题型05 基因工程的应用（4大考向）（题型专练）2026年高考生物二轮复习讲练测

题型 05 基因工程的应用 目录 第一部分 题型解码 高屋建瓴，掌握全局 第二部分 考向破译 微观解剖，精细教学 考向解读 方法透视 典例引领 变式演练 考向01 基因工程核心操作流程 考向02 基因工程在农业领域的应用 考向03 基因工程在医药与医学领域的应用 考向04 蛋白质工程的应用 第三部分 新题演练 整合应用，模拟实战 高考真题 命题点 常见设问/关键词 2025   黑吉辽蒙：PCR的原理、应用；浙江：PCR原理、目的基因的获取；河北：基因自由组合定律的实质和应用   基因突变   PCR扩增的原理与过程   基因连锁与交换定律；江苏：基因突变与基因工程；安徽：基因工程与发酵工程（PCR 扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；山东：基因工程与发酵工程（PCR 扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；陕晋青宁：基因工程的操作程序综合；湖南：基因表达载体的构建；动物细胞融合与单克隆抗体的制备；北京：PCR技术的应用； 2024·北京：贵州：限制酶的作用特点；甘肃、湖北、江西：基因工程技术的基本步骤；浙江：引物、凝胶电泳；山东、安徽：DNA 粗提取与鉴定、PCR条件；河北：PCR的原理、条件；吉林：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；全国、重庆 2023·浙江：PCR技术；广东、湖南：基因工程培养抗逆性作物；山西、山东、湖北：构建基因表达载体； 设问关键词：限制酶、基因表达载体的组成包括哪些元件、构建过程中为何要选择同种限制酶切割目的基因和载体、启动子的作用是什么 关键技巧 解答高考生物基因工程应用类非选择题，需紧扣操作流程与核心原理。首先要明确基因工程工具的特性，限制酶需识别特定序列且注意黏性末端匹配，载体要具备标记基因等必备元件。构建表达载体时，需牢记其包含目的基因、启动子、终止子和标记基因，且启动子需适配受体细胞类型。目的基因导入环节，要区分动植物和微生物的不同方法，如农杆菌转化法适用于植物、显微注射法用于动物。筛选鉴定需分层次，先通过标记基因筛选导入成功的受体细胞，再用分子杂交技术检测目的基因的转录与表达。答题时结合题干应用场景，用专业术语规范表述操作逻辑，确保流程与原理对应。 思维误区 1、工具酶功能认知混淆 易混淆限制酶与 DNA 连接酶的作用，误将限制酶的 “切割磷酸二酯键” 等同于 DNA 连接酶的 “连接氢键”；同时忽略 DNA 聚合酶与 DNA 连接酶的差异，认为二者均可连接 DNA 片段，实则前者仅用于 DNA 复制时单链的延伸，后者才用于目的基因与载体的拼接。 2、基因表达载体元件理解偏差 误认为基因表达载体只需包含目的基因，遗漏启动子、终止子、标记基因等核心元件；还会混淆启动子与起始密码子、终止子与终止密码子的概念，将调控转录的启动子 / 终止子归为翻译层面的密码子，忽略二者的作用阶段和本质差异。 3、目的基因导入方法与受体细胞错配 对不同受体细胞的导入方法记忆混乱，比如将农杆菌转化法用于动物细胞，或将显微注射法用于微生物细胞；同时忽视受体细胞的特殊性，如导入植物细胞时未考虑体细胞需经植物组织培养才能获得转基因植株，导入微生物细胞前未进行 Ca²⁺处理增加通透性。 4、筛选鉴定层次与方法混淆 把 “筛选成功导入载体的受体细胞” 和 “鉴定目的基因是否表达” 的方法混为一谈，比如用抗原 - 抗体杂交技术筛选导入载体的细胞，而非仅用于检测蛋白质水平的表达；还会遗漏分子水平检测的多步流程，仅进行标记基因筛选就判定目的基因已成功表达。 5、基因工程安全性与应用原理脱节 分析转基因生物安全性时，仅泛泛提及 “生态风险”，未结合具体实例（如抗虫基因可能流向近缘物种）；在解释基因工程应用机理时，如抗虫棉的抗虫原理，误将 Bt 毒蛋白基因直接等同于毒蛋白，忽略基因需经转录翻译才能合成抗虫蛋白的过程。 考向01 基因工程核心操作流程 这是基础考向，聚焦基因工程的核心步骤与工具。常以流程图为载体，考查限制酶、DNA 连接酶等工具酶的选择与作用，基因表达载体的必备元件（启动子、终止子、目的基因、标记基因）及构建逻辑，还有目的基因导入不同受体细胞（植物、动物、微生物）的方法差异，需精准区分各步骤的原理与操作细节。 1、核心操作流程技巧：牢记 “获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定” 四步流程。目的基因获取可通过 PCR 扩增、从基因文库中提取；基因表达载体构建是核心，需含启动子、目的基因、终止子、标记基因（如抗生素抗性基因）；导入受体细胞方法需匹配生物类型（植物用农杆菌转化法，动物用显微注射法，微生物用感受态细胞法）。 2、关键步骤分析逻辑：构建表达载体时，需用同种限制酶切割目的基因和载体，再用 DNA 连接酶连接，保证目的基因正确插入；检测鉴定分三步 —— 分子水平检测（DNA 分子杂交、分子杂交、抗原 - 抗体杂交）和个体水平鉴定（如抗虫实验），解题时按 “步骤→工具→目的” 梳理，明确各环节作用。 3、应用场景匹配技巧：基因工程应用聚焦 “医疗、农业、环保” 三大领域。医疗上如生产胰岛素、基因治疗遗传病；农业上如培育抗虫（Bt 毒蛋白基因）、抗逆作物；环保上如降解污染物的基因工程菌。答题时需结合具体应用，对应核心操作流程，说明技术原理。 4、规范答题模板：按 “操作流程→核心工具→应用场景→预期效果” 表述，例：“该基因工程中，先通过 PCR 扩增获取抗虫基因，与含标记基因的载体用限制酶和 DNA 连接酶构建表达载体，经农杆菌转化法导入棉花细胞，通过抗原 - 抗体杂交检测目的基因表达，最终培育出抗虫棉花品种”。 例1.（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。 (1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌 的功能，导致该细胞器不能产生ATP。 (2)获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株 ①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。 ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。 已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向 。 ③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。 (3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择 。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的 。 在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供 ，大肠杆菌为酵母菌提供 ，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是： 。 例2.（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是 。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是 。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有 ，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有 （至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及 。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是 ，②是 ，③是 ，④是 。 1．研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因 afp 整合到土壤农杆菌的 Ti 质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。所用农杆菌的 Ti 质粒的结构如图所示，其中 Vir 区的基因活化能促进 T-DNA 的加工和转移，回答下列问题: (1)利用 PCR 可以快速扩增抗冻蛋白基因 afp，PCR 反应需要提供 DNA 模板、引物、脱氧核苷酸和 ，需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中 Mg²⁺的作用是 。 (2)构建含有 afp 基因的 Ti 质粒需要限制酶和 酶。根据图中农杆菌的 Ti 质粒的结构，为提高农杆菌的转化效率，构建重组质粒应选择的限制酶是 。 (3)采用农杆菌转化法能将 afp 基因导入番茄细胞利用了农杆菌的特点是 。 (4)为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有 和 。 2．研究人员将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。据图回答下列问题： (1)为了便于质粒和Bar基因连接构建基因表达载体，在利用PCR技术扩增Bar基因时需要设计特定的引物，结合图1分析，左边引物要包括哪些碱基序列 （注明引物的方向）。耐高温的DNA聚合酶从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是 （答出1点）。 (2)图1质粒中TetR基因的作用是 ；利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，一般选择陆地棉的 细胞作为受体细胞，最终得到的转基因棉花不具有抗四环素的特性，原因是 。 (3)为了鉴定转基因棉培育是否成功，可提取转基因棉花的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的DNA样品进行检测，在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与 有关（答出2点）；还可以从个体水平进行鉴定，方法是 。 3．土壤中的污染物RDX具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌的RDX降解酶基因XplA与XplB整合为融合基因，导入柳枝稷草使其根细胞分泌RDX降解酶，以修复污染土壤。图1、2为降解酶基因XplA、XplB及农杆菌转化流程示意图。 回答下列问题： (1)获取XplA与XplB基因。随着测序技术的发展，可通过检索 获取XplA与XplB的相关序列，然后用 法制备得到。 (2)通过融合PCR获得XplB-XplA融合基因。为使两基因能正确融合并表达，引物 和 的 端需包含部分互补序列。同时部分引物还应包含相应的限制酶识别序列。PCR循环步骤中， 步骤的温度需根据引物的碱基组成（GC含量）调整，引物长度一定时，GC含量增加（合理范围内），该步骤温度应 ，其目的是 。 (3)图2中，将融合基因插入Ti质粒T-DNA区后，可通过PCR验证重组质粒是否构建成功，该过程中常采用 技术鉴定PCR产物，再将重组质粒与经 处理的农杆菌混合以实现转化。在添加潮霉素的LB培养基中 （填“能”或“不能”）直接筛选出导入融合基因的农杆菌。 (4)获得融合基因转化成功的目的农杆菌后，对其进行 。再用农杆菌侵染经消毒的柳枝稷草外植体，其Ti质粒上的T-DNA可将融合基因整合到柳枝稷草细胞的 。若经组织培养获得了转基因柳枝稷草，但其根细胞仍不能合成RDX降解酶，从基因表达调控角度分析，可能的原因是 （结合载体具体元件分析）。 考向02 基因工程在农业领域的应用 为高频应用考向，结合农业生产实际场景出题。核心考查抗虫、抗病、抗逆（抗盐碱、抗干旱）转基因作物的培育原理，如抗虫棉中 Bt 毒蛋白基因的表达机制、抗除草剂作物的作用靶点；还会涉及转基因作物的优势分析（如减少农药使用）及育种流程的优化，需将基因工程技术与作物育种需求结合。 1、应用方向定位技巧：聚焦农业核心需求，明确三大高频应用方向 —— 抗逆（抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐碱）、改良品质（提高营养含量、改善口感）、提高产量（促进生长、抗倒伏）。解题时先锁定题干需求，对应匹配基因工程技术路径，如抗虫需求优先关联 Bt 毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因。 2、核心操作适配技巧：结合农业应用场景细化操作流程 —— 目的基因选择需针对性（抗虫选 Bt 基因，抗除草剂选 EPSPS 基因）；载体常用农杆菌 Ti 质粒（植物转化首选）；导入方法优先农杆菌转化法（双子叶植物）或基因枪法（单子叶植物）；检测鉴定需兼顾分子水平（抗原 - 抗体杂交验证表达）和田间实验（抗虫性、产量对比）。 3、优势与问题分析逻辑：答题需体现 “技术优势→实际价值”“潜在风险→应对措施”。优势如减少农药使用（抗虫作物）、拓宽种植范围（耐盐碱作物）；风险如基因污染、害虫抗药性，应对措施可提 “合理布局非转基因作物”“多基因叠加导入”。 4、规范答题模板：按 “需求→基因选择→操作流程→应用效果” 表述，例：“为培育抗虫棉花，选择 Bt 毒蛋白基因作为目的基因，与 Ti 质粒构建表达载体，通过农杆菌转化法导入棉花细胞，经筛选鉴定获得转基因植株，其可表达抗虫蛋白，减少农药使用，提高产量”。 例1.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 1．水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1），为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题： (1)基因工程中启动子与增强子都与基因转录有关，增强子可增强转录效率。启动子是 ，其位于基因的上游，紧挨 。 (2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活 Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (3)研究人员欲通过改造重组质粒，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度。方法一是选择激活能力更强的调控蛋白基因nahRl替代 nahR：方法二是在 mrfp基因前插入 。 (4)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与 mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的 。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是 。 (5)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB 基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的 、 （填字母）位点。 2．赖氨酸是人体必需氨基酸之一，但玉米种子中赖氨酸含量较低，影响其营养价值。科学家发现，玉米中赖氨酸的合成受关键酶（天冬氨酸激酶，AK）的反馈抑制：当赖氨酸积累时，AK活性被抑制。通过基因工程改造AK基因，可解除这种抑制，从而提高赖氨酸含量。下图为科学家拟用农杆菌转化法将改造后的AK基因导入玉米细胞的示意图，回答下列问题： (1)天然玉米中，赖氨酸对AK的抑制作用属于 调节，这种调节的意义是 。 (2)为便于筛选，应选择 的农杆菌作为受体细胞。在构建基因表达载体时需将AK基因插入Ti质粒的T-DNA区域，目的是 。 (3)已知AK基因的a链为模板链，则在PCR扩增AK基因时应在图示的3’端添加 的酶切位点，便于AK基因的正确连接和表达。启动子应选择玉米种子特异性启动子，目的是 。为验证AK基因是否成功表达，可采用的检测方法是 。 (4)与传统诱变和杂交育种相比，基因工程培育高赖氨酸玉米的优势是 。 3．C4植物玉米细胞内存在GOLDEN2（G2）基因和GOLDEN2-LIKE（GLK）基因，它们通过激活位于叶绿体内编码光合作用相关蛋白的基因来调控光合作用。为研究这两种基因在光合作用中的作用，科学家利用构建的过表达G2基因水稻ZmG2、过表达GLK基因水稻ZmGLK1和野生型水稻WT（无GLK和G2基因）作为研究对象，探究了它们在田间生长时相关因素的变化情况，结果如图1所示。请回答下列问题： (1)在叶绿体基质中分布有DNA、RNA以及 （结构），因此叶绿体可以进行DNA的复制和基因的表达。从细胞核基因控制的角度分析，叶绿体是 （填“完全”或“不完全”）自主性细胞器。 (2)结合图甲和图乙所示结果，转基因水稻相较于野生型水稻产量 （填“增加”或“减少），原因是G2基因和GLK基因 。 (3)当植物光合结构吸收的光能超过光合作用所能利用的量时，过剩的光能会引起光能转化效率的下降，这种现象即光抑制。为探究光抑制对ZmGLK1和ZmC2的影响，科学家测定了高光照处理后光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学效率（Fv/Fm,即植物的最大光能转化效率）和热耗散（NPQ,即光能以热能形式散失）变化，如图2ⅰ和图ⅱ。 根据实验结果可知，转基因水稻ZmGLK1和ZmG2的光抑制强度 （填“高于”或“低于”）野生型水稻，结合图示分析出现该现象的机制是 。 考向03 基因工程在医药与医学领域的应用 侧重技术的医用价值，考查基因工程药物（如胰岛素、干扰素）的生产流程，即目的基因在工程菌中的高效表达条件；同时涵盖基因治疗的两种策略（体内基因治疗、体外基因治疗），以及针对遗传病、肿瘤等疾病的治疗原理，需区分基因工程药物生产与基因治疗的本质差异。 1、应用方向定位技巧：聚焦医学核心需求，明确三大高频方向 —— 药物生产（重组蛋白类药物）、基因治疗（遗传病 / 肿瘤）、诊断技术（分子探针）。解题时先锁定题干场景，如 “生产胰岛素” 对应重组药物，“治疗镰状细胞贫血” 对应基因治疗，精准匹配技术路径。 2、核心技术适配技巧：按应用场景细化操作 —— 药物生产需选择高效表达载体（如大肠杆菌、酵母菌），目的基因多为功能蛋白基因（胰岛素、干扰素基因）；基因治疗分体外（提取细胞修饰后回输）和体内（直接导入治疗基因）途径，常用病毒载体（如逆转录病毒、腺病毒）；诊断技术依赖 DNA 分子杂交、PCR 扩增等技术，实现病原体或基因突变检测。 3、关键逻辑分析技巧：答题需体现 “技术原理→临床价值”“风险防控”。如重组药物生产逻辑：目的基因克隆→构建表达载体→导入工程菌→表达纯化→药物制剂；基因治疗需强调 “靶向性” 和 “安全性”，避免载体引发免疫反应。 4、规范答题模板：按 “需求→技术路径→核心操作→应用效果” 表述，例：“为生产重组人胰岛素，先克隆人胰岛素基因，与大肠杆菌表达载体构建重组质粒，导入工程菌后诱导表达，经纯化获得药物，可精准调节血糖，治疗糖尿病”。 例1.（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。 (2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。 例2.（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 1．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。 (1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是 。 (2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时需要添加限制酶的识别序列。根据图中限制酶识别及切割位点等信息，设计出适合目的基因上游引物,该引物的第1、9、15位的碱基分别是 。 (3)为获得更多的目的基因，需利用PCR技术进行扩增，引物与DNA结合发生在 阶段，PCR第四次循环需要消耗 对引物。 (4)质粒中复制原点应使用大肠杆菌的复制原点的原因是 (5)采用 法将重组质粒导入大肠杆菌。 2．科学家设想将HIV的壳体蛋白（CA）基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内，利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗，以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如下图所示。回答下列问题∶ (1)①过程为 ，进行①过程操作的目的是 。为获得大量图中的DNA片段（目的基因），科学家需要根据 设计引物。若有a条起始的RNA片段，经过图中的①过程，再进行PCR循环30次，理论上PCR过程需要引物 （用算式表示）个。 (2)选用Ti质粒作为HIV壳体蛋白（CA）基因的载体，优点是∶ 。 (3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制性内切核酸酶是 ，不选用其他两种限制酶的原因是 。 (4)为了筛选出含重组载体的农杆菌，在选择培养基上添加氨苄青霉素，一段时间后，培养基上形成的菌落 （填“一定”或“不一定”）含有重组载体，原因是 。是否成功培育出转基因植株需从 与个体水平上对转基因植株进行检测与鉴定。 3．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。 (1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是 。BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，再由mRNA （填过程）得到胰岛素基因。 (2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 （选填编号）的识别序列。 ①MunI  ②XhoI  ③EcoRI  ④SalI  ⑤NheI (3)实践操作中，通过添加保护碱基序列GGG可以延长限制酶识别序列一端的碱基数，从而提高限制酶识别及切割的效率。根据上述信息，设计出适合作为目的基因上游引物的序列5′— -3'（写出18个碱基） (4)采用 法将重组质粒导入大肠杆菌。β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质，筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，应在培养基中加入 ，应选择培养基上 （填“蓝色”或“白色”）的菌落。 考向04 蛋白质工程的应用 蛋白质工程作为基因工程的延伸，其高考应用类题型围绕 “原理 - 改造 - 应用 - 争议” 的核心逻辑展开考查，聚焦逆向工程本质与实践场景的结合。题型核心先立足基础原理，重点检测 “从预期蛋白质功能出发，设计蛋白质结构、推测氨基酸序列，进而改造基因序列” 的逆向逻辑，同时需区分其与基因工程 “生产天然蛋白质” 的差异，拆解分子设计、基因改造、表达鉴定等关键流程。高频考向集中在医药领域，涉及人源化抗体改造以降低免疫原性、酶类药物（如长效胰岛素）的活性优化、疫苗抗原修饰以增强免疫效果等 “定制化” 应用，凸显临床价值。工农领域则侧重功能蛋白的定向改良，农业中通过改造抗逆蛋白、贮藏蛋白提升作物抗逆性与营养品质，工业上优化纤维素酶、蛋白酶的热稳定性和催化效率以适配生产需求。此外，试题还会考查技术瓶颈与伦理争议，如蛋白质空间结构预测难度、表达折叠障碍，以及医用蛋白的免疫风险、生态影响等，全面检测学生的知识应用与辩证思维能力。 1、应用方向定位技巧：紧扣 “功能优化” 核心需求，明确三大高频方向 —— 改造现有蛋白质（如提高酶的热稳定性、改变抗体亲和力）、合成新型蛋白质（如设计抗菌肽、肿瘤靶向蛋白）、修正异常蛋白（如治疗遗传病的功能蛋白）。解题时先锁定题干功能需求，如 “耐高温蛋白酶” 对应改造酶的结构，精准匹配技术路径。 2、核心改造流程技巧：牢记 “从基因入手” 的本质，流程为 “预期蛋白质功能→设计预期氨基酸序列→推测对应基因序列→改造 / 合成基因→表达验证蛋白质”。关键在于 “基因修饰”，需通过碱基对替换、插入或缺失改变氨基酸序列，进而优化蛋白质结构与功能，避免混淆 “蛋白质直接改造”（不可行）与 “基因层面改造”（核心路径）。 3、场景适配分析逻辑：结合具体应用场景梳理逻辑链 —— 工业领域（改造酶结构提升催化效率、降低成本）、医药领域（设计靶向蛋白药物、优化抗体治疗效果）、农业领域（改良植物蛋白营养、增强抗逆蛋白功能）。答题需体现 “结构决定功能”，如 “替换酶的关键氨基酸残基→改变空间结构→提升热稳定性”。 4、规范答题模板：按 “功能需求→基因改造→蛋白质优化→应用效果” 表述，例：“为获得耐高温淀粉酶，先明确其热稳定功能需求，设计对应的氨基酸序列并推测基因序列，通过定点突变改造淀粉酶基因，导入工程菌表达后验证，最终获得高温下仍具高效催化活性的酶，适用于工业高温发酵场景”。 例1.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： (1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的 拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是 。 (2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的 （填下图字母）处。理由是 。 (3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为 。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的 中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是 。 例2.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 (1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ① ； ②将 分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。 (2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。 (3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是 。 1．抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，与传统抗生素相比具有无药残、不易产生耐药性等特点，是抗生素理想的替代品，具有广谱抗细菌活性，在医学和饲料企业中具有重要应用价值。研究人员根据抗菌肽A和抗菌肽D的部分氨基酸序列，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。请回答下列问题。 注:K为赖氨酸，A为丙氨酸，M为甲硫氨酸（5’-AUG-3’）， 起始密码子为5’-AUG-3’， 终止密码子为5’-UAA-3’。Leu⁺为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，O为复制原点。 注：Leu+为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁的合成发挥作用；O为复制原点。 (1)由抗菌肽AD的氨基酸序列可推得多种不同序列的AD基因，原因是 。 (2)研究人员在人工合成AD基因后，为了使AD基因与pC穿梭质粒正确连接，设计了引物P1（由12个脱氧核苷酸组成的正向引物，结合在AD基因的上游）和P2（由18个脱氧核苷酸组成的反向引物，结合在AD基因的下游），通过PCR扩增AD基因，然后与pC穿梭质粒连接形成重组质粒。据图推测引物P1的碱基序列为5'- -3'。在P2引物中，除了构建相应限制酶的识别序列外，还构建了2个终止密码子的编码序列，以保证翻译过程的顺利进行，推测引物P2的碱基序列为5'- -3' (3)将构建的重组质粒导入酵母菌后，需要用选择培养基筛选并培养受体菌。从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择培养基应 。 (4)通过上述筛选仍不能确定导入受体菌的是pC穿梭质粒还是含AD基因的重组质粒，可采用 方法（填一种方法）做进一步鉴定。 (5)为提高抗菌肽活性，研究人员拟对其氨基酸序列进行一定的修饰和改造，该项技术需要通过 工程来实现，直接操作的对象是 。 2．科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（下图），水杨酸是常见的水体污染物。请回答： (1)获得纯净的大肠杆菌的关键是防止 ，对该工程菌进行扩大培养时所用的液体培养基中是否 （填“是”或“否”）需要添加琼脂成分。若需分离得到大肠杆菌单菌落，可采用 （答2种方法）。 (2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活 启动子，最终使菌体发出红色荧光，根据 可判定环境中的水杨酸浓度。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸分解。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdB基因应插入下图中的 位点。 (4)在分子水平上可以采用 技术检测nahR蛋白。科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是 ，诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其 结构并未被破坏。用抗nahR蛋白的单克隆抗体检测nahR蛋白的优点是 。 (5)结果显示转智能工程菌的灵敏性并未达到预期，为提升nahR蛋白的生物活性，科研人员欲通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，诸按正确顺序排列： 。 ①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构 ②推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点 ③采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列 ④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性 3．抗菌肽是生物体为了抵抗外来细菌而迅速诱导产生的一系列具有抗菌或杀菌活性的多肽类物质，在医学上具有重要应用价值。研究人员根据天然抗菌肽A和抗菌肽D的部分氨基酸序列，以及酵母菌对密码子的偏好，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，然后利用酵母菌发酵生产活性更高的抗菌肽AD，请回答下列问题： 注:K为赖氨酸，A为丙氨酸，M为甲硫氨酸（5’-AUG-3’）， 起始密码子为5’-AUG-3’， 终止密码子为5’-UAA-3’。Leu⁺为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，O为复制原点。 (1)由抗菌肽AD的氨基酸序列可推出多种不同序列的AD 基因，原因是 。图中丙氨酸A的反密码子为5’- -3’。 (2)研究人员在人工合成AD 基因后，为了使AD基因与pC 穿梭质粒正确连接，设计了引物P1（由12个脱氧核苷酸组成的正向引物，结合在AD基因的上游）和P2 （由18个脱氧核苷酸组成的反向引物，结合在AD基因的下游），通过PCR扩增AD基因，然后与pC穿梭质粒连接形成重组质粒。据图推测引物P1的碱基序列为5’- -3’。在引物P2中，除了构建相应限制酶的识别序列外，还构建了2个终止密码子的编码序列，以保证翻译过程的顺利进行，推测引物P2的碱基序列为：5’- -3’ (3)将AD基因重组质粒导入酵母菌后，需用选择培养基筛选并培养受体菌。从培养基的成分分析，该选择培养基与普通培养基的不同之处是 。 (4)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是 。 1．（2025·浙江宁波·一模）玉米作为重要的粮食和饲料作物，在转基因育种中提高其转化效率不仅能降低成本，还能加速新品种的培育进程，更好地满足农业生产的需求。已有研究发现，提高WUS、BBM、GRF、GF等发育调节因子的表达量可有效提高单子叶植物的转化效率。回答下列问题： (1)GRF蛋白是一类调控植物生长发育的关键转录因子，GIF蛋白是其辅助因子。通常将GRF基因与GIF基因组成融合基因，制备过程如图1。为使扩增出的GRF和GIF基因片段在混合后通过引物部分延伸融合，引物 和引物 的碱基序列必须有 （填“相同”或“互补”）片段。 (2)科研人员欲利用上述四种发育调节因子的基因加速玉米的遗传改良，构建了图2所示的三种载体。其中DsRed和NPTⅡ作为 用于筛选转化成功的受体细胞，每个插入单位均需含有 。 (3)将三种载体分别导入玉米胚中。将构建的重组Ti质粒导入经过 处理的农杆菌后，稀释得到一定浓度的农杆菌液。双子叶植物伤口处的细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，但农杆菌一般难以感染单子叶植物。为了提高转化成功率，将玉米萌发种子的胚芽尖端割伤，在伤口处施加 ，然后放入 中浸泡。 (4)将各组玉米胚插入诱导愈伤组织的培养基中，该过程需在 操作完成，以减少空气中微生物的污染。培养一段时间后，将愈伤组织转接到生长素用量与细胞分裂素用量比值 的培养基上，诱导愈伤组织生芽。不同阶段的实验数据如下表所示，由表可知，发育调节因子能大幅度提高转基因玉米的 。 组别 载体 胚（个） 愈伤组织（个） 存活率（%） 带芽的愈伤组织（个） 再生率（%） 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 14.29 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 38.18 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 54.35 26.04 2．（2025·山东聊城·三模）CRISPR/Cas12a系统是由crRNA和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的复合体。crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。下图是CRISPR/Cas12a系统的工作原理示意图。请回答下列问题。 注：PAM是一种短DNA序列，N表示任意碱基。PAM可以帮助Cas12a识别和切割目标DNA序列。“”表示在相应位置剪切DNA。 (1)在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含 种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化 水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断，切割DNA后形成的是 （填“黏性”或“平”）末端。 (2)某科研团队基于CRISPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。他们利用crRNA对应基因序列和PX458质粒（如下图）构建crRNA/Cas12a重组载体，转染至HeLa细胞进行相关研究。 ①为保证crRNA对应的基因序列与PX458质粒正确连接，应在扩增该基因序列的一对引物的5’端分别添加 两种限制酶的识别序列。其中P1的碱基序列为5’ 3’（写出前9个碱基）。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是 。 ②将CrRNA/Cas12a重组载体成功转染至HeL.a细胞。与对照组相比，实验组中KIFCl蛋白表达量、细胞数目的变化如下图所示，由此得出结论是 。判断依据是： 。 3．（2025·山东淄博·三模）荧光素酶互补实验可用于研究两种蛋白质的相互作用。荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光。科研人员利用该技术探究植物中的ERF114蛋白能否与MYB8蛋白相互作用，过程如下图。 (1)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两末端有至少15bp的相同序列，这些相同序列通过设计引物、经PCR获得。图1中为保证基因正向连接在质粒上，PCR的引物中应有 种相同的15bp序列，这些序列应构建在相应引物的 （填“5′端”“3′端”）。 (2)以构建重组载体ERF114-Nluc为例，将PCR获得的ERF114、NLuc及线性化质粒混合并加入三种酶，50℃条件下共同孵育1h可完成连接，原理见图2。图中过程③和过程④分别加入的酶是 、 。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术的优点是 （答出1点即可）。 (3)将构建正确的ERF114-Nluc、MYB8-CLuc、NLuc、CLuc、T-NLuc及p53-CLuc等6种重组载体分别导入农杆菌，将不同农杆菌组合注射到烟草叶片中，24h后将荧光素底物喷洒到叶片上，结果如图3。若ERF114能与MYB8相互作用，则 （填图中数字）区域会发出荧光。该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是 。 4．（2025·江苏南京·二模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在 酶的作用下先合cDNA。选择cDNA而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是 。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是 。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是 ，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加 限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有 （答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品 最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是 。 (4)将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为 ，检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为 。天然的干扰素在体外保存相当困难，为了生产出耐储存干扰素，科学家可通过蛋白质工程对干扰素进行改造，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→ → →找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。 5．（2025·江西九江·三模）黄瓜花叶病毒是寄主范围最多的植物病毒之一，对多种重要经济作物的生存造成威胁。研究发现，由该病毒C基因表达出的C蛋白是病毒合成和释放的关键成分，将C基因敲除后，单株烟草病毒侵染性大大降低。为提高烟草等经济作物产量，科研人员利用PCR技术大量扩增出C基因，并将C基因导入Ti质粒中，通过农杆菌转化法获得能表达C基因反义RNA（能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链）的转基因抗病毒烟草。回答以下问题。 注：图1中a~e表示不同的引物；图2为Ti质粒，T-DNA的左、右边界见图，其中EcoRI和XhoI是两种限制酶且切割后形成的黏性末端不互补。 (1)一般来说，设计的引物序列越短，其特异性越 （填“强”或“弱”）。据图可知扩增完整的C基因，应选择图1中的引物 。若任意使用图1中涉及的所有引物，通过PCR技术可扩增出 种等长的DNA片段。 (2)该实验利用反义RNA介导基因沉默，主要抑制病毒C基因表达中的 过程。结合图2，为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，应在左侧引物的5’端设计添加 酶切位点。 (3)重组质粒构建完成后需进行琼脂糖凝胶电泳实验验证，为保证电泳结果的准确性，对该环状质粒电泳时需分为无酶切组和单酶切组，结果发现无酶切组的电泳速率慢于酶切组，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其 有关。 (4)为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，还需进行个体水平检测，请简述实验思路 。 6．（2025·河南·三模）抗菌肽是生物体免疫系统自身分泌的一种可以有效抵御外来病原体侵害的肽类化学物质。抗菌肽TLN-58是存在于人皮肤病变小泡中的多肽，抗菌肽hLYZ是人体免疫防御机制的组成部分。科研人员将基因TLN-58和基因hLYZ进行融合（图1），构建重组载体（图2），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ。回答下列问题： (1)为使基因TLN-58和基因hLYZ融合，需要先设计引物，通过PCR技术在引物R2的 （填“3′端”或“5′端”）添加一段核苷酸序列，从而使两个基因能够融合成一个基因。利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入 作为合成DNA子链的原料，该过程需要的酶是 。 (2)要使融合基因按图示方向插入到质粒中，应在引物 （填“F1”“F2”“R1”或“R2”）的5′端添加限制酶EcoRⅠ的识别序列。构建基因表达载体时，一般采用双酶切法，而不用单酶切法，优点是 （答出2点）。 (3)为验证杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ对金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性（高于单一抗菌肽），科研人员做了如下实验，请完善实验步骤。 ①将适宜浓度的金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布到平板上； ②用经灭菌的镊子分别将浸过等量且适量无菌水（A组）、抗菌肽TLN-58（B组）、抗菌肽hLYZ（C组）、 （D组）的圆形滤纸片沥干后置于上述平板上； ③将培养基置于适宜条件下培养一段时间； ④测量并比较 。 预期结果及结论： 。 7．（2025·北京海淀·二模）发酵工程离不开微生物培养，为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时。 (1)发酵工程一般包括菌种的选育、 、培养基的配制、灭菌、接种、发酵产品的分离、提纯等方面。其中 是发酵工程的中心环节。 (2)PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。 ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，M蛋白 ，PE表达的产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理 。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测 和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 (3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pc，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中c蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ① ② 高浓度葡萄糖 ③ ④ 8．（2025·辽宁沈阳·三模）大豆脂肪氧化酶（LOX）在食品加工等方面有重要作用。下图表示建立LOX基因原核表达体系生产LOX的过程。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，T7启动子可被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）激活。回答下列问题。 (1)①RT-PCR（逆转录PCR）获得LOX基因（cDNA）的过程需要 的催化。为了便于基因表达载体的构建，引物F1和R1分别为 。 A．5′-GGTACCGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′ B．5′-CTCGAGAAAGCCAAACATGAAAGC-3′ C．5′-GGTACCAAAGCCAAACATGAAAGC-3′ D．5′-CTCGAGGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′ (2)图中代表基因工程核心步骤的是 （填序号）。③过程需用 处理大肠杆菌，以利于重组质粒的转化。仅利用含氨苄青霉素的培养基无法区分含有 的大肠杆菌，因此还需利用PCR等技术在 水平上对大肠杆菌进行检测与筛选。筛选后的大肠杆菌用于生产时，除营养物质外，培养基中还需添加 。 (3)已知天然的LOX具有使β-胡萝卜素漂白褪色的特性。简要叙述利用以上过程生产的LOX进行活性鉴定的实验设计思路： 。 9．（2025·四川乐山·三模）我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B及质粒的限制酶切割位点如图所示。 (1)将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有 （填图中限制酶）和DNA连接酶。将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是 。 (2)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用了他们独创的一种方法 ，将目的基因导入番茄细胞。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。 (3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到 ，并且将其整合到 上。 (4)抗虫基因A导入番茄细胞后，若要检测抗虫基因A是否插入番茄染色体中，需要从番茄细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。 (5)若要通过实验检测抗虫基因A在番茄细胞中是否表达为抗虫蛋白，请简要写出实验思路 。 10．（2025·湖南常德·三模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了AmyS2基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1所示。最终结果表明，与导入质粒B相比，导入质粒C的芽孢杆菌的培养液中更易获得并提纯AmyS2.回答下列问题： (1)科研人员利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的 →人工合成AmyS2基因的 序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2. (2)根据图2分析，利用PCR技术扩增AmyS2基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 。若将该基因扩增过程中至少经过 次循环，可获得32个符合要求的目的基因。 (3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B，应选择的限制酶是 ；将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是 。在工业生产中，使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质，据此推测，信号肽的功能可能是 。 (4)芽孢杆菌细胞内的bp基因会表达出一种胞外蛋白酶，导致胞外α淀粉酶被降解。科研人员利用基因编辑技术敲除芽孢杆菌的bp基因，构建能高效表达α淀粉酶的工程菌。利用PCR技术可以检测bp基因是否被成功敲除，请简述实验设计思路： 。 11．（2025·重庆·一模）土壤盐碱化问题已成为全球性难题，培育耐盐碱作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。 (1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建了过表达植株（AT1-OE）。以高粱的cDNA为模板，利用 方法获取目的基因。如图1，最好选择限制酶 处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。 (2)将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，为筛选出T-DNA成功转入的愈伤组织，培养基中需加入 。获得所需愈伤组织后，经再分化发育成完整植株。 (3)同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株 ，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 (4)高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对空质粒组和重组质粒组总蛋白进行免疫共沉淀（GFP基因位于图1所示质粒中）。然后分别用抗GFP抗体和抗PIP2抗体对免疫共沉淀蛋白进行检测，实验结果如图3。通过哪一个条带可以判断，AT1与PIP2有相互作用? 。电泳时，应在 侧进行点样（填“A”或“B”）。 (5)细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因 。 12．（2025·陕西咸阳·三模）水稻在生长过程中容易感染病虫害，从而引起作物减产。C蛋白和V蛋白分别对水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫有较强的杀伤效果，科研人员构建了C—V抗虫融合基因（简称C—V基因）表达载体，通过农杆菌转化法将C—V基因表达载体导入水稻叶肉细胞，使其表达出C—V联合蛋白，从而培育出转基因抗虫水稻新品种，过程如图1。所示。回答下列问题： (1)科研人员进行PCR1和PCR2时，扩增体系中需要分别加入C基因和V基因，其作用均是 。 (2)据图分析，PCR扩增时需要设计引物，为了使C基因和V基因能够正确相连，设计引物2和引物3时，引物序列除了能与模板DNA结合，还需要遵循的原则是 ，因此PCR1和PCR2需要在 （填“同一个”。或“不同”）PCR反应体系中进行。同时，为了使连接后的C—V基因能够正确插入载体中，需要在引物1和引物4的5端插入相关 酶的识别序列。 (3)进行PCR3时，不需要额外添加引物，此反应体系中具有引物效果的是 。 (4)用抗C蛋白抗体和抗V蛋白抗体检测转基因抗虫水稻中的蛋白质，结果如图2所示，1～7为被检测的转基因抗虫水稻，WT表示野生型水稻。 ①转基因抗虫水稻6体内未检测到C蛋白和V蛋白，其原因可能是 （答两点）。 ②为评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，探究思路是向非转基因水稻和转基因抗虫水稻 （填序号）接种等量的 ，观察其抗虫效果。 13．（2025·广东广州·二模）不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。 (1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割质粒p-lacZ,然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。 (2)将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含 的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果（如图乙）表明，应选择质粒 并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是 。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒（记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路 。 14．（2025·内蒙古通辽·三模）组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种血栓溶解剂，难以从天然组织中提取或人工合成。科研人员从人胎盘染色体基因库中筛选出t-PA基因，将其与质粒结合，导入人黑色素瘤细胞中构建工程细胞，以生产t-PA。回答下列问题： (1)用PCR技术扩增t-PA基因时的步骤及设定的参数如图1所示。引物在步骤 中与模板链结合，步骤丁的目的是 。步骤戊应设定跳转到步骤 。 (2)PCR需要设计两种引物，如图2所示。图示中可作为引物的是 （填序号），原因是 。 (3)t-PA基因及构建表达载体的过程如图3所示。为保证t-PA基因与质粒高效连接，应选用图3中的限制酶 进行切割。 (4)与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞的优点是 。 15．（2025·广东惠州·一模）科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。回答下列问题： (1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的 将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于 条件下培养来筛选所需的菌株。 (2)适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是 。 (3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路： 。 (4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是 ，判断理由是 。 (5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题： （回答1点即可）。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 题型 05 基因工程的应用 目录 第一部分 题型解码 高屋建瓴，掌握全局 第二部分 考向破译 微观解剖，精细教学 考向解读 方法透视 典例引领 变式演练 考向01 基因工程核心操作流程 考向02 基因工程在农业领域的应用 考向03 基因工程在医药与医学领域的应用 考向04 蛋白质工程的应用 第三部分 新题演练 整合应用，模拟实战 高考真题 命题点 常见设问/关键词 2025   黑吉辽蒙：PCR的原理、应用；浙江：PCR原理、目的基因的获取；河北：基因自由组合定律的实质和应用   基因突变   PCR扩增的原理与过程   基因连锁与交换定律；江苏：基因突变与基因工程；安徽：基因工程与发酵工程（PCR 扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；山东：基因工程与发酵工程（PCR 扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；陕晋青宁：基因工程的操作程序综合；湖南：基因表达载体的构建；动物细胞融合与单克隆抗体的制备；北京：PCR技术的应用； 2024·北京：贵州：限制酶的作用特点；甘肃、湖北、江西：基因工程技术的基本步骤；浙江：引物、凝胶电泳；山东、安徽：DNA 粗提取与鉴定、PCR条件；河北：PCR的原理、条件；吉林：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；全国、重庆 2023·浙江：PCR技术；广东、湖南：基因工程培养抗逆性作物；山西、山东、湖北：构建基因表达载体； 设问关键词：限制酶、基因表达载体的组成包括哪些元件、构建过程中为何要选择同种限制酶切割目的基因和载体、启动子的作用是什么 关键技巧 解答高考生物基因工程应用类非选择题，需紧扣操作流程与核心原理。首先要明确基因工程工具的特性，限制酶需识别特定序列且注意黏性末端匹配，载体要具备标记基因等必备元件。构建表达载体时，需牢记其包含目的基因、启动子、终止子和标记基因，且启动子需适配受体细胞类型。目的基因导入环节，要区分动植物和微生物的不同方法，如农杆菌转化法适用于植物、显微注射法用于动物。筛选鉴定需分层次，先通过标记基因筛选导入成功的受体细胞，再用分子杂交技术检测目的基因的转录与表达。答题时结合题干应用场景，用专业术语规范表述操作逻辑，确保流程与原理对应。 思维误区 1、工具酶功能认知混淆 易混淆限制酶与 DNA 连接酶的作用，误将限制酶的 “切割磷酸二酯键” 等同于 DNA 连接酶的 “连接氢键”；同时忽略 DNA 聚合酶与 DNA 连接酶的差异，认为二者均可连接 DNA 片段，实则前者仅用于 DNA 复制时单链的延伸，后者才用于目的基因与载体的拼接。 2、基因表达载体元件理解偏差 误认为基因表达载体只需包含目的基因，遗漏启动子、终止子、标记基因等核心元件；还会混淆启动子与起始密码子、终止子与终止密码子的概念，将调控转录的启动子 / 终止子归为翻译层面的密码子，忽略二者的作用阶段和本质差异。 3、目的基因导入方法与受体细胞错配 对不同受体细胞的导入方法记忆混乱，比如将农杆菌转化法用于动物细胞，或将显微注射法用于微生物细胞；同时忽视受体细胞的特殊性，如导入植物细胞时未考虑体细胞需经植物组织培养才能获得转基因植株，导入微生物细胞前未进行 Ca²⁺处理增加通透性。 4、筛选鉴定层次与方法混淆 把 “筛选成功导入载体的受体细胞” 和 “鉴定目的基因是否表达” 的方法混为一谈，比如用抗原 - 抗体杂交技术筛选导入载体的细胞，而非仅用于检测蛋白质水平的表达；还会遗漏分子水平检测的多步流程，仅进行标记基因筛选就判定目的基因已成功表达。 5、基因工程安全性与应用原理脱节 分析转基因生物安全性时，仅泛泛提及 “生态风险”，未结合具体实例（如抗虫基因可能流向近缘物种）；在解释基因工程应用机理时，如抗虫棉的抗虫原理，误将 Bt 毒蛋白基因直接等同于毒蛋白，忽略基因需经转录翻译才能合成抗虫蛋白的过程。 考向01 基因工程核心操作流程 这是基础考向，聚焦基因工程的核心步骤与工具。常以流程图为载体，考查限制酶、DNA 连接酶等工具酶的选择与作用，基因表达载体的必备元件（启动子、终止子、目的基因、标记基因）及构建逻辑，还有目的基因导入不同受体细胞（植物、动物、微生物）的方法差异，需精准区分各步骤的原理与操作细节。 1、核心操作流程技巧：牢记 “获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定” 四步流程。目的基因获取可通过 PCR 扩增、从基因文库中提取；基因表达载体构建是核心，需含启动子、目的基因、终止子、标记基因（如抗生素抗性基因）；导入受体细胞方法需匹配生物类型（植物用农杆菌转化法，动物用显微注射法，微生物用感受态细胞法）。 2、关键步骤分析逻辑：构建表达载体时，需用同种限制酶切割目的基因和载体，再用 DNA 连接酶连接，保证目的基因正确插入；检测鉴定分三步 —— 分子水平检测（DNA 分子杂交、分子杂交、抗原 - 抗体杂交）和个体水平鉴定（如抗虫实验），解题时按 “步骤→工具→目的” 梳理，明确各环节作用。 3、应用场景匹配技巧：基因工程应用聚焦 “医疗、农业、环保” 三大领域。医疗上如生产胰岛素、基因治疗遗传病；农业上如培育抗虫（Bt 毒蛋白基因）、抗逆作物；环保上如降解污染物的基因工程菌。答题时需结合具体应用，对应核心操作流程，说明技术原理。 4、规范答题模板：按 “操作流程→核心工具→应用场景→预期效果” 表述，例：“该基因工程中，先通过 PCR 扩增获取抗虫基因，与含标记基因的载体用限制酶和 DNA 连接酶构建表达载体，经农杆菌转化法导入棉花细胞，通过抗原 - 抗体杂交检测目的基因表达，最终培育出抗虫棉花品种”。 例1.（2025·天津·高考真题）内共生假说认为，线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体，为上述假说提供证据。 (1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌 的功能，导致该细胞器不能产生ATP。 (2)获得维生素营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株 ①利用基因敲除技术获得维生素营养缺陷型大肠杆菌菌株A。 ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。 已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1（含EcoRⅠ识别序列）和P2（含NotⅠ识别序列）对基因X进行扩增，并采用引物P3（含EcoRⅠ识别序列）和P4（含NotⅠ识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使基因X与质粒1重组为质粒2．请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向 。 ③将质粒2转入菌株A中，筛选获得菌株B。 (3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤（1）获得的酵母菌中，筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择 。大肠杆菌细胞壁为双层结构，内层为坚固的肽聚糖，外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的 。 在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株，其中酵母菌为大肠杆菌提供 ，大肠杆菌为酵母菌提供 ，表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时，不能用葡萄糖为碳源，原因是： 。 【答案】(1)线粒体 (2) (3) PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH） 细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜） 维生素B1 ATP 葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：Mg2+、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）线粒体是有氧呼吸产生ATP的主要场所，要获得专性厌氧呼吸的酵母菌株，利用基因敲除技术破坏酵母菌线粒体的功能，就能导致该细胞器不能产生ATP。 （2）要使质粒1线性化，且能与扩增后的基因X经酶切、连接重组为质粒2，引物P3和P4应分别位于质粒1的两端，且方向相反（因为PCR扩增时引物是从5’到3’方向延伸的，这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoR Ⅰ和Not Ⅰ识别序列，与基因X两端的酶切位点匹配）。位置及方向如图：。 （3）促进膜融合的化学试剂通常选择PEG（或聚乙二醇，或高Ca2+-高pH）。大肠杆菌细胞壁外层为脂质双分子层膜结构，融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性，说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的细胞壁外层（或外层脂质双分子层膜）。 在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上，酵母菌可进行代谢为大肠杆菌提供维生素B1，大肠杆菌能分泌ATP，为酵母菌提供ATP，表明二者建立了互利共生关系。不能用葡萄糖为碳源筛选融合菌株，原因是葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP，未与大肠杆菌融合的酵母也可存活，二者都能在以葡萄糖为碳源的培养基上都能生长，无法区分出只有二者互利共生才能生长的融合菌株。 例2.（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是 。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是 。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有 ，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有 （至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及 。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是 ，②是 ，③是 ，④是 。 【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ (2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 (3) 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 (4) 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 【分析】1、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成等。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中①是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶1基因序列，④是溶解酶2基因序列。 1．研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因 afp 整合到土壤农杆菌的 Ti 质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。所用农杆菌的 Ti 质粒的结构如图所示，其中 Vir 区的基因活化能促进 T-DNA 的加工和转移，回答下列问题: (1)利用 PCR 可以快速扩增抗冻蛋白基因 afp，PCR 反应需要提供 DNA 模板、引物、脱氧核苷酸和 ，需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中 Mg²⁺的作用是 。 (2)构建含有 afp 基因的 Ti 质粒需要限制酶和 酶。根据图中农杆菌的 Ti 质粒的结构，为提高农杆菌的转化效率，构建重组质粒应选择的限制酶是 。 (3)采用农杆菌转化法能将 afp 基因导入番茄细胞利用了农杆菌的特点是 。 (4)为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有 和 。 【答案】(1) 耐高温的 DNA 聚合酶 激活 DNA 聚合酶 (2) DNA 连接 限制酶Ⅲ (3)农杆菌中的 T-DNA 能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体 DNA 上 (含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的 T-DNA 转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上) (4) PCR 技术 抗原-抗体杂交技术 【分析】基因工程基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR反应需要提供DNA模板、2 种引物、4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中Mg²⁺的作用是激活DNA聚合酶。 （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶和DNA连接酶。构建重组质粒，应选择的限制酶是限制酶Ⅲ，使用限制酶Ⅰ会破坏标记基因（四环素抗性基因），使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区活化基因。 （3）农杆菌的特点是T-DNA能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体DNA上 (含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上)。 （4）为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有通过PCR技术检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了含基因afp的T-DNA，或检测基因afp是否转录出mRNA，利用抗原-抗体杂交技术检测基因afp是否翻译出抗冻蛋白。 2．研究人员将海岛棉中抗草铵膦除草剂基因Bar导入陆地棉中，经培养筛选获得抗草铵膦除草剂的棉花。据图回答下列问题： (1)为了便于质粒和Bar基因连接构建基因表达载体，在利用PCR技术扩增Bar基因时需要设计特定的引物，结合图1分析，左边引物要包括哪些碱基序列 （注明引物的方向）。耐高温的DNA聚合酶从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是 （答出1点）。 (2)图1质粒中TetR基因的作用是 ；利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，一般选择陆地棉的 细胞作为受体细胞，最终得到的转基因棉花不具有抗四环素的特性，原因是 。 (3)为了鉴定转基因棉培育是否成功，可提取转基因棉花的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取到的DNA样品进行检测，在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与 有关（答出2点）；还可以从个体水平进行鉴定，方法是 。 【答案】(1) 5’-GAATTCATGGGC-3’ 3’ 能避免目的基因和载体自身环化（能避免目的基因与载体反向连接） (2) 作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选（答到标记基因即可） 受精卵或体细胞 只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上 (3) 凝胶浓度、分子构象（电场强度） 用草铵膦处理陆地棉，观察其是否能正常生长 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）扩增Bar基因，需要设计2种引物，分别与模板DNA的两条链的3’端进行配对，根据限制酶位点、转录方向和碱基互补配对原则，左边引物应该与EcoR Ⅰ和Bar基因的下面一条链配对，即左边引物为5’-GAATTCATGGGC-3’。耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。与单酶切相比，双酶切构建基因表达载体的优点是防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因反向接入质粒。 （2）图1质粒中TetR基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。一般利用农杆菌转化法将目的基因导入植物的受精卵或体细胞，随后采用植物组织培养技术将转基因植物细胞培育成转基因植株，由于只有T-DNA片段能转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，而TetR基因不在T-DNA片段上，所以最终获得的转基因棉花不含抗四环素基因，不具有抗四环素的特有。 【点睛】在凝胶中DNA分子的迁移速率除与DNA分子的大小有关外，还与凝胶浓度、分子构象、电场强度等有关。由于Bar基因控制性状具有抗草铵膦除草剂的作用，所以可以用抗草铵膦处理陆地棉，观察其是否能正常生长，若能正常生长，则表明转基因棉培育成功。 3．土壤中的污染物RDX具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌的RDX降解酶基因XplA与XplB整合为融合基因，导入柳枝稷草使其根细胞分泌RDX降解酶，以修复污染土壤。图1、2为降解酶基因XplA、XplB及农杆菌转化流程示意图。 回答下列问题： (1)获取XplA与XplB基因。随着测序技术的发展，可通过检索 获取XplA与XplB的相关序列，然后用 法制备得到。 (2)通过融合PCR获得XplB-XplA融合基因。为使两基因能正确融合并表达，引物 和 的 端需包含部分互补序列。同时部分引物还应包含相应的限制酶识别序列。PCR循环步骤中， 步骤的温度需根据引物的碱基组成（GC含量）调整，引物长度一定时，GC含量增加（合理范围内），该步骤温度应 ，其目的是 。 (3)图2中，将融合基因插入Ti质粒T-DNA区后，可通过PCR验证重组质粒是否构建成功，该过程中常采用 技术鉴定PCR产物，再将重组质粒与经 处理的农杆菌混合以实现转化。在添加潮霉素的LB培养基中 （填“能”或“不能”）直接筛选出导入融合基因的农杆菌。 (4)获得融合基因转化成功的目的农杆菌后，对其进行 。再用农杆菌侵染经消毒的柳枝稷草外植体，其Ti质粒上的T-DNA可将融合基因整合到柳枝稷草细胞的 。若经组织培养获得了转基因柳枝稷草，但其根细胞仍不能合成RDX降解酶，从基因表达调控角度分析，可能的原因是 （结合载体具体元件分析）。 【答案】(1) 基因数据库 化学合成 (2) 2 4 5' 退火 升高 提高引物与模板结合的特异性，减少引物与非目标序列结合导致的非特异性扩增 (3) 琼脂糖凝胶电泳 CaCl2 不能 (4) 扩大培养 染色体DNA 柳枝稷草的根细胞中缺乏识别融合基因启动子的RNA聚合酶（该融合基因启动子在柳枝稷草根细胞中活性不足） 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）现代分子生物学中，目的基因的序列可通过基因数据库检索获得，若序列已知，可通过化学合成法直接合成。 （2）构建融合基因需把基因XplA的b链的3'端与基因XplB的a链的5'端相连，理由是DNA两条链反向平行，基因XplA和XplB共用启动子和终止子，且转录时只能以模板链的3'→5'方向为模板进行转录，要使融合基因能正常转录，需将基因XplA的b链的3'端与基因XplB的a链的5'端相连。利用PCR拼接融合基因时，需在引物2和引物4的5'端加入互补序列，这样在PCR过程中，引物2和引物4扩增出的片段就能通过互补序列连接形成融合基因。PCR的复性（退火）步骤温度由引物GC含量决定：GC碱基对含3个氢键，稳定性更高，因此GC含量增加时，复性温度需升高，以提高引物与模板结合的特异性，减少引物与非目标序列结合导致的非特异性扩增。 （3）PCR产物的鉴定常用琼脂糖凝胶电泳（根据片段大小判断是否扩增出目标融合基因）。农杆菌转化需用CaCl2处理，使其细胞膜通透性增加，成为感受态细胞。 潮霉素抗性基因是载体上的标记基因，导入了重组质粒和空质粒的农杆菌均能在添加潮霉素的LB培养基中生长，因此不能直接筛选出导入融合基因的农杆菌。 （4）目的农杆菌需先扩大培养（至对数期），以保证侵染效率。农杆菌Ti质粒的T-DNA可将携带的融合基因整合到受体细胞（柳枝稷草）的染色体DNA上，实现稳定表达。 基因表达需启动子（驱动转录）和终止子（终止转录）等关键元件：若柳枝稷草的根细胞中缺乏识别融合基因启动子的RNA聚合酶（该融合基因启动子在柳枝稷草根细胞中活性不足）则无法启动转录，最终导致根细胞不能合成RDX降解酶。 考向02 基因工程在农业领域的应用 为高频应用考向，结合农业生产实际场景出题。核心考查抗虫、抗病、抗逆（抗盐碱、抗干旱）转基因作物的培育原理，如抗虫棉中 Bt 毒蛋白基因的表达机制、抗除草剂作物的作用靶点；还会涉及转基因作物的优势分析（如减少农药使用）及育种流程的优化，需将基因工程技术与作物育种需求结合。 1、应用方向定位技巧：聚焦农业核心需求，明确三大高频应用方向 —— 抗逆（抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐碱）、改良品质（提高营养含量、改善口感）、提高产量（促进生长、抗倒伏）。解题时先锁定题干需求，对应匹配基因工程技术路径，如抗虫需求优先关联 Bt 毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因。 2、核心操作适配技巧：结合农业应用场景细化操作流程 —— 目的基因选择需针对性（抗虫选 Bt 基因，抗除草剂选 EPSPS 基因）；载体常用农杆菌 Ti 质粒（植物转化首选）；导入方法优先农杆菌转化法（双子叶植物）或基因枪法（单子叶植物）；检测鉴定需兼顾分子水平（抗原 - 抗体杂交验证表达）和田间实验（抗虫性、产量对比）。 3、优势与问题分析逻辑：答题需体现 “技术优势→实际价值”“潜在风险→应对措施”。优势如减少农药使用（抗虫作物）、拓宽种植范围（耐盐碱作物）；风险如基因污染、害虫抗药性，应对措施可提 “合理布局非转基因作物”“多基因叠加导入”。 4、规范答题模板：按 “需求→基因选择→操作流程→应用效果” 表述，例：“为培育抗虫棉花，选择 Bt 毒蛋白基因作为目的基因，与 Ti 质粒构建表达载体，通过农杆菌转化法导入棉花细胞，经筛选鉴定获得转基因植株，其可表达抗虫蛋白，减少农药使用，提高产量”。 例1.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 【答案】(1)mKate2蛋白或荧光 (2) 细菌计数板计数法 作为mKate2蛋白的荧光对照 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。 1．水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1），为环境污染治理提供新方法。请回答下列问题： (1)基因工程中启动子与增强子都与基因转录有关，增强子可增强转录效率。启动子是 ，其位于基因的上游，紧挨 。 (2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活 Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (3)研究人员欲通过改造重组质粒，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度。方法一是选择激活能力更强的调控蛋白基因nahRl替代 nahR：方法二是在 mrfp基因前插入 。 (4)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与 mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的 。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是 。 (5)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB 基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的 、 （填字母）位点。 【答案】(1) RNA聚合酶识别和结合的位点 转录的起始位点 (2)水杨酸-调控蛋白复合物 (3)提高表达效率的DNA序列/增强子/强启动子 (4) 动态检测和清除 引物1和引物3 (5) C B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动子位于转录的起始位点上游，其作用是起始转录。 （2）从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活Ps启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 （3）方法一：基因工程中用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，改造重组质粒，用基因nahRI替代nahR，需要先用限制性核酸内切酶切割质粒和基因，再用 DNA连接酶将基因连接到质粒上。方法二：选择灵敏度更高的启动子替代Ps，在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列，使启动子能更高效地启动下游基因表达，从而提高红色荧光蛋白的表达量，增强荧光强度。 （4）水杨酸是常见的水体污染物，若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。PCR技术要求引物与模板链的 3' 端互补配对，且 DNA 聚合酶从引物的3' 端开始延伸子链。要判定水杨酸羟化酶基因与基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物1 和引物3可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因的 3' 端和mrfp基因的 3' 端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3。 （5）ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后，即图中的C位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdA基因表达抗毒素蛋白；ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，ccdB应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B位点。 2．赖氨酸是人体必需氨基酸之一，但玉米种子中赖氨酸含量较低，影响其营养价值。科学家发现，玉米中赖氨酸的合成受关键酶（天冬氨酸激酶，AK）的反馈抑制：当赖氨酸积累时，AK活性被抑制。通过基因工程改造AK基因，可解除这种抑制，从而提高赖氨酸含量。下图为科学家拟用农杆菌转化法将改造后的AK基因导入玉米细胞的示意图，回答下列问题： (1)天然玉米中，赖氨酸对AK的抑制作用属于 调节，这种调节的意义是 。 (2)为便于筛选，应选择 的农杆菌作为受体细胞。在构建基因表达载体时需将AK基因插入Ti质粒的T-DNA区域，目的是 。 (3)已知AK基因的a链为模板链，则在PCR扩增AK基因时应在图示的3’端添加 的酶切位点，便于AK基因的正确连接和表达。启动子应选择玉米种子特异性启动子，目的是 。为验证AK基因是否成功表达，可采用的检测方法是 。 (4)与传统诱变和杂交育种相比，基因工程培育高赖氨酸玉米的优势是 。 【答案】(1) （负）反馈 避免物质和能量浪费，维持代谢平衡 (2) 对四环素敏感 使目的基因随T-DNA转移至受体细胞并整合到染色体DNA上 (3) Hind 让AK基因在玉米种子中特异性表达 抗原-抗体杂交 (4)定向改造性状，克服远缘杂交障碍，缩短育种周期等 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）分析题意可知，玉米中赖氨酸的合成受关键酶（天冬氨酸激酶，AK）的反馈抑制：当赖氨酸积累时，AK活性被抑制，调节过程的结果与起点相反，故该代谢过程体现负反馈调节，这种调节可避免细胞内物质和能量浪费，维持代谢平衡。 （2）受体菌的选择应结合载体上的标记基因，因此应选择对四环素敏感 （不含四环素抗性基因）的农杆菌；T-DNA是可转移DNA，将AK基因插入Ti质柱的T-DNA区域，目的是T-DNA可转移至受体细胞并整合到染色体DNA上。 （3）为了便于AK基因的正确连接和表达，限制酶应位于启动子和终止子之间，且图示BclI会破坏启动子，故应选择Hind和BamH两种限制酶切割质粒，AK基 因的a链为模板链，其3’端的上游为启动子位置，因此应在PCR扩增AK基因时应在其 3’端添加Hind的酶切位点；选择玉米种子特异性启动子，目的是让AK基因在玉米种子中 特异性表达，从而增加玉米种子中赖氨酸的含量；AK基因最终表达的产物是蛋白质，抗原与抗体的结合具有特异性，故为验证AK基因是否成功表达，可采用的检测方法是抗原-抗体杂交。 （4）与传统诱变和杂交育种相比，基因工程培育高赖氨酸玉米的优势是能定向改造性状，能克服远缘杂交不亲和的障碍，缩短育 种周期等优点。 3．C4植物玉米细胞内存在GOLDEN2（G2）基因和GOLDEN2-LIKE（GLK）基因，它们通过激活位于叶绿体内编码光合作用相关蛋白的基因来调控光合作用。为研究这两种基因在光合作用中的作用，科学家利用构建的过表达G2基因水稻ZmG2、过表达GLK基因水稻ZmGLK1和野生型水稻WT（无GLK和G2基因）作为研究对象，探究了它们在田间生长时相关因素的变化情况，结果如图1所示。请回答下列问题： (1)在叶绿体基质中分布有DNA、RNA以及 （结构），因此叶绿体可以进行DNA的复制和基因的表达。从细胞核基因控制的角度分析，叶绿体是 （填“完全”或“不完全”）自主性细胞器。 (2)结合图甲和图乙所示结果，转基因水稻相较于野生型水稻产量 （填“增加”或“减少），原因是G2基因和GLK基因 。 (3)当植物光合结构吸收的光能超过光合作用所能利用的量时，过剩的光能会引起光能转化效率的下降，这种现象即光抑制。为探究光抑制对ZmGLK1和ZmC2的影响，科学家测定了高光照处理后光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学效率（Fv/Fm,即植物的最大光能转化效率）和热耗散（NPQ,即光能以热能形式散失）变化，如图2ⅰ和图ⅱ。 根据实验结果可知，转基因水稻ZmGLK1和ZmG2的光抑制强度 （填“高于”或“低于”）野生型水稻，结合图示分析出现该现象的机制是 。 【答案】(1) 核糖体 不完全 (2) 增加 激活了编码光合作用相关蛋白的基因，促使它们表达出相应的蛋白质，促进光合色素的合成和气孔导度的增大，从而促进光合作用速率，使水稻产量更高 (3) 低于 高光照条件下，转基因植物通过提高热耗散，将更多过剩的光能转化为热能散失掉，减小过剩的光能对光能转化效率的抑制，使光抑制强度下降 【分析】光合作用包括光反应和暗反应两个阶段。光反应发生场所在叶绿体的类囊体薄膜上，色素吸收光照，吸收光能、传递光能，并将一部分光能用于水的光解生成NADPH和氧气，另一部分光能用于合成ATP；暗反应发生场所是叶绿体基质中，首先发生二氧化碳的固定，即二氧化碳和五碳化合物结合形成两分子的三碳化合物，三碳化合物利用光反应产生的NADPH和ATP被还原。 【详解】（1）叶绿体基质中含有DNA、RNA和核糖体，使叶绿体能独立进行部分遗传信息的表达和蛋白质合成，但其基因表达会受到细胞核基因调控，故称为不完全自主性细胞器。 （2）结合题意和图示可知转基因水稻含有的G2基因和GLK基因通过激活位于叶绿体内编码光合作用相关蛋白的基因来调控光合作用，故过表达G2基因水稻ZmG2、过表达GLK基因水稻ZmGLK1激活相关蛋白的基因，使相关基因表达的蛋白质促进转基因水稻合成更多光合色素和增大气孔导度，有利于提高光反应速率和吸收二氧化碳，增大光合作用强度，水稻产量提高。 （3）由图i可知，转基因水稻ZmGLK1和ZmG2的Fv/Fm更高，即植物的最大光能转化效率高，光抑制弱，又由图ii可知，转基水稻ZmGLK1和ZmG2的NPQ更高，推测转基因植物通过提高热耗散，将更多过剩的光能转化为热能散失掉，减小过剩的光能对光能转化效率的抑制，使光抑制强度下降。 考向03 基因工程在医药与医学领域的应用 侧重技术的医用价值，考查基因工程药物（如胰岛素、干扰素）的生产流程，即目的基因在工程菌中的高效表达条件；同时涵盖基因治疗的两种策略（体内基因治疗、体外基因治疗），以及针对遗传病、肿瘤等疾病的治疗原理，需区分基因工程药物生产与基因治疗的本质差异。 1、应用方向定位技巧：聚焦医学核心需求，明确三大高频方向 —— 药物生产（重组蛋白类药物）、基因治疗（遗传病 / 肿瘤）、诊断技术（分子探针）。解题时先锁定题干场景，如 “生产胰岛素” 对应重组药物，“治疗镰状细胞贫血” 对应基因治疗，精准匹配技术路径。 2、核心技术适配技巧：按应用场景细化操作 —— 药物生产需选择高效表达载体（如大肠杆菌、酵母菌），目的基因多为功能蛋白基因（胰岛素、干扰素基因）；基因治疗分体外（提取细胞修饰后回输）和体内（直接导入治疗基因）途径，常用病毒载体（如逆转录病毒、腺病毒）；诊断技术依赖 DNA 分子杂交、PCR 扩增等技术，实现病原体或基因突变检测。 3、关键逻辑分析技巧：答题需体现 “技术原理→临床价值”“风险防控”。如重组药物生产逻辑：目的基因克隆→构建表达载体→导入工程菌→表达纯化→药物制剂；基因治疗需强调 “靶向性” 和 “安全性”，避免载体引发免疫反应。 4、规范答题模板：按 “需求→技术路径→核心操作→应用效果” 表述，例：“为生产重组人胰岛素，先克隆人胰岛素基因，与大肠杆菌表达载体构建重组质粒，导入工程菌后诱导表达，经纯化获得药物，可精准调节血糖，治疗糖尿病”。 例1.（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。 (2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。 【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制 (2) 2 验证重组质粒是否构建成功 (3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻 (4) 目的基因发生突变或变异 发酵条件优化 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。 （2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。 （3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 例2.（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 1．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。 (1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是 。 (2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时需要添加限制酶的识别序列。根据图中限制酶识别及切割位点等信息，设计出适合目的基因上游引物,该引物的第1、9、15位的碱基分别是 。 (3)为获得更多的目的基因，需利用PCR技术进行扩增，引物与DNA结合发生在 阶段，PCR第四次循环需要消耗 对引物。 (4)质粒中复制原点应使用大肠杆菌的复制原点的原因是 (5)采用 法将重组质粒导入大肠杆菌。 【答案】(1)密码子具有简并性 (2)C    G    C (3) 复性阶段 8 (4)保证目的基因能在大肠杆菌细胞中正常复制 (5)Ca2+ 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术；因为DNA合成时，新链的延伸方向是5’→3’，因此，在设计PCR引物时需要在5’端加上酶切位点。 【详解】（1）结合题干“AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段”，而一种氨基酸可能对应一种或多种密码子，即密码子具有简并性，导致AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。 （2）分析图2可知：EcoRⅠ限制酶会破坏标记基因，不可用，SalⅠ和NheI限制酶会破坏目的基因，不可用，故选用XhoⅠ和MunⅠ限制酶切割质粒和目的基因，由目的基因的转录方向可知，上游引物的碱基序列为5'-ATGCCAATC-3'，由于需要在引物5'端加上XhoⅠ限制酶识别序列CTCGAG，故上游引物最终碱基序列为5'-CTCGAGATGCCAATC-3'，因此上游引物第1、9、15位的碱基分别为C、G、C。 （3）PCR技术基本步骤为变性（高温使得DNA双链间的氢键断裂、解旋）→复性（降低温度，2种引物分别与2条DNA模板结合）→延伸（在耐高温DNA聚合酶的作用下进行子链的延伸），故引物与DNA结合发生在复性阶段；PCR第四次循环是在第三次循环的基础上进行的，经过第三次循环之后，产生的DNA分子为8个，以这8个DNA分子为模板（共16条链）进行复制，需要消耗16个引物，即第四次循环需要消耗8对引物。 （4）结合题干，目的基因导入的受体细胞是大肠杆菌，故质粒中复制原点应使用大肠杆菌的复制原点的原因是保证目的基因能在大肠杆菌细胞中正常复制。 （5）大肠杆菌为微生物，采用Ca2+法将重组质粒导入大肠杆菌，利用Ca2+处理大肠杆菌后，使其处于一种能从周围环境吸收DNA分子的状态。 2．科学家设想将HIV的壳体蛋白（CA）基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内，利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗，以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如下图所示。回答下列问题∶ (1)①过程为 ，进行①过程操作的目的是 。为获得大量图中的DNA片段（目的基因），科学家需要根据 设计引物。若有a条起始的RNA片段，经过图中的①过程，再进行PCR循环30次，理论上PCR过程需要引物 （用算式表示）个。 (2)选用Ti质粒作为HIV壳体蛋白（CA）基因的载体，优点是∶ 。 (3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制性内切核酸酶是 ，不选用其他两种限制酶的原因是 。 (4)为了筛选出含重组载体的农杆菌，在选择培养基上添加氨苄青霉素，一段时间后，培养基上形成的菌落 （填“一定”或“不一定”）含有重组载体，原因是 。是否成功培育出转基因植株需从 与个体水平上对转基因植株进行检测与鉴定。 【答案】(1) 逆转录 将单链RNA逆转录为双链DNA，获得CA基因的DNA片段以便与Ti质粒连接成重组载体 目的基因DNA片段上游和下游的部分核苷酸序列 a×（231-2） (2)Ti质粒的T-DNA能将目的基因转移并整合到侵染植物细胞的染色体DNA上 (3) Pat I和BamH I EcoR I会破坏目的基因，Not I的切割位点不在T-DNA中 (4) 不一定 空载体和重组载体均含有氨苄青霉素抗性基因 分子水平（PCR技术检测目的植株是否含有目的基因，或者检测目的基因是否转录；还可以通过抗原-抗体杂交检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质） 【分析】1、利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测。 【详解】（1）从图中可以看出，①过程是从RNA合成DNA的过程，这一过程为逆转录，进行①过程操作的目的是将单链RNA逆转录为双链DNA，获得CA基因的DNA片段以便与Ti质粒连接成重组载体。PCR技术扩增目的基因时，需要根据目的基因DNA片段上游和下游的部分核苷酸序列来设计引物。因为引物要与模板链特定区域互补配对，这样才能引导DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，从而扩增出目的基因。PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则。一个DNA分子经过n次循环后，得到2n个DNA分子。起始有a条RNA片段，逆转录得到a条cDNA，相当于起始有a个DNA模板。 1个DNA分子经过30次PCR循环后，得到的DNA分子总数为230个，而最初的DNA模板有a个，所以总共形成的DNA分子数是a×230个。多数DNA分子需要2条引物，但是刚开始的模板链不需要连接引物，因此理论上PCR过程需要引物a×（231-2） 个。 （2）选用Ti质粒作为HIV壳体蛋白（CA）基因的载体，优点是Ti质粒的T-DNA能将目的基因转移并整合到侵染植物细胞的染色体DNA上。 （3）因为EcoR I会破坏目的基因，Not I的切割位点不在T-DNA中，所以选用Pat I和BamH I切割CA-DNA和Ti质粒。 （4）由于空载体和重组载体均含有氨苄青霉素抗性基因，故在选择培养基上添加氨苄青霉素，一段时间后，培养基上形成的菌落不一定含有重组载体。目的基因的检测包括分子水平和个体水平检测，是否成功培育出转基因植株需从分子水平（PCR技术检测目的植株是否含有目的基因，或者检测目的基因是否转录，还可以通过抗原-抗体杂交检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质）与个体水平上对转基因植株进行检测与鉴定。 3．人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的胰岛素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰岛素，如图1所示。科学家据此提出了利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。 (1)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列的原因是 。BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，再由mRNA （填过程）得到胰岛素基因。 (2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 （选填编号）的识别序列。 ①MunI  ②XhoI  ③EcoRI  ④SalI  ⑤NheI (3)实践操作中，通过添加保护碱基序列GGG可以延长限制酶识别序列一端的碱基数，从而提高限制酶识别及切割的效率。根据上述信息，设计出适合作为目的基因上游引物的序列5′— -3'（写出18个碱基） (4)采用 法将重组质粒导入大肠杆菌。β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质，筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，应在培养基中加入 ，应选择培养基上 （填“蓝色”或“白色”）的菌落。 【答案】(1) 1种氨基酸可能对应1种或多种密码子（密码子具有简并性） 逆转录 (2)①② (3)GGGCTCGAGATGCCAATC (4) Ca2+处理 氨苄青霉素和X-gal 白色 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 【详解】（1）AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，由于密码子具有简并性，即1种氨基酸可能对应1种或多种密码子，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种序列。BCA法中mRNA为模板合成DNA的过程称为逆转录。 （2）由图可知，对于目的基因，SalI和NheI的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoI、MunI和EcoRI中选择；同时质粒上EcoRI的其中一个作用位点是在标记基因（Amp）上，所以只能选择XhoI和MunI两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoI和MunI的识别序列。 （3）由转录方向可知目的基因左边（上游）应该与启动子相连，添加XhoI识别序列（5'-CTCGAG-3'）；目的基因右边（下游）应该与终止子相连，添加MunI识别序列，且引物的5′端与基因的3端连接。另外，由题干信息可知在限制酶最前端添加GGG可以提高限制酶识别及切割的效率。因此目的基因上游序列为3'-TACGGTTAG-5'，与其互补的上游引物序列为5′-GGGCTCGAGATGCCAATC-3'。 （4）采用Ca2+处理法将重组质粒导入大肠杆菌，Ca2+可以使大肠杆菌变为容易吸收外界物质的感受态。结合图示可知，将目的基因的插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素（Amp为标记基因）和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。 考向04 蛋白质工程的应用 蛋白质工程作为基因工程的延伸，其高考应用类题型围绕 “原理 - 改造 - 应用 - 争议” 的核心逻辑展开考查，聚焦逆向工程本质与实践场景的结合。题型核心先立足基础原理，重点检测 “从预期蛋白质功能出发，设计蛋白质结构、推测氨基酸序列，进而改造基因序列” 的逆向逻辑，同时需区分其与基因工程 “生产天然蛋白质” 的差异，拆解分子设计、基因改造、表达鉴定等关键流程。高频考向集中在医药领域，涉及人源化抗体改造以降低免疫原性、酶类药物（如长效胰岛素）的活性优化、疫苗抗原修饰以增强免疫效果等 “定制化” 应用，凸显临床价值。工农领域则侧重功能蛋白的定向改良，农业中通过改造抗逆蛋白、贮藏蛋白提升作物抗逆性与营养品质，工业上优化纤维素酶、蛋白酶的热稳定性和催化效率以适配生产需求。此外，试题还会考查技术瓶颈与伦理争议，如蛋白质空间结构预测难度、表达折叠障碍，以及医用蛋白的免疫风险、生态影响等，全面检测学生的知识应用与辩证思维能力。 1、应用方向定位技巧：紧扣 “功能优化” 核心需求，明确三大高频方向 —— 改造现有蛋白质（如提高酶的热稳定性、改变抗体亲和力）、合成新型蛋白质（如设计抗菌肽、肿瘤靶向蛋白）、修正异常蛋白（如治疗遗传病的功能蛋白）。解题时先锁定题干功能需求，如 “耐高温蛋白酶” 对应改造酶的结构，精准匹配技术路径。 2、核心改造流程技巧：牢记 “从基因入手” 的本质，流程为 “预期蛋白质功能→设计预期氨基酸序列→推测对应基因序列→改造 / 合成基因→表达验证蛋白质”。关键在于 “基因修饰”，需通过碱基对替换、插入或缺失改变氨基酸序列，进而优化蛋白质结构与功能，避免混淆 “蛋白质直接改造”（不可行）与 “基因层面改造”（核心路径）。 3、场景适配分析逻辑：结合具体应用场景梳理逻辑链 —— 工业领域（改造酶结构提升催化效率、降低成本）、医药领域（设计靶向蛋白药物、优化抗体治疗效果）、农业领域（改良植物蛋白营养、增强抗逆蛋白功能）。答题需体现 “结构决定功能”，如 “替换酶的关键氨基酸残基→改变空间结构→提升热稳定性”。 4、规范答题模板：按 “功能需求→基因改造→蛋白质优化→应用效果” 表述，例：“为获得耐高温淀粉酶，先明确其热稳定功能需求，设计对应的氨基酸序列并推测基因序列，通过定点突变改造淀粉酶基因，导入工程菌表达后验证，最终获得高温下仍具高效催化活性的酶，适用于工业高温发酵场景”。 例1.（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： (1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的 拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是 。 (2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的 （填下图字母）处。理由是 。 (3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为 。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的 中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是 。 【答案】(1) DNA序列 COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化 (2) B B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录 (3) 外植体 染色体DNA 生长素和细胞分裂素 【分析】核心思路：通过 “蛋白质工程” 思路，将决定蛋白质细胞内定位的特定肽链与绿色荧光蛋白（GFP）“嫁接”，利用 GFP 的荧光标记，在显微镜下观察线粒体形态变化。知识融合：蛋白质工程：需通过改造基因（DNA 片段）实现肽链 “嫁接”，利用特定肽链（如 COXⅣ 的肽链序列X）的细胞定位功能，引导 GFP 标记线粒体。基因工程：借助农杆菌转化法，将目的序列插入 Ti 质粒的T - DNA（可转移至植物细胞并整合到染色体 DNA 上）。植物组织培养：涉及外植体（离体的器官、组织或细胞）、目的基因整合位置（番茄细胞的染色体 DNA），以及诱导期所需的植物激素（生长素和细胞分裂素，调控细胞脱分化与再分化）。 【详解】（1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的DNA序列拼接在一起完成 “嫁接”（蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质）。COXⅣ 的一段肽链序列X决定了 COXⅣ 在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP的荧光来观察线粒体的形态变化（利用X的定位功能，使GFP标记线粒体）。 （2）拼接好的序列应插入农杆菌 Ti - DNA 的B处。B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为外植体（外植体是植物组织培养中用于培养的离体器官、组织或细胞）。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色体DNA中（农杆菌的 T - DNA 会整合到植物细胞的染色体 DNA 上）。番茄组织培养过程中，诱导期需在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素（植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化过程，芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化）。 例2.（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 (1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ① ； ②将 分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。 (2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。 (3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是 。 【答案】(1) 克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因 目的基因与载体 氨基酸序列 (2)利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。 (3)树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择 【分析】基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析①为克隆树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白基因。②为将树鼩、其他哺乳动物TR1蛋白基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由(2)中展示的蛋白质之间的差异推测④为检测树鼩和其他哺乳动物TRI蛋白质的氨基酸序列。 （2）树鼩TRI蛋白第579位氨基酸为M，人和小鼠TR1蛋白第579位氨基酸为T，利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升高，则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TRI蛋白第579位氨基酸序列差异造成的。 （3）适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树嗣的食物来源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素类物质的植物。 1．抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，与传统抗生素相比具有无药残、不易产生耐药性等特点，是抗生素理想的替代品，具有广谱抗细菌活性，在医学和饲料企业中具有重要应用价值。研究人员根据抗菌肽A和抗菌肽D的部分氨基酸序列，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。请回答下列问题。 注:K为赖氨酸，A为丙氨酸，M为甲硫氨酸（5’-AUG-3’）， 起始密码子为5’-AUG-3’， 终止密码子为5’-UAA-3’。Leu⁺为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，O为复制原点。 注：Leu+为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁的合成发挥作用；O为复制原点。 (1)由抗菌肽AD的氨基酸序列可推得多种不同序列的AD基因，原因是 。 (2)研究人员在人工合成AD基因后，为了使AD基因与pC穿梭质粒正确连接，设计了引物P1（由12个脱氧核苷酸组成的正向引物，结合在AD基因的上游）和P2（由18个脱氧核苷酸组成的反向引物，结合在AD基因的下游），通过PCR扩增AD基因，然后与pC穿梭质粒连接形成重组质粒。据图推测引物P1的碱基序列为5'- -3'。在P2引物中，除了构建相应限制酶的识别序列外，还构建了2个终止密码子的编码序列，以保证翻译过程的顺利进行，推测引物P2的碱基序列为5'- -3' (3)将构建的重组质粒导入酵母菌后，需要用选择培养基筛选并培养受体菌。从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择培养基应 。 (4)通过上述筛选仍不能确定导入受体菌的是pC穿梭质粒还是含AD基因的重组质粒，可采用 方法（填一种方法）做进一步鉴定。 (5)为提高抗菌肽活性，研究人员拟对其氨基酸序列进行一定的修饰和改造，该项技术需要通过 工程来实现，直接操作的对象是 。 【答案】(1)密码子具有简并性 (2) GGATCCATGAAA GTCGACTTATTACTTAGC (3)不含亮氨酸 (4)PCR扩增AD基因（抗菌肽AD抗菌活性测定、基因测序、抗菌肽AD的抗体检测等） (5) 蛋白质 基因 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品的技术。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）由于密码子具有简并性，所以由抗菌肽AD的氨基酸序列可推得多种不同序列的AD基因的mRNA，进而推得多种不同序列的AD基因。 （2）由于限制酶HindⅢ在质粒上有两个酶切位点，所以不能选择HindⅢ，而应该选择限制酶BamHⅠ和SalⅠ。PCR时，在DNA聚合酶的作用下子链由5'→3'延伸，因此限制酶的识别序列（不与模板链配对）应构建在引物的5'端，要使AD基因与pC穿梭质粒正确连接，引物P1应选择限制酶BamHⅠ，引物P2应选择限制酶SalⅠ，P1应为5'-GGATCCATGAAA-3'，原理如下图。由于终止密码子为UAA，由P2引物中的5'-TTATTA-3'编码，所以P2应为5'-GTCGACTTATTACTTAGC-3'。 （3）用选择培养基筛选并培养含AD基因表达载体的酵母菌时，因为pC穿梭质粒上有Ampr，因此要加入氨苄青霉素；因为Leu+能自主合成亮氨酸，因此培养基应不含亮氨酸。 （4）用不含亮氨酸的选择培养基筛选出的菌落有两类：导入pC穿梭质粒的受体菌，导入含AD基因的重组质粒的受体菌。可采用PCR扩增AD基因（抗菌肽AD抗菌活性测定、基因测序、抗菌肽AD的抗体检测等）方法做进一步鉴定。 （5）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，研究人员拟对其氨基酸序列进行一定的修饰和改造，该项技术需要通过蛋白质工程来实现，直接操作的对象是基因。 2．科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（下图），水杨酸是常见的水体污染物。请回答： (1)获得纯净的大肠杆菌的关键是防止 ，对该工程菌进行扩大培养时所用的液体培养基中是否 （填“是”或“否”）需要添加琼脂成分。若需分离得到大肠杆菌单菌落，可采用 （答2种方法）。 (2)分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活 启动子，最终使菌体发出红色荧光，根据 可判定环境中的水杨酸浓度。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸分解。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdB基因应插入下图中的 位点。 (4)在分子水平上可以采用 技术检测nahR蛋白。科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是 ，诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其 结构并未被破坏。用抗nahR蛋白的单克隆抗体检测nahR蛋白的优点是 。 (5)结果显示转智能工程菌的灵敏性并未达到预期，为提升nahR蛋白的生物活性，科研人员欲通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，诸按正确顺序排列： 。 ①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构 ②推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点 ③采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列 ④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性 【答案】(1) 杂菌污染 否 平板划线法、稀释涂布平板法 (2) Ps（水杨酸诱导） 红色荧光强度 (3)B (4) 抗原-抗体杂交 刺激小鼠免疫系统产生特异性B细胞 抗原 特异性强、灵敏度高 (5)①②③④ 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）纯净培养的关键是避免杂菌污染（无菌操作）；液体培养基无需琼脂（琼脂为固体培养基凝固剂）；单菌落分离常用方法为平板划线法或稀释涂布平板，二者均能分散菌体形成独立菌落。 （2）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可驱动基因的转录，据图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活Ps启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 （3）由题干可知，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后，即图中的D位点，在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdA基因表达抗毒素蛋白，而ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，ccdB应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B位点。 （4）抗原与抗体的结合具有特异性，故在分子水平上可以采用 抗原-抗体杂交技术检测nahR蛋白；特定抗原可诱导机体产生特定的B细胞，进而产生特异性抗体，故制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是刺激小鼠免疫系统产生特异性B细胞；诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其抗原结构未被破坏，故仍可诱导机体的特异性免疫过程；用抗nahR蛋白的单克隆抗体检测nahR蛋白的优点是特异性强、灵敏度高。 （5）蛋白质工程是按照相反的思路进行的，确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→基因中的碱基序列，可以创造自然界不存在的蛋白质，故按正确顺序排列应是：①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构→②推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点→③采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列→④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性。 3．抗菌肽是生物体为了抵抗外来细菌而迅速诱导产生的一系列具有抗菌或杀菌活性的多肽类物质，在医学上具有重要应用价值。研究人员根据天然抗菌肽A和抗菌肽D的部分氨基酸序列，以及酵母菌对密码子的偏好，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，然后利用酵母菌发酵生产活性更高的抗菌肽AD，请回答下列问题： 注:K为赖氨酸，A为丙氨酸，M为甲硫氨酸（5’-AUG-3’）， 起始密码子为5’-AUG-3’， 终止密码子为5’-UAA-3’。Leu⁺为控制亮氨酸合成的基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，O为复制原点。 (1)由抗菌肽AD的氨基酸序列可推出多种不同序列的AD 基因，原因是 。图中丙氨酸A的反密码子为5’- -3’。 (2)研究人员在人工合成AD 基因后，为了使AD基因与pC 穿梭质粒正确连接，设计了引物P1（由12个脱氧核苷酸组成的正向引物，结合在AD基因的上游）和P2 （由18个脱氧核苷酸组成的反向引物，结合在AD基因的下游），通过PCR扩增AD基因，然后与pC穿梭质粒连接形成重组质粒。据图推测引物P1的碱基序列为5’- -3’。在引物P2中，除了构建相应限制酶的识别序列外，还构建了2个终止密码子的编码序列，以保证翻译过程的顺利进行，推测引物P2的碱基序列为：5’- -3’ (3)将AD基因重组质粒导入酵母菌后，需用选择培养基筛选并培养受体菌。从培养基的成分分析，该选择培养基与普通培养基的不同之处是 。 (4)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是 。 【答案】(1) 密码子具有简并性 AGC (2) GGA TCC ATG AAA GTC GAC TTA TTA CTT AGC (3)不含亮氨酸、加入氨苄青霉素 (4)抗菌肽AD由天然抗菌肽A和抗菌肽D改造拼接而成，其氨基酸序列在自然界中并不存在（根据酵母菌对密码子的偏好，人工设计并合成了抗菌肽AD基因，并不影响氨基酸序列，不能作为判断的理由。） 【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品的技术。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）因为密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以由抗菌肽AD的氨基酸序列可推出多种不同序列的AD基因。起始密码子为5’-AUG-3’，可知以图中下链作为转录的模板链，转录的模板链中丙氨酸对应的碱基序列为3'-CGA-5'，故丙氨酸的密码子为5' - GCU - 3'，根据反密码子与密码子碱基互补配对（A - U、C - G）且方向相反，所以丙氨酸A的反密码子为5' - AGC - 3'。 （2）要使AD基因与pC穿梭质粒正确连接，观察质粒上的酶切位点，AD基因上游应构建BamHⅠ的识别序列5' - GGATCC - 3'，引物与DNA链的3'互补配对，由于引物P1是12个脱氧核苷酸组成的正向引物且结合在AD基因的上游，所以引物P1的碱基序列为5' - GGATCCATGAAA - 3'（取前12个碱基5' - GGATCC - 3' ）。AD基因下游应构建SalⅠ的识别序列5' - GTCGAC - 3'，又因为要构建2个终止密码子的编码序列（终止密码子为5' - UAA - 3'，其DNA模板链的编码序列为3' - ATT - 5' ），所以引物P2的碱基序列为5' - GTC GAC TTA TTA CTT AGC - 3' 。   （3） 观察质粒可知，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因Ampr，所以该选择培养基与普通培养基的不同之处是不含亮氨酸、加入氨苄青霉素，这样可以筛选出导入了重组质粒（含有氨苄青霉素抗性基因）的酵母菌。 （4） 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。抗菌肽AD由天然抗菌肽A和抗菌肽D改造拼接而成，其氨基酸序列在自然界中并不存在。本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程。 1．（2025·浙江宁波·一模）玉米作为重要的粮食和饲料作物，在转基因育种中提高其转化效率不仅能降低成本，还能加速新品种的培育进程，更好地满足农业生产的需求。已有研究发现，提高WUS、BBM、GRF、GF等发育调节因子的表达量可有效提高单子叶植物的转化效率。回答下列问题： (1)GRF蛋白是一类调控植物生长发育的关键转录因子，GIF蛋白是其辅助因子。通常将GRF基因与GIF基因组成融合基因，制备过程如图1。为使扩增出的GRF和GIF基因片段在混合后通过引物部分延伸融合，引物 和引物 的碱基序列必须有 （填“相同”或“互补”）片段。 (2)科研人员欲利用上述四种发育调节因子的基因加速玉米的遗传改良，构建了图2所示的三种载体。其中DsRed和NPTⅡ作为 用于筛选转化成功的受体细胞，每个插入单位均需含有 。 (3)将三种载体分别导入玉米胚中。将构建的重组Ti质粒导入经过 处理的农杆菌后，稀释得到一定浓度的农杆菌液。双子叶植物伤口处的细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，但农杆菌一般难以感染单子叶植物。为了提高转化成功率，将玉米萌发种子的胚芽尖端割伤，在伤口处施加 ，然后放入 中浸泡。 (4)将各组玉米胚插入诱导愈伤组织的培养基中，该过程需在 操作完成，以减少空气中微生物的污染。培养一段时间后，将愈伤组织转接到生长素用量与细胞分裂素用量比值 的培养基上，诱导愈伤组织生芽。不同阶段的实验数据如下表所示，由表可知，发育调节因子能大幅度提高转基因玉米的 。 组别 载体 胚（个） 愈伤组织（个） 存活率（%） 带芽的愈伤组织（个） 再生率（%） 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 14.29 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 38.18 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 54.35 26.04 【答案】(1) B C 互补 (2) 标记基因 启动子、终止子 (3) CaCl2/Ca2+ 酚类化合物 农杆菌液 (4) 超净工作台上的酒精灯火焰旁 小于1 再生率和转化效率 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括： （1）目的基因的获取； （2）基因表达载体的构建（核心）； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）为使扩增出的GRF和GIF基因片段在混合后通过引物部分延伸融合，根据引物设计原理，引物需要与模板链的3'端结合，子链沿着5'→3'的方向延伸，结合图1中混合链的组成可知，需要DNA单链B和DNA单链C混合，所以选择引物B和引物C，引物B和引物C的碱基序列必须有互补片段，这样才能在混合后通过引物部分延伸实现融合。 （2）据题干信息“DsRed是红色荧光基因，NPTⅡ是新霉素抗性基因”可知，DsRed和NPTⅡ作为标记基因用于筛选转化成功的受体细胞；插入单位需要包含启动子、目的基因（如WUS、BBM、GRF-GIF等）和终止子，启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录，终止子终止转录，以确保基因在受体细胞中的正确表达。 （3）将构建的重组Ti质粒导入农杆菌时，需经过CaCl2或Ca2+处理，使农杆菌处于感受态，便于吸收重组质粒。由于农杆菌一般难以感染单子叶植物，而双子叶植物伤口处细胞分泌酚类化合物吸引农杆菌，所以将玉米萌发种子的胚芽尖端割伤，在伤口处施加酚类化合物，然后放入农杆菌液中浸泡，利用农杆菌将目的基因导入玉米胚细胞。 （4）将各组玉米胚插入诱导愈伤组织的培养基中，为减少空气中微生物污染，该过程需在超净工作台上的酒精灯火焰旁操作完成。植物组织培养中，生长素用量与细胞分裂素用量比值小于1时，有利于诱导愈伤组织生芽。分析表格数据，与对照载体组相比，使用发育调节因子的组（WUS+BBM组、GRF-GIF组）再生率和转化效率均大幅提高，所以发育调节因子能大幅度提高转基因玉米的再生率和转化效率。 2．（2025·山东聊城·三模）CRISPR/Cas12a系统是由crRNA和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的复合体。crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。下图是CRISPR/Cas12a系统的工作原理示意图。请回答下列问题。 注：PAM是一种短DNA序列，N表示任意碱基。PAM可以帮助Cas12a识别和切割目标DNA序列。“”表示在相应位置剪切DNA。 (1)在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含 种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化 水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断，切割DNA后形成的是 （填“黏性”或“平”）末端。 (2)某科研团队基于CRISPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。他们利用crRNA对应基因序列和PX458质粒（如下图）构建crRNA/Cas12a重组载体，转染至HeLa细胞进行相关研究。 ①为保证crRNA对应的基因序列与PX458质粒正确连接，应在扩增该基因序列的一对引物的5’端分别添加 两种限制酶的识别序列。其中P1的碱基序列为5’ 3’（写出前9个碱基）。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是 。 ②将CrRNA/Cas12a重组载体成功转染至HeL.a细胞。与对照组相比，实验组中KIFCl蛋白表达量、细胞数目的变化如下图所示，由此得出结论是 。判断依据是： 。 【答案】(1) 8/八 磷酸二酯键 黏性 (2) PvitII、EcoRI CAGCTGCTC 实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用 KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖 与对照组相比实验组的KIFC1蛋白表达量明显下降 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定。 【详解】（1） crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域包含了单链DNA和RNA，DNA的基本单位是四种脱氧核苷酸，RNA的基本单位是四种核糖核苷酸，因此结合区域最多含8种核苷酸。Cas12a是一种内切核酸酶，能催化磷酸二酯键水解，切割DNA后形成的是黏性末端。 （2） ①质粒上含有3种限制酶识别序列，若选择KpnI限制酶识别序列，对质粒进行切割时会破坏Cas12a基因，因此应选择PvitII、EcoRI对质粒进行酶切获得黏性末端，保证目的基因准确接入完成转录，应在扩增该基因序列的一对引物的5'端分别添加PvitII、EcoRI两种限制酶的识别序列。扩增目的基因时，引物需要与模板链的3'端结合，按照碱基互补配对原则保证子链从5'向3'延伸，结合图示可知，P1的碱基序列为5′CAGCTGCTC3′。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用。 ②结合实验结果可知，对照组KIFCl蛋白表达量多于实验组，对照组的细胞数量多于实验组，对照组和实验组的差异是KIFC1基因的有无，因此可得出的结论是KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。证明HeLa细胞中KIFC1基因敲除成功的依据是与对照组相比实验组的KIFC1蛋白表达量明显下降。 3．（2025·山东淄博·三模）荧光素酶互补实验可用于研究两种蛋白质的相互作用。荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光。科研人员利用该技术探究植物中的ERF114蛋白能否与MYB8蛋白相互作用，过程如下图。 (1)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两末端有至少15bp的相同序列，这些相同序列通过设计引物、经PCR获得。图1中为保证基因正向连接在质粒上，PCR的引物中应有 种相同的15bp序列，这些序列应构建在相应引物的 （填“5′端”“3′端”）。 (2)以构建重组载体ERF114-Nluc为例，将PCR获得的ERF114、NLuc及线性化质粒混合并加入三种酶，50℃条件下共同孵育1h可完成连接，原理见图2。图中过程③和过程④分别加入的酶是 、 。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术的优点是 （答出1点即可）。 (3)将构建正确的ERF114-Nluc、MYB8-CLuc、NLuc、CLuc、T-NLuc及p53-CLuc等6种重组载体分别导入农杆菌，将不同农杆菌组合注射到烟草叶片中，24h后将荧光素底物喷洒到叶片上，结果如图3。若ERF114能与MYB8相互作用，则 （填图中数字）区域会发出荧光。该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是 。 【答案】(1) 3/三 5′端 (2) （耐高温的）DNA聚合酶 DNA连接酶 无需限制酶（避免酶切位点的引入）；仅需一次反应就可实现多个基因与载体的连接 (3) 1、2 NLuc+CLuc 【分析】PCR技术： (1) 概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 (2) 原理：DNA双链复制。 (3) 前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一-对引物。 (4) 条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 (5) 过程：高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开) ；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。 【详解】（1）为保证线性化质粒和ERF114及NLuc连接在一起，则需要引物②和引物⑤的15bp序列相同，引物①和引物③的15bp序列相同，引物④和引物⑥的15bp序列相同，且保证基因正向连接在质粒上，说明三种序列不同，即PCR的引物中应有3种相同的15bp序列。PCR子链延伸时，游离的脱氧核苷酸添加到引物的3′端，故这些序列应构建在相应引物的5′端。 （2）由图可知，过程③是PCR延伸子链，需要（耐高温的）DNA聚合酶，过程④将DNA片段拼接到一起，需要DNA连接酶。与传统克隆技术相比，Gibson无缝克隆技术无需限制酶（避免酶切位点的引入）；仅需一次反应就可实现多个基因与载体的连接。 （3）由题干信息“荧光素酶蛋白被切成N端（NLuc）和C端（CLuc）两个功能片段，将待检测的两个蛋白分别与NLuc和CLuc融合，当两个蛋白有相互作用时，NLuc和CLuc在空间上才能靠近并正确组装，发挥荧光素酶活性，分解荧光素底物并产生荧光”可知，1、2区域载体的蛋白质基因两侧含有N端（NLuc）和C端（CLuc）相关基因，可产生NLuc和CLuc，发挥荧光素酶活性，故1、2区域会发出荧光。根据单一变量原则，该实验还需要增加的一组对照，该对照中的混合重组载体是NLuc+CLuc。 4．（2025·江苏南京·二模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在 酶的作用下先合cDNA。选择cDNA而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是 。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是 。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是 ，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加 限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有 （答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品 最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是 。 (4)将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为 ，检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为 。天然的干扰素在体外保存相当困难，为了生产出耐储存干扰素，科学家可通过蛋白质工程对干扰素进行改造，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→ → →找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。 【答案】(1) 逆转录 受体细胞大肠杆菌无法对转录产生的mRNA进行加工（大肠杆菌无法切除内含子的转录序列） 引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成 (2) ②④ EcoRI、XhoI 模板；4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液 (3) 2 EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段 (4) 用Ca2+处理 抗原-抗体杂交 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要经过RNA变成相应的DNA逆转录过程，需要逆转录酶的作用下先合cDNA。选择cDNA（不含内含子）而不是提取DNA后进行PCR获取干扰素蛋白基因的原因是：受体细胞大肠杆菌无法对转录产生的mRNA进行加工（大肠杆菌无法切除内含子的转录序列）。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，指导新生的多肽链和核糖体与内质网膜结合，使蛋白质的合成和加工在粗面内质网上进行，所以其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成。 （2）为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是②④，其他引物会导致含信号肽序列的干扰素基因的合成；为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上，需要在目的基因两端添加可以与质粒酶切位点互补的限制酶识别序列，结合图2可知，Hind Ⅲ会破坏启动子、Pst I会破坏终止子、Sau 3A I也会破坏启动子（Hind Ⅲ的识别序列中含有Sau 3A I的识别序列），因此，为了保证目的基因的正向连接及防止目的基因及质粒自连，通常需要选择两种酶，因此需要在目的基因的两端添加EcoRI、XhoI限制酶的序列；PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有相应的模板，原料是4种游离的脱氧核苷酸（dNTP），耐高温的DNA聚合酶，含Mg2+缓冲液。 （3） 为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，因为一个切割位点只会将环状的质粒切割成一条线性的DNA，有两个切割位点才能切成2条片段，根据题图分析EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp（486bp）和5800bp的两个片段，所以样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 （4） 将重组pET32a质粒导入大肠杆菌的方法为用Ca2+处理，使大肠杆菌处于感受态，增大细胞膜的通透性；检测大肠杆菌是否能成功表达干扰素蛋白的方法为抗原-抗体杂交；蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，具体流程是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→使用工程菌获得耐储存的干扰素。 5．（2025·江西九江·三模）黄瓜花叶病毒是寄主范围最多的植物病毒之一，对多种重要经济作物的生存造成威胁。研究发现，由该病毒C基因表达出的C蛋白是病毒合成和释放的关键成分，将C基因敲除后，单株烟草病毒侵染性大大降低。为提高烟草等经济作物产量，科研人员利用PCR技术大量扩增出C基因，并将C基因导入Ti质粒中，通过农杆菌转化法获得能表达C基因反义RNA（能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链）的转基因抗病毒烟草。回答以下问题。 注：图1中a~e表示不同的引物；图2为Ti质粒，T-DNA的左、右边界见图，其中EcoRI和XhoI是两种限制酶且切割后形成的黏性末端不互补。 (1)一般来说，设计的引物序列越短，其特异性越 （填“强”或“弱”）。据图可知扩增完整的C基因，应选择图1中的引物 。若任意使用图1中涉及的所有引物，通过PCR技术可扩增出 种等长的DNA片段。 (2)该实验利用反义RNA介导基因沉默，主要抑制病毒C基因表达中的 过程。结合图2，为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，应在左侧引物的5’端设计添加 酶切位点。 (3)重组质粒构建完成后需进行琼脂糖凝胶电泳实验验证，为保证电泳结果的准确性，对该环状质粒电泳时需分为无酶切组和单酶切组，结果发现无酶切组的电泳速率慢于酶切组，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其 有关。 (4)为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，还需进行个体水平检测，请简述实验思路 。 【答案】(1) 弱 c、d 4 (2) 翻译 EcoRI (3)大小与构象 (4)用等量且适量的病毒分别接种（或感染）长势相同的野生型烟草和转基因抗病毒烟草，适宜且相同条件下培养一段时间后，观察并比较二者的生长状况 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导人其中； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测有①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）一般来说，设计的引物序列越长，其特异性越强；引物越短，特异性越弱。人工合成如图1所示的DNA片段，为了扩增C基因，扩增时子链的延伸必须从引物的5‘’到3′端，且引物与模板链方向相反，因此该过程中利用的引物组合为引物c和d进行PCR扩增。图1中有a、b、c、d、e三种引物，若任意使用这些引物，可形成10种组合，其中aa、bb、cc、dd扩增出的DNA片段等长（因为它们分别是从同一端开始扩增相同的模板区域），所以通过PCR技术可扩增出4种等长的DNA片段。 （2）反义RNA能与病毒C基因转录形成的mRNA结合形成双链，从而阻止mRNA与核糖体结合，抑制了翻译过程。为确保C基因按照实验要求的方式正确连接在Ti质粒上，根据图2中T-DNA的左、右边界以及EcoRI和XhoI两种限制酶的位置，且EcoRI和XhoI切割后形成的黏性末端不互补，为了使C基因正确插入T-DNA中，应在左侧引物的5'端设计添加EcoRI酶切位点。 （3）无酶切组的环状质粒和酶切组的线性化质粒相比，无酶切组的电泳速率慢于酶切组，这是因为环状质粒和线性化质粒的大小和构象不同，由此可知电泳时DNA分子的迁移速率与其大小和构象有关。 （4）为进一步验证转基因抗病毒烟草的抗病毒效果，进行个体水平检测的实验思路为：分别用等量且适量的病毒分别接种（或感染）长势相同的野生型烟草和转基因抗病毒烟草，适宜且相同条件下培养一段时间后，观察并比较二者的生长状况。 6．（2025·河南·三模）抗菌肽是生物体免疫系统自身分泌的一种可以有效抵御外来病原体侵害的肽类化学物质。抗菌肽TLN-58是存在于人皮肤病变小泡中的多肽，抗菌肽hLYZ是人体免疫防御机制的组成部分。科研人员将基因TLN-58和基因hLYZ进行融合（图1），构建重组载体（图2），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ。回答下列问题： (1)为使基因TLN-58和基因hLYZ融合，需要先设计引物，通过PCR技术在引物R2的 （填“3′端”或“5′端”）添加一段核苷酸序列，从而使两个基因能够融合成一个基因。利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入 作为合成DNA子链的原料，该过程需要的酶是 。 (2)要使融合基因按图示方向插入到质粒中，应在引物 （填“F1”“F2”“R1”或“R2”）的5′端添加限制酶EcoRⅠ的识别序列。构建基因表达载体时，一般采用双酶切法，而不用单酶切法，优点是 （答出2点）。 (3)为验证杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ对金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性（高于单一抗菌肽），科研人员做了如下实验，请完善实验步骤。 ①将适宜浓度的金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布到平板上； ②用经灭菌的镊子分别将浸过等量且适量无菌水（A组）、抗菌肽TLN-58（B组）、抗菌肽hLYZ（C组）、 （D组）的圆形滤纸片沥干后置于上述平板上； ③将培养基置于适宜条件下培养一段时间； ④测量并比较 。 预期结果及结论： 。 【答案】(1) 5′端 4种游离的脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶） (2) R1 防止目的基因及质粒自身环化并保证目的基因与质粒正确连接（或并防止目的基因和质粒反向连接） (3) 抗菌肽TLN-58-hLYZ 滤纸片周围抑菌圈（或透明圈）的直径 D组抑菌圈的直径大于B、C两组的，A组几乎没有抑菌圈，说明杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ对金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）若需要在引物上添加特殊序列，则应该在其5′端进行添加。利用PCR技术扩增DNA时，应以4种游离的脱氧核苷酸为原料，需要Taq酶催化DNA链的合成。 （2）由图2可知，限制酶EcoRⅠ的识别序列应该加在TLN-58基因一侧，再结合图1可知，应在R1添加限制酶EcoRⅠ的识别序列。构建基因表达载体时，一般采用双酶切法，其优点是防止目的基因及质粒自身环化并保证目的基因与质粒正确连接。 （3）步骤②应该分别用无菌水（A组）、抗菌肽TLN-58（B组）、抗菌肽hLYZ（C组）、抗菌肽TLN-58-hLYZ（D组）处理金黄色葡萄球菌。步骤④应该是比较各组滤纸片周围抑菌圈（或透明圈）的直径。 预期结果及结论：D组抑菌圈的直径大于B、C两组的，A组几乎没有抑菌圈，说明杂合抗菌肽TLN-58-hLYZ对金黄色葡萄球菌具有较高抗菌活性。 7．（2025·北京海淀·二模）发酵工程离不开微生物培养，为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时。 (1)发酵工程一般包括菌种的选育、 、培养基的配制、灭菌、接种、发酵产品的分离、提纯等方面。其中 是发酵工程的中心环节。 (2)PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。 ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，M蛋白 ，PE表达的产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理 。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测 和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 (3)在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pc，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中c蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ① ② 高浓度葡萄糖 ③ ④ 【答案】(1) 扩大培养 发酵罐内的发酵 (2) 脱离启动子P 存在葡萄糖时，葡萄糖进入细胞使M蛋白脱离启动子P，PE基因表达，产生荧光；无葡萄糖时，M蛋白结合启动子P，PE基因不表达，无荧光 葡萄糖摄取量 (3) ①+ ②- ③- ④- 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）发酵工程一般包括菌种的选育、扩大培养、培养基的配制、灭菌、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，其中发酵罐内的发酵是发酵工程的中心环节 （2）①推测M蛋白的作用：当存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，此时M蛋白与启动子P脱离。这是因为葡萄糖的代谢产物可能改变了M蛋白的构象或磷酸化状态，使其失去对启动子的亲和力，从而解除对PE基因和GFP基因的转录抑制。 ②生物传感器的工作原理：无葡萄糖时M蛋白结合在启动子P上，抑制PE基因和GFP基因的转录，因此细胞不产生GFP，无荧光信号。有葡萄糖时葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，导致M蛋白脱离启动子P。此时，启动子P启动PE基因和GFP基因的转录，PE酶使E蛋白重新磷酸化以维持葡萄糖摄取，同时GFP表达产生荧光。荧光强度与葡萄糖摄取量正相关，从而实现对葡萄糖摄取状态的监测。 ③验证生物传感器可靠性的检测指标：在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测葡萄糖消耗量和荧光强度。若二者呈正相关，则证明荧光信号可可靠反映葡萄糖摄取量。 （3）调控机制解释：低浓度葡萄糖时C蛋白仍能结合Pc（+），启动子Pc被激活；同时，葡萄糖的存在使M蛋白脱离启动子（-），PE基因和GFP基因高效表达，促进葡萄糖摄取。高浓度葡萄糖抑制C蛋白与Pc的结合（-），启动子Pc活性降低；同时，M蛋白仍保持脱离状态（-），但由于Pc失活，PE基因和GFP基因表达量下降，从而减少葡萄糖摄取，避免浪费。这种双调控机制使生物传感器能根据葡萄糖浓度动态调整基因表达，优化目标产物的生产过程。 8．（2025·辽宁沈阳·三模）大豆脂肪氧化酶（LOX）在食品加工等方面有重要作用。下图表示建立LOX基因原核表达体系生产LOX的过程。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，T7启动子可被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）激活。回答下列问题。 (1)①RT-PCR（逆转录PCR）获得LOX基因（cDNA）的过程需要 的催化。为了便于基因表达载体的构建，引物F1和R1分别为 。 A．5′-GGTACCGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′ B．5′-CTCGAGAAAGCCAAACATGAAAGC-3′ C．5′-GGTACCAAAGCCAAACATGAAAGC-3′ D．5′-CTCGAGGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′ (2)图中代表基因工程核心步骤的是 （填序号）。③过程需用 处理大肠杆菌，以利于重组质粒的转化。仅利用含氨苄青霉素的培养基无法区分含有 的大肠杆菌，因此还需利用PCR等技术在 水平上对大肠杆菌进行检测与筛选。筛选后的大肠杆菌用于生产时，除营养物质外，培养基中还需添加 。 (3)已知天然的LOX具有使β-胡萝卜素漂白褪色的特性。简要叙述利用以上过程生产的LOX进行活性鉴定的实验设计思路： 。 【答案】(1) 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 AB (2) ② Ca2+ 重组质粒和空质粒 分子 IPTG (3)将等量的从大肠杆菌中分离得到的LOX和从大豆中提取的LOX分别加入到适量的β-胡萝卜素溶液中，在相同环境下反应相同时间，观察β-胡萝卜素溶液的褪色情况 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）①在RT−PCR（逆转录PCR）过程中，需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶的催化，将mRNA逆转录成cDNA。根据题图中LOX基因序列、转录方向及表达载体结构可知，为了便于基因表达载体的构建，引物F1和R1应分别包含Kpn I和Aval酶切位点，因此引物F1为‌5′-GGTACCGTAGTGTTGGTGGGTTGG-3′，引物R1为5′-CTCGAGAAAGCCAAACATGAAAGC-3′，故引物F1和R1应分别为A和B。 （2）图中代表基因工程核心步骤的是②，即基因表达载体的构建。这一步是基因工程的关键，它涉及到将目的基因（LOX基因）与载体（如质粒）连接起来，形成重组质粒，以便于在大肠杆菌中表达目的基因。③过程是将重组质粒转化到大肠杆菌中，使其能够在大肠杆菌中复制并表达目的基因。为了利于重组质粒的转化，需要用Ca2+处理大肠杆菌，以利于重组质粒的转化。仅利用含氨苄青霉素的培养基无法区分含有目的基因（LOX基因）和空载体（只含有氨苄青霉素抗性基因，但没有目的基因）的大肠杆菌。因为这两种大肠杆菌都能在含氨苄青霉素的培养基上生长。因此，还需利用PCR等技术在分子水平上对大肠杆菌进行检测与筛选，以确定哪些大肠杆菌含有目的基因。筛选后的大肠杆菌用于生产时，除营养物质外，培养基中还需添加IPTG（异丙基-β−D-硫代半乳糖苷）。IPTG可以激活T7启动子，从而启动目的基因（LOX基因）的表达。 （3）要对利用基因工程生产的LOX进行活性鉴定，因此需要通过与天然的LOX进行对比来确定其活性，因为天然的LOX具有使β−胡萝卜素漂白褪色的特性，所以可以通过这一特性来鉴定生产的LOX是否具有活性。所以实验设计思路为：将等量的从大肠杆菌中分离得到的LOX和从大豆中提取的LOX分别加入到适量的β-胡萝卜素溶液中，在相同环境下反应相同时间，观察β-胡萝卜素溶液的褪色情况。如果β−胡萝卜素发生漂白褪色，则说明生产的LOX具有活性；如果β−胡萝卜素没有发生漂白褪色，则说明生产的LOX没有活性或活性很低。 9．（2025·四川乐山·三模）我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B及质粒的限制酶切割位点如图所示。 (1)将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有 （填图中限制酶）和DNA连接酶。将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是 。 (2)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用了他们独创的一种方法 ，将目的基因导入番茄细胞。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。 (3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到 ，并且将其整合到 上。 (4)抗虫基因A导入番茄细胞后，若要检测抗虫基因A是否插入番茄染色体中，需要从番茄细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。 (5)若要通过实验检测抗虫基因A在番茄细胞中是否表达为抗虫蛋白，请简要写出实验思路 。 【答案】(1) NdeI、XbaI BamHI (2)花粉管通道法 (3) 被侵染的细胞 该细胞的染色体DNA (4) 核染色体DNA 被标记的抗虫基因A的单链DNA片段 (5)取转基因番茄叶片细胞提取蛋白质，用抗虫蛋白A的抗体进行抗原—抗体杂交。若出现特异性杂交带，则表明抗虫基因A成功表达 【分析】1、基因工程的一般操作步骤有：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达；其中获取的目的基因常用PCR技术进行扩增；基因工程的工具酶有限制酶和DNA连接酶，通常要用同一种限制酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，然后再用DNA连接酶连接成重组质粒。 2、PCR技术：概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链．PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）利用同一种限制酶切割质粒和目的基因产生的黏性末端相同，这样容易导致质粒和目的基因自身环化。据图可知，抗虫基因A的两端含有限制酶Nde I和Xba I识别位点，质粒中也有这两种酶的识别位点，因此将抗虫基因A和质粒连接的过程需要用到的酶有Nde I和Xba I分别切割目的基因，然后用DNA连接酶连接起来。抗冻基因B的两端和质粒中都存在限制酶BamH I识别位点，因此将抗虫基因A与质粒连接后，再将抗冻基因B连接到重组质粒上所用的限制酶是BamH I。 （2）构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，我国科学家独创的转基因操作方法是花粉管通道法。 （3）当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到被侵染的细胞（受体细胞），并且将其整合到受体细胞的染色体DNA上。 （4）若要检测目的基因是否插入染色体中，提取番茄细胞中核染色体DNA进行DNA分子杂交。基因探针是一段被标记的抗虫基因A的单链DNA片段，能与目的基因进行碱基互补配对。 （5）由于抗原与抗体的结合具有特异性，故若要通过实验检测目的基因在受体细胞中是否表达出相应蛋白质，即可以以转基因番茄叶片细胞为材料提取蛋白质，用抗虫蛋白A的抗体进行抗原—抗体杂交；若出现杂交带，则证明表达出相应蛋白质。 10．（2025·湖南常德·三模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了AmyS2基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1所示。最终结果表明，与导入质粒B相比，导入质粒C的芽孢杆菌的培养液中更易获得并提纯AmyS2.回答下列问题： (1)科研人员利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的 →人工合成AmyS2基因的 序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2. (2)根据图2分析，利用PCR技术扩增AmyS2基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 。若将该基因扩增过程中至少经过 次循环，可获得32个符合要求的目的基因。 (3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B，应选择的限制酶是 ；将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是 。在工业生产中，使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质，据此推测，信号肽的功能可能是 。 (4)芽孢杆菌细胞内的bp基因会表达出一种胞外蛋白酶，导致胞外α淀粉酶被降解。科研人员利用基因编辑技术敲除芽孢杆菌的bp基因，构建能高效表达α淀粉酶的工程菌。利用PCR技术可以检测bp基因是否被成功敲除，请简述实验设计思路： 。 【答案】(1) 氨基酸序列 脱氧核苷酸 (2) 乙、丙 6 (3) Nde I和EcoRI MluI和 Eco52I 引导目标蛋白质分泌到细胞外 (4)提取工程菌的DNA，加入根据bp基因的一段已知序列设计的引物进行PCR扩增，检测是否有扩增产物 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 【详解】（1）蛋白质工程模板是根据人们对蛋白质功能的特殊要求，对蛋白质的结构进行分子设计，最终通过基因完成，故基本流程是：预期蛋白质功能→蛋白质分子结构设计→推测氨基酸系列多肽链→据核苷酸序列推出脱氧核苷酸序列→DNA合成。本实验利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的氨基酸序列→人工合成AmyS2基因的脱氧核苷酸序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2； （2）PCR扩增目的基因时，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸子链。据图分析可知，扩增AmyS2基因时，应选择引物乙、丙；设至少经过n次循环可获得32个符合要求的目的基因。PCR扩增时，1个DNA分子经过n次循环后得到2n个DNA分子。由于第一次循环得到的2个DNA分子只有1条链是新合成的（含引物），从第二次循环开始，每次新合成的DNA分子都含引物，且符合要求的目的基因两端都含引物。经过n次循环后，含引物的DNA链数为2n+1- 2，要获得32个符合要求的目的基因（即32个双链DNA），则含引物的DNA链数为64，所以2n+1- 2=64，即2n+1=66，因为26=64，27=128，所以n至少为6； （3）目的基因上只有BamHI、NdeI和EcoRI识别序列，若用BamHI进行切割，会破坏AmyS2基因，因此选择NdeI和EcoRI进行切割；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是MluI和Eco52I；在工业生产中，使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质，据此推测，信号肽的功能可能是引导目标蛋白质分泌到细胞外； （4）PCR技术依据的原理是DNA半保留复制，根据已知目的基因的一段碱基序列设计引物，可特异性地扩增目的基因。因此，提取工程菌的DNA后，加入根据bp基因的一段已知序列设计的引物进行PCR扩增，检测是否有扩增产物。若出现扩增产物，则说明样本中有bp基因，若无扩增产物，则说明样本中没有bp基因。 11．（2025·重庆·一模）土壤盐碱化问题已成为全球性难题，培育耐盐碱作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。 (1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建了过表达植株（AT1-OE）。以高粱的cDNA为模板，利用 方法获取目的基因。如图1，最好选择限制酶 处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。 (2)将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，为筛选出T-DNA成功转入的愈伤组织，培养基中需加入 。获得所需愈伤组织后，经再分化发育成完整植株。 (3)同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株 ，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。 (4)高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对空质粒组和重组质粒组总蛋白进行免疫共沉淀（GFP基因位于图1所示质粒中）。然后分别用抗GFP抗体和抗PIP2抗体对免疫共沉淀蛋白进行检测，实验结果如图3。通过哪一个条带可以判断，AT1与PIP2有相互作用? 。电泳时，应在 侧进行点样（填“A”或“B”）。 (5)细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因 。 【答案】(1) PCR BamHI和EcoRI (2)潮霉素 (3)幼苗长势好、作物产量高 (4) 3 A (5)敲除AT1基因后，无AT1与PIP2相互作用，（不会抑制PIP2磷酸化）PIP2磷酸化上升，能在高碱环境中促进H2O2外排，提高作物存活率。 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR是一项体外扩增DNA的技术，该过程中，可以以高粱cDNA为模板，利用PCR技术获得目的基因；为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，需要用两种酶进行切割，据图可知，XhoI会有两个切割位点，且有一处位于标记基因上，故不能选择，结合目的基因和质粒的限制酶位点可知，BamH I和EcoR I为最佳限制酶。 （2） T-DNA能够将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，据图可知，在T-DNA区域含有的抗性基因是潮霉素抗性基因，故将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，为筛选出T-DNA成功转入的愈伤组织，培养基中需加入潮霉素。 （3）分析题意可知，基因敲除植株是AT1-KO，而过表达植株是AT1-OE，野生型是对照组，若AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用，则预期结果应为：相比野生型植株，AT1-KO植株幼苗长势好、作物产量高，AT1-OE植株表型相反。 （4）据图可知，对总蛋白进行抗PIP2抗体检测时对照组和实验组均有条带3出现，转入空质粒的对照组对免疫共沉淀蛋白进行抗PIP2抗体检测时无条带3出现，而转入重组质粒的实验组有条带3出现，说明AT1与PIP2有相互作用，能够相互反应、结合；重组质粒比空质粒分子量大，移动速率慢，条带3位于最下面，条带2位于上面，DNA带负电，因此B测为点样孔。 （5） 分析题意，PIP2磷酸化能够促进H2O2外排，综合上述信息，敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因是：高碱环境中AT1与PIP2相互作用抑制其磷酸化，从而抑制H2O2外排，导致植物细胞死亡；敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上升，促进H2O2外排，作物存活率提高。 12．（2025·陕西咸阳·三模）水稻在生长过程中容易感染病虫害，从而引起作物减产。C蛋白和V蛋白分别对水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫有较强的杀伤效果，科研人员构建了C—V抗虫融合基因（简称C—V基因）表达载体，通过农杆菌转化法将C—V基因表达载体导入水稻叶肉细胞，使其表达出C—V联合蛋白，从而培育出转基因抗虫水稻新品种，过程如图1。所示。回答下列问题： (1)科研人员进行PCR1和PCR2时，扩增体系中需要分别加入C基因和V基因，其作用均是 。 (2)据图分析，PCR扩增时需要设计引物，为了使C基因和V基因能够正确相连，设计引物2和引物3时，引物序列除了能与模板DNA结合，还需要遵循的原则是 ，因此PCR1和PCR2需要在 （填“同一个”。或“不同”）PCR反应体系中进行。同时，为了使连接后的C—V基因能够正确插入载体中，需要在引物1和引物4的5端插入相关 酶的识别序列。 (3)进行PCR3时，不需要额外添加引物，此反应体系中具有引物效果的是 。 (4)用抗C蛋白抗体和抗V蛋白抗体检测转基因抗虫水稻中的蛋白质，结果如图2所示，1～7为被检测的转基因抗虫水稻，WT表示野生型水稻。 ①转基因抗虫水稻6体内未检测到C蛋白和V蛋白，其原因可能是 （答两点）。 ②为评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，探究思路是向非转基因水稻和转基因抗虫水稻 （填序号）接种等量的 ，观察其抗虫效果。 【答案】(1)提供DNA复制的模板 (2) 引物2和引物3的5'端存在部分碱基序列能互补配对 不同 限制 (3)C基因和V基因的两条添加了引物2、3序列的DNA链 (4) 转基因抗虫水稻6中的C-V基因不能转录，转基因抗虫水稻6中的C-V基因转录产生的mRNA不能翻译，转基因抗虫水稻6中未导入C-V基因（或导入的是空载体） 2、5、7 水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）扩增体系中需要加入C基因和V基因，其作用是提供DNA复制的模板； （2）设计引物2和引物3时，引物序列除了能与模板DNA结合，还需要引物2和引物3的5'端存在部分碱基序列能互补配对。由于引物2和引物3部分碱基序列互补，若在同一PCR反应体系中进行PCR1、PCR2，则可能会出现引物互补及降低PCR效率等情况，因此PCR1 和PCR2需要在不同PCR反应体系中进行。同时，为了使连接后的C-V基因能够插入载体中，需要在引物1和引物4的5'端插入限制酶的识别序列； （3）通过PCR1 和PCR2扩增反应得到C基因和V基因有部分碱基序列互补，以两者为模板进行PCR3扩增反应时，C基因和V基因的两条添加了引物2、3序列的DNA链具有引物效果； （4）①根据图2电泳结果可知，转基因抗虫水稻2、5、7成功导入C-V基因且能表达，而转基因抗虫水稻6体内未检测到C蛋白和V蛋白，可能是因为转基因抗虫水稻6中的C-V基因不能转录或C-V基因转录产生的mRNA不能翻译，还可能是因为转基因抗虫水稻6中未导入C-V基因； ②若要评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，则应该向非转基因水稻和转基因抗虫水稻2、5、7接种等量的水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫，然后观察其抗虫效果。 13．（2025·广东广州·二模）不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。 (1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割质粒p-lacZ,然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。 (2)将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含 的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果（如图乙）表明，应选择质粒 并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是 。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒（记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路 。 【答案】(1)SacⅡ、BglⅡ (2) 氯霉素 P06 28℃ 28℃条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小 (3)将PR空质粒、PR-A、PR-B分别导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅 【分析】1.工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 2.基因工程技术的基本步骤：1、提取目的基因；2、目的基因与运载体结合；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测和表达。 【详解】（1）切割质粒p-lacZ时，不能破坏复制原点和标记基因，所以不能选择限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，依据基因转录方向，且MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，酶切位点应位于转录的上游，且应实行双酶切法，所以应选择限制酶SacⅡ、BglⅡ切割质粒p-lacZ，然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。 （2）构建的重组质粒中含有氯霉素抗性基因，所以将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含氯霉素的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定。LacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶，若β-半乳糖苷酶活性较低，说明其对外源性启动子活性检测干扰较小，则用于插入外源启动子进行活性检测较为灵敏，反之较大，据图，质粒p06在28℃的温度条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小，说明用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏。 （3）依据题干信息可知，实验的自变量为外源启动子的不同，实验应分为三组，分别将不含外源启动子的pR空质粒、pR-A、pR-B导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅，蓝色越深，说明其活性越强。 14．（2025·内蒙古通辽·三模）组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种血栓溶解剂，难以从天然组织中提取或人工合成。科研人员从人胎盘染色体基因库中筛选出t-PA基因，将其与质粒结合，导入人黑色素瘤细胞中构建工程细胞，以生产t-PA。回答下列问题： (1)用PCR技术扩增t-PA基因时的步骤及设定的参数如图1所示。引物在步骤 中与模板链结合，步骤丁的目的是 。步骤戊应设定跳转到步骤 。 (2)PCR需要设计两种引物，如图2所示。图示中可作为引物的是 （填序号），原因是 。 (3)t-PA基因及构建表达载体的过程如图3所示。为保证t-PA基因与质粒高效连接，应选用图3中的限制酶 进行切割。 (4)与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞的优点是 。 【答案】(1) 丙 合成子链DNA 乙 (2) ②③ DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (3)XmaⅠ和BglⅡ (4)人黑色素瘤细胞具有内质网和高尔基体，能对t-PA进行加工和修饰 【分析】1、作为运载体必须具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存； ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 2、蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。通过蛋白质工程生产出来的蛋白质更加符合人类生产和生活的需要。 【详解】（1）步骤乙为高温解旋，步骤丙降低温度，使得引物与模板链结合,合成子链DNA；步骤丁为子链延伸；步骤戊应设定跳转到步骤乙，开始下一轮PCR，完成多次循环。 （2）引物与模板链的3'端结合，引物②③可作为图示DNA的引物；DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，因此只能选择引物②③来扩增t-PA基因。 （3）t-PA基因左侧的粘性末端为5，CCGG 3，，质粒上的XmaⅠ酶切后可以产生该黏性末端，t-PA基因右侧的粘性末端为5，GATC 3，，质粒上的BglⅡ酶切后可以产生该黏性末端，为保证t-PA基因与质粒高效连接，应选用图3中的限制酶XmaⅠ和BglⅡ。 （4）人黑色素瘤细胞具有内质网和高尔基体，与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞能对t-PA进行加工和修饰，使目的基因高效表达。 15．（2025·广东惠州·一模）科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。回答下列问题： (1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的 将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于 条件下培养来筛选所需的菌株。 (2)适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是 。 (3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路： 。 (4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是 ，判断理由是 。 (5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题： （回答1点即可）。 【答案】(1) 形态特征 适宜的温度 (2)定向改造微生物的遗传特性 (3)构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变或仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现 (4) 甲 乙中TAG对应终止密码，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白 (5)确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的形态特征将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于适宜的温度下培养来筛选所需的菌株。 （2）适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程可定向改造微生物的遗传特性，比如需要微生物具有耐寒的性质，可以通过基因工程将耐寒的基因导入微生物。 （3）该实验的目的是fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，因此要构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，可将实验分为三组，甲组fusA突变的菌株，乙组abrB突变的菌株，丙组同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，将三组菌株放到高温环境下培养一段（相同）时间，观察三组菌株的耐热性表现，若丙组菌株的耐热性大于甲和乙，则说明fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性存在协同效应，反之不行。 （4）根据题意分析，表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，需去除cotB基因中编码终止密码的序列，导入耐热孢子形成的菌株中才能表达出融合蛋白，乙中的TAG编码终止密码，会使翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白。 （5）未来若将该技术应用于生产实践中，需要考虑孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 / 学科网（北京）股份有限公司 $