2026届高三生物一轮复习课件22 微生物的选择培养与计数

1 第1章 发酵工程 第2节 微生物的选择培养与计数 1 1 选择培养基 1.概念: 2.类型: 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 选择培养基 1 选择培养基 选择培养基 根据透明圈直径与菌落直径的比值， 可以判断纤维素分解菌分解纤维素的能力， 比值越大，分解能力越强。 刚果红培养基 刚果红与多糖形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。 纤维素分解菌在含有刚果红和纤维素的培养基上形成透明圈。 1 选择培养基 (2016课标全国Ⅲ) 某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明, 乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题: (1)分离纯化乳酸菌时,首先需要用____________对泡菜滤液进行梯度稀释,进行梯度稀释的理由是_____________________________________________________。  (2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_________________和_______________。分离纯化时应挑选出________________的菌落作为候选菌。  (3)乳酸菌在-20 ℃长期保存时,菌液中常需要加入一定量的__________(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。 甘油 无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落 中和产生的乳酸 具有透明圈 鉴别乳酸菌　 1 选择培养基 尿素的立体结构 思考·讨论 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。 尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。 脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。 + H2O CO(NH2)2 脲酶 + CO2 2NH3 1 选择培养基 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 思考·讨论 1 选择培养基 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4 ·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基二 1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_____________________；该类培养基的主要用途为________________________。 2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。 3.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的主要碳源为 ，主要氮源为 ； 培养基二的碳源为 ，氮源为 。 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数、保存 培养基二 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 练习 2 微生物的选择培养 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 主要过程: A、梯度稀释菌液 B、涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 稀释涂布平板法 2 微生物的选择培养 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 微量 移液器 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 （1）梯度稀释 稀释涂布平板法 2 微生物的选择培养 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 （2）涂布平板 稀释涂布平板法 2 微生物的选择培养 恒温培养箱 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 （3）菌落培养 2 微生物的选择培养 主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法 主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线 接种工具 涂布器 接种环 菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 能否用于计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。 比较稀释涂布平板法和平板划线法 3 微生物的数量测定 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 1.稀释涂布平板法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 ——间接计数法 ——直接计数法 计数原则: 为了保证结果准确，选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 数量测定方法 3 微生物的数量测定 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 结果分析: 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 1.稀释涂布平板法 3 微生物的数量测定 计算公式: 每g样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M 代表稀释倍数 C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 1.稀释涂布平板法 3 微生物的数量测定 1.稀释涂布平板法 (2014课标全国Ⅱ) (1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前,随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间,这样做的目的是 __________________________________________________________;  然后,将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL 稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。 据此可得出每升水样中的活菌数为________________。 检测培养基平板的灭菌效果，避免杂菌污染干扰实验 3.8×107 · 30~300个菌落的平板适于计数； · 至少3次重复计数取平均值 · 每隔24h统计一次，数目稳定时作为结果 3 微生物的数量测定 血细胞计数板： 细菌计数板： 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 优点： 2.显微镜直接计数法 快速、直观 ①不能区分死菌和活菌 ②不适于对运动细菌的计数 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察 缺点： → 偏大 3 微生物的数量测定 2.显微镜直接计数法 (4) 为使酵母数量迅速增加,培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度,将发酵液稀释 1000 倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5 个中格中的细胞数，理论上_______色细胞的个数应不少于_______,才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。  (2018江苏) O2 无 30 （3×109 ÷1000 ÷ 2）个/mL × 10−4 mL × 5个/25 个中格 计数室体积 0.1 mm3 (=0.1 μL) 等体积台盼蓝 练习 (4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量,在同一稀释倍数下得到以下结果: 甲同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133; 乙同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。 有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是 __________________________________________________________________。  (2018课标全国Ⅰ) 乙同学的结果中,1个平板的计数结果与另2个相差悬殊,结果的重复性差 练习 (2021浙江6月) 下列关于原生质体和细胞计数的叙述,错误的是(　　) A.测定植物原生质体的密度时,可用血细胞计数板 B.红墨水不能进入活细胞,可用于检测细胞的存活状态并计数 C.涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落,都可用于细菌计数 D.酵母菌在液体培养基中培养一段时间后,可用比浊计测定其密度 C 稀释涂布平板法 和 平板划线法 都可用于分离微生物， 前者还能用于计数，后者不能用于计数。 练习 (2023山东) 平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　) A.不含氮源的平板不能用于微生物培养 B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒 C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃 D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物 D 灭菌 练习 (2023北京) 自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性,能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。 (1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分,其中蛋白胨主要为细菌提供______________和维生素等。  (2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上,凝固形成薄层。培养一段时间后,薄层变浑浊 (如图),表明_____________________________________________。  碳源、氮源 A菌通过增殖长成菌落均匀分布在培养基表面 练习 (3)为分离出具有溶菌作用的细菌,需要合适的菌落密度,因此应将含菌量较高的湖泊水样_________后,依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后,能溶解A菌的菌落周围会出现_________。采用这种方法,研究者分离、培养并鉴定出P菌。  (4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式,请提出一个假设,该假设能用以下材料和设备加以验证。 主要实验材料和设备: P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。 假设：_________________________________________________ 稀释 抑菌圈 P菌通过分泌溶菌物质破坏A菌 3 微生物的数量测定 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 1.提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 2.做出假设 3.实验设计 实验步骤 土壤 取样 制备 培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 3 微生物的数量测定 ①培养基的制备 制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 对照作用 思考1. 为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ 4.进行实验 3 微生物的数量测定 ②土壤取样 取样：铲去表层土（一般3cm左右）。 细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。 思考2.测定土壤中细菌总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 4.进行实验 取样地：酸碱度接近中性的潮湿土壤中。 3 微生物的数量测定 ③样品的稀释与涂布平板 a. 每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基 实验; b. 4为 培养基，其目的是 ； c. 另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 .培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 4 重复 牛肉膏蛋白胨 2 选择培养基和牛肉膏蛋白胨 4.进行实验 判断选择培养基是否具有选择作用 3 微生物的数量测定 4.进行实验 ④微生物的培养与观察 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。 结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 因培养时间不足而导致菌落数目遗漏 24h 菌落数目稳定 注意事项： 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等； 3 微生物的数量测定 5.进一步探究 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 方法：在培养基中加入酚红指示剂 ——鉴别培养基 CO(NH2)2 + H2O 脲酶 2NH3+CO2 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 3 微生物的数量测定 名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化 伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现金属光泽的深紫色菌落 刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈 油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色 淀粉培养基 鉴别产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉被分解后出现淀粉水解圈 H2S试验培养基 鉴别产H2S菌株 醋酸铅 产生黑色沉淀 鉴别培养基（拓展） 小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 $