专题14 基因工程（培优专练）2026年高考生物二轮复习高效培优系列

专题14 基因工程 真题引领练 素养拔高练 高考真题限时测、知己知彼百战不殆 限时：30分钟 1．【实践应用】（2025·山东·高考真题）利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如图所示，下列说法错误的是（    ）    A．对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞 B．卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行 C．培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液 D．可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛 2．【新情境】（2025·河北·高考真题）（多选题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 3．【实践应用】（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 4．【实践应用】（2025·天津·高考真题）二倍体番茄浆果中的小分子化合物H对食用者有益。H是由前体物甲经酶A催化成乙，乙经酶B催化成丙，丙再经酶C催化而成。浆果积累这些化合物，仅影响自身籽粒数及食用者健康，对应关系如下表： 累积物 甲 乙 丙 H 食用者健康 无影响 有害 有害 有益 浆果籽粒数 多 无 少 多 表达酶A、B和C的基因分别为A、B和C，位于非同源染色体上。为获取浆果含H的纯合番茄植株（不考虑突变与染色体互换），开展以下研究。 (1)浆果含H的纯合番茄植株的基因型为_____。 (2)基因型AaBbCc植株自交，中浆果籽粒数有_____种表型，有籽浆果植株占_____。为获得理想番茄植株，须遴选浆果籽粒数_____的，具有该性状的自交，后代不出现性状分离的基因型有_____种（类群M）。随后，再遴选浆果含H且该性状不分离的植株。 (3)除直接测量浆果H含量外，还可分别提取类群M各自交子代浆果的蛋白质来筛选目标植株，其方法是：用_____抗体对提取的蛋白质进行特异性识别，阳性率为_____%的子代即为目标品系。 5．【实践应用】（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 6．【实践应用】（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题： (1)基因内碱基的增添、缺失或_____都可导致基因突变。 (2)以Aa植株为_____（填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为_____。 (3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生_____种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为_____。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为_____。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为_____。 (4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验： ①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为_____的F1植株。 ②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为_____；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为_____。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因：_____。 7．【联系生活】（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 8．【实践应用】（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是______（答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有______（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 9．【实践应用】（2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 10．【新情境】（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是______。将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是______。 限制酶的识别序列和切割位点如下：    (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是______，随后在含______和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______。    11．【实践应用】（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 12．【实践应用】（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题： (1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为______。 (2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a： ①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的______；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的______（填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。 ②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为______[书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是______。 ③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明______。 13．【新情境】（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 素养导向限时测、训练解题思维、提升关键能力 限时：40分钟 1．【结构与功能观】（2026·安徽芜湖·一模）下图为检测残留在生物组织或环境中四环素水平的大肠杆菌工程菌的作用原理，当四环素存在时，大肠杆菌可以发出绿色荧光。下列叙述错误的是（    ） 注：图中“+”表示促进，“-”表示抑制 A．图中?处应为“-”，四环素直接解除对启动子2的抑制，使大肠杆菌发光 B．DNA的双螺旋结构是外源基因整合到大肠杆菌DNA上的结构基础 C．大肠杆菌出现绿色荧光性状受到T基因和绿色荧光基因的共同影响 D．启动子是基因上游的一段特殊的DNA序列，与RNA聚合酶发生特异性结合 2．【信息观】（2026·四川绵阳·二模）人类的每条5号染色体上有2个SMN1或其等位基因。SMN1有基因内长序列缺失和微小突变（基因中一个或几个核苷酸发生变化）两种变异类型，其中长序列缺失的突变基因不能通过现有引物进行PCR扩增。无正常SMN1基因的个体患脊髓性肌萎缩症（SMA），不考虑其他变异，下列说法正确的是（　　） A．SMN1基因的长序列缺失属于染色体变异，微小突变属于基因突变 B．SMA患者的基因型有5种 C．通过PCR扩增后电泳，有条带的个体均不患SMA D．正常夫妇生下患病后代属于基因重组 3．【信息观】（2026·山东德州·一模）蚊子一次受精可多次产卵，雄蚊只以花蜜和植物汁液为食，雌蚊要靠吸血来满足产卵的需求。蚊子在叮咬人时传播疾病(如登革热、寨卡病毒等)。为控制蚊子传播疾病，科研人员进行了相关研究。(不考虑突变和互换) (1)W菌是蚊子的胞内共生菌。科研人员利用一种新型W菌转染蚊子获得品系W，将其与野生型品系Z进行如下杂交实验。 P F1 Z(♀)×Z(♂) 均为野生型 Z(♀)×W(♂) 无后代 W(♀)×W(♂) 均为品系W W(♀)×Z(♂) 均为品系W 根据杂交结果可知，W菌在蚊子亲子代之间依靠___________(填“精子”或“卵细胞”)传播。为控制蚊子的数量，应连续多次释放___________(填“雄性”或“雌性”)品系W蚊子。 (2)S基因表达的蛋白能抑制登革热病毒复制。科研人员将S基因分别与A、B基因构建融合基因，并利用基因编辑技术将两种融合基因分别插入两对常染色体上，获得纯合的显性突变雄蚊(品系N)。已知只有A或B基因的胚胎致死，让品系N与野生型雌蚊(不含A、B基因)交配获得F1，F1自由交配，F2个体中有___________种基因型，其中A基因频率为___________。若将品系N释放，野生蚊子体内登革热病毒的平均含量会逐代降低，原因是___________。 (3)新型防控策略一般都需要释放雄蚊，为高效生产和分离非转基因雄蚊(不含荧光蛋白基因的雄蚊)，科研人员构建了双荧光品系，如图1所示。 注：M为决定雄性特征的特殊序列，没有M的对应位置记作m；C和P分别为外源插入的红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因；l为天然存在的隐性致死基因 ①利用双荧光品系分离并持续生产非转基因雄蚊的方案是___________。若双荧光品系的F1自由交配，F2中无荧光的个体所占比例为___________，无荧光个体中非转基因雄蚊所占比例为___________。 ②在双荧光品系的基础上，科研人员利用另一天然存在的隐性致死基因k并通过不断的筛选和交配，构建了单荧光品系，如图2所示。据图分析，与双荧光品系相比，单荧光品系在生产和分离非转基因雄蚊上的优势是___________。 4．【演绎与推理】（2026·浙江·二模）Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，主要由Cre与LoxP两部分组成，Cre是一种酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP位点间的DNA序列被删除，从而实现基因组DNA中特异位点基因的敲除。Cre品系小鼠是体内2号染色体带有Cre重组酶基因的小鼠，flox品系小鼠是在3号染色体的基因2两边都插入了loxP位点的小鼠。现利用两个品系小鼠培育基因2完全敲除的纯合小鼠，下列说法正确的是（　　） A．在两品系小鼠杂交所得F1代中检测到Cre重组酶即可说明Cre-LoxP系统对基因2删除成功 B．要获得肝脏中基因2敲除的小鼠，可在loxP基因序列上游添加肝脏特异性启动子 C．LoxP基因的插入不会改变基因2的碱基序列，因此不属于可遗传变异 D．至少在F2代中才能获得基因2完全敲除的纯合小鼠 5．【归纳与概括】（2026·辽宁·二模）黄色荧光蛋白与绿色荧光蛋白相比，只是第203位的苏氨酸变成了酪氨酸，科学家根据两种蛋白质结构上的差异，改造绿色荧光蛋白基因，获得了黄色荧光蛋白。下列叙述错误的是（    ） A．上述获得黄色荧光蛋白的过程属于蛋白质工程 B．由于酪氨酸有两种密码子，必须合成出两种碱基序列的基因 C．筛选重组DNA是该技术的重要操作之一 D．蛋白质的功能是设计蛋白质结构的依据 6．【归纳与概括】（2026·四川绵阳·二模）基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（    ） A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B．应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C．步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D．步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 7．【演绎与推理】（2025·四川凉山·一模）为在大肠杆菌中表达人的胰岛素基因，将胰岛素基因（目的基因）插入质粒，构建重组质粒，并导入大肠杆菌。为鉴定大肠杆菌中是否含有正确插入胰岛素基因的重组质粒，设计引物进行PCR扩增（引物1~4结合位置如图所示，表示引物方向），所用模板、引物和结果下表。下列分析错误的是（    ） 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 模板 引物对 引物1、2 引物3、4 引物2、3 引物1、4 扩增产物 无 有 有 有 无 无 无 有 A．图中的酶处理与PCR中的酶不同，但形成的化学键相同 B．在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C．①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同 D．②④⑧离心管中的都是胰岛素基因正向插入的重组质粒 8．【演绎与推理】（2026·江西九江·一模）科研人员为培育转基因大豆，构建了含特定功能元件的基因表达载体（左图为载体部分结构，右图为限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点），LB/RB是T-DNA的边界序列，Kanr为卡那霉素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，下列说法正确的是（    ） A．经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列相同 B．用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，扩增产物特异性越低 C．用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4种 9．【制定计划与设计实验】（2026·贵州黔东南·三模）用洋葱进行DNA的粗提取与鉴定时，取洋葱进行研磨得到研磨液，研磨液离心后获得上清液备用。下列有关叙述正确的是（　　） A．因猪血获取方便，所以常用于提取DNA的材料也包括猪的成熟红细胞 B．为使蛋白质等杂质析出，可在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液 C．将粗提取的DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中，为DNA的鉴定做准备 D．向含有DNA粗提取物的试管中加入二苯胺试剂，可直接观察颜色变化 10．【分析结果与得出结论】（2026·重庆·一模）科研人员发现BbCUC蛋白与野生型球孢白僵菌（WT）分生孢子的形成有关，利用基因工程获得了BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC和超量表达菌株BbCUCOE，并将BbCUC基因导入△BbCUC获得回补菌株BbCUCCOM。将等量菌株分别接种在相同且适宜的培养基上，统计相关数据，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．构建BbCUCOE菌株时可将BbCUC基因的启动子替换为活性更强的启动子 B．BbCUC基因通过促进球孢白僵菌产孢结构的发生促进分生孢子的形成 C．可以利用抗原-抗体杂交技术检验目的菌株是否构建成功 D．BbCUCCOM表型并未完全与WT一致，说明导入后可能影响其他基因表达 11．【表达与交流】（2026·四川广安·一模）为获得高产脂质的硅藻用于生产生物柴油，研究人员将苹果酸酶（ME）基因（长度约800 bp）构建到含新霉素抗性基因的超表达载体上，导入硅藻细胞。为验证转化是否成功，以野生型基因组、转化后硅藻基因组以及重组质粒为模板，使用可特异性扩增完整ME基因的引物进行PCR，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并测定条带亮度（相对值），结果如图所示，下列分析正确的是（    ） A．PCR过程中，引物作用是使Taq DNA聚合酶从其3'端开始连接核糖核苷酸 B．为确保ME基因正确插入载体，需在引物3'端加入不同的限制酶识别序列 C．转化后硅藻基因组检测到明显条带，说明ME基因已整合到其染色体DNA上 D．为评价所获硅藻品系的生产潜力，还需检测其生长速率与胞内脂质含量 12．【表达与交流】（2026·上海浦东新·一模）诺沃霉素的生产 植物病害大多由真菌感染导致。诺沃霉素是由链霉菌（需氧型微生物）产生的一种代谢产物，具有良好的广谱抗真菌活性。 (1)通过大规模培养链霉菌生产诺沃霉素，用到的技术是（    ）（单选） A．细胞融合技术 B．转基因技术 C．微生物培养技术 D．干细胞技术 (2)大规模培养链霉菌，需采用的措施有____________。（编号选填） ①使用固体培养基     ②调节培养基的pH   ③延长光照时间 ④实时监测氧气条件   ⑤及时收集诺沃霉素  ⑥生产过程无菌操作 研究表明，来自透明颤菌的V蛋白（由V基因控制）能够增强菌体呼吸作用，进而提升菌体对氧气的利用效率。通过基因工程获得能表达V蛋白的新型链霉菌，成为提升诺沃霉素产量的有效策略。相关途径如图1所示。 (3)基于上述信息可知，获得新型链霉菌的生物学原理是（    ）（单选） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体变异 D．诱变育种 (4)利用PCR技术从透明颤菌的基因组中获取V基因时，需要用到的引物必须含有的序列是：5'____________3'和5'_________3' (5)图中培养皿B和培养皿C中应添加的抗生素分别是__________和__________；培养皿B和C的1~3和1'~3'中，含有符合育种目标的工程菌株是__________（填编号） 质粒pSET152上的启动子（RNA聚合酶结合的特定DNA序列，与转录起始有关）不同也会影响诺沃霉素的产量。研究人员比较五种启动子（P1、P2、P3、P4和PS）介导下5种新型链霉菌中V基因的表达水平（图1），以及这5种新型链霉菌和原始菌株的诺沃霉素产量（图2）。 (6)根据上述信息，结合已有知识推测，五种启动子应分别插在图1中质粒pSET152的位置是（    ）（单选） A．ori B．PO C．Ampr D．Ter’ (7)综合上述信息并结合已有知识，分析导入P3启动子后诺沃霉素的产量比原始菌株高，但比导入P2启动子的菌株产量低的原因_________。 13．【表达与交流】（2025·浙江绍兴·一模）某双链DNA病毒，可引起急性传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。为了该急性传染病的早期诊断进行了下列研究，回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒。PCR扩增目的基因时，退火的温度主要取决于________（答出两点）。PCR过程中因参与合成反应不断消耗而浓度下降的组分有______。对基因A的PCR扩增产物和质粒（该质粒的部分结构和限制酶切割位点如下图所示，三种限制酶切割后形成的黏性末端不同）进行双酶切，随后用DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，A基因转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入用______处理的大肠杆菌，培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是_______（答出两点）。若成功制备得到蛋白A，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物结构出现异常，可能的原因是_______。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。与植物体细胞杂交相比，诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的特有方式是______。杂交瘤细胞进行克隆化培养和筛选时，可通过______操作确保一个培养孔中接种一个细胞。取培养孔中的______（填“细胞”或“上清液”）进行抗体检测，筛选获得能分泌所需抗体的细胞。大量培养这些细胞，产生的抗体就可以用于该急性传染病的早期诊断。 14．【制定计划与设计实验】（2026·甘肃陇南·一模）生物柴油作为新型能源已成为世界上广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究发现，油料作物紫苏具有产油基因DGAT1，现利用基因工程的技术，获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。图1、图2是获得产油微藻的基因工程操作程序，回答以下问题。 (1)图1为构建DGAT1基因文库的过程，①代表______过程。 (2)现需将DGAT1基因通过PCR技术进行扩增，在扩增DGAT1基因时，需要根据______设计特异性引物序列。 (3)利用转基因技术获得产油微藻的核心步骤为：______，据图2分析，该过程需要选择______限制酶切割DGAT1基因。 (4)为了保证DGAT1基因能够在微藻细胞中表达，应该将pBI121质粒上的启动子替换为______。 (5)用______方法检测微藻细胞中是否插入了DGAT1基因并转录出了相应的mRNA；若要进一步判断DGAT1基因是否成功表达，需要加入______进行检测。 检测指标 总氮/（mg·L-1） 总磷/（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 地热废水培养基 23.2 4.32 4.56 培养转基因产油微藻11d后 1.9 0.45 0.84 (6)为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表所示。 该实验不能说明产油微藻对地热废水有去污能力，请进一步完善实验______。 （1）逆转录 （2）DGATl基因两端的核苷酸序列 （3）基因表达载体的构建;XbaⅠ和HindⅢ （4）微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子 （5）DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法;DGAT1抗体 （6）添加用地热废水培养普通微藻的对照组，在相同条件下培养11d后检测总氮、总磷和氟化物的含量 15．【分析结果与得出结论】（2026·广东佛山·二模）“端稳中国碗，装满中国粮”。水稻是我国主要粮食作物之一，稻黄单胞菌能分泌相应的蛋白质进入水稻叶肉细胞，使细胞转变为有利于该菌生长繁殖的状态，从而引起白叶枯病，导致产量下降。为培育好中国粮种，科研人员在基因工程育种领域开展相关研究。 (1)水稻白叶枯病的易感病与抗病是一对由S/s基因控制的相对性状，图1为该病的遗传关系图，可以判断白叶枯病的抗病基因是___________(填“显性”或“隐性”)基因，F2表型及比例是___________。 (2)已知特定蛋白与启动子结合后能激活相应基因的表达。为研究水稻感病与抗病机理，科研人员进行如下实验：构建不同“启动子-报告基因”(图2)表达载体，并分别与含有稻黄单胞菌T蛋白基因或A蛋白基因的表达载体同时转化到烟草叶片中，随后将上述烟草叶片培养于含X-Gluc的培养基中，结果如图3所示。 ①该实验设计用以探究S/s基因启动子与何种蛋白结合。实验的空白对照组操作为将___________转化到烟草叶片中。 ②据实验结果推测，某对照基因启动子能与___________(填“T”或“A”)蛋白结合S/s基因启动子与T蛋白和A蛋白结合的具体情况为___________。 (3)据该实验结果推测，具有抗病性状的水稻植株抗病机理可能是___________。研究发现，并非所有稻黄单胞菌都能使易感病水稻患白叶枯病，据上述研究推测可能的原因是___________。 (4)基于上述研究，请从分子水平提出一种培育水稻抗白叶枯病新品种的思路：___________。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 真题引领练 素养拔高练 高考真题限时测、知己知彼百战不殆 限时：30分钟 1．【实践应用】（2025·山东·高考真题）利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如图所示，下列说法错误的是（    ）    A．对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞 B．卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行 C．培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液 D．可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛 【答案】B 【解析】A、对牛乙注射促性腺激素进行超数排卵，目的是收集更多数量的卵母细胞，以便后续进行核移植操作，A正确； B、卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅱ中期进行，B错误； C、在培养动物体细胞时，需要定期更换培养液，防止细胞代谢产物的积累对细胞自身造成危害，C正确； D、PCR技术可以扩增特定的DNA片段，通过检测犊牛丁细胞中是否含有转基因的DNA片段，就可以鉴定犊牛丁是否为转基因牛，D正确。 故选B。 2．【新情境】（2025·河北·高考真题）（多选题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 【答案】AB 【解析】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A错误； B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误； C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确； D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 故选AB。 3．【实践应用】（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【解析】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误； B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确； C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误； D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。 故选BD。 4．【实践应用】（2025·天津·高考真题）二倍体番茄浆果中的小分子化合物H对食用者有益。H是由前体物甲经酶A催化成乙，乙经酶B催化成丙，丙再经酶C催化而成。浆果积累这些化合物，仅影响自身籽粒数及食用者健康，对应关系如下表： 累积物 甲 乙 丙 H 食用者健康 无影响 有害 有害 有益 浆果籽粒数 多 无 少 多 表达酶A、B和C的基因分别为A、B和C，位于非同源染色体上。为获取浆果含H的纯合番茄植株（不考虑突变与染色体互换），开展以下研究。 (1)浆果含H的纯合番茄植株的基因型为_____。 (2)基因型AaBbCc植株自交，中浆果籽粒数有_____种表型，有籽浆果植株占_____。为获得理想番茄植株，须遴选浆果籽粒数_____的，具有该性状的自交，后代不出现性状分离的基因型有_____种（类群M）。随后，再遴选浆果含H且该性状不分离的植株。 (3)除直接测量浆果H含量外，还可分别提取类群M各自交子代浆果的蛋白质来筛选目标植株，其方法是：用_____抗体对提取的蛋白质进行特异性识别，阳性率为_____%的子代即为目标品系。 【答案】(1)AABBCC (2) 3 13/16（或81.25%） 多 11 (3) 酶A 100 【解析】（1）根据题干信息，H是由前体物甲经酶A催化成乙，乙经酶B催化成丙，丙再经酶C催化而成，而表达酶A、B和C的基因分别为A、B和C，所以浆果含H的纯合番茄植株的基因型为AABBCC。 （2）基因型AaBbCc植株自交，根据基因的自由组合定律，后代基因型有多种组合，浆果籽粒数的表型由基因控制，结合表格信息，多籽浆果的基因型aa----、A-B-C-，无籽浆果的基因型是A-bb--，少籽浆果的基因型是A-B-cc，所以F1中浆果籽粒数有3种表型。无籽浆果植株的基因型为A-bb--，其比例为3/4×1/4×1=3/16，所以有籽浆果植株占1-3/16=13/16。理想番茄植株要求浆果含H且籽粒数多，籽粒数多的表型对应的是有籽情况，所以须遴选浆果籽粒数多的F1，具有该性状（籽粒数多）的F1基因型为A-B-C-，自交后代不出现性状分离的基因型有aa----（1×3×3=9种）、A-BBCC（2种），共11种。 （3）类群M的基因型有2种，分别为aa----、A-BBCC，要筛选含H的植株，其基因型为A-BBCC，与aa----的植株相比，基因型为A-BBCC的植株含有酶A，所以除直接测量浆果H含量外，还可以分别提取类群M各自交子代浆果的蛋白质来筛选目标植株，用酶A抗体对提取的蛋白质进行特异性识别，阳性率为100%的子代即为目标品系（AABBCC）。 5．【实践应用】（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【解析】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 6．【实践应用】（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题： (1)基因内碱基的增添、缺失或_____都可导致基因突变。 (2)以Aa植株为_____（填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为_____。 (3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生_____种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为_____。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为_____。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为_____。 (4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验： ①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为_____的F1植株。 ②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为_____；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为_____。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因：_____。 【答案】(1)替换 (2) 父本 1/2 (3) 3 1/3 2/3 a花粉不育，无法形成纯合aa植株 (4) AaEe E/e和A/a连锁且无交换，F₂中无同时含A和E的配子 1/6 若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6 【解析】（1）基因突变是指DNA分子上碱基对增添、缺失或替换引起基因结构的改变。基因内碱基的增添、缺失或替换都可导致基因突变。 （2）据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失（a基因）会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0；若Aa植株作为母本，其卵细胞可育（含a基因），而野生型父本花粉（含A基因）可育，F1基因型为Aa（抗性）和AA（非抗性），比例为1：1，因此卡那霉素抗性植株占比为1/2。 （3）为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为Aa（2号染色体为Aa，3号染色体为A0）。该植株会产生4种基因型的花粉，即AA、A0、Aa、a0，其中a不育，即产生3种可育基因型的花粉，而具有a基因的花粉占比为1/3。该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0，均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型为AAAA：AAA0：AA00：AAAa：AAa0：AAaa：Aa00：Aaa0=1∶2∶1∶2∶3∶1∶1∶1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR扩增出900bp（A）和600bp（a）条带。Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900bp条带。其中Ⅰ型植株占比为（2+3+1+1+1）/（1+2+1+2+3+1+1+1）=2/3。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株。 （4）①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出F1中AaEe植株（双杂合）。若E/e和A/a连锁且无交换，F2中无同时含A和E的配子（花粉或种子致死），正常植株占比为0。若两基因独立遗传（非同源染色体），F1植株（AaEe）产生雌配子为AE：Ae：aE：ae=1：1：1：1，均可育，而雄配子AE：Ae=1；1，aE和ae不可育，利用棋盘法可知，F2为AAEE：AAEe：AaEE：AaEe=1：2：1：2，其中只有AAEE的花粉和自交所结种子均发育正常，即正常植株（AAEE）占比为1/6。其他可能：若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6。 7．【联系生活】（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 【解析】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 8．【实践应用】（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是______（答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有______（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 【答案】(1) 终止子（复制原点） P1 和 P3 782 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失 (2) 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测 【解析】（1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。 将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：缺失分泌到细胞外的信号，重组菌没有将蛋白A释放到细胞外；基因A未表达；基因A丢失。 （2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。 ②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 9．【实践应用】（2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 【答案】(1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C 【解析】（1）由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。 （2）由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育：雄性不育=285：94≈3：1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE：EE1：E1E1=1：2：1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1：EE2=1：1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为1/2×1/2=1/4。 （3）由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1：E2=1：1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E：E1=1：1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1：EE2：E1E1：E1E2=1：1：1：1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不可育，因此丁×戊获得F1的遗传图解为： （4）鉴定基因有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育：雄性不育=1：1；自交后代雄性可育：雄性不育=3：1。 （5）A、PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确； B、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确； CD、在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合P1引物。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为24-2×4=8个。C错误，D正确。 故选C。 10．【新情境】（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是______。将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是______。 限制酶的识别序列和切割位点如下：    (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是______，随后在含______和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______。    【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释 (2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 (4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 【解析】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 11．【实践应用】（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【解析】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 12．【实践应用】（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题： (1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为______。 (2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a： ①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的______；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的______（填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。 ②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为______[书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是______。 ③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明______。 【答案】(1)绿色豆荚 (2) 替换 Ⅱ （△G+H）/（G+h） G调控下游基因H的表达，缺失G时，基因H的表达量下降：另一条染色体上的h无功能。 G不调控下游基因H的表达。 【解析】（1）纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，说明F1表现的性状为显性性状。F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为297:105≈3:1，符合孟德尔分离定律中杂合子自交后代显性性状与隐性性状的分离比，所以显性性状为绿色。 （2）①用待测植株的DNA进行PCR,产物电泳结果全为预测的1125bp,推测可能 没有突变发生，若发生突变，只能是碱基对的替换；扩增片段全长为1125bp,野生型H 的扩增产物被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，所以Hh扩增产物的 酶切结果应该为1125 bp、699bp和426bp三种片段，选II。 ② 据图a,亲代绿色豆荚植株和黄色豆荚植株的基因型分别为(G+H)/(G+h)和 (AG+H)/(AG+H),根据分离定律，F1的基因型为两种：(G+H)/(AG+H)和(AG+H) /(G+h),且数量相等。据题意，基因型(G+H)/(AG+H)应为绿色豆荚，黄色豆荚植株 的基因型为(AG+H)/(G+h)。推测G调控H表达，当缺失G时H表达量下降，等位基因 h无功能，因此豆荚表现为黄色性状。 ③ 若F1中两种基因型植株数量无差异，表明F1没有出现致死；但F1表型全为绿色， 所以基因型(AG+H)/(G+h)的豆荚也呈绿色，提示该基因型植株下游H正常表达，没有 受到G缺失的影响。说明G不调控下游H的表达。 13．【新情境】（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ (2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 (3) 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 (4) 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 【解析】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中①是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶1基因序列，④是溶解酶2基因序列。 模块说明：做好的资料需删除该表格 按照4个核心素养（生命观念、科学思维、科学探究、社会责任），结合本专题能体现的素养方向，进行试题的选择，标明具体考查的素养方向 试题量：15~20道，选择各地最新优质模拟题，可加出处（注意根据具体的题量修改限时） 素养的图标选择如下 素养导向限时测、训练解题思维、提升关键能力 限时：25分钟 1．【结构与功能观】（2026·安徽芜湖·一模）下图为检测残留在生物组织或环境中四环素水平的大肠杆菌工程菌的作用原理，当四环素存在时，大肠杆菌可以发出绿色荧光。下列叙述错误的是（    ） 注：图中“+”表示促进，“-”表示抑制 A．图中?处应为“-”，四环素直接解除对启动子2的抑制，使大肠杆菌发光 B．DNA的双螺旋结构是外源基因整合到大肠杆菌DNA上的结构基础 C．大肠杆菌出现绿色荧光性状受到T基因和绿色荧光基因的共同影响 D．启动子是基因上游的一段特殊的DNA序列，与RNA聚合酶发生特异性结合 【答案】A 【解析】A、图中?处应为“-”（T蛋白对启动子2的作用是抑制），但四环素并非直接解除对启动子2的抑制，而是通过抑制T蛋白的活性，间接解除T蛋白对启动子2的抑制，使绿色荧光蛋白基因表达。因此“四环素直接解除对启动子2的抑制”表述错误，A错误； B、DNA的双螺旋结构是不同生物DNA能够重组的结构基础，也是外源基因整合到大肠杆菌DNA（如质粒）上的结构基础，B正确； C、大肠杆菌能否发出绿色荧光，既受T基因（表达的T蛋白抑制绿色荧光基因的启动子2）的调控，也受绿色荧光基因（表达荧光蛋白）的直接控制，因此性状受二者共同影响，C正确； D、启动子是基因上游的特殊DNA序列，能够与RNA聚合酶特异性结合，驱动基因转录，这是启动子的核心功能，D正确。 故选A。 2．【信息观】（2026·四川绵阳·二模）人类的每条5号染色体上有2个SMN1或其等位基因。SMN1有基因内长序列缺失和微小突变（基因中一个或几个核苷酸发生变化）两种变异类型，其中长序列缺失的突变基因不能通过现有引物进行PCR扩增。无正常SMN1基因的个体患脊髓性肌萎缩症（SMA），不考虑其他变异，下列说法正确的是（　　） A．SMN1基因的长序列缺失属于染色体变异，微小突变属于基因突变 B．SMA患者的基因型有5种 C．通过PCR扩增后电泳，有条带的个体均不患SMA D．正常夫妇生下患病后代属于基因重组 【答案】B 【解析】A、SMN1基因的长序列缺失属于基因内部碱基序列缺失，属于基因突变，微小突变（基因中一个或几个核苷酸发生变化）属于基因突变，A错误； B、根据题意可以设控制该病的基因型为A、a1、a2，a1、a2为两种突变产生的等位基因，因为每条5号染色体上有2个SMN1或其等位基因，患者的基因型有a1a1a1a1，a2a2a2a2，a1a1a1a2，a1a1a2a2，a1a2a2a2，5种，B正确； C、仅发生长序列缺失的SMN1基因不能通过PCR扩增，因此通过PCR扩增后电泳，有条带的个体也可能因不含正常SMN1基因而患SMA，C错误； D、患病基因是通过基因突变形成的等位基因，正常夫妇生下患病后代的原因是等位基因分离，等位基因不发生基因重组，D错误。 故选B。 3．【信息观】（2026·山东德州·一模）蚊子一次受精可多次产卵，雄蚊只以花蜜和植物汁液为食，雌蚊要靠吸血来满足产卵的需求。蚊子在叮咬人时传播疾病(如登革热、寨卡病毒等)。为控制蚊子传播疾病，科研人员进行了相关研究。(不考虑突变和互换) (1)W菌是蚊子的胞内共生菌。科研人员利用一种新型W菌转染蚊子获得品系W，将其与野生型品系Z进行如下杂交实验。 P F1 Z(♀)×Z(♂) 均为野生型 Z(♀)×W(♂) 无后代 W(♀)×W(♂) 均为品系W W(♀)×Z(♂) 均为品系W 根据杂交结果可知，W菌在蚊子亲子代之间依靠___________(填“精子”或“卵细胞”)传播。为控制蚊子的数量，应连续多次释放___________(填“雄性”或“雌性”)品系W蚊子。 (2)S基因表达的蛋白能抑制登革热病毒复制。科研人员将S基因分别与A、B基因构建融合基因，并利用基因编辑技术将两种融合基因分别插入两对常染色体上，获得纯合的显性突变雄蚊(品系N)。已知只有A或B基因的胚胎致死，让品系N与野生型雌蚊(不含A、B基因)交配获得F1，F1自由交配，F2个体中有___________种基因型，其中A基因频率为___________。若将品系N释放，野生蚊子体内登革热病毒的平均含量会逐代降低，原因是___________。 (3)新型防控策略一般都需要释放雄蚊，为高效生产和分离非转基因雄蚊(不含荧光蛋白基因的雄蚊)，科研人员构建了双荧光品系，如图1所示。 注：M为决定雄性特征的特殊序列，没有M的对应位置记作m；C和P分别为外源插入的红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因；l为天然存在的隐性致死基因 ①利用双荧光品系分离并持续生产非转基因雄蚊的方案是___________。若双荧光品系的F1自由交配，F2中无荧光的个体所占比例为___________，无荧光个体中非转基因雄蚊所占比例为___________。 ②在双荧光品系的基础上，科研人员利用另一天然存在的隐性致死基因k并通过不断的筛选和交配，构建了单荧光品系，如图2所示。据图分析，与双荧光品系相比，单荧光品系在生产和分离非转基因雄蚊上的优势是___________。 【答案】(1) 卵细胞 雄性 (2) 5 60% 群体中S基因频率逐代升高，而S基因表达的蛋白可以抑制病毒复制 (3) 在双荧光品系杂交的后代中，无荧光的个体即为非转基因雄蚊，让有荧光的个体相互交配用于持续生产 3/7 2/3 不需挑选即可连续传代且易分离出非转基因雄蚊 【解析】（1）由 W菌的传播方式 观察杂交实验： Z(♀)×W(♂)：无后代（无法判断）， W(♀)×W(♂)：后代均为品系W ， W(♀)×Z(♂)：后代均为品系W ， 关键对比：当母本为W时，无论父本是W还是Z，后代都是W；而Z(♀)×W(♂)无后代。这说明W菌通过母本（卵细胞）传递给后代，属于母系遗传（细胞质遗传）。 根据"Z(♀)×W(♂)无后代"这一关键结果，释放雄性品系W蚊子可使野生型雌蚊交配后无法产生后代，从而逐代降低蚊子数量。 （2）分析F₁自由交配产生F₂的情况 F₁（AaBb）自由交配，理论上F₂有9种基因型：A_B、A_bb、aaB、aabb  根据条件"只有A或B基因的胚胎致死"；只有A基因（有A无B）：A_bb 致死，即AAbb、Aabb 致死；只有B基因（有B无A）：aaB 致死，即aaBB、aaBb 致死 ；存活个体： A_B_（有A和B）：AABB、AABb、AaBB、AaBb  和aabb（同时无A和B）。 F₂存活基因型共5种：AABB、AABb、AaBB、AaBb、aabb。存活个体中： AABB: 1，AABb: 2 ，AaBB: 2，AaBb: 4，aabb: 1。计算A基因频率： A基因总数 = 2+4+2+4= 12，等位基因总数 = 2×10 = 20， A基因频率 = 12/20 = 3/5（或60%）。由于致死现象的存在，群体中A、B的基因频率逐代升高，伴随着群体中S基因频率逐代升高，而S基因表达的蛋白可以抑制病毒复制，因此将品系N释放，野生蚊子体内登革热病毒的平均含量会逐代降低。 （3）分析图1染色体组成：雄蚊（♂）：M / m-C-l（一条含M，另一条含C和致死基因l） ，雌蚊（♀）：m/m-P-l（含P和致死基因l）。遗传特点：有M → 发育为雄性l为隐性致死，纯合ll致死 C（红荧光）、P（绿荧光）为转基因标记。杂交策略： 让两种荧光品系的雄蚊与雌蚊交配，后代中：无荧光个体不含C和P，即为非转基因雄蚊（目Mm）；有荧光个体含C或P，留下继续交配生产。具体方案： 让双荧光品系的雄蚊与雌蚊交配，后代中无荧光的个体即为非转基因雄蚊，将有荧光的个体留下相互交配用于持续生产。 亲本杂交：♂（M/m-C-l）× ♀（m/m-P-l），F₁基因型及比例：M/m-P-l（绿色荧光雄蚊）： M/m（无荧光雄蚊）： m-C-l/m-P-l（II致死）：m-C-l/m红色荧光雌蚊）=1：1：1：1， 即F₁中：绿色荧光雄蚊:无荧光雄蚊:红色荧光雌蚊 = 1:1:1。 F₁自由交配，雄蚊（M/m）和  M/m-P-l， 雌蚊m-C-l/m，F1雄配子M:m:m-P-l= 2:1:1，雌配子m:m-C-l= 1:1，故F2中Mm:mm:mm-P-1:Mm-C-1:mm-C-1:m-C-1m-P-1=2:1:1:2:1:1，m-C-1mP-1致死，故F2中无荧光的个体Mm和mm共为3/7，无荧光个体中非转基因雄蚊为Mm，所占比例为2/3。 单荧光品系中雄蚊无荧光，雌蚊有绿色荧光，通过荧光筛选可直接分离雌雄，简化了非转基因雄蚊的筛选过程，不需挑选即可连续传代且易分离出非转基因雄蚊。 4．【演绎与推理】（2026·浙江·二模）Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，主要由Cre与LoxP两部分组成，Cre是一种酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP位点间的DNA序列被删除，从而实现基因组DNA中特异位点基因的敲除。Cre品系小鼠是体内2号染色体带有Cre重组酶基因的小鼠，flox品系小鼠是在3号染色体的基因2两边都插入了loxP位点的小鼠。现利用两个品系小鼠培育基因2完全敲除的纯合小鼠，下列说法正确的是（　　） A．在两品系小鼠杂交所得F1代中检测到Cre重组酶即可说明Cre-LoxP系统对基因2删除成功 B．要获得肝脏中基因2敲除的小鼠，可在loxP基因序列上游添加肝脏特异性启动子 C．LoxP基因的插入不会改变基因2的碱基序列，因此不属于可遗传变异 D．至少在F2代中才能获得基因2完全敲除的纯合小鼠 【答案】D 【解析】A、F1代检测到Cre重组酶仅说明个体携带Cre基因，若个体未继承两侧插入LoxP位点的基因2等位基因，Cre无法识别靶序列完成基因2的删除，不能说明系统发挥作用，A错误； B、要实现肝脏特异性敲除基因2，需让Cre重组酶仅在肝脏细胞中表达，因此应在Cre基因上游添加肝脏特异性启动子，LoxP是Cre的识别序列，不需要特异性表达，B错误； C、LoxP序列插入后，基因组DNA的总碱基序列发生改变，遗传物质发生了变化，属于可遗传变异，C错误； D、两品系杂交得到的F1代最多为基因2敲除杂合子（仅一条3号染色体的基因2被敲除），F1个体相互交配，最早在F2代可获得两条3号染色体的基因2均被敲除的纯合小鼠，D正确。 故选D。 5．【归纳与概括】（2026·辽宁·二模）黄色荧光蛋白与绿色荧光蛋白相比，只是第203位的苏氨酸变成了酪氨酸，科学家根据两种蛋白质结构上的差异，改造绿色荧光蛋白基因，获得了黄色荧光蛋白。下列叙述错误的是（    ） A．上述获得黄色荧光蛋白的过程属于蛋白质工程 B．由于酪氨酸有两种密码子，必须合成出两种碱基序列的基因 C．筛选重组DNA是该技术的重要操作之一 D．蛋白质的功能是设计蛋白质结构的依据 【答案】B 【解析】A、科学家通过改造绿色荧光蛋白基因获得黄色荧光蛋白，该过程以蛋白质结构为基础定向修改基因，符合蛋白质工程的定义（通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造新蛋白质），A正确； B、酪氨酸有2种密码子（UAU、UAC），但改造基因时只需选择其中一种密码子合成对应的碱基序列即可，无需合成两种（实际操作中根据宿主细胞偏好性选择最优密码子），B错误； C、蛋白质工程需将改造后的基因导入受体细胞表达，过程中涉及重组DNA的构建和筛选（如利用标记基因筛选成功重组的载体），C正确； D、蛋白质工程的核心是依据预期功能设计蛋白质结构，再反向推导基因序列进行修饰或合成，D正确。 故选B。 6．【归纳与概括】（2026·四川绵阳·二模）基因PCR定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR是发展最早的定点突变技术，其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（    ） A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质 B．应将引物1、2与引物3、4置于两个独立的反应体系中 C．步骤④使用DNA聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸 D．步骤⑤中如果完成6轮循环一共需要消耗63个引物1 【答案】C 【解析】A、蛋白质工程是通过改造基因来设计具有新功能的蛋白质，能够创造自然界中原本不存在的蛋白质，A正确； B、引物1、2用于扩增含突变位点的上游片段，引物3、4用于扩增含突变位点的下游片段。若将四组引物置于同一反应体系，会导致引物交叉结合、干扰PCR产物的特异性，因此需在两个独立的反应体系中分别扩增上下游片段，B正确； C、步骤④使用DNA聚合酶可对分子乙进行延伸，甲不可延伸，C错误； D、PCR过程中，引物的消耗数量为2n+1－2（n为循环数），初始模板不消耗引物。6轮循环后，总产物数为27－2=126，因此消耗的引物1数量为126÷2=63，D正确。 故选C。 7．【演绎与推理】（2025·四川凉山·一模）为在大肠杆菌中表达人的胰岛素基因，将胰岛素基因（目的基因）插入质粒，构建重组质粒，并导入大肠杆菌。为鉴定大肠杆菌中是否含有正确插入胰岛素基因的重组质粒，设计引物进行PCR扩增（引物1~4结合位置如图所示，表示引物方向），所用模板、引物和结果下表。下列分析错误的是（    ） 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 模板 引物对 引物1、2 引物3、4 引物2、3 引物1、4 扩增产物 无 有 有 有 无 无 无 有 A．图中的酶处理与PCR中的酶不同，但形成的化学键相同 B．在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C．①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同 D．②④⑧离心管中的都是胰岛素基因正向插入的重组质粒 【答案】D 【解析】A、图中的酶处理（DNA连接酶）与PCR中的酶（Taq酶）不同，但形成的化学键相同，均涉及磷酸二酯键，A正确； B、在PCR反应过程中，复性阶段发生引物与两条模板DNA结合，B正确； C、①无扩增产物，因质粒P0无胰岛素基因，⑥无扩增产物，可能因胰岛素基因反向插入质粒P0，故①与⑥离心管都没有扩增产物，但形成的原因可能不相同，C正确； D、引物1和引物2扩增出的是胰岛素基因，故②离心管中的PX无法确定胰岛素基因是否被正向插入。引物3和引物4含与P0互补的碱基序列，无法确定④离心管中的PX中胰岛素基因是否被正向插入。P0含与引物4互补的碱基序列，胰岛素基因含与引物1互补的碱基序列，可确定⑧离心管中的PX是胰岛素基因正向插入的重组质粒，因为反向插入应该无扩增产物出现，D错误。 故选D。 8．【演绎与推理】（2026·江西九江·一模）科研人员为培育转基因大豆，构建了含特定功能元件的基因表达载体（左图为载体部分结构，右图为限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点），LB/RB是T-DNA的边界序列，Kanr为卡那霉素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，下列说法正确的是（    ） A．经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列相同 B．用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，扩增产物特异性越低 C．用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4种 D．应选择含有氨苄青霉素的培养基去筛选成功转化的大豆细胞 【答案】B 【解析】A、由限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点可知，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'和5'-GTTT-3'，A错误； B、用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，引物与模板的结合特异性越差，非特异性结合增多，扩增产物特异性越低，B正确； C、由限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点可知，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端远远多于4种，C错误； D、Kanr是卡那霉素抗性基因，且位于T-DNA上，因此会进入受体细胞，重组Ti质粒通过农杆菌导入大豆细胞后，应使用含卡那霉素的培养基对受体细胞进行筛选，D错误。 故选B。 9．【制定计划与设计实验】（2026·贵州黔东南·三模）用洋葱进行DNA的粗提取与鉴定时，取洋葱进行研磨得到研磨液，研磨液离心后获得上清液备用。下列有关叙述正确的是（　　） A．因猪血获取方便，所以常用于提取DNA的材料也包括猪的成熟红细胞 B．为使蛋白质等杂质析出，可在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液 C．将粗提取的DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中，为DNA的鉴定做准备 D．向含有DNA粗提取物的试管中加入二苯胺试剂，可直接观察颜色变化 【答案】C 【解析】A、猪的成熟红细胞无细胞核和线粒体，不含DNA，故不能作为提取DNA的材料，A错误； B、DNA 在体积分数为95% 的冷酒精中溶解度低，会析出；而蛋白质等杂质在酒精中溶解度较高，会留在上清液中，B错误； C、DNA在2mol/L NaCl溶液中溶解度较高，可溶解粗提取的DNA，为后续鉴定实验（二苯胺试剂反应）提供适宜环境，C正确； D、二苯胺试剂鉴定DNA需沸水浴加热（约5分钟）才能出现蓝色，直接观察无颜色变化，D错误。 故选C。 10．【分析结果与得出结论】（2026·重庆·一模）科研人员发现BbCUC蛋白与野生型球孢白僵菌（WT）分生孢子的形成有关，利用基因工程获得了BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC和超量表达菌株BbCUCOE，并将BbCUC基因导入△BbCUC获得回补菌株BbCUCCOM。将等量菌株分别接种在相同且适宜的培养基上，统计相关数据，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．构建BbCUCOE菌株时可将BbCUC基因的启动子替换为活性更强的启动子 B．BbCUC基因通过促进球孢白僵菌产孢结构的发生促进分生孢子的形成 C．可以利用抗原-抗体杂交技术检验目的菌株是否构建成功 D．BbCUCCOM表型并未完全与WT一致，说明导入后可能影响其他基因表达 【答案】B 【解析】A、超量表达菌株构建常采用强启动子(如组成型或诱导型高效启动子)替代原启动子，以增强目的基因转录水平，A正确； B、根据柱状图，BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC的分生孢子数量和产孢结构平均数量都高于野生型，说明BbCUC基因通过抑制球孢白僵菌产孢结构的发生抑制分生孢子的形成，B错误； C、Western-blot(抗原-抗体杂交)可检测BbCUC蛋白有无及表达量差异，是验证基因敲除、超表达及回补效果的可靠手段，C正确； D、回补菌株表型未完全恢复，可能因随机插入导致邻近基因表达受影响、拷贝数变异或表观遗传修饰，该解释合理，D正确。 故选B。 11．【表达与交流】（2026·四川广安·一模）为获得高产脂质的硅藻用于生产生物柴油，研究人员将苹果酸酶（ME）基因（长度约800 bp）构建到含新霉素抗性基因的超表达载体上，导入硅藻细胞。为验证转化是否成功，以野生型基因组、转化后硅藻基因组以及重组质粒为模板，使用可特异性扩增完整ME基因的引物进行PCR，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并测定条带亮度（相对值），结果如图所示，下列分析正确的是（    ） A．PCR过程中，引物作用是使Taq DNA聚合酶从其3'端开始连接核糖核苷酸 B．为确保ME基因正确插入载体，需在引物3'端加入不同的限制酶识别序列 C．转化后硅藻基因组检测到明显条带，说明ME基因已整合到其染色体DNA上 D．为评价所获硅藻品系的生产潜力，还需检测其生长速率与胞内脂质含量 【答案】D 【解析】A、PCR使用DNA聚合酶连接脱氧核糖核苷酸（dNTP），不是核糖核苷酸。而且引物是提供 3'-OH 末端让聚合酶延伸 DNA 链，A错误； B、设计引物时，在5' 端加酶切位点（用于克隆时引入酶切位点），不是在 3' 端，3' 端必须与模板匹配以保证扩增特异性。而且“不同限制酶识别序列”不是必须的（有时只需同种两端不同酶），B错误； C、转化后硅藻基因组检测到明显条带，可能ME基因整合到质粒上，质粒进入转化后的硅藻，不能说明ME基因已整合到其染色体DNA上，C错误； D、因为实验目的是获得高产脂质的硅藻用于生物柴油，仅验证基因转入还不够，必须评估实际表现：生长速率（影响培养产量）和脂质含量（影响产油率）是关键生产指标，D正确。 故选D。 12．【表达与交流】（2026·上海浦东新·一模）诺沃霉素的生产 植物病害大多由真菌感染导致。诺沃霉素是由链霉菌（需氧型微生物）产生的一种代谢产物，具有良好的广谱抗真菌活性。 (1)通过大规模培养链霉菌生产诺沃霉素，用到的技术是（    ）（单选） A．细胞融合技术 B．转基因技术 C．微生物培养技术 D．干细胞技术 (2)大规模培养链霉菌，需采用的措施有____________。（编号选填） ①使用固体培养基     ②调节培养基的pH   ③延长光照时间 ④实时监测氧气条件   ⑤及时收集诺沃霉素  ⑥生产过程无菌操作 研究表明，来自透明颤菌的V蛋白（由V基因控制）能够增强菌体呼吸作用，进而提升菌体对氧气的利用效率。通过基因工程获得能表达V蛋白的新型链霉菌，成为提升诺沃霉素产量的有效策略。相关途径如图1所示。 (3)基于上述信息可知，获得新型链霉菌的生物学原理是（    ）（单选） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体变异 D．诱变育种 (4)利用PCR技术从透明颤菌的基因组中获取V基因时，需要用到的引物必须含有的序列是：5'____________3'和5'_________3' (5)图中培养皿B和培养皿C中应添加的抗生素分别是__________和__________；培养皿B和C的1~3和1'~3'中，含有符合育种目标的工程菌株是__________（填编号） 质粒pSET152上的启动子（RNA聚合酶结合的特定DNA序列，与转录起始有关）不同也会影响诺沃霉素的产量。研究人员比较五种启动子（P1、P2、P3、P4和PS）介导下5种新型链霉菌中V基因的表达水平（图1），以及这5种新型链霉菌和原始菌株的诺沃霉素产量（图2）。 (6)根据上述信息，结合已有知识推测，五种启动子应分别插在图1中质粒pSET152的位置是（    ）（单选） A．ori B．PO C．Ampr D．Ter’ (7)综合上述信息并结合已有知识，分析导入P3启动子后诺沃霉素的产量比原始菌株高，但比导入P2启动子的菌株产量低的原因_________。 【答案】(1)C (2)②④⑤⑥ (3)B (4) GAATTC GGATCC (5) 氨苄青霉素 四环素 1、3 (6)B (7)据图2和图3可知，P3启动子导入链霉菌后增强了V蛋白的表达，进一步增强 了菌体的呼吸作用，提升菌体对氧气的利用效率，有利于细胞的代谢活动的进行，因此诺沃霉素的产量比原始菌株高。但是与导入P2启动子组相比，虽然V蛋白的表达量显著高于该 组，但是由于导入P3启动子组的细胞中更多的物质和能量用于了V蛋白的合成，使得异源 蛋白的高表达给细胞带来了额外的代谢负担，从而导致诺沃霉素的产量比导入P2启动子低 【解析】（1）大规模培养链霉菌（微生物）生产诺沃霉素，需要用到微生物培养技术来提供适宜的环境，让链霉菌大量繁殖并产生代谢产物。C符合题意，ABD不符合题意。 故选C。 （2）①链霉菌的大规模培养一般使用液体培养基，这样有利于菌体与营养物质充分接触以及代谢产物的扩散等，而不是固体培养基，①不符合题意；②不同微生物生长对培养基pH有不同要求，调节培养基的pH可满足链霉菌生长需求，②符合题意；③链霉菌是需氧微生物，其生长与光照无关，不需要延长光照时间，③不符合题意；④链霉菌是需氧微生物，实时监测氧气条件可保证其正常生长和代谢，④符合题意；⑤及时收集诺沃霉素可避免其在培养体系中积累可能带来的反馈抑制等问题，⑤符合题意；⑥生产过程无菌操作可防止杂菌污染，保证链霉菌的正常生长和诺沃霉素的产量与质量，⑥符合题意。大规模培养链霉菌，需采用的措施有②④⑤⑥。 （3）通过基因工程获得新型链霉菌，基因工程的原理是基因重组，将透明颤菌的V基因导入链霉菌，使链霉菌获得新的性状。B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 （4）要从透明颤菌的基因组中获取V基因，利用PCR技术时，引物需要与V基因两端的序列互补。结合图中V基因的两端序列（以及限制酶切割位点等信息）可知，V基因两端分别是限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的切割位点，所以需要用到的引物必须含有的序列是5'GAATTC3'和5'GGATCC3'。 （5）由图可知，重组质粒中氨苄青霉素抗性基因完整，四环素抗性基因被破坏，据图可知，C培养基中有些位点没有菌落，所以培养皿B中应添加氨苄青霉素，培养皿C中应添加四环素；含有符合育种目标的工程菌株应是含有重组质粒的菌株，由于重组质粒中四环素抗性基因被破坏，所以在含有四环素的培养皿C中不能生长，在含有氨苄青霉素的培养皿B中能生长，因此培养皿B和C的1-3和1'-3'中，含有育种目标的工程菌株是1和3。 （6）启动子是RNA聚合酶结合的特定DNA序列，与转录起始有关，应该插入在目的基因上游调控目的基因转录，PO是启动子区域，五种启动子应分别插在该位置来调控基因表达。B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 （7）据图2和图3可知，P3启动子导入链霉菌后增强了V蛋白的表达，进一步增强 了菌体的呼吸作用，提升菌体对氧气的利用效率，有利于细胞的代谢活动的进行，因此诺沃霉素的产量比原始菌株高。但是与导入P2启动子组相比，虽然V蛋白的表达量显著高于该 组，但是由于导入P3启动子组的细胞中更多的物质和能量用于了V蛋白的合成，使得异源 蛋白的高表达给细胞带来了额外的代谢负担，从而导致诺沃霉素的产量比导入P2启动子低。 13．【表达与交流】（2025·浙江绍兴·一模）某双链DNA病毒，可引起急性传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。为了该急性传染病的早期诊断进行了下列研究，回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒。PCR扩增目的基因时，退火的温度主要取决于________（答出两点）。PCR过程中因参与合成反应不断消耗而浓度下降的组分有______。对基因A的PCR扩增产物和质粒（该质粒的部分结构和限制酶切割位点如下图所示，三种限制酶切割后形成的黏性末端不同）进行双酶切，随后用DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，A基因转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入用______处理的大肠杆菌，培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是_______（答出两点）。若成功制备得到蛋白A，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物结构出现异常，可能的原因是_______。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。与植物体细胞杂交相比，诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的特有方式是______。杂交瘤细胞进行克隆化培养和筛选时，可通过______操作确保一个培养孔中接种一个细胞。取培养孔中的______（填“细胞”或“上清液”）进行抗体检测，筛选获得能分泌所需抗体的细胞。大量培养这些细胞，产生的抗体就可以用于该急性传染病的早期诊断。 【答案】(1) 引物的碱基组成和长度 脱氧核苷三磷酸（dNTP）、引物 BamHI CaCl2 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达，A基因丢失 A基因发生了变异 (2) 灭活的病毒诱导 梯度稀释 上清液 【解析】（1）退火温度主要取决于引物的长度、引物的 GC 含量（引物越长、GC 占比越高，退火温度越高）；PCR 过程中，引物、脱氧核苷三磷酸（dNTP）会因参与合成反应被消耗，浓度下降（DNA 聚合酶是耐高温的，不会被消耗）； A基因转录模板链的5'端对应的是RNA3'端，转录产物RNA从5'到3'的开始转录，所以A基因转录模板链的5'端最好与终止子连接，转录到终止子就会终止转录，使用BamHI限制酶酶切最好；重组质粒导入大肠杆菌前，需用Ca²⁺（或 CaCl₂）处理大肠杆菌，使其处于感受态，重组质粒容易导入大肠杆菌；收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，原因是蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外，基因A未表达，A基因丢失，蛋白A错误折叠（未正确表达）。 （2）动物细胞融合的特有方式是使用灭活的病毒诱导融合（植物细胞融合和动物细胞融合共有的方法包括PEG融合法和电融合法）；保证一个培养孔中接种一个细胞的操作是梯度稀释（或有限稀释法），确保一个培养孔中接种一个细胞；杂交瘤细胞分泌抗体到培养液中，因此取上清液进行抗体检测。 14．【制定计划与设计实验】（2026·甘肃陇南·一模）生物柴油作为新型能源已成为世界上广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究发现，油料作物紫苏具有产油基因DGAT1，现利用基因工程的技术，获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。图1、图2是获得产油微藻的基因工程操作程序，回答以下问题。 (1)图1为构建DGAT1基因文库的过程，①代表______过程。 (2)现需将DGAT1基因通过PCR技术进行扩增，在扩增DGAT1基因时，需要根据______设计特异性引物序列。 (3)利用转基因技术获得产油微藻的核心步骤为：______，据图2分析，该过程需要选择______限制酶切割DGAT1基因。 (4)为了保证DGAT1基因能够在微藻细胞中表达，应该将pBI121质粒上的启动子替换为______。 (5)用______方法检测微藻细胞中是否插入了DGAT1基因并转录出了相应的mRNA；若要进一步判断DGAT1基因是否成功表达，需要加入______进行检测。 检测指标 总氮/（mg·L-1） 总磷/（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 地热废水培养基 23.2 4.32 4.56 培养转基因产油微藻11d后 1.9 0.45 0.84 (6)为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表所示。 该实验不能说明产油微藻对地热废水有去污能力，请进一步完善实验______。 （1）逆转录 （2）DGATl基因两端的核苷酸序列 （3）基因表达载体的构建;XbaⅠ和HindⅢ （4）微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子 （5）DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法;DGAT1抗体 （6）添加用地热废水培养普通微藻的对照组，在相同条件下培养11d后检测总氮、总磷和氟化物的含量 【答案】(1)逆转录 (2)DGAT1基因两端的核苷酸序列 (3) 基因表达载体的构建 XbaⅠ和HindⅢ (4)微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子 (5) DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法 DGAT1抗体 (6)添加用地热废水培养普通微藻的对照组，在相同条件下培养11d后检测总氮、总磷和氟化物的含量 【解析】（1）由图1可知，①由mRNA到cDNA，该过程表示逆转录。 （2）现需将DGAT1基因通过PCR技术进行扩增，在扩增DGATI基因时，需要根据DGATI基因两端的（已知）核苷酸序列设计特异性引物序列。 （3）基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，所以利用转基因技术获得产油微藻的核心步骤为:基因表达载体的构建;构建表达载体过程中需要将目的基因插入载体（质粒）的启动子和终止子之间，目的基因和质粒相连需要具有相同的黏性末端，为了防止目的基因和质粒自身环化，目的基因和质粒均需要采用双酶切法;由图2可知，pBI121质粒启动子和终止子之间存在四种限制酶，即EcoRI、BamH I、XbaI和Hind Ⅲ，而DGATI基因序列中间含有BamHI酶切位点，采用其酶切会将目的基因切开，可见不能选用BamHI酶切，而DGAT1基因转录方向由左向右，综合pBI121质粒的酶切位点、目的基因两端酶切位点及转录方向等因素，需要选择XbaI和Hind Ⅲ限制酶切割DGATI基因。 （4）启动子是RNA聚合酶识别及结合的位点，是基因转录的起始标志，其具有特异性，为了保证DGAT1基因能够在微藻细胞中表达，应该将pBI121质粒上的启动子替换为微藻细胞中能特异性表达的基因的启动子。 （5）若要检测微藻细胞中DGAT1基因及其转录出的mRNA，属于分子水平上的检测转录产物，可以采用DGAT1基因探针或者PCR或者分子杂交法;判断产油微藻细胞中DGAT1基因是否成功表达，属于分子水平上检测翻译的产物--蛋白质，用抗原-抗体杂交技术，需要加入DGAT1抗体检测。 （6）实验缺少对照组，不能确定是不是普通微藻本身有去污能力，所以需要增加一组实验，即添加用地热废水培养普通微藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量。 15．【分析结果与得出结论】（2026·广东佛山·二模）“端稳中国碗，装满中国粮”。水稻是我国主要粮食作物之一，稻黄单胞菌能分泌相应的蛋白质进入水稻叶肉细胞，使细胞转变为有利于该菌生长繁殖的状态，从而引起白叶枯病，导致产量下降。为培育好中国粮种，科研人员在基因工程育种领域开展相关研究。 (1)水稻白叶枯病的易感病与抗病是一对由S/s基因控制的相对性状，图1为该病的遗传关系图，可以判断白叶枯病的抗病基因是___________(填“显性”或“隐性”)基因，F2表型及比例是___________。 (2)已知特定蛋白与启动子结合后能激活相应基因的表达。为研究水稻感病与抗病机理，科研人员进行如下实验：构建不同“启动子-报告基因”(图2)表达载体，并分别与含有稻黄单胞菌T蛋白基因或A蛋白基因的表达载体同时转化到烟草叶片中，随后将上述烟草叶片培养于含X-Gluc的培养基中，结果如图3所示。 ①该实验设计用以探究S/s基因启动子与何种蛋白结合。实验的空白对照组操作为将___________转化到烟草叶片中。 ②据实验结果推测，某对照基因启动子能与___________(填“T”或“A”)蛋白结合S/s基因启动子与T蛋白和A蛋白结合的具体情况为___________。 (3)据该实验结果推测，具有抗病性状的水稻植株抗病机理可能是___________。研究发现，并非所有稻黄单胞菌都能使易感病水稻患白叶枯病，据上述研究推测可能的原因是___________。 (4)基于上述研究，请从分子水平提出一种培育水稻抗白叶枯病新品种的思路：___________。 【答案】(1) 隐性 抗病：易感病=1:3 (2) 不含启动子的报告基因表达载体分别与含有稻黄单胞菌T蛋白基因或A蛋白基因的表达载体同时 A S基因启动子只能与T蛋白结合，不能与A蛋白结合，s基因启动子既不能与A蛋白结合，也不能与T蛋白结合 (3) 病菌T蛋白与s基因启动子不能结合，无法激活s基因表达，从而使水稻抗病 不同稻黄单胞菌分泌的T蛋白存在差异，部分T蛋白无法结合水稻细胞 (4)启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于启动基因转录，利用基因编辑技术，改造水稻S基因的启动子序列会导致S基因不能表达（或者敲除感病水稻的S基因会导致S基因不能表达） 【解析】（1）图1分析，纯合突变体（抗病）和野生型（易感病）杂交，子一代均表现为易感病，说明抗病基因为隐性基因，F1基因型为Ss，F2表型及比例是抗病：易感病=1:3。 （2）①本实验的目的是探究S/s基因启动子与何种蛋白结合能激活相应基因的表达，自变量是基因的种类，空白对照组的操作为将不含启动子的报告基因表达载体分别与含有稻黄单胞菌T蛋白基因或A蛋白基因的表达载体同时转化到烟草叶片中。 ②分析题意，报告基因编码β-葡萄糖醛酸酶，该酶可催化X-Gluc生成蓝色产物，特定蛋白与启动子结合后能激活相应基因的表达，该实验用以探究S、s基因启动子与何种蛋白结合，结合图3可知，S基因启动子可使病菌T蛋白变蓝，而不能使病菌A蛋白变蓝，s基因启动子不能使两种蛋白变蓝，说明S基因启动子只能与T蛋白结合，不能与A蛋白结合，s基因启动子既不能与A蛋白结合，也不能与T蛋白结合。某对照基因启动子可使病菌A蛋白变蓝，说明S基因启动子能与A蛋白结合。 （3）依据实验结果，推测水稻抗病机理是：病菌T蛋白与s基因启动子不能结合，无法激活s基因表达，从而使水稻抗病。并非所有稻黄单胞菌都能使感病水稻患白叶枯病，可能的原因是：不同稻黄单胞菌分泌的T蛋白存在差异，部分T蛋白无法结合水稻细胞。 （4）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于启动基因转录，利用基因编辑技术，改造水稻S基因的启动子序列会导致S基因不能表达，或者敲除感病水稻的S基因会导致S基因不能表达，从而培育水稻抗白叶枯病新品种。 / 学科网（北京）股份有限公司 $