T₄DNA连接酶：可连接黏性末端和平末端 载体 1.质粒（最常用） 2.λ噬菌体衍生物 3. 动植物病毒 必备条件： 1.有一个至多个限制酶切割位点 2.能在受体细胞中自我复制或整合到染色体 DNA 上同步复制 3.有标记基因（如抗生素抗性基因），便于筛选 4.对受体细胞无害 【易错易混】 1. 限制酶切割的是磷酸二酯键，而非氢键 2. 不同限制酶可能产生相同的黏性末端（同尾酶） 3. DNA 聚合酶需模板链，连接单个脱氧核苷酸；DNA 连接酶连接 DNA 片段，无需模板两者都不催化氢键形成 4. 质粒≠载体：载体包含质粒，质粒是常用载体 5. 天然质粒需人工改造（如添加标记基因、多克隆位点）才能作为载体 【典例1】马铃薯在生长期易受多种病毒侵染而严重减产。科研人员通过农杆菌介导法，将4种病毒CP融合基因导入马铃薯，获得多抗转基因马铃薯，有效解决了多种病毒的侵染问题。其转化中所涉及的CP融合基因、Ti质粒部分结构如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） 注∶ClaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、SacⅠ为相应限制酶的识别位点，Kan片段为卡那霉素抗性基因片段 A．具体操作过程中CP融合基因需先经PCR扩增，再进行凝胶电泳加以分离和鉴定 B．为了使CP融合基因能在马铃薯叶细胞中表达，可从马铃薯任何部位细胞中获取启动子1 C．应选择BamHⅠ和SacⅠ同时处理CP融合基因所在的DNA分子和Ti质粒 D．若经限制酶处理的CP融合基因与Ti质粒反向连接，会导致CP融合基因不能正常表达 要点02核心操作程序（核心得分点） 操作步骤 核心内容 目的基因的获取 方法1：从基因文库中获取 基因组文库：包含一种生物的全部基因 cDNA文库：包含一种生物的部分基因（由mRNA反转录而来） 方法2：PCR技术扩增 原理：DNA半保留复制 ；条件：模板DNA、引物、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、dNTP；过程：变性→退火→延伸 方法3：人工合成（基因较小、核苷酸序列已知） 基因表达载体的构建（核心步骤） 组成：目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因 + 复制原点 启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 终止子：终止转录的部位 标记基因：筛选含目的基因的受体细胞 构建工具：限制酶、DNA连接酶 将目的基因导入受体细胞 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，适用于双子叶和裸子植物）、基因枪法、花粉管通道法 动物细胞：显微注射技术（最常用，将基因表达载体注射到受精卵中） 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理，使细胞处于能吸收周围DNA的状态） 目的基因的检测与鉴定 分子水平检测（3 步） ① DNA 分子杂交：检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 ② 核酸分子杂交：检测目的基因是否转录出mRNA ③ 抗原 - 抗体杂交：检测目的基因是否翻译出蛋白质个体水平鉴定：抗虫 / 抗病接种实验、性状观察等 【典例2】下列关于PCR技术的叙述，错误的是（　　） A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差 B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异 C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量 D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个 要点03分子检测与应用（能力提升点） 易错点解析： 1.DNA水平检测（整合与插入） 易错点：同尾酶连接后仍用原限制酶验证；单酶切无法区分正反向连接。 对策：双酶切避免同尾酶，用特异引物PCR鉴定方向，产物大小差异判断连接正确性。 2.PCR鉴定易错 易错点：引物仅加一条或同方向；模板浓度过高 / 过低致无产物或非特异带。 对策：必须加一对反向互补引物 3.RT - PCR易错 易错点：未去除基因组DNA致假阳性；引物跨内含子设计失败。 对策：设计跨外显子引物，产物无内含子片段才为cDNA扩增产物。 4.标记基因与目的基因混淆 易错点：抗生素抗性阳性即认为目的基因表达。 对策：抗性仅为筛选，需加蛋白质杂交验证。 【典例3】琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是（    ） A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快 B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内 C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊 【典例4】研究人员利用农杆菌侵染水稻叶片，经组培、筛选最终获得了一株水稻突变体。利用不同的限制酶处理突变体的总 DNA、电泳；并与野生型的处理结果对比，得到图所示放射性检测结果。（注：T-DNA 上没有所用限制酶的酶切位点）对该实验的分析错误的是（ ） A．检测结果时使用了放射性标记的 T-DNA 片段做探针 B．该突变体产生的根本原因是由于 T-DNA 插入到水稻核 DNA 中 C．不同酶切显示的杂交带位置不同，说明 T-DNA 有不同的插入位置 D．若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确 专题拓展·能力提升 热点情境拓展 基因编辑技术的应用与安全伦理思辨 情境解读 1.医学应用情景：聚焦遗传病治疗与癌症攻坚 此类情景为高频考点，围绕CRISPR-Cas9等技术在人类疾病治疗展开，核心是技术原理与应用效果分析。典型情景包括单基因遗传病的基因编辑治疗、CAR-T疗法基因优化、异种器官移植基因编辑突破。 2.农业应用情景：紧扣作物改良与精准育种 结合农业发展需求，该方向为重要情景类型，近三年试题情景包括CRISPR技术编辑小麦、水稻基因培育抗逆品种，培育高油酸、耐盐碱大豆等优质作物，均源于真实科研，体现“科技兴农”导向。 3.伦理争议情景：围绕技术边界与社会影响 伦理争议是考察“社会责任”素养的核心载体，试题情景延伸至生殖细胞编辑代际风险、基因增强与社会公平、基因歧视等议题，基因编辑动物伦理争议等。 命题分析 命题立足教材核心知识，避免前沿技术堆砌，考察重点集中于三大核心知识点： 基因工程工具：CRISPR-Cas9系统作用机制，与传统工具的对比优势； 操作流程与检测：目的基因定点编辑，分子（PCR、测序等）与个体水平检测方法； 安全性问题：脱靶效应成因与应对，基因编辑对基因组稳定性的影响。 【典例5】下列关于基因编辑技术（CRISPR/Cas9）的应用与安全伦理的叙述，正确的是（    ） A. 体细胞基因编辑可改变生殖细胞的遗传物质，进而遗传给子代 B. 生殖细胞基因编辑因可能污染人类基因库，被全球各国严格禁止用于非治疗目的 C. 脱靶效应是基因编辑技术的特有风险，可通过精准设计 sgRNA 完全消除 D. 基因编辑技术用于增强人类身高、智力等性状的研究，符合伦理规范与社会公平原则 【典例6】下列有关生物技术的安全性和伦理性问题的叙述，正确的是（    ） A．人类基因组编写计划是测定人类的基因组序列的一项伟大工程 B．我国对农业转基因生物实行标识制度，需在标签上警示性注明可能危害 C．中国政府不反对治疗性克隆，但可以有限制地进行生殖性克隆研究 D．生物武器包括病菌类、病毒类和生化毒剂类等，其特点为致病能力强 01基因工程核心工具与操作程序 1.乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列分析不合理的是（　　） A．转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B．可以利用PCR技术筛选含有L-PG 基因的受体细胞 C．基因表达载体质粒除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等 D．标记基因Ampr即可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 2.下列关于高中生物学“载体”的叙述，正确的是（　　） A．载体蛋白转运物质时自身构象不会发生改变 B．氢载体NADH在叶绿体基质中可用于碳固定过程 C．作为基因工程载体的质粒仅存在于原核生物中 D．腺苷三磷酸在生物体内可作为能量和磷酸的载体 3.真核细胞转座子有逆转录转座子（如图①）和DNA转座子（如图②）之分，可在染色体内部和染色体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA分子的特定位点中，具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键 B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异 C．DNA转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变 D．逆转录转座子通常存在于不易于转录的区域 4.（多选）农杆菌Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法正确的有（    ） A．进行PCR扩增的依据是DNA热变性的原理 B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶、引物、四种脱氧核苷三磷酸（dNTP） C．利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定TDNA的插入位置 5.苏云金杆菌是一种细菌，它能产生使棉铃虫死亡的杀虫蛋白，这种杀虫蛋白对人和牲畜无任何毒害作用。科学家将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞，获得了能产生杀虫蛋白的抗虫棉，提高了棉花的产量。下列相关叙述不正确的是（    ） A．苏云金杆菌有成形的细胞核 B．抗虫棉的培育使用了转基因技术 C．苏云金杆菌是单细胞生物 D．该方法能减少农药对环境的污染 02基因工程的应用与蛋白质工程 1.（2024·江苏南京·二模）（多选）嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是癌症治疗的研究热点。其原理是将CAR基因导入T细胞获得CAR-T，进而表达出特异性更强的癌细胞抗原受体蛋白（CAR）。相比自然状态下的细胞毒性T细胞，CAR-T对肿瘤细胞的杀伤性、靶向性更强。治疗流程如下图。下列叙述错误的有（    ） A．步骤②属于生物工程中的细胞工程 B．CAR-T细胞的CAR能特异性识别并杀伤癌细胞 C．步骤④可选用动物病毒或噬菌体作为载体 D．步骤⑤需定期更换培养液以补充营养物质并清除代谢废物 2.（多选）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是（    ） A．为连入GUS 基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 B．表达载体中GUS 基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板 C．可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞，在培养基中添加壮观霉素进行筛选 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用 3.“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（　　） A．诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出异种融合细胞 B．用灭活的仙台病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交瘤细胞 C．培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行分子杂交显示出杂交带即可筛选耐盐植株 D．制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行SRY基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 4.（2025·江苏常州·三模）（多选）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　） A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 03基因工程相关实验技术与探究 1.（2025·江苏南通·一模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述正确的是（　　） A．取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精可析出DNA B．提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝 C．电泳过程中DNA分子越大，所带电荷数越多，迁移速率越快 D．在琼脂糖凝固前加入指示剂，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 2.关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集 B．PCR缓冲液中需保持较高浓度的Mg2+，以确保DNA聚合酶最佳活性 C．将白色丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化 D．DNA电泳指示剂需要加入到稍冷却的琼脂糖溶液中 3.（2025·江苏苏州·三模）蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是（    ） A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化 C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中 D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色 4.为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA 的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末 B．利用NaOH溶液提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤 C．NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈震荡，以免造成DNA 损伤断裂 D．缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有维持DNA 酶活性、促进微生物生长等功能 04转基因生物的安全性与伦理问题 1.“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列叙述正确的是（　　） A．用选择培养基筛选微生物，对照组不接种微生物，实验组接种微生物 B．诱导植物原生质体融合时，观察是否再生细胞壁可筛选异种融合细胞 C．制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞 D．在试管婴儿技术中，需取滋养层细胞进行性别鉴定来筛选所需的胚胎 2.治疗性克隆的一般流程是把患者（供体）体细胞移植到去核卵母细胞中形成重构胚，再把重构胚体外培养到囊胚，然后从中分离出ES细胞，并诱导ES细胞定向分化为所需的特定细胞类型用于移植。下列说法错误的是（    ） A．供体细胞注入去核卵母细胞后还需诱导融合 B．ES细胞在核遗传上和供体细胞相同 C．治疗性克隆是治疗遗传病的根本措施 D．治疗性克隆可解决器官移植时的免疫排斥问题 3.生物技术应用广泛，下列有关叙述正确的是（　　） A．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，发育成的个体没有形态学差异 B．动物细胞体外培养均需贴附在某些基质表面才能生长增殖 C．可通过脱分化和再分化过程获得胚状体，提取紫杉醇等次生代谢物 D．种植转基因植物有可能因基因扩散而影响自然界原有植物的遗传多样性 一、单选题 1.（2025·江苏·一模）关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述正确的是（    ） A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液 B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化 C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察 2.（2025·江苏盐城·二模）下列有关“DNA的提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中 B．将丝状物溶于体积分数95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定 C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量 D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致 3.下列生物技术操作能达成预期目标的是（    ） A．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 B．发酵工程中通过观察发酵液是否有气泡产生判断醋酸发酵是否终止 C．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 D．胚胎工程中利用胚胎分割技术可以大大提高移植胚胎的成活率 4.下图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是（    ） A．②链从 L 到 R 的方向为 3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环需消耗 8 个引物③ D．物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得该序列的双链产物 二、多选题 5.等位基因特异性PCR（AS-PCR）可用于对已知突变基因进行检测。TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，引物3′端的碱基若与核模板形成错配，子链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸。依据待检样本分别设计4条引物，突变位置设计在引物2和引物3的3′端最后一个位置，如图所示。相关叙述错误的是（    ） A．基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带 B．基因A及a经过AS-PCR、电泳鉴定，条带数和长度均相同 C．PCR反应体系中会出现引物2和引物3扩增得到的短片段 D．可通过增加引物3′端碱基错配率以避免出现假阳性的结果 6.（2024·江苏南京·一模）研究发现XM基因表达的蛋白发生变化会影响种子对脱落酸的敏感性。XM基因上不同位置的突变及其影响如图。下列分析错误的有（    ） A．脱落酸通过直接参与细胞代谢而影响种子萌发 B．位点1可能位于基因编码区的启动子序列 C．位点2和位点3都可能发生了碱基对的替换 D．XM基因表达产物增加会加强种子对脱落酸的敏感性 三、非选择题 7．（2025·江苏盐城·二模）I．某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白（HBsAg）基因的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，再经酶切后导入酵母菌，经同源重组整合到其染色体DNA上。请回答下列问题： （1）科研人员构建HBsAg基因表达载体时，应选用 酶对质粒进行酶切处理，并使用E．coliDNA连接酶将扩增后的HBsAg基因正确插入图1所示质粒。启动子的作用是 。 （2）已知HBsAg基因的a链的部分序列为5'-CGCTACTCATTGCTGCG……CGGATGAGCGCGTAGAT-3’。利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物M与 （填“a链”或“b链”）的部分序列相同。某同学设计了如下的4种引物，引物M、N对应的序列分别为 、 。 A．5'-GGATCCATCTACGCGCTCATCCG-3' B．5'-CCCGGGCGCTACTCATTGCTGCG-3' C．5'-CGCAGCAATGAGTAGCGGGGCCC-3' D．5'-CGGATGAGCGCGTAGATGGATCC-3' （3）将重组载体导入大肠杆菌时，应在 的培养基上进行筛选。欲从大肠杆菌中提取DNA，需向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液后进行离心，取 （选填“上清液”或“沉淀物”）即获得大肠杆菌的DNA。将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。 （4）转化的酵母菌在培养基上培养时，需向其中加入甲醇，目的是 。 Ⅱ．运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图4。 （5）过程②运用的具体方法为 ；④过程前需取 （填部位）的细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加 。 一、多选题 1.（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 二、非选择题 2.（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： （1）川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① ，加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 （5）依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。 a.建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b.保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c.需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d.主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 3.（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－（GTTCCTGGTGTTGGC）50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 （2）步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。 （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 4.（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 （2）有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。 （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 目录 第一部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第二部分 核心要点提升 要点精析、能力提升 知识串联·核心必记 要点01核心工具与载体（基础必考点） 要点02核心操作程序（核心得分点） 要点03分子检测与应用（能力提升点） 专题拓展·能力提升 热点情境 基因编辑技术的应用与安全伦理思辨 第三部分 题型精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01基因工程核心工具与操作程序 题型02基因工程的应用与蛋白质工程 题型03基因工程相关实验技术与探究 题型04转基因生物的安全性与伦理问题 B组·增分能力练 第四部分 真题演练进阶 对标高考，感悟考法 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 核心工具与载体 （2025江苏卷）限制酶切割位点、基因突变分析 （2024江苏卷）融合蛋白载体元件、标记基因 （2023江苏卷）DNA 连接酶作用位点与类型区分 1.结合 CRISPR 等新技术，考查工具酶特异性与载体改造 2.新增基因治疗伦理、转基因生物安全相关情境，关联检测技术的实际应用价值 3. 强化实验设计与结果预测 ，要求规范描述检测流程与结果判定标准 核心操作程序 （2025江苏卷）农杆菌转化法、PCR 引物设计 （2024江苏卷）表达载体构建顺序、感受态制备 （2023江苏卷）cDNA 文库法、微生物导入 分子检测与应用 （2025江苏卷）DNA 分子杂交、抗原 - 抗体杂交 （2024江苏卷）分子杂交、乳腺生物反应器 （2023江苏卷）抗虫接种、分子检测结果 新风向演练 1.【新情境·融合蛋白】（2024·江苏连云港·一模）基因工程中，为方便纯化蛋白质，构建表达载体时可将目的基因序列与标签基因序列连接，表达含有标签的融合蛋白。下图为某质粒编码链（转录时的非模板链）的部分序列。下列相关叙述错误的是（　　） A．转录后的mRNA序列与图中DNA序列一致，仅T替换为U B．若目的蛋白中只保留组氨酸标签，选择酶切位点时优先考虑Nde I和Xho I（或Ava I） C．若目的蛋白中保留了组氨酸标签，翻译时标签下游的基因序列不编码氨基酸 D．以组氨酸标签的基因序列为模板设计下游引物，扩增导入成功的目的基因时，获得的序列可能比预期的序列短 【答案】D 【解析】A、质粒的编码链不含内含子，与转录后的mRNA链序列一致，仅T换成U，A正确； B、若目的蛋白中只保留组氨酸标签，选择酶切位点时优先考虑Nde I和Xho I（或Ava I），以去除T7标签的基因序列，同时保留Nde I识别序列中对应的起始密码，B正确； C、标签下游TGA对应的密码子为UGA，为终止密码，不编码氨基酸，C正确； D、扩增导入成功的目的基因时，以组氨酸标签的基因序列为模板设计下游引物，获得的序列为目的基因序列+标签基因序列，比预期的序列长，D错误。 故选D。 2.【新情境·膀胱生物反应器】（2024·江苏南京·一模）研究人员制备了膀胱生物反应器，用其获得人体特殊功能蛋白S，基本过程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．步骤①需要在S基因编码区上游添加乳腺蛋白基因启动子 B．步骤②需要在高Ca2+-高pH条件下将S基因表达载体导入受精卵 C．步骤④可选择发育良好的囊胚，且代孕母体一般需要同期发情处理 D．与乳腺反应器不同的是膀胱生物反应器会受到转基因动物的性别和年龄的限制 【答案】C 【解析】A、步骤①需要在S基因编码区上游导入膀胱上皮细胞蛋白基因启动子，A错误； B、步骤②是将重组表达载体导入受体细胞，受精卵的全能性最大，利用受精卵作为重组表达载体的宿主细胞常采用显微注射的方法将载体导入，B错误； C、步骤④的代孕母体需进行同期发情处理，这样可以为移入的胚胎提供相同的生理环境，C正确； D、乳腺生物反应器要求性别是雌性、年龄适宜，膀胱生物反应器没有这些要求，D错误。 故选C。 3.【新情境·AI 技术】（2025·江苏淮安·二模）AI 技术通过大数据分析、机器学习、深度学习等方法，为生物医药研究、药物开发、临床诊断和治疗等带来革命性的变化。下列关于 AI 技术在生物医药领域的应用，下列叙述错误的是（　　） A．AI 技术对大量的蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于蛋白质工程技术 B．AI 技术通过智能穿戴设备和移动应用程序可实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和治疗建议 C．AI 技术对大量的基因组数据进行处理和分析，可以识别疾病相关的基因突变，为精准医疗 提供支持 D．AI 技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，且基因序列中不包含启动子和终止子 【答案】A 【解析】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用AI技术设计新药物，没有对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，不属于蛋白质工程技术，A错误； B、利用AI技术，通过智能穿戴设备和移动应用程序，能够实时监测患者的生理参数，预测健康风险，并提供相应的诊断和治疗建议，AI技术为临床诊断和治疗等方面带来了革命性的变化，B正确； C、AI技术在基因组数据处理和分析中的应用，通过识别疾病相关的基因突变，为精准医疗的实现提供了强大的技术支持，C正确； D、密码子具有简并性，故AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列推导出的对应基因序列不唯一，启动子和终止子为非编码区，由氨基酸序列推理的基因序列中不包含启动子和终止子，D正确。 故选A。 4.【新考法·科学实验】（2025·江苏南京·二模）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（　　） A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，取沉淀物再溶解 B．在DNA鉴定和PCR扩增过程中，DNA双螺旋结构都会改变 C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D．a个DNA模板分子完成第20轮循环需要a×（220-2）个引物 【答案】B 【解析】A、将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA 主要存在于上清液中，应取上清液进行后续操作，而不是沉淀物，A 错误； B、在 DNA 鉴定实验中，在沸水浴条件下，DNA 与二苯胺反应呈现蓝色，此过程中 DNA 双螺旋结构被破坏；在 PCR 扩增过程中，高温变性使 DNA 双螺旋结构解开，B 正确； C、核酸染料是在制备凝胶时加入到凝胶中的，而不是在凝胶载样缓冲液中加入，C 错误； D、PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则。一个双链DNA分子经过n次循环后得到2ⁿ个DNA分子，需要的引物数量为（2ⁿ⁺¹ - 2）×a个（因为最初的2个DNA分子各有2条模板链，不需要引物）。n-1次循环共需引物（2ⁿ - 2）×a，第n次循环共需引物a2n个，D错误。 故选B。 5.【新考法·DNA聚合酶】（2024·江苏南通·二模）在Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列相关说法正确的是（　　） A．细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2+ B．PCR技术中的DNA聚合酶在90℃条件下不会失活 C．DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3'端延伸子链 D．真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 【答案】B 【解析】A、细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用也需要Mg2+，A错误； B、DNA聚合酶在90℃条件下不会失活，B正确； C、DNA聚合酶需不与启动子结合，C错误； D、真核细胞内的DNA聚合酶也可以在细胞质发挥作用，D错误。 故选B。 知识串联·核心必记 要点01核心工具与载体（基础必考点） 类别 具体类型 作用 限制酶 如EcoRⅠ、BamHⅠ 1.识别双链DNA分子的特定核苷酸序列 2.使每条链中特定部位的磷酸二酯键断裂 3.产生黏性末端或平末端 DNA连接酶 1.E·coliDNA连接酶 2.T₄ DNA连接酶 1.连接两个DNA片段的磷酸二酯键 2.E·coliDNA 连接酶：只能连接黏性末端 3.T₄DNA连接酶：可连接黏性末端和平末端 载体 1.质粒（最常用） 2.λ噬菌体衍生物 3. 动植物病毒 必备条件： 1.有一个至多个限制酶切割位点 2.能在受体细胞中自我复制或整合到染色体 DNA 上同步复制 3.有标记基因（如抗生素抗性基因），便于筛选 4.对受体细胞无害 【易错易混】 1. 限制酶切割的是磷酸二酯键，而非氢键 2. 不同限制酶可能产生相同的黏性末端（同尾酶） 3. DNA 聚合酶需模板链，连接单个脱氧核苷酸；DNA 连接酶连接 DNA 片段，无需模板两者都不催化氢键形成 4. 质粒≠载体：载体包含质粒，质粒是常用载体 5. 天然质粒需人工改造（如添加标记基因、多克隆位点）才能作为载体 【典例1】马铃薯在生长期易受多种病毒侵染而严重减产。科研人员通过农杆菌介导法，将4种病毒CP融合基因导入马铃薯，获得多抗转基因马铃薯，有效解决了多种病毒的侵染问题。其转化中所涉及的CP融合基因、Ti质粒部分结构如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） 注∶ClaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、SacⅠ为相应限制酶的识别位点，Kan片段为卡那霉素抗性基因片段 A．具体操作过程中CP融合基因需先经PCR扩增，再进行凝胶电泳加以分离和鉴定 B．为了使CP融合基因能在马铃薯叶细胞中表达，可从马铃薯任何部位细胞中获取启动子1 C．应选择BamHⅠ和SacⅠ同时处理CP融合基因所在的DNA分子和Ti质粒 D．若经限制酶处理的CP融合基因与Ti质粒反向连接，会导致CP融合基因不能正常表达 【答案】B 【解析】A、将4种病毒CP融合基因导入马铃薯前，需要对CP融合基因进行扩增，即进行PCR扩增，再进行凝胶电泳加以分离和鉴定，A正确； B、为了使CP融合基因能在马铃薯叶细胞中表达，启动子1应为来源于叶细胞中特异性表达的启动子，B错误； C、在构建重组质粒时为了避免目的基因自身环化等，通常采用两种限制酶，根据题图可知，应选择BamHⅠ和SacⅠ同时处理CP融合基因所在的DNA分子和Ti质粒，C正确； D、经限制酶处理的CP融合基因虽然带有相应的启动子1，但要利用T-DNA的终止子，若与Ti质粒反向连接，可能因缺失相应的终止子或相关的终止子位置改变，导致CP融合基因不能表达或不能正确表达出相应的mRNA，D正确。 故选B。 要点02核心操作程序（核心得分点） 操作步骤 核心内容 目的基因的获取 方法1：从基因文库中获取 基因组文库：包含一种生物的全部基因 cDNA文库：包含一种生物的部分基因（由mRNA反转录而来） 方法2：PCR技术扩增 原理：DNA半保留复制 ；条件：模板DNA、引物、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、dNTP；过程：变性→退火→延伸 方法3：人工合成（基因较小、核苷酸序列已知） 基因表达载体的构建（核心步骤） 组成：目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因 + 复制原点 启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 终止子：终止转录的部位 标记基因：筛选含目的基因的受体细胞 构建工具：限制酶、DNA连接酶 将目的基因导入受体细胞 植物细胞：农杆菌转化法（最常用，适用于双子叶和裸子植物）、基因枪法、花粉管通道法 动物细胞：显微注射技术（最常用，将基因表达载体注射到受精卵中） 微生物细胞：感受态细胞法（用Ca²⁺处理，使细胞处于能吸收周围DNA的状态） 目的基因的检测与鉴定 分子水平检测（3 步） ① DNA 分子杂交：检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 ② 核酸分子杂交：检测目的基因是否转录出mRNA ③ 抗原 - 抗体杂交：检测目的基因是否翻译出蛋白质个体水平鉴定：抗虫 / 抗病接种实验、性状观察等 【典例2】下列关于PCR技术的叙述，错误的是（　　） A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差 B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异 C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量 D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个 【答案】C 【解析】A、引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响退火温度，循环次数过多会增加非特异性产物，均影响特异性，A正确； B、不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确； C、PCR延伸时由dNTP的高能磷酸键供能，无需额外ATP，C错误； D、第n次循环需合成a·2ⁿ⁻¹个新DNA分子，每个需2个引物，故需a·2ⁿ个引物，D正确。 故选C。 要点03分子检测与应用（能力提升点） 易错点解析： 1.DNA水平检测（整合与插入） 易错点：同尾酶连接后仍用原限制酶验证；单酶切无法区分正反向连接。 对策：双酶切避免同尾酶，用特异引物PCR鉴定方向，产物大小差异判断连接正确性。 2.PCR鉴定易错 易错点：引物仅加一条或同方向；模板浓度过高 / 过低致无产物或非特异带。 对策：必须加一对反向互补引物 3.RT - PCR易错 易错点：未去除基因组DNA致假阳性；引物跨内含子设计失败。 对策：设计跨外显子引物，产物无内含子片段才为cDNA扩增产物。 4.标记基因与目的基因混淆 易错点：抗生素抗性阳性即认为目的基因表达。 对策：抗性仅为筛选，需加蛋白质杂交验证。 【典例3】琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR产物的鉴定，相关叙述正确的是（    ） A．DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快 B．用微量移液器将PCR产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内 C．电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V D．PCR非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊 【答案】D 【解析】A、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在凝胶中的迁移速率主要取决于DNA分子的大小，而非所带电荷多少。因为DNA分子本身带有大量负电荷，在电场中都会向正极移动，且在凝胶介质中，分子大小对迁移的阻碍作用更为关键，A正确； B、用微量移液器将PCR产物缓慢注入凝胶的加样孔内，核酸染料是在制胶时加入到琼脂糖凝胶中，而不是与PCR产物混合后注入加样孔，B错误； C、电场强度增大，DNA在凝胶中的迁移速率确实会加快，但电泳时的电压一般为5 - 15V，而不是1 - 5V，C错误； D、CR非特异性扩增产物电泳时，由于存在多种不同的扩增片段，会导致电泳条带混乱模糊；样品上样量过多时，会使条带变宽、分辨率降低，也会导致电泳条带模糊，D正确。 故选D。 【典例4】研究人员利用农杆菌侵染水稻叶片，经组培、筛选最终获得了一株水稻突变体。利用不同的限制酶处理突变体的总 DNA、电泳；并与野生型的处理结果对比，得到图所示放射性检测结果。（注：T-DNA 上没有所用限制酶的酶切位点）对该实验的分析错误的是（ ） A．检测结果时使用了放射性标记的 T-DNA 片段做探针 B．该突变体产生的根本原因是由于 T-DNA 插入到水稻核 DNA 中 C．不同酶切显示的杂交带位置不同，说明 T-DNA 有不同的插入位置 D．若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确 【答案】C 【解析】A、需用放射性标记的 T-DNA 片段作为探针，若水稻 DNA 中存在 T-DNA，探针会与之结合，电泳后可通过放射性检测到杂交带，A正确； B、实验中通过农杆菌介导法将 T-DNA 导入水稻，T-DNA 插入水稻核 DNA 后，会导致水稻基因组中特定基因被破坏或表达异常，进而产生突变表型，从分子水平看，基因组序列的改变（T-DNA 插入）是突变体产生的根本原因，B正确； C、：杂交带的位置由酶切后含 T-DNA 的 DNA 片段长度决定。不同限制酶的识别位点不同，对水稻核 DNA 的切割位点存在差异，即使 T-DNA 插入同一位置，不同限制酶切割后，含 T-DNA 的片段长度也会不同，电泳时迁移速率（带位置）就会不同。因此，杂交带位置不同的原因是限制酶切割位点不同导致片段长度不同，而非T-DNA 插入位置不同，C错误； D、野生型水稻未导入 T-DNA，其基因组中不含 T-DNA 序列，理论上不会与放射性标记的 T-DNA 探针结合，电泳后不应出现杂交带。若野生型出现杂交带，最可能的原因是实验样本被含 T-DNA 的材料（如农杆菌、已成功转化的水稻样本）污染，导致检测结果出现假阳性，无法准确判断突变体是否真的含有插入的 T-DNA，D正确。 故选C。 专题拓展·能力提升 热点情境拓展 基因编辑技术的应用与安全伦理思辨 情境解读 1.医学应用情景：聚焦遗传病治疗与癌症攻坚 此类情景为高频考点，围绕CRISPR-Cas9等技术在人类疾病治疗展开，核心是技术原理与应用效果分析。典型情景包括单基因遗传病的基因编辑治疗、CAR-T疗法基因优化、异种器官移植基因编辑突破。 2.农业应用情景：紧扣作物改良与精准育种 结合农业发展需求，该方向为重要情景类型，近三年试题情景包括CRISPR技术编辑小麦、水稻基因培育抗逆品种，培育高油酸、耐盐碱大豆等优质作物，均源于真实科研，体现“科技兴农”导向。 3.伦理争议情景：围绕技术边界与社会影响 伦理争议是考察“社会责任”素养的核心载体，试题情景延伸至生殖细胞编辑代际风险、基因增强与社会公平、基因歧视等议题，基因编辑动物伦理争议等。 命题分析 命题立足教材核心知识，避免前沿技术堆砌，考察重点集中于三大核心知识点： 基因工程工具：CRISPR-Cas9系统作用机制，与传统工具的对比优势； 操作流程与检测：目的基因定点编辑，分子（PCR、测序等）与个体水平检测方法； 安全性问题：脱靶效应成因与应对，基因编辑对基因组稳定性的影响。 【典例5】下列关于基因编辑技术（CRISPR/Cas9）的应用与安全伦理的叙述，正确的是（    ） A. 体细胞基因编辑可改变生殖细胞的遗传物质，进而遗传给子代 B. 生殖细胞基因编辑因可能污染人类基因库，被全球各国严格禁止用于非治疗目的 C. 脱靶效应是基因编辑技术的特有风险，可通过精准设计 sgRNA 完全消除 D. 基因编辑技术用于增强人类身高、智力等性状的研究，符合伦理规范与社会公平原则 【答案】B 【解析】A、体细胞基因编辑仅改变个体体细胞的遗传物质，不会影响生殖细胞，性状无法遗传给子代；生殖细胞基因编辑才会改变可遗传的遗传物质，A错误； B、生殖细胞基因编辑的效应可遗传给后代，可能改变人类基因库的组成，引发不可预测的群体遗传风险，因此全球各国均严格禁止其用于非治疗目的，B正确； C、脱靶效应是 CRISPR/Cas9 技术的主要安全风险之一，精准设计 sgRNA 可降低脱靶概率，但无法完全消除，C错误； D、利用基因编辑技术增强人类身高、智力等性状，会打破自然生殖的公平性，引发社会伦理问题，被明确禁止，D错误。 故选B。 【典例6】下列有关生物技术的安全性和伦理性问题的叙述，正确的是（    ） A．人类基因组编写计划是测定人类的基因组序列的一项伟大工程 B．我国对农业转基因生物实行标识制度，需在标签上警示性注明可能危害 C．中国政府不反对治疗性克隆，但可以有限制地进行生殖性克隆研究 D．生物武器包括病菌类、病毒类和生化毒剂类等，其特点为致病能力强 【答案】D 【解析】A、人类基因组编写计划（Human Genome Project，HGP）是对人类基因组进行测序和分析，以找到与各种生理功能和疾病相关的基因，而不是仅仅测定基因组序列，A错误； B、我国对农业转基因生物实行了标识制度，但没有注明可能的危害，B错误； C、中国政府明确禁止生殖性克隆研究，而治疗性克隆研究也是受到严格限制的，C错误； D、生物武器包括病菌类、病毒类和生化毒剂类等，其特点为致病能力强，破坏力大，对人类社会构成严重威胁，D正确。 故选D。 01基因工程核心工具与操作程序 1.乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如下图所示。下列分析不合理的是（　　） A．转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性 B．可以利用PCR技术筛选含有L-PG 基因的受体细胞 C．基因表达载体质粒除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等 D．标记基因Ampr即可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 【答案】D 【解析】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存或活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确； B、PCR技术可以扩增特定基因片段，因此可以用来检测受体细胞中是否成功导入了L-PG基因，B正确； C、基因表达载体通常需要包含启动子、终止子等调控元件，以确保目的基因能够正确表达，C正确； D、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，对重组质粒进行初步筛选，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，D错误。 故选D。 2.下列关于高中生物学“载体”的叙述，正确的是（　　） A．载体蛋白转运物质时自身构象不会发生改变 B．氢载体NADH在叶绿体基质中可用于碳固定过程 C．作为基因工程载体的质粒仅存在于原核生物中 D．腺苷三磷酸在生物体内可作为能量和磷酸的载体 【答案】D 【解析】A、载体蛋白转运物质时需与物质结合，并发生自身构象的改变以完成运输，A错误； B、叶绿体基质中暗反应的碳固定过程需要NADPH提供氢和能量，而NADH参与呼吸作用，B错误； C、质粒不仅存在于原核生物中，某些真核生物（如酵母菌）也含有质粒，C错误； D、ATP水解时释放能量并转移磷酸基团，可作为能量和磷酸的载体，D正确。 故选D。 3.真核细胞转座子有逆转录转座子（如图①）和DNA转座子（如图②）之分，可在染色体内部和染色体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA分子的特定位点中，具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键 B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异 C．DNA转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变 D．逆转录转座子通常存在于不易于转录的区域 【答案】D 【解析】A、转座酶将转座子两端特定序列进行切割，破坏的是磷酸二酯键，限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并破坏磷酸二酯键断开，A正确； B、转座子在DNA分子内部转移，可造成基因突变，在真核细胞染色体内部转移，可造成基因重组，在染色体间转移造成染色体变异，B正确； C、由图可知，逆转录转座子不仅改变其在染色体上的位置，总数还会增多，DNA转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变，C正确； D、编码区分为能编码蛋白质的外显子和不能编码蛋白质的内含子，逆转录转座子通常存在于外显子等易于转录的区域，D错误。 故选D。 4.（多选）农杆菌Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法正确的有（    ） A．进行PCR扩增的依据是DNA热变性的原理 B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶、引物、四种脱氧核苷三磷酸（dNTP） C．利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定TDNA的插入位置 【答案】CD 【解析】A、PCR扩增依据的是DNA半保留复制的原理，A错误； B、进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶），但不需要解旋酶，B错误； C、DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C正确； D、基因有特定的碱基序列，通过与受体细胞的基因组序列比对，即可确定T-DNA的插入位置，D正确。 故选CD。 5.苏云金杆菌是一种细菌，它能产生使棉铃虫死亡的杀虫蛋白，这种杀虫蛋白对人和牲畜无任何毒害作用。科学家将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞，获得了能产生杀虫蛋白的抗虫棉，提高了棉花的产量。下列相关叙述不正确的是（    ） A．苏云金杆菌有成形的细胞核 B．抗虫棉的培育使用了转基因技术 C．苏云金杆菌是单细胞生物 D．该方法能减少农药对环境的污染 【答案】A 【解析】A、苏云金杆菌是原核生物，没有成形的细胞核，A错误； B、抗虫棉的培育是将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞，使用了转基因技术，B正确； C、苏云金杆菌是单细胞生物，一个细胞就是一个个体，C正确； D、抗虫棉的培育和种植，可以减少农药的使用，减少农药对环境的污染，D正确。 故选A。 02基因工程的应用与蛋白质工程 1.（2024·江苏南京·二模）（多选）嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是癌症治疗的研究热点。其原理是将CAR基因导入T细胞获得CAR-T，进而表达出特异性更强的癌细胞抗原受体蛋白（CAR）。相比自然状态下的细胞毒性T细胞，CAR-T对肿瘤细胞的杀伤性、靶向性更强。治疗流程如下图。下列叙述错误的有（    ） A．步骤②属于生物工程中的细胞工程 B．CAR-T细胞的CAR能特异性识别并杀伤癌细胞 C．步骤④可选用动物病毒或噬菌体作为载体 D．步骤⑤需定期更换培养液以补充营养物质并清除代谢废物 【答案】ABC 【难度】0.65 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求，它是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 【详解】A、分析题意，步骤②是根据靶抗原设计CAR结构，是从蛋白质的预期结构开始，属于蛋白质工程，A错误； B、CAR是CAR-T细胞表面的嵌合抗原受体，受体只有识别作用，没有杀伤癌细胞的功能，B错误； C、基因工程中常见的载体有质粒、动植物病毒、噬菌体等，噬菌体载体是依据噬菌体侵染大肠杆菌的原理，将目的基因片段整合到噬菌体基因组中，因此将CAR基因导入T细胞不能用噬菌体作为载体，C错误； D、动物细胞培养时，为补充营养物质并清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，需定期更换培养液，D正确。 故选ABC。 2.（多选）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是（    ） A．为连入GUS 基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 B．表达载体中GUS 基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板 C．可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞，在培养基中添加壮观霉素进行筛选 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用 【答案】ABC 【解析】A、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，A错误； B、表达载体中GUS 基因和LUC基因转录时双向启动子的转录方向不同，使用T-DNA的模板链也不同，B错误； C、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，但壮观霉素抗性基因位于T-DNA序列之外，可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C错误； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选ABC。 3.“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（　　） A．诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出异种融合细胞 B．用灭活的仙台病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交瘤细胞 C．培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行分子杂交显示出杂交带即可筛选耐盐植株 D．制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行SRY基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 【答案】D 【解析】A、诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体有可能是白菜原生质体之间相互融合，或者就是白菜叶肉细胞原生质体，没有发生融合，A错误； B、用灭活的仙台病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，促进二者融合，而不是筛选杂交瘤细胞，B错误； C、培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行分子杂交显示出杂交带，表明植株含有目的基因，但不一定表达，所以不一定能筛选耐盐植株，C错误； D、SRY基因是哺乳动物Y染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段，所以制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行SRY基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 ，D正确。 故选D。 4.（2025·江苏常州·三模）（多选）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（　　） A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 【答案】ABC 【解析】A、花粉管通道法是一种常用的植物基因转移方法，适用于多种植物，包括棉花，A正确； B、花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，故花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，B正确； C、授粉过程需要在雌蕊成熟后，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确； D、要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建重组载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，D错误。 故选ABC。 03基因工程相关实验技术与探究 1.（2025·江苏南通·一模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述正确的是（　　） A．取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精可析出DNA B．提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝 C．电泳过程中DNA分子越大，所带电荷数越多，迁移速率越快 D．在琼脂糖凝固前加入指示剂，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】A 【解析】A、洋葱研磨液的上清液中含有溶解的DNA，加入等体积95%冷酒精可析出DNA，原因是①DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精，冷酒精能有效分离DNA与杂质；②低温（冷酒精）可降低DNA的溶解度，进一步促进DNA析出，形成白色丝状物，A正确； B、丝状物应先溶于2mol的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B错误； C、电泳中DNA迁移速率与分子大小成反比，大分子阻力大迁移慢，电荷数虽多但质量影响更大，C错误； D、指示剂（如溴酚蓝）应加入样品中，而非凝固前的凝胶中，否则无法指示电泳进程，D错误。 故选A。 2.关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后可以用离心法收集 B．PCR缓冲液中需保持较高浓度的Mg2+，以确保DNA聚合酶最佳活性 C．将白色丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化 D．DNA电泳指示剂需要加入到稍冷却的琼脂糖溶液中 【答案】A 【解析】A、DNA 不溶于酒精溶液，粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物（DNA）后，用离心法可以将 DNA 收集起来，A 正确； B、PCR 缓冲液中需要保持一定浓度的Mg2+，Mg2+可以激活 DNA 聚合酶，但不是较高浓度，过高浓度可能会对反应产生不利影响，B 错误； C、将白色丝状物（DNA）溶解在2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，沸水浴待冷却后观察颜色变化，不能直接将白色丝状物加入二苯胺试剂，C 错误； D、DNA 电泳指示剂是在加样时与 DNA 样品混合加入到凝胶加样孔中的，而不是加入到稍冷却的琼脂糖溶液中，D 错误。 故选A。 3.（2025·江苏苏州·三模）蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是（    ） A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化 C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中 D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色 【答案】D 【解析】A、细胞研磨能破坏细胞结构，使 DNA 释放，充分研磨可让更多 DNA 释放，A正确； B、DNA 溶于水相，转移水相并重复酚、氯仿抽提步骤，可进一步去除杂质纯化 DNA，B正确 ； C、DNA 不溶于乙醇，95% 冷乙醇能使 DNA 析出，离心后 DNA 在沉淀物，C正确 ； D、二苯胺检测 DNA 需在沸水浴条件下才会呈现蓝色，仅复溶后加入不处理不会显色，D错误。 故选D。 4.为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA 的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末 B．利用NaOH溶液提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤 C．NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈震荡，以免造成DNA 损伤断裂 D．缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有维持DNA 酶活性、促进微生物生长等功能 【答案】D 【解析】A、将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末，有利于提取DNA，A正确； B、NaOH呈碱性，碱溶液可能可以破坏细胞膜和细胞壁进而可以快速提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤，B正确； C、NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈震荡，否则会造成DNA 损伤断裂，C正确； D、缓冲液除了中和碱性物质之外，还可使DNA 酶失活、抑制微生物生长等功能，D错误。 故选D。 04转基因生物的安全性与伦理问题 1.“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列叙述正确的是（　　） A．用选择培养基筛选微生物，对照组不接种微生物，实验组接种微生物 B．诱导植物原生质体融合时，观察是否再生细胞壁可筛选异种融合细胞 C．制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞 D．在试管婴儿技术中，需取滋养层细胞进行性别鉴定来筛选所需的胚胎 【答案】C 【解析】A、选择培养基的作用是目的菌能够正常在其上生存，其他微生物不能正常生存，为了确定选择培养基是否具有选择作用，应设计一个在完全培养基上接种的培养皿作对照，即对照组也接种微生物，只是实验组和对照组培养基的成分不同，A错误； B、诱导植物原生质体融合时，观察是否再生细胞壁不能用于筛选异种融合细胞，因为同种融合细胞也会再生出细胞壁，B错误； C、单克隆抗体制备过程中，第一次筛选要用特定的选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选要用抗体阳性检测方法从分子水平筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞，即从分子水平筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞，C正确； D、在试管婴儿技术中，不需要进行胚胎的性别鉴定，设计试管婴儿有时需要进行性别鉴定，D错误。 故选C。 2.治疗性克隆的一般流程是把患者（供体）体细胞移植到去核卵母细胞中形成重构胚，再把重构胚体外培养到囊胚，然后从中分离出ES细胞，并诱导ES细胞定向分化为所需的特定细胞类型用于移植。下列说法错误的是（    ） A．供体细胞注入去核卵母细胞后还需诱导融合 B．ES细胞在核遗传上和供体细胞相同 C．治疗性克隆是治疗遗传病的根本措施 D．治疗性克隆可解决器官移植时的免疫排斥问题 【答案】C 【解析】A、供体细胞注入去核卵母细胞后，还需通过电融合法等诱导融合，使供体核进入卵母细胞，形成重构胚，A正确； B、治疗性克隆的ES细胞来源于供体细胞，在核遗传上和供体细胞相同，B正确； C、治疗遗传病的根本措施是基因治疗，C错误； D、治疗性克隆的目的是培养出能够用于医学治疗的供体器官，以解决目前临床上存在的供体器官不足和移植后免疫排斥的问题，D正确。 故选C。 3.生物技术应用广泛，下列有关叙述正确的是（　　） A．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，发育成的个体没有形态学差异 B．动物细胞体外培养均需贴附在某些基质表面才能生长增殖 C．可通过脱分化和再分化过程获得胚状体，提取紫杉醇等次生代谢物 D．种植转基因植物有可能因基因扩散而影响自然界原有植物的遗传多样性 【答案】D 【解析】A、分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，但个体的性状还受到环境的影响，因此发育成的个体有形态学差异，A错误； B、体外培养的动物细胞一类能悬浮在培养液中生长增殖，另一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，B错误； C、红豆杉茎尖分生组织通过脱分化过程形成愈伤组织，一方面愈伤组织通过再分化形成胚状体，进而培养成红豆杉植株；另一方面，愈伤组织培养增殖产生更多的愈伤组织细胞，从愈伤组织细胞中提取紫杉醇，C错误； D、转基因植物可能与野生植物发生杂交而出现基因交流，影响野生植物的遗传多样性，D正确。 故选D。 一、单选题 1.（2025·江苏·一模）关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述正确的是（    ） A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液 B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化 C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察 【答案】D 【解析】A、配制琼脂糖溶液时，应该用缓冲液而不是无菌水来配制，这样才能维持合适的离子强度和pH等条件，保证电泳效果，A错误； B、应该是先将琼脂糖加入缓冲液中，在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化，冷却至50 - 60℃左右时再加入适量的核酸染料，而不是先加染料再加热熔化琼脂糖，B错误； C、PCR产物和上样缓冲液混合，而不是和电泳缓冲液混合，然后用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，C错误； D、待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察，这样可以清晰地观察到DNA条带的位置和情况，D正确。 故选D。 2.（2025·江苏盐城·二模）下列有关“DNA的提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中 B．将丝状物溶于体积分数95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定 C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量 D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致 【答案】B 【解析】A、洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4∘C冰箱中静置，DNA存在于上清液中。因为在该实验中，破碎细胞释放出 DNA 等物质，经过离心或静置分层后DNA会溶解在上清液中，A正确； B、应该将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定，而不是溶于体积分数95%的酒精，B错误； C、PCR扩增反应体系中dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）既可以为扩增提供原料，在形成磷酸二酯键时，dNTP 脱去两个磷酸基团，释放的能量为子链的合成提供能量，C正确； D、PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强，导致引物与模板结合位点不唯一，扩增出多种不同的DNA片段，从而在电泳结果上出现多条条带，D正确。 故选B。 3.下列生物技术操作能达成预期目标的是（    ） A．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 B．发酵工程中通过观察发酵液是否有气泡产生判断醋酸发酵是否终止 C．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 D．胚胎工程中利用胚胎分割技术可以大大提高移植胚胎的成活率 【答案】A 【解析】A、将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，可以识别特定的癌细胞，从而进行癌症治疗，A正确； B、以乙醇为底物进行果醋发酵时，不会产生气体，因此不能通过观察发酵液是否有气泡产生判断醋酸发酵是否终止，B错误； C、将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，可以培育出产低乳糖牛乳的奶牛，如果导入奶牛乳腺细胞则不能达成预期目标，C错误； D、胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小，因此胚胎分割技术不能提高移植胚胎的成活率，D错误。 故选A。 4.下图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是（    ） A．②链从 L 到 R 的方向为 3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环需消耗 8 个引物③ D．物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得该序列的双链产物 【答案】D 【解析】A、根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误； B、PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度使子链沿着引物的3’端延伸，B错误； C、以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环产生的DNA分子数目为23=8，则需消耗 引物③的数目为（8×2-2）÷2=7，C错误； D、物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。 故选D。 二、多选题 5.等位基因特异性PCR（AS-PCR）可用于对已知突变基因进行检测。TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，引物3′端的碱基若与核模板形成错配，子链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸。依据待检样本分别设计4条引物，突变位置设计在引物2和引物3的3′端最后一个位置，如图所示。相关叙述错误的是（    ） A．基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带 B．基因A及a经过AS-PCR、电泳鉴定，条带数和长度均相同 C．PCR反应体系中会出现引物2和引物3扩增得到的短片段 D．可通过增加引物3′端碱基错配率以避免出现假阳性的结果 【答案】BC 【解析】A、基因型为Aa的样品，含有基因A和基因a，根据图示，以基因A为模板时，用引物1和引物3进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，以基因a为模板时，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，用引物2和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，共4种，其中基因A和基因a用引物1和引物4进行PCR扩增可得到相同的双链等长的条带，所以基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带，A正确； B、基因A及其等位基因a的碱基序列不同，经电泳鉴定得到的条带数相同，但长度不一定相同，如对于基因a，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到的条带，与引物2和引物4进行PCR扩增可得到的条带长度就不相同，而对于基因A和基因a用引物1和引物4进行PCR扩增可得的条带长度是相同的，B错误； C、由于TaqDNA聚合酶缺少3'，5'外切酶活性，对于基因A，引物2的3'端碱基与模板形成错配，链延伸反应受阻，对于基因a，引物3的3'端碱基与模板形成错配，链延伸反应受阻，所以PCR反应体系中不会出现引物2和引物3扩增得到的短片段，C错误； D、因为引物3'端的碱基若与核酸模板形成错配，链延伸反应就会因3'，5'-磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸，所以增加引物3'端碱基错配率，能使非目标基因的扩增受到抑制，从而避免出现假阳性的结果，D正确。 故选BC。 6.（2024·江苏南京·一模）研究发现XM基因表达的蛋白发生变化会影响种子对脱落酸的敏感性。XM基因上不同位置的突变及其影响如图。下列分析错误的有（    ） A．脱落酸通过直接参与细胞代谢而影响种子萌发 B．位点1可能位于基因编码区的启动子序列 C．位点2和位点3都可能发生了碱基对的替换 D．XM基因表达产物增加会加强种子对脱落酸的敏感性 【答案】AB 【解析】A、脱落酸属于植物激素，激素给细胞传达信息，对细胞的生命活动起到调节作用，并不直接参与细胞代谢，A错误； B、由图可知，XM基因位点1突变导致基因不表达，基因的表达包括转录和翻译过程，因此推测位点1可能位于基因上游非编码区的启动子序列，发生突变后导致RNA聚合酶不能与启动子识别并结合，无法转录，从而导致该基因不能表达出相应的蛋白质，B错误； C、由图可知，XM基因位点2突变导致基因表达的蛋白质发生变异，但是蛋白质的中氨基酸的数量不变，因此推测可能发生了碱基对的替换，导致氨基酸种类改变；XM基因位点3突变导致基因表达的蛋白质与正常蛋白质相比，该蛋白质的氨基酸数量减少，推测可能发生了碱基对的替换导致mRNA上的终止密码子提前出现，C正确； D、据图可知，位点4突变是XM蛋白的表达倍增，使得种子对脱落酸的敏感性增强，休眠增加，说明XM基因表达产物增加会加强种子对脱落酸的敏感性，D正确。 故选AB。 三、非选择题 7．（2025·江苏盐城·二模）I．某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白（HBsAg）基因的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，再经酶切后导入酵母菌，经同源重组整合到其染色体DNA上。请回答下列问题： （1）科研人员构建HBsAg基因表达载体时，应选用 酶对质粒进行酶切处理，并使用E．coliDNA连接酶将扩增后的HBsAg基因正确插入图1所示质粒。启动子的作用是 。 （2）已知HBsAg基因的a链的部分序列为5'-CGCTACTCATTGCTGCG……CGGATGAGCGCGTAGAT-3’。利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物M与 （填“a链”或“b链”）的部分序列相同。某同学设计了如下的4种引物，引物M、N对应的序列分别为 、 。 A．5'-GGATCCATCTACGCGCTCATCCG-3' B．5'-CCCGGGCGCTACTCATTGCTGCG-3' C．5'-CGCAGCAATGAGTAGCGGGGCCC-3' D．5'-CGGATGAGCGCGTAGATGGATCC-3' （3）将重组载体导入大肠杆菌时，应在 的培养基上进行筛选。欲从大肠杆菌中提取DNA，需向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液后进行离心，取 （选填“上清液”或“沉淀物”）即获得大肠杆菌的DNA。将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。 （4）转化的酵母菌在培养基上培养时，需向其中加入甲醇，目的是 。 Ⅱ．运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图4。 （5）过程②运用的具体方法为 ；④过程前需取 （填部位）的细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加 。 【答案】（1） XmaⅠ、BclⅠ RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA （2） a链 B A （3） 含有氨苄青霉素、不含组氨酸 沉淀物 大量扩增含目的基因的重组质粒 （4）诱导HBsAg基因表达，为酵母菌提供碳源 （5） 显微注射技术 滋养层 膀胱上皮细胞特异性表达基因的启动子 【解析】（1） 在构建重组DNA分子时，质粒用XmaⅠ酶切，与目的基因用Xma Ⅰ酶切获得的黏性末端一侧相连；质粒用Bcl Ⅰ酶切获得的黏性末端和目的基因用BamII Ⅰ酶切获得的黏性末端相连，以防止目的基因、载体自身环化或目的基因反向连接，因此科研人员利用限制酶XmaⅠ、BclⅠ和E.coliDNA连接酶将HBsAg基因正确插入图1所示质粒。启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 （2）在PCR技术获取HBsAg基因时，引物是与模板链的3'端结合，因此，引物M结合的单链是b链，部分序列与a链相同。在PCR扩增过程中应在5'端添加相应的酶切位点。利用PCR扩增目的基因时，引物需要与模板的3'端（b链的左边）结合，并遵循碱基互补配对原则，同时在引物的5'端添加限制酶酶切位点。根据给出的序列和PCR引物的设计原则，可以判断引物M的序列应为5′−CCCGGGCGCTACTCATTGCTGCG−3′，B正确。 故选B。 而引物N与a链的3’端结合互补配对，引物N的前六个碱基是在引物N的5’端加上了限制酶序列GGATTC，即5′−GGATCCATCTACGCGCTCATCCG−3′，A正确。 故选A。 （3）将重组载体导入大肠杆菌时，应在含有氨苄青霉素、不含组氨酸的培养基上进行筛选。提取DNA时需向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液后进行离心，取沉淀物，获得大肠杆菌的DNA。将重组质粒导入大肠杆菌的目的是让重组质粒在大肠杆菌中大量扩增。 （4）将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇。加入甲醇的作用有两点：一是提供碳源，促进酵母菌的生长和代谢；二是启动甲醇代谢相关的基因表达，从而启动目的基因的表达。 （5）图中过程②是将目的基因（t - PA蛋白改良基因）导入受精卵。 将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术。 ④过程是将早期胚胎移植到代孕母牛体内，在胚胎移植前进行性别鉴定，一般取滋养层细胞进行，因为滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，取其细胞进行鉴定不影响内细胞团将来发育成胎儿的各种组织。 若要在尿液中获得相应蛋白，需要让目的基因在膀胱上皮细胞特异性表达，所以在构建基因表达载体时，需要添加膀胱上皮细胞特异性表达基因的启动子，以驱动目的基因在膀胱上皮细胞中表达。 一、多选题 1.（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【解析】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误； B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确； C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误； D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。 故选BD。 二、非选择题 2.（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： （1）川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① ，加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 （5）依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。 a.建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b.保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c.需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d.主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 【答案】（1） 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等 （2）互利共生 （3） 上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 （4） 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段 (5)ab 【解析】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。 （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。 （5） a.建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确； b.保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确； c.川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误； d.保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。 故选ab。 3.（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－（GTTCCTGGTGTTGGC）50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 （2）步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。 （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 【答案】（1）EcoR I、Hind Ⅲ （2） CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R （3） 启动子 C （4） SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【解析】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 4.（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 （2）有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。 （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 【答案】（1） 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 （2）CD （3）限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 （4）ABC （5）P3、P4 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【解析】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 / 学科网（北京）股份有限公司 $