专题12 基因工程（期末真题汇编，江苏专用）高三生物上学期

专题12 基因工程 6大高频考点概览 考点01 目的基因的筛选、获取 考点02 基因表达载体的构建 考点03 将目的基因导入受体细胞 考点04 目的基因的检测与鉴定 考点05 基因工程的基本工具 考点06 基因工程的应用 地 城 考点01 目的基因的筛选、获取 1．(24-25高三上·江苏无锡·期末)下列有关高中生物学实验的归纳，正确的是（    ） 组别 目的 原理或方法 结果或结论 ① 观察比较多种细胞 归纳法 都有细胞膜、细胞核等 ② 比较H2O2在不同条件下的分解 加法原理 酶的催化效率更高 ③ 研究土壤中小动物类群丰富度 样方法 不同群落物种丰富度不同 ④ DNA片段的扩增 DNA在一定pH下带负电 合成新的DNA链 A．组别① B．组别② C．组别③ D．组别④ 2．(23-24高三上·江苏·期末)农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是（　　） A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点 B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA 的插入位置 3．(23-24高三上·江苏扬州宝应县·期末)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．PCR中DNA双链的解聚与结合利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA复制 B．PCR反应体系中需要加入大肠杆菌中的DNA聚合酶 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关 D．DNA分子在一定的pH下带电，在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动 4．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)下列关于PCR技术相关叙述正确的是（    ） A．DNA聚合酶可从引物的5端开始连接脱氧核苷酸 B．退火温度过低导致得不到任何产物，过高导致产生非特异性片段 C．PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用 D．扩增DNA片段的过程中，第n次循环共需要引物2n+1-2个 5．(24-25高三上·江苏淮安淮安中学·期末)有人说，生物学可分为两个阶段——有PCR技术的生物学和没有PCR技术的生物学。由此可见PCR技术对于生物学发展是举足轻重的。回答下列与PCR相关的问题： (1)PCR技术的中文名称是 ，其主要原理是 。初始的PCR是以大肠杆菌的DNA聚合酶为工具酶的，中国台湾钱嘉韵发现的Taq DNA聚合酶的应用为PCR的自动化创造了重要条件，原因是 。 (2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有______。 A．Taq DNA聚合酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (3)为了便于PCR扩增的胰岛素基因与质粒进行无缝连接，引物设计的主要依据有 。而PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为下图中 ，这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有 。 (4)一般地，首轮PCR之前预变性的目的是 。最后一轮PCR结束后应维持72℃下7min，其目的是 。 6．(23-24高三上·江苏·期末)PCR技术的发明可以说是生物学的分水岭，该技术对于目的基因的定点诱变也是非常重要的，目的基因的不同位置突变需求往往可以采用不同的策略。结合所学知识回答以下问题：    (1)PCR的主要原理是 ，dNTP的功能有 。 (2)若突变的碱基位于目的基因的末端，可以直接在设计 时直接予以考虑，但是最好不要太靠近 端，否则热稳定DNA聚合酶的延伸效率偏低（甚至无法延伸）。 (3)若突变碱基位于目的基因某一侧，可以采用如图1所示的“大引物PCR技术”，在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物： 引物A： 5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA- 3'（下划线字母为突变碱基） 引物B： 5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列） 引物C： 5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列） 则PCR1中使用的引物有 ，PCR2中使用的引物有 和图中大引物的 （选填“①”或“②”）链。 (4)若突变碱基位于目的基因中央时，可以采用如图2所示的PCR技术，图2中4次PCR对引物的使用不完全相同，如PCR1选择引物A和B，PCR2选择引物C和D，请问PCR3和PCR4应分别如何选择引物： 、 。 PCR1和PCR2 （选填“能”或“不能”）在同一个反应体系里面进行，主要原因是 。 7．(24-25高三上·江苏常州·期末)目前检测SARS-Cov-2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT-PCR(RT-qPCR)，该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题： (1)RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 酶作用生成cDNA． (2)PCR时，需加入荧光染料(如图1中的SYBRGreenI)。进行阶段2时，引物与cDNA按照 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 酶催化子链的合成。 (3)科研人员通过实时荧光RT-PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。 ①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 。 ②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光 阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。 ③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 。 (4)科研人员又发明了一种无逆转录-指数扩增反应技术(RTF-EXPAR)，该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS-Cov-2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA-X”含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA-X”可与两个重复序列(X’和X')结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。 ①模板链X'-X'的序列为：5'-GGTATTTGGTTTACCCTGTGAGACTCTGGTATTTGGTTTACCCT-3'，其中的5'-GACTCT-3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA-X"延伸的DNA链切断，切口酶切开的是 键。“触发DNA-X”的序列是5' 3’。 ②RTF-EXPAR比RT-qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 。 ③尽管RTF-EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 ，导致扩增效率降低。 地 城 考点02 基因表达载体的构建 8．(23-24高三上·江苏·期末)如图1所示，1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）由包膜和核衣壳两部分组成，核衣壳包括衣壳蛋白、两条单链RNA、逆转录酶等。图2是HIV侵入人体细胞后的增殖过程。请分析回答下列问题： (1)与T2噬菌体相比，HIV具有的包膜来自 ，感染细胞时膜外蛋白gp120主要与 细胞表面的CD4受体结合，其构象改变导致与gp41分离。独立的跨膜蛋白gp41由于含有较多的 （选填“疏水”或“亲水”）性氨基酸残基，可部分插入宿主细胞的质膜,在细胞表面辅助受体CCR5等的参与下，造成包膜与细胞（质）膜的融合。HIV含有2条相同的RNA链，推测其主要意义是 。 (2)研究发现，被HIV 潜伏感染的细胞表面没有HIV的蛋白（此时的病毒称为“原病毒”），对HIV而言，主要意义是 。参与过程①的酶也参与过程②，由此可推测逆转录酶的功能有 （①催化DNA链的延伸 ②催化RNA链延伸 ③切割DNA分子）。 (3)潜伏期之后，原病毒利用宿主细胞的转录和翻译系统形成子代病毒组装的“原件”，此时宿主细胞膜上会出现HIV的蛋白，其主要意义是 。研究还发现HIV基因组可以产生一个miRNA，可以降低细胞凋亡通路下游基因ERCC1和IER3表达，其主要意义是 。 (4)目前已批准的抗HIV药物主要有核苷酸型反转录抑制剂和反转录酶抑制剂两类，由于核苷酸型反转录抑制剂与脱氧核苷酸结构相似，掺入后导致图2中过程①受阻。与之相比反转录酶抑制剂类药物副作用较小，其原因是 。 (5)迄今为止,虽然对艾滋病研究高度重视，仍然无药物可以彻底治愈艾滋病，故预防仍然是上策，下列做法有助于预防艾滋病传播的有 。 ①采取安全的性行为，如使用避孕套 ②接受检测并积极治疗HIV ③不与他人共用牙刷、剃须刀等 ④不与HIV感染者握手、拥抱 9．(23-24高三上·江苏扬州宝应县·期末)某研究小组利用转基因技术，将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3基因的载体中，载体和目的基因所在DNA上的限制酶识别位点及PCR扩增使用的相关引物如图甲所示。实验获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只，利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。回答下列问题： (1)为了使RFP基因能正确插入载体中，在PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的（填“3”或“5”） 端需分别插入 、 的限制酶识别序列。 (2)引物的另一端将会进行的过程是在 酶的催化下，以 为模板将 。 (3)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，共需要 种酶的参与。 (4)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得若干F1，利用荧光蛋白活体成像系统检测后，随机取阳性小鼠并随机进行交配获得8只F2小鼠，其表型及比例为阳性:阴性=5:3，为从F2阳性小鼠中获得Gata3-RFP基因纯合子小鼠，研究人员从这些阳性小鼠中提取Gata3基因相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物如图乙所示，则 号小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠。若用引物A和引物B进行PCR， （填‘能”或“不能”）更好地区分杂合子和纯合子。 10．(24-25高三上·江苏常州·期末)肿瘤是细胞异常增生形成的疾病，对人体健康造成严重危害。请回答下列问题： (1)人体可通过 免疫清除体内的肿瘤细胞，体现了免疫系统具有 功能。但是肿瘤细胞表面可表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞活化，进而实现免疫逃逸。故可通过注入 抗体来阻断这一免疫逃逸通路。 (2)科研人员通过蛋白质工程在患者T细胞膜表面表达针对特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗，称为CAR-T疗法，具体操作如下。 操作目的 具体操作 从患者的外周血中分离T淋巴细胞 利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性，常采用① 法将其与血清、红细胞等成分精细分离，进而进一步纯化提取T淋巴细胞 ② T淋巴细胞 利用人工刺激的抗原呈递细胞(APC)处理T淋巴细胞 将CAR基因导入T淋巴细胞 构建③ 载体，利用载体将CAR基因转移到T细胞中 CAR-T细胞体外扩增 对改造后的CAR-T细胞进行体外传代培养 回输患者体内 临床常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内 (3)相比于(1)中的阻断免疫逃逸通路方法，CAR-T疗法的优点是 。但CAR-T回输到体内后释放的细胞因子往往会进一步活化免疫细胞，进而释放更多细胞因子导致机体发热，这种调节方式属于 反馈，该综合征在临床上常用 激素加以缓解。 (4)为实现对CAR-T疗法进行时空精准操控，科研人员对靶向hCD19抗原的CAR-T细胞进行了优化设计，获得了对蓝光响应的CAR-T细胞(LiCAR-T)，并进行了相关实验，结果如图所示。结果表明，LiCAR-T细胞能够在 的刺激下，特异且严格的杀伤肿瘤细胞。 地 城 考点03 将目的基因导入受体细胞 11．(23-24高三上·江苏无锡南菁高级中学·期末)为获得导入R基因的转基因小鼠，科研人员进行了如下图所示的操作过程。相关叙述正确的是（    ） A．过程①需用促性腺激素处理以获得更多的卵母细胞 B．过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵 C．过程③需使用药物抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 D．过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态 12．(24-25高三上·江苏扬州·期末)I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。研究人员基于益生大肠杆菌（EcN）设计了一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌（EcN-HT）用于治疗HT1模型小鼠，如图1所示。其中，基因TyrP（编码酪氨酸转运蛋白TyrP）和基因HpaBC（编码酶HpaBC，催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA）均为目的基因。图2表示质粒pUC57的结构示意图、相关限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题： (1)肠道微生物与人体健康密不可分。EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网，可抑制病原菌的侵袭，这种防御属于机体的 免疫。图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有 （填序号）。 ①内质网  ②核糖体  ③细胞膜  ④高尔基体 (2)图2中pfnr的基本组成单位是 。在 条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。 (3)为实现高效构建重组质粒并筛选获得EcN-HT工程菌，研究人员开展以下实验： Ⅰ．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。 ①获取基因TyrP； ②选用限制酶EcoRI和SmaI，分别切割 ，构建重组质粒pUC57-T； ③将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上，培养一段时间后，菌落呈 色的为目的菌株EcN-T。 Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。 ④获取基因HpaBC； ⑤选用限制酶 ，构建重组质粒pUC57-H； ⑥将pUC57-H导入EcN-T，并将其接种在培养基乙上，以筛选出含双质粒的菌株EcN-HT。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是 。 (4)图3显示目的基因TyrP两端的部分碱基序列，为获得能与质粒pUC57相连接的目的基因，PCR时设计的引物应选用______。    A．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-TGTTACGAATTC-3' B．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-CATTGTGAATTC-3' C．5'-GAATTCAAGGCA-3'和5'-CCCGGGCATTGT-3' D．5'-GAATTCTGTTAC-3'和5'-CCCGGGAAGGCA-3' (5)本实验将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒导入受体细胞，与装载在同一个质粒的方法相比，优点有______。 A．提高导入受体细胞的效率 B．降低基因逃逸的可能性，不存在生物安全风险 C．增强基因表达的灵活性 D．提高基因的稳定性，增强治疗的效果 (6)进一步研究表明，EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是 。 地 城 考点04 目的基因的检测与鉴定 13．(24-25高三上·江苏扬州·期末)“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（    ） A．在添加尿素的马铃薯琼脂培养基上可筛选出能分解尿素的细菌 B．只要筛选出含有抗冻基因的番茄细胞，就代表抗冻番茄培育成功 C．取内细胞团细胞进行性别鉴定，可筛选出胚胎用于制备动物乳腺生物反应器 D．在临床试管婴儿术中，需利用遗传学诊断的方法筛选出所需的胚胎进行移植 14．(24-25高三上·江苏部分高中·期末)SBPase基因编码的酶是卡尔文循环的关键酶。为提高甜菜的光合效率和产量，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，获得如图1的表达载体。请回答下列问题： (1)图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，还未指示出的结构元件有 ，其中启动子的功能是 。 (2)人工合成SBPase基因后进行扩增，正确选择引物后对目的基因进行PCR，PCR程序设置如图2所示，其中，60℃20s环节的目的是 。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，一般还需要添加Mg2+，添加Mg2+的作用是 。 (3)获取的PCR产物还需要经凝胶电泳鉴定。通常DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将PCR样品加入 电极端的点样孔内。电泳之后切割凝胶再将其溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。 (4)研究人员采用不对称PCR技术扩增大量单链DNA片段，用于目的基因的检测。现有不等量的一对引物A和B，经若干次循环后，引物A被消耗尽，之后的循环只产生高浓度引物B的延伸产物，获得大量单链DNA．若反应体系中原有200个模板DNA，最初8个循环后限制性引物A耗尽，再进行25个循环，理论上可制备的单链DNA有 个。 (5)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有氨苄青霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项有 。 (6)为便于纯化SBPase酶蛋白，现改进生产路线，另将小段TAP基因序列（标签）与SBPase基因相连，构建出能表达SBPase酶融合蛋白的重组DNA（如图3，F1、F2、R1、R2表示引物）。为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有 （填字母）。 15．(24-25高三上·江苏苏州·期末)玉米是一种C4植物，下图表示玉米的叶肉细胞和维管束鞘细胞（叶绿体无基粒）中部分物质代谢过程，其中Rubisco和PEPC代表参与代谢的酶。请回答下列问题：    (1)据图可知，玉米叶片光反应发生在 的叶绿体中，固定CO2的场所有 和 。 (2)图中参与卡尔文循环的CO2来自 等过程，丙糖磷酸的去处有：在叶绿体中合成淀粉， 。玉米叶肉细胞包围在维管束鞘细胞四周，形成花环状结构，有助于维管束鞘细胞散失的CO2再次被 捕获。 (3)Rubisco是暗反应中的关键酶，其活性受到Rubisco活化酶（RCA）的调节。但玉米的RCA基因的表达水平低于C3植物水稻。研究人员在玉米植株中过表达水稻的RCA（OsRCA）基因，以期提高玉米的Rubisco活性，请完成下表。 实验目的 实验步骤 克隆OsRCA基因 提取水稻叶片总RNA，逆转录获得cDNA作为模板进行PCR 转基因玉米植株的获得 利用① 法将目的基因导入玉米细胞中，获得转基因玉米植株。 目的基因导入的检测 对WT和转基因植株叶片的DNA进行② 检测 ③ 的检测 采用实时荧光定量PCR（RNA检测技术）和Western-Blot（蛋白质检测技术）对转基因植株叶片作进一步检测 Rubisco活力的检测 称取0.1g鲜叶置于研钵中，加入1mL提取液进行研磨，离心后取④ （填“上清液”或“沉淀物”）进行Rubisco酶活力检测 光合特性的检测 进行WT和转基因植株的⑤ （填“真”或“净”）光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度的测定 16．(23-24高三·江苏苏州·期末)Ndrg2基因参与神经系统的发育和退行性疾病的发生和发展，并可参与血管的形成。为研究Ndrg2基因的功能，可利用染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP构建Ndrg2基因敲除小鼠（如下图1、2所示），并对其进行鉴定和表型分析。请回答下列问题：    (1)图1中LoxP序列的方向取决于序号 对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre重组酶切割后会增加 个游离的磷酸基团。 (2)当两个loxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre重组酶在此过程中的作用类似于 酶。当两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个loxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于 。 (3)构建Ndrg2基因敲除小鼠需要先构建Flox小鼠（该小鼠的Ndrg2基因两侧需插入Loxp序列）。为构建相应的基因表达载体，据图2分析，应选择限制酶 处理含有Ndrg2基因的DNA片段，而在处理质粒时应选用限制酶 。质粒中启动子的作用是 。 限制酶种类 识别序列及切割位置 BamHⅠ 5＇-G↓GATCC-3＇ BclⅠ 5＇-T↓GATCA-3＇ Sau3Ⅰ 5＇-↓GATC-3＇ HindⅢ 5＇-A↓AGCTT-3＇ EcoRⅠ 5＇-G↓AATTC-3＇ (4)将重组质粒导入小鼠 。经胚胎工程获得杂合Flox小鼠（flox/+）,之后雌雄小鼠相互交配可获得纯合Flox小鼠。 (5)构建Ndrg2基因敲除小鼠还需要构建Cre转基因小鼠（cre/+）（Cre基因上游添加有造血干细胞基因启动子EDAG）。已知Ndrg2基因与Cre重组酶基因独立遗传，现将纯合Flox小鼠（flox/flox）与Cre转基因小鼠（cre/+）交配，将F1中的双杂合小鼠雌雄交配，获得造血干细胞中Ndrg2基因完全敲除的小鼠的概率为 。 (6)以下能说明造血干细胞中Ndrg2基因完全敲除小鼠构建成功的有 。 ①小鼠不同组织中提取的DNA可检测到cre基因 ②小鼠造血干细胞中Ndrg2基因的mRNA基本为零 ③利用抗原抗体杂交技术在造血干细胞中检测不到有Ndrg2蛋白 17．(24-25高三上·江苏苏州·期末)羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： (1)为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生 。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后， （填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是 。 (2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带 最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 (3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶 识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是 。 (4)转化时常用 处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有 的培养基筛选大肠杆菌，挑选 色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 地 城 考点05 基因工程的基本工具 18．(24-25高三上·江苏扬州·期末)下列关于高中生物学实验的叙述，正确的是（    ） A．黑藻可替代紫色洋葱鳞片叶用于探究植物细胞的吸水和失水 B．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同且能溶于冷酒精 C．在观察叶绿体和细胞质的流动实验中，可观察到叶绿体中的类囊体结构 D．苯酚品红溶液能将活细胞中染色体染成深色，体现了生物膜的选择透过性 19．(23-24高三·江苏苏州·期末)当细胞接受到凋亡信号后，位于线粒体内膜上的细胞色素c（参与电子传递）会释放进而引发细胞凋亡。研究人员用某种药物处理家蚕细胞不同时间后，用凝胶电泳法测定细胞不同结构中细胞色素c及微管蛋白的含量，结果如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．细胞色素c参与有氧呼吸第三阶段的化学反应 B．在细胞中含量比较稳定的微管蛋白可作为实验参照 C．该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质 D．凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是所带电荷性质 20．(24-25高三上·江苏扬州·期末)为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可充分破碎细胞，从而获得真菌粉末 B．NaOH的碱性条件可以进一步破坏细胞结构，使DNA从细胞中释放出来 C．缓冲液除了中和碱性物质外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能 D．提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性 21．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)下列有关实验的方法、现象和解释的叙述合理的是（    ） A．向DNA粗提取溶液中加入二苯胺试剂不显蓝色是由于DNA含量太低 B．观察洋葱根尖有丝分裂时，分生区细胞都呈正方形 C．利用血球计数板对酵母菌进行计数时，可以观察到酵母菌的细胞膜、细胞核、线粒体等 D．利用洋葱鳞片叶外表皮进行质壁分离实验中，若发现某一细胞从紫色变成无色，可能是细胞失水过多而死亡 22．(23-24高三·江苏扬州·期末)以洋葱为实验材料可进行多项实验。下列叙述错误的是（    ） A．用一定浓度的尿素溶液处理洋葱鳞片叶细胞，可观察到质壁分离和自动复原现象 B．以洋葱为材料进行DNA粗提取时，加入的研磨液中往往含有洗涤剂和食盐 C．显微镜观察洋葱根尖分生区的一个视野中，往往看不到细胞周期各时期的图像 D．向洋葱根尖研磨液中加入双缩脲试剂后未出现紫色反应，表明该根尖中不含蛋白质 23．(23-24高三上·江苏常州教育学会·期末)下图1是QuickChange定点突变技术及副反应的示意图，其中的F和R代表引物，其上含有突变的碱基序列。请回答下列问题。 (1)图中PCR反应体系进行时，除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外，还需加入的物质有 。 (2)已知DpnI酶是一种限制酶，能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知，在原始质粒上有 （选填“0”“1”或“很多”）个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒，应对来自大肠杆菌的原始质粒进行的处理是 。 (3)图中的DH5a细胞是处于 的大肠杆菌，对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加 酶。图中副反应发生的原因是新链退火时，两条新链互补配对，互为复制的 ，扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外，还存在的不足是 。 (4)研究人员对QuickChange定点突变技术进行了改进，在两个PCR体系中分别加入单引物F或R，具体过程下图2。 ①单引物PCR1过程中，假设原始质粒有n个，每循环一次产生 个双链DNA，循环30次需要 个引物F。 ②与QuickChange定点突变技术相比，单引物PCR除了能解决第（3）问中的不足，还存在的优点是 24．(24-25高三上·江苏无锡·期末)质体是植物细胞中一类常见的细胞器（如叶绿体），质体转化通常需要构建相应的质粒载体，而传统的载体构建依赖大肠杆菌感受态细胞等问题。某科研团队利用人工重组的pYY12质粒和人工合成的线性DNA片段（A、B1、B2和B3）进行烟草质体转化及转化效果比较的实验。图1是野生型烟草质体基因组中一片段（ptDNA）图谱，X为目标基因的插入位点；图2是使用pYY12质粒和线性片段A、B1Z、B2Z、B3Z产生的转基因质体中的基因组内片段图谱，其中HS1（500bp）、HS2（200bp）、HS3（50bp）为同源序列，gfp为绿色荧光蛋白基因，aadA的表达产物具有壮观霉素和链霉素的抗性。请回答下列问题：    (1)高等植物细胞中的基因组有三类：质体基因组、线粒体基因组和 基因组，其中 基因组具有半自主性。 (2)外源基因在质体DNA上的插入位点X位于基因trnfM和trnG之间的非编码序列，以基因间的序列作为插入位点的优点有 （答出一点即可）。 (3)研究人员依据质粒pYY12上的功能区段（图2中两长虚线间），设计用于质体转化的线性DNA片段（A、B1、B2、B3和Z）并进行PCR扩增，反应程序均为98℃3min，98℃10s，58℃15s，72℃3min，3个循环，72℃10min，其中98℃3min的目的是 ；图2中，Prrn为gfp的启动子，其作用是 ，与Prrn有类似功能的是 。 (4)研究人员将pYY12质粒、A、B1和Z混合物（B1Z）、B2和Z混合物（B2Z）、B3和Z混合物（B3Z）包裹的金属颗粒用基因枪轰击烟草幼叶，然后将轰击后的叶片样品切成小块，在含有壮观霉素的RMOP培养基（含BA和NAA的MS培养基）上初筛，然后在含有壮观霉素和链霉素的RMOP培养基上复筛，结果如图3。    ①在片段B（B1、B2、B3）和片段Z连接重组的过程中，HS（HS1、HS2、HS3）起 的作用。 ②复筛时，培养基中同时加入壮观霉素和链霉素是为了去除 突变体。 ③根据图3，可以得出的结论有 。 (5)为进一步检测筛选获得的烟草植株是否为稳定遗传的阳性转基因系，科研人员随机选取甲、乙、丙三个测试对象，提取叶片DNA样品用限制酶 消化，通过 分离后使用特定引物进行PCR，然后再对PCR阳性的测试对象使用特异性探针进行DNA分子杂交，发现甲、乙只显示出6301bp的杂交信号，丙显示出6301bp和3491bp的杂交信号，说明 为能稳定遗传的阳性转基因系。 地 城 考点06 基因工程的应用 25．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。有一对夫妇均为镰形细胞贫血致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为这对夫妇和孩子核酸分子杂交诊断的结果示意图。下列相关叙述正确的有（    ）    A．与图中正常基因模板链杂交的探针碱基对应序列为“5'—AACTCGT-3'” B．根据凝胶电泳带谱分析，基因纯合的是Ⅱ-2 C．该地区镰形细胞贫血患病率为1/10000，若Ⅱ-3与另一正常女子婚配，则生出患病孩子的概率为1/202 D．若将正常的血红蛋白基因成功导入患者的骨髓造血干细胞中，可用于治疗该病 26．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)透明质酸是一种应用广泛的粘性多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来协调菌体生长与产物生产之间的关系。 (1)图1中透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，由此可以推测H基因的转录是从其 （填“左侧”或“右侧”）开始的。透明质酸合成酶基因H上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该序列进行剪切的Xho识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为 。 (2)为通过外源添加诱导剂来控制基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为保证图1中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接，p质粒位点1和2的识别序列所对应的酶分别是 ，酶切后加入 酶使它们形成重组质粒。 (3)为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经 处理后的枯草芽孢杆菌（D菌），在含 的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌E（E菌）。对E菌进行工业培养时，培养基应先以蔗糖为唯一碳源，接种2小时后添加 ，以诱导E菌产生更多的透明质酸。 (4)质粒在细菌细胞中遗传不稳定、易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方法将H基因插入枯草芽孢杆菌D的基因组mpr位点，得到整合型枯草芽孢杆菌F（F菌）。请在图2方框中画出F菌的基因组 。 (5)对三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3， 最适宜工业发酵生产透明质酸，请阐明理由 。 27．(23-24高三上·江苏扬州·期末)人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题： 注1：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔 注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。 (2)当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。同源切割是一种代替 将目的基因导入基因表达载体的方法。 (3)阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (4)为了检验重组质粒是否构建成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物进行PCR扩增，则最好选择图2中的引物 。PCR反应体系中需加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等，再将扩增产物进行 来确定可用于导入酵母菌的重组质粒。 (5)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a．氨苄青霉素b．组氨酸c．无机盐d．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用 进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 (6)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题12 基因工程 6大高频考点概览 考点01 目的基因的筛选、获取 考点02 基因表达载体的构建 考点03 将目的基因导入受体细胞 考点04 目的基因的检测与鉴定 考点05 基因工程的基本工具 考点06 基因工程的应用 地 城 考点01 目的基因的筛选、获取 1．(24-25高三上·江苏无锡·期末)下列有关高中生物学实验的归纳，正确的是（    ） 组别 目的 原理或方法 结果或结论 ① 观察比较多种细胞 归纳法 都有细胞膜、细胞核等 ② 比较H2O2在不同条件下的分解 加法原理 酶的催化效率更高 ③ 研究土壤中小动物类群丰富度 样方法 不同群落物种丰富度不同 ④ DNA片段的扩增 DNA在一定pH下带负电 合成新的DNA链 A．组别① B．组别② C．组别③ D．组别④ 【答案】B 【详解】组别①：观察比较多种细胞，使用的是归纳法，但并不是所有细胞都有细胞核，如原核细胞没有细胞核，组别①错误； 组别②：比较H2O2在不同条件下的分解，运用的是控制变量法和对比实验，分别加入H2O2酶和Fe3+，运用的是加法原理，且该实验能得出酶的催化效率更高的结论，组别②正确； 组别③：研究土壤中小动物类群丰富度应该用取样器取样法，而不是样方法，组别③错误； 组别④：DNA片段的扩增是利用PCR技术，其原理是DNA双链复制，而不是因为DNA在一定pH下带负电，组别④错误。 综上所述，组别②正确，即B正确，ACD错误。 故选B。 2．(23-24高三上·江苏·期末)农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是（　　） A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点 B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA 的插入位置 【答案】D 【详解】AB、PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，该过程是先解旋后复制，不需要解旋酶，AB错误； C、DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误； D、T-DNA的插入会改变基因的排列顺序，可通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置，D正确。 故选D。 3．(23-24高三上·江苏扬州宝应县·期末)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．PCR中DNA双链的解聚与结合利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA复制 B．PCR反应体系中需要加入大肠杆菌中的DNA聚合酶 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关 D．DNA分子在一定的pH下带电，在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动 【答案】A 【详解】A、在PCR技术的过程中包括：高温变性（解链）→低温复性→中温延伸三个步骤，因此DNA两条链的解旋过程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA在高温下变性的原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，A正确； B、PCR反应体系中需要加入耐高温的DNA聚合酶，B错误； C、DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小有关外、还与DNA分子构象、凝胶的浓度等有关，C错误； D、根据电荷同性相斥、异性相吸引可知，DNA分子进行电泳时，会向着与其所带电荷相反的电极移动，D错误。 故选A。 4．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)下列关于PCR技术相关叙述正确的是（    ） A．DNA聚合酶可从引物的5端开始连接脱氧核苷酸 B．退火温度过低导致得不到任何产物，过高导致产生非特异性片段 C．PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用 D．扩增DNA片段的过程中，第n次循环共需要引物2n+1-2个 【答案】C 【详解】A、DNA聚合酶可从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误； B、退火温度过低会导致引物与模板链不能形成互补的碱基对，从而不能进行延伸，过高会导致引物与非特异性片段结合，进而产生非特异性片段，B错误； C、PCR反应体系中需加入TaqDNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，C正确； D、扩增DNA片段的过程中，第n次循环共需要引物[（2n+1-2）-（2n-2）]=2n个，D错误。 故选C。 5．(24-25高三上·江苏淮安淮安中学·期末)有人说，生物学可分为两个阶段——有PCR技术的生物学和没有PCR技术的生物学。由此可见PCR技术对于生物学发展是举足轻重的。回答下列与PCR相关的问题： (1)PCR技术的中文名称是 ，其主要原理是 。初始的PCR是以大肠杆菌的DNA聚合酶为工具酶的，中国台湾钱嘉韵发现的Taq DNA聚合酶的应用为PCR的自动化创造了重要条件，原因是 。 (2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有______。 A．Taq DNA聚合酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (3)为了便于PCR扩增的胰岛素基因与质粒进行无缝连接，引物设计的主要依据有 。而PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为下图中 ，这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有 。 (4)一般地，首轮PCR之前预变性的目的是 。最后一轮PCR结束后应维持72℃下7min，其目的是 。 【答案】(1)聚合酶链式反应 DNA半保留复制（DNA热变性） 其耐高温的特性是PCR可循环（高温变性→低温复性→中温延伸）进行的重要原因 (2)BC (3)胰岛素基因两侧（3′端）的序列、在5′端添加合适的酶切位点或同源序列 甲、丙 可扩增目的基因部分特异性序列，引物不必包含酶切位点或同源序列 (4)增加大分子DNA彻底变性的概率 使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列 【详解】（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA半保留的复制，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加，可以实现细胞外微量DNA分子的大幅增加。相比较人体细胞中的DNA聚合酶，参与PCR扩增的酶是TaqDNA聚合酶具有耐高温的特点，可实现高温变性下DNA复制的循环进行。 （2）A、Taq酶最适催化温度范围为60—70℃，即延伸时的温度，A错误； B、分析题意可知，热启动PCR进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，故可减少反应起始时引物错配形成的产物，B正确； C、DNA分子两条链反向平行，PCR扩增时引物加到3'端，复制时子链只能是从5′端向到3'端延伸，C正确； D、PCR产物DNA碱基序列的特异性是碱基互补配对的结果，不能体现TaqDNA聚合酶的特异性，D错误。 故选BC。 （3）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。因此为了便于PCR扩增的胰岛素基因与表达载体连接，需要确定胰岛素基因的3'端边界的DNA序列，且在两条引物上设计加入特定的限制酶识别序列，即在5'端添加合适的酶切位点或同源序列。识图分析可知，而用PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为图中的引物甲和引物丙，这样扩增出的DNA片段含有目的基因。这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有：鉴定时所用的引物与目的DNA进行碱基互补配对后，需要能够延伸并复制目的基因的部分特异性序列，因此引物不必包含酶切位点或同源序列；而扩增时的引物与目的基因3'端边界进行碱基互补配对后，必须能延伸并复制完整的目的DNA片段，必须包含酶切位点或同源序列。 （4）在PCR可扩增过程中，首轮PCR之前预变性的目的是增加大分子DNA彻底变性的概率，最后一轮PCR结束后维持最适温度（72℃、7min）一段时间，目的是使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列。 6．(23-24高三上·江苏·期末)PCR技术的发明可以说是生物学的分水岭，该技术对于目的基因的定点诱变也是非常重要的，目的基因的不同位置突变需求往往可以采用不同的策略。结合所学知识回答以下问题：    (1)PCR的主要原理是 ，dNTP的功能有 。 (2)若突变的碱基位于目的基因的末端，可以直接在设计 时直接予以考虑，但是最好不要太靠近 端，否则热稳定DNA聚合酶的延伸效率偏低（甚至无法延伸）。 (3)若突变碱基位于目的基因某一侧，可以采用如图1所示的“大引物PCR技术”，在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物： 引物A： 5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA- 3'（下划线字母为突变碱基） 引物B： 5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列） 引物C： 5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列） 则PCR1中使用的引物有 ，PCR2中使用的引物有 和图中大引物的 （选填“①”或“②”）链。 (4)若突变碱基位于目的基因中央时，可以采用如图2所示的PCR技术，图2中4次PCR对引物的使用不完全相同，如PCR1选择引物A和B，PCR2选择引物C和D，请问PCR3和PCR4应分别如何选择引物： 、 。 PCR1和PCR2 （选填“能”或“不能”）在同一个反应体系里面进行，主要原因是 。 【答案】(1)DNA的半保留复制/DNA热变性 提供原料和（子链延伸）能量 (2)特异性引物 3' (3)引物A和引物C 引物B ② (4)不使用引物 引物A和D 不能 引物B和引物C会互补配对而失效 【详解】（1）PCR是一种DNA的体外复制技术，其原理是DNA的半保留复制（DNA热变性），dNTP既可以作为能源物质提供能量，也可以作为合成DNA的原料。 （2）若突变的碱基位于目的基因的末端，可以根据剪辑互补配对原则，直接在设计特异性引物时直接予以考虑，若该位点太靠近3'端，由于无后续的碱基配对，导致其热稳定DNA聚合酶的延伸效率偏低。 （3）分析图1可知，在PCR1中，获取的是大引物，大引物中含有突变基因，所以应含有引物A，在基因的右端有限制酶SacⅠ识别序列，所以要用到引物C。在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5'到3'的序列的开始部位应含有限制酶HindⅢ识别序列，所以要用到引物B。而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5'到3'端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的②链。 （4）PCR3的两条链都是从头开始的，不需要引物即可顺着3'端延伸，PCR4最后要得的新的蛋白A基因，所以需要引物A和引物D，即从该基因的两条链的两端开始延伸。由于引物B和引物C会互补配对而失效，所以PCR1和PCR2不能在同一个反应体系里面进行。 7．(24-25高三上·江苏常州·期末)目前检测SARS-Cov-2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT-PCR(RT-qPCR)，该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题： (1)RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 酶作用生成cDNA． (2)PCR时，需加入荧光染料(如图1中的SYBRGreenI)。进行阶段2时，引物与cDNA按照 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 酶催化子链的合成。 (3)科研人员通过实时荧光RT-PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。 ①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 。 ②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光 阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。 ③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 。 (4)科研人员又发明了一种无逆转录-指数扩增反应技术(RTF-EXPAR)，该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS-Cov-2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA-X”含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA-X”可与两个重复序列(X’和X')结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。 ①模板链X'-X'的序列为：5'-GGTATTTGGTTTACCCTGTGAGACTCTGGTATTTGGTTTACCCT-3'，其中的5'-GACTCT-3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA-X"延伸的DNA链切断，切口酶切开的是 键。“触发DNA-X”的序列是5' 3’。 ②RTF-EXPAR比RT-qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 。 ③尽管RTF-EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 ，导致扩增效率降低。 【答案】(1)逆转录 (2)碱基互补配对 热稳定的DNA 聚合酶（Taq酶） (3)引物浓度下降、Taq酶的活性下降、原料dNTP浓度下降 越小 阳性 (4)磷酸二酯 AGGGTAAACCAAATACC 避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT-qPCR 更小 触发DNA-X不可避免地与模板的5'端杂交 【详解】（1）由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。 （2）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此进行阶段②时，引物与cDNA按照碱基互补配对原则进行特异性结合。在 PCR 循环的③延伸阶段，Taq酶催化子链的合成。 （3）平台期目的基因的数量几乎不再增长，有可能是引物浓度下降、Taq酶的活性下降、原料dNTP浓度下降导致的。样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct 值就越低。据图2可知荧光阈值大概是36，病毒核酸检测结果应判定为阳性。 （4）根据题意可知切口酶是将DNA链切断，因此该酶破坏的是磷酸二酯键，：根据题意可知5'-GACTC-3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA-X"延伸的DNA链切断切口酶切开，所以可推测“触发DNA-X”的序列是5'-AGGGTAAACCAAATACC-3'。据图可知RTF-EXPAR的过程避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT-qPCR 更小，因此RTF-EXPAR比RT-qPCR能更快速地检测病毒RNA。RTF-EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中触发DNA-X不可避免地与模板的5'端杂交，导致扩增效率低。 地 城 考点02 基因表达载体的构建 8．(23-24高三上·江苏·期末)如图1所示，1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）由包膜和核衣壳两部分组成，核衣壳包括衣壳蛋白、两条单链RNA、逆转录酶等。图2是HIV侵入人体细胞后的增殖过程。请分析回答下列问题： (1)与T2噬菌体相比，HIV具有的包膜来自 ，感染细胞时膜外蛋白gp120主要与 细胞表面的CD4受体结合，其构象改变导致与gp41分离。独立的跨膜蛋白gp41由于含有较多的 （选填“疏水”或“亲水”）性氨基酸残基，可部分插入宿主细胞的质膜,在细胞表面辅助受体CCR5等的参与下，造成包膜与细胞（质）膜的融合。HIV含有2条相同的RNA链，推测其主要意义是 。 (2)研究发现，被HIV 潜伏感染的细胞表面没有HIV的蛋白（此时的病毒称为“原病毒”），对HIV而言，主要意义是 。参与过程①的酶也参与过程②，由此可推测逆转录酶的功能有 （①催化DNA链的延伸 ②催化RNA链延伸 ③切割DNA分子）。 (3)潜伏期之后，原病毒利用宿主细胞的转录和翻译系统形成子代病毒组装的“原件”，此时宿主细胞膜上会出现HIV的蛋白，其主要意义是 。研究还发现HIV基因组可以产生一个miRNA，可以降低细胞凋亡通路下游基因ERCC1和IER3表达，其主要意义是 。 (4)目前已批准的抗HIV药物主要有核苷酸型反转录抑制剂和反转录酶抑制剂两类，由于核苷酸型反转录抑制剂与脱氧核苷酸结构相似，掺入后导致图2中过程①受阻。与之相比反转录酶抑制剂类药物副作用较小，其原因是 。 (5)迄今为止,虽然对艾滋病研究高度重视，仍然无药物可以彻底治愈艾滋病，故预防仍然是上策，下列做法有助于预防艾滋病传播的有 。 ①采取安全的性行为，如使用避孕套 ②接受检测并积极治疗HIV ③不与他人共用牙刷、剃须刀等 ④不与HIV感染者握手、拥抱 【答案】(1)宿主细胞的细胞膜（质膜） 辅助性T 疏水 病毒在宿主细胞中增殖时可以短时间内产生更多的子代，快速形成生存优势 (2)有助于在宿主免疫系统较强时逃避免疫系统的识别和攻击（“免疫较强”“免疫逃逸”） ①③ (3)有助于宿主细胞裂解后，包装形成的子代病毒识别和侵染新的健康细胞 阻止细胞凋亡，以利于病毒的复制增殖 (4)反转录酶抑制剂抑制的逆转录过程是HIV侵染过程特有的，而核苷酸型反转录抑制剂既抑制反转录，也会影响宿主细胞的DNA复制，进而影响其增殖 (5)①②③ 【详解】（1）HIV具有的包膜来源于病毒最后所在的宿主细胞的细胞膜。HIV主要侵入并破坏人体的辅助性T细胞，感染细胞时膜外蛋白gp120主要与辅助性T细胞表面的CD4受体结合。独立的跨膜蛋白gp41由于含有较多的疏水性氨基酸残基，可部分插入宿主细胞的质膜（磷脂双分子层的尾部未疏水部分），在细胞表面辅助受体CCR5等的参与下，造成病毒包膜与宿主细胞膜融合，为病毒侵入细胞做准备。HIV含有2条相同的RNA链，所以病毒在宿主细胞中增殖时可以短时间内产生更多的子代，具有快速形成的生存优势。 （2）被HIV潜伏感染的细胞表面没有HIV的蛋白，免疫系统识别不出HIV，从而有助于在宿主免疫系统较强时逃避免疫系统的识别和攻击。由图可知，①为逆转录，②为基因重组，参与①的酶可参与②，说明逆转录酶的功能有催化DNA链的延伸（逆转录），切割DNA分子（基因重组）。 （3）潜伏期之后，原病毒利用宿主细胞的转录和翻译系统形成子代病毒组装的“原件”，此时宿主细胞膜上会出现HIV的蛋白，免疫系统识别HIV，最终使宿主细胞裂解，宿主细胞裂解后，包装形成的子代病毒就可以识别和侵染新的健康细胞。病毒必须寄生在活细胞内才能完成各项生命活动，HIV基因组可以产生一个miRNA，通过降低细胞凋亡通路下游基因ERCCI和IER3表达，从而阻止细胞凋亡，以利于病毒的复制增殖，产生更多的子代病毒。 （4）核苷酸型反转录抑制剂，由于它在结构上与脱氧核苷酸具有相似性，掺入后使病毒DNA的合成不能进行，从而起到治疗的作用。反转录酶抑制剂抑制的逆转录过程是HIV病毒侵染过程特有的，而核苷酸型反转录抑制剂，既抑制反转录，也会影响宿主细胞的DNA复制，进而影响其增殖，因此反转录酶抑制剂类药物副作用较小。 （5）艾滋病的传播途径主要有性接触传播、血液传播和母婴传播。下面这些做法可以预防艾滋病的传播：(1)采取安全的性行为，如使用避孕套；(2)避免注射吸毒；(3)接受检测并积极治疗HIV等性传播感染；(4)不与他人共用牙刷和剃须刀；(5)不用未经消毒的器械文眉、穿耳等。 与HIV感染者的一般接触，如握手、拥抱等，不会使人感染HIV。 故选①②③。 9．(23-24高三上·江苏扬州宝应县·期末)某研究小组利用转基因技术，将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3基因的载体中，载体和目的基因所在DNA上的限制酶识别位点及PCR扩增使用的相关引物如图甲所示。实验获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只，利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。回答下列问题： (1)为了使RFP基因能正确插入载体中，在PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的（填“3”或“5”） 端需分别插入 、 的限制酶识别序列。 (2)引物的另一端将会进行的过程是在 酶的催化下，以 为模板将 。 (3)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，共需要 种酶的参与。 (4)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得若干F1，利用荧光蛋白活体成像系统检测后，随机取阳性小鼠并随机进行交配获得8只F2小鼠，其表型及比例为阳性:阴性=5:3，为从F2阳性小鼠中获得Gata3-RFP基因纯合子小鼠，研究人员从这些阳性小鼠中提取Gata3基因相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物如图乙所示，则 号小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠。若用引物A和引物B进行PCR， （填‘能”或“不能”）更好地区分杂合子和纯合子。 【答案】(1)5’ SalI EcRI (2)Taq RFP 编码序列 单个脱氧核苷酸连接处子 (3)6 (4)1和5号 不能 【详解】（1）若要对RFP基因进行扩增，需在引物的5’端添加限制酶识别序列，因为引物对应区段也属于调控序列，若在3’端添加限制酶识别序列，会导致限制酶的切割位点位于调控序列内部，进行相应酶切实，调控序列会被破坏。RFP基因的终止子在右侧（即转录方向为从左到右），故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计的时候：R引物末端插入对应下方载体的XhoⅠ酶切位点，F引物末端插入对应下方载体的MunⅠ酶切位点，又因为RFP基因中含有的XhoⅠ位点，因此不能用XhoⅠ酶来切，否则会破坏基因序列。结合题干当中所给的5种限制酶的识别序列，XhoⅠ和SalⅠ互为同尾酶；MunⅠ和EcorRⅠ互为同尾酶（即切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切酶）。因此，可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F末端添加的序列所对应的限制酶应选择SalⅠ，这样可以与下方载体中XhoⅠ的酶切位点结合；同理R末端应选用与MunⅠ同尾的EcorRⅠ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有效片段，又能使之正确转录。 （2）引物的另一端将会进行的过程是在TaqDNA聚合酶的催化下以RFP编码序列为模板，将单个脱氧核苷酸连接处子链。 （3）从产物扩增到载体构建完成需要SalⅠ、EcorRⅠ（这两个酶用于切RFP基因）、MunⅠ、XhoⅠ（这两个对应的用于切下方载体的结合位点），载体构建过程中用到DNA扩增技术，所以还需要Taq DNA聚合酶，而载体构建完成还需要DNA连接酶将DNA片段连接起来，所以一共需要限制酶SalⅠ、限制酶EcorRⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、DNA连接酶这6种酶。 （4）2号和4号为杂合子同时含有两种基因，又因为Gata3-RFP基因为大片段，因此1、5号小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠，若用引物A和引物B进行PCR扩增只含有RFP基因的小鼠与Gata3-RFP基因小鼠无法区分。 10．(24-25高三上·江苏常州·期末)肿瘤是细胞异常增生形成的疾病，对人体健康造成严重危害。请回答下列问题： (1)人体可通过 免疫清除体内的肿瘤细胞，体现了免疫系统具有 功能。但是肿瘤细胞表面可表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞活化，进而实现免疫逃逸。故可通过注入 抗体来阻断这一免疫逃逸通路。 (2)科研人员通过蛋白质工程在患者T细胞膜表面表达针对特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗，称为CAR-T疗法，具体操作如下。 操作目的 具体操作 从患者的外周血中分离T淋巴细胞 利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性，常采用① 法将其与血清、红细胞等成分精细分离，进而进一步纯化提取T淋巴细胞 ② T淋巴细胞 利用人工刺激的抗原呈递细胞(APC)处理T淋巴细胞 将CAR基因导入T淋巴细胞 构建③ 载体，利用载体将CAR基因转移到T细胞中 CAR-T细胞体外扩增 对改造后的CAR-T细胞进行体外传代培养 回输患者体内 临床常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内 (3)相比于(1)中的阻断免疫逃逸通路方法，CAR-T疗法的优点是 。但CAR-T回输到体内后释放的细胞因子往往会进一步活化免疫细胞，进而释放更多细胞因子导致机体发热，这种调节方式属于 反馈，该综合征在临床上常用 激素加以缓解。 (4)为实现对CAR-T疗法进行时空精准操控，科研人员对靶向hCD19抗原的CAR-T细胞进行了优化设计，获得了对蓝光响应的CAR-T细胞(LiCAR-T)，并进行了相关实验，结果如图所示。结果表明，LiCAR-T细胞能够在 的刺激下，特异且严格的杀伤肿瘤细胞。 【答案】(1) 细胞 免疫监视 PD-L1或PD-1 (2) 密度梯度离心 活化 基因表达 (3) 治疗更精确（靶向性更强） 正 糖皮质 (4)蓝光照射和hCD19抗原 【详解】（1）人体可通过细胞免疫清除体内的肿瘤细胞，细胞免疫还能清除被病原体感染的体细胞、异体细胞。细胞免疫清除体内的肿瘤细胞体现了免疫系统的免疫监视功能。由于肿瘤细胞表面可表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞活化，进而实现免疫逃逸，因此可通过注入PD-L1或PD-1抗体，抑制PD-L1和PD-1结合，从而阻断这一免疫逃逸通路。 （2）利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性，常采用密度梯度离心法将其与血清、红细胞等成分精细分离，进而进一步纯化提取T淋巴细胞。利用人工刺激的抗原呈递细胞(APC)处理T淋巴细胞，激活T淋巴细胞。构建含CAR的基因表达载体，利用载体将CAR基因转移到T细胞中，从而获得含CAR基因的T淋巴细胞。对改造后的CAR-T细胞进行体外传代培养，常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗。 （3）相比于(1)中的阻断免疫逃逸通路方法，科研人员通过蛋白质工程在患者T细胞膜表面表达针对特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗，CAR-T疗法的优点是CAR-T细胞可以特异性识别肿瘤细胞，具有更强的靶向性，能更精确地杀伤肿瘤细胞。CAR-T回输到体内后释放的细胞因子往往会进一步活化免疫细胞，进而释放更多细胞因子导致机体发热，这种调节方式属于正反馈。糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克等作用，可以减轻机体的炎症反应，缓解发热等症状，因此该综合征在临床上常用糖皮质激素加以缓解。 （4）结合图示可知，LiCAR-T细胞表达hCD19抗体，且照射蓝光，肿瘤细胞杀伤率最大，说明LiCAR-T细胞能够在蓝光和hCD19抗原的刺激下，特异且严格的杀伤肿瘤细胞。 地 城 考点03 将目的基因导入受体细胞 11．(23-24高三上·江苏无锡南菁高级中学·期末)为获得导入R基因的转基因小鼠，科研人员进行了如下图所示的操作过程。相关叙述正确的是（    ） A．过程①需用促性腺激素处理以获得更多的卵母细胞 B．过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵 C．过程③需使用药物抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 D．过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态 【答案】ABD 【详解】A、为了胚胎移植成功往往需要更多的卵母细胞，所以过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，A正确； B、将目的基因导入受体细胞用多个表达载体和多个受精卵可以提高成功率，所以过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵，B正确； C、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程③不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，C错误； D、胚胎移植成功需要受体和供体达到相同的生理状态，所以过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态，D正确。 故选ABD。 12．(24-25高三上·江苏扬州·期末)I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。研究人员基于益生大肠杆菌（EcN）设计了一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌（EcN-HT）用于治疗HT1模型小鼠，如图1所示。其中，基因TyrP（编码酪氨酸转运蛋白TyrP）和基因HpaBC（编码酶HpaBC，催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA）均为目的基因。图2表示质粒pUC57的结构示意图、相关限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题： (1)肠道微生物与人体健康密不可分。EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网，可抑制病原菌的侵袭，这种防御属于机体的 免疫。图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有 （填序号）。 ①内质网  ②核糖体  ③细胞膜  ④高尔基体 (2)图2中pfnr的基本组成单位是 。在 条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。 (3)为实现高效构建重组质粒并筛选获得EcN-HT工程菌，研究人员开展以下实验： Ⅰ．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。 ①获取基因TyrP； ②选用限制酶EcoRI和SmaI，分别切割 ，构建重组质粒pUC57-T； ③将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上，培养一段时间后，菌落呈 色的为目的菌株EcN-T。 Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。 ④获取基因HpaBC； ⑤选用限制酶 ，构建重组质粒pUC57-H； ⑥将pUC57-H导入EcN-T，并将其接种在培养基乙上，以筛选出含双质粒的菌株EcN-HT。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是 。 (4)图3显示目的基因TyrP两端的部分碱基序列，为获得能与质粒pUC57相连接的目的基因，PCR时设计的引物应选用______。    A．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-TGTTACGAATTC-3' B．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-CATTGTGAATTC-3' C．5'-GAATTCAAGGCA-3'和5'-CCCGGGCATTGT-3' D．5'-GAATTCTGTTAC-3'和5'-CCCGGGAAGGCA-3' (5)本实验将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒导入受体细胞，与装载在同一个质粒的方法相比，优点有______。 A．提高导入受体细胞的效率 B．降低基因逃逸的可能性，不存在生物安全风险 C．增强基因表达的灵活性 D．提高基因的稳定性，增强治疗的效果 (6)进一步研究表明，EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是 。 【答案】(1)非特异性 ②③ (2)脱氧核苷酸 厌氧/低氧/缺氧） (3)含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57 白 BglⅡ、EcoRⅠ 氯霉素 (4)C (5)ACD (6)EcN-HT可以吸收酪氨酸，使其转变成无毒物质（减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积） 【详解】（1）EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网，可抑制病原菌的侵袭，这种防御不针对某一类特定的病原体，而是对多种病原体都有防御作用，因此属于机体的非特异性免疫。图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，说明TyrP的合成及加工过程与分泌蛋白的类似，即在核糖体中以氨基酸为原料合成肽链，经过内质网的加工、折叠以及高尔基体的进一步的修饰加工，然后通过囊泡转运到细胞膜上。可见，EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有②核糖体和③细胞膜。 （2）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。图2中pfnr为厌氧启动子，其基本组成单位是脱氧核苷酸。在厌氧（或低氧或缺氧）条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。 （3）Ⅰ．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。 ②构建重组质粒pUC57-T时，目的基因为基因TyrP、载体是质粒pUC57，因此，用限制酶EcoRI和SmaI应分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57。 ③基因lacZr表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物。由图2可知：基因lacZr在限制酶EcoRI的识别序列和切割位点内。构建重组质粒pUC57-T时，用限制酶EcoRI切割质粒pUC57，基因lacZr的结构被破坏，不能表达相应的酶蛋白，所以将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上。培养一段时间后，成功导入pUC57-T的菌落呈白色，此白色菌落即为目的菌株EcN-T。 Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。 ⑤构建重组质粒pUC57-T时，选用了限制酶用限制酶EcoRI和SmaI，这两种酶破坏了标记基因Cmr（氯霉素抗性基因）和lacZ，lacZ表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物，该重组质粒中含有Kanr标记基因（卡那霉素抗性基因），因此筛选受体菌株EcN-T，应使用含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲。目的基因应该插入到启动子和终止子之间，可选的限制酶只有BglⅡ、EcoRⅠ、MboⅠ、SmaⅠ，由于BglⅡ的识别序列中含有MboⅠ识别序列，如果使用MboⅠ，Bgl Ⅱ的识别序列也会被切割，且由于重组质粒pUC57-T破坏了标记基因Cmr（氯霉素抗性基因），为了区分两者不同，那么构建的重组质粒pUC57-H不能破坏该标记基因，因此构建重组质粒pUC57-H需选用限制酶BglⅡ、EcoRⅠ。 ⑥综上分析，筛选时，固体培养基乙应加入卡那霉素、氯霉素、X-gal。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是氯霉素。 （4）由于构建重组质粒pUC57-T时，选用限制酶EcoRI和SmaI分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57，根据该基因的转录方向和质粒中启动子和终止子的位置，该基因的左端应该加上EcoRⅠ识别序列，右端应该加上SmaⅠ识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链，因此左端的引物应该是5'-GAATTC AAGGCA-3'，同理，右端的引物是5'-CCCGGG CATTGT-3'，ABD错误，C正确。 故选C。 （5）A、与装载在同一个质粒的方法相比，将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒，这两种重组质粒均较小，因此能提高导入受体细胞的效率，A正确； B、将外源基因导入受体细胞，构成的工程菌也可能存在生物安全风险，B错误； CD、与装载在同一个质粒的方法相比，将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒，这两种重组质粒上的目的基因均容易表达，增强了基因表达的灵活性，同时也使基因的稳定性得以提高，进而增强治疗的效果，CD正确。 故选ACD。 （6）I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。在肠道工程益生菌（EcN-HT）体内，基因TyrP编码的酪氨酸转运蛋白TyrP有助于细胞吸收酪氨酸，基因HpaBC编码的酶HpaBC能催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA。可见， EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是：EcN-HT可以吸收酪氨酸，使其转变成无毒物质（减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积）。 地 城 考点04 目的基因的检测与鉴定 13．(24-25高三上·江苏扬州·期末)“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（    ） A．在添加尿素的马铃薯琼脂培养基上可筛选出能分解尿素的细菌 B．只要筛选出含有抗冻基因的番茄细胞，就代表抗冻番茄培育成功 C．取内细胞团细胞进行性别鉴定，可筛选出胚胎用于制备动物乳腺生物反应器 D．在临床试管婴儿术中，需利用遗传学诊断的方法筛选出所需的胚胎进行移植 【答案】D 【详解】A、若要筛选能分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源。马铃薯中含有氮源，所以在添加尿素的马铃薯琼脂培养基上不能筛选出能分解尿素的细菌，A错误； B、筛选出含有抗冻基因的番茄细胞，并不代表抗冻番茄培育成功，因为抗冻基因不一定能在番茄细胞中正确表达，B错误； C、进行性别鉴定时，应选择滋养层细胞进行DNA分析，C错误； D、胚胎植入前筛查能够避免严重遗传疾病的患儿出生，在临床试管婴儿术中，需利用遗传学诊断的方法筛选出所需的胚胎进行移植，D正确。 故选D。 14．(24-25高三上·江苏部分高中·期末)SBPase基因编码的酶是卡尔文循环的关键酶。为提高甜菜的光合效率和产量，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，获得如图1的表达载体。请回答下列问题： (1)图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，还未指示出的结构元件有 ，其中启动子的功能是 。 (2)人工合成SBPase基因后进行扩增，正确选择引物后对目的基因进行PCR，PCR程序设置如图2所示，其中，60℃20s环节的目的是 。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，一般还需要添加Mg2+，添加Mg2+的作用是 。 (3)获取的PCR产物还需要经凝胶电泳鉴定。通常DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将PCR样品加入 电极端的点样孔内。电泳之后切割凝胶再将其溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。 (4)研究人员采用不对称PCR技术扩增大量单链DNA片段，用于目的基因的检测。现有不等量的一对引物A和B，经若干次循环后，引物A被消耗尽，之后的循环只产生高浓度引物B的延伸产物，获得大量单链DNA．若反应体系中原有200个模板DNA，最初8个循环后限制性引物A耗尽，再进行25个循环，理论上可制备的单链DNA有 个。 (5)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有氨苄青霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项有 。 (6)为便于纯化SBPase酶蛋白，现改进生产路线，另将小段TAP基因序列（标签）与SBPase基因相连，构建出能表达SBPase酶融合蛋白的重组DNA（如图3，F1、F2、R1、R2表示引物）。为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有 （填字母）。 【答案】(1) 复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (2) 使引物与单链相应互补序列结合（或复性/退火） 激活TaqDNA聚合酶的活性 (3)负 (4)1280000 (5)杀灭农杆菌（或抑制农杆菌生长/抑制农杆菌/抑菌） 卡那霉素 注意抗生素的种类、剂量及作用时间等 (6)F1与R2（或F2与R1） 【详解】（1）一个完整的基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点等，图1重组质粒结构中，除了图中所示结构元件外，未指示出复制原点。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 （2）PCR的基本过程是先进行预变性，然后发生变性→复性→延伸的循环。60℃20s环节发生复性/退火，即引物与单链相应互补序列结合。Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶的活性。 （3）通常DNA分子片段带负电荷，所以加样品加到负电极端的点样孔内，使DNA样品向正极迁移。 （4）先进行正常PCR，200×28=51200个双链DNA，再进行25个不对称循环，每一次循环只得到1条单链。因此可制备的单链有51200×25=1280000个。 （5）氨苄青霉素和头孢霉素都属于抗生素，能杀死细菌，在此是为了杀灭农杆菌（抑制农杆菌生长、抑制农杆菌）。因重组质粒的标记基因是卡那霉素抗性基因，故转入含有卡那霉素的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意抗生素的种类、剂量及作用时间等，防止对外植体产生毒害作用。 （6）为确定融合基因插入并且方向正确，进行PCR检测，可选择图3中的引物组合有F1与R2（或F2与R1），若融合基因未插入或方向错误，则得不到产物。 15．(24-25高三上·江苏苏州·期末)玉米是一种C4植物，下图表示玉米的叶肉细胞和维管束鞘细胞（叶绿体无基粒）中部分物质代谢过程，其中Rubisco和PEPC代表参与代谢的酶。请回答下列问题：    (1)据图可知，玉米叶片光反应发生在 的叶绿体中，固定CO2的场所有 和 。 (2)图中参与卡尔文循环的CO2来自 等过程，丙糖磷酸的去处有：在叶绿体中合成淀粉， 。玉米叶肉细胞包围在维管束鞘细胞四周，形成花环状结构，有助于维管束鞘细胞散失的CO2再次被 捕获。 (3)Rubisco是暗反应中的关键酶，其活性受到Rubisco活化酶（RCA）的调节。但玉米的RCA基因的表达水平低于C3植物水稻。研究人员在玉米植株中过表达水稻的RCA（OsRCA）基因，以期提高玉米的Rubisco活性，请完成下表。 实验目的 实验步骤 克隆OsRCA基因 提取水稻叶片总RNA，逆转录获得cDNA作为模板进行PCR 转基因玉米植株的获得 利用① 法将目的基因导入玉米细胞中，获得转基因玉米植株。 目的基因导入的检测 对WT和转基因植株叶片的DNA进行② 检测 ③ 的检测 采用实时荧光定量PCR（RNA检测技术）和Western-Blot（蛋白质检测技术）对转基因植株叶片作进一步检测 Rubisco活力的检测 称取0.1g鲜叶置于研钵中，加入1mL提取液进行研磨，离心后取④ （填“上清液”或“沉淀物”）进行Rubisco酶活力检测 光合特性的检测 进行WT和转基因植株的⑤ （填“真”或“净”）光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度的测定 【答案】(1)叶肉细胞 叶肉细胞的细胞质基质 维管束鞘细胞的叶绿体 (2)苹果酸转化(成丙酮酸)和细胞呼吸(或有氧呼吸，或三羧酸循环) (在细胞质基质中)合成蔗糖 PEPC (3)农杆菌转化（或花粉管通道法，或基因枪法） PCR OsRCA基因表达（水平或情况） 上清液 净 【详解】（1）由图可知，玉米叶片叶肉细胞中的叶绿体可合成ATP，而维管束鞘细胞中的叶绿体进行卡尔文循环，说明其光反应发生于叶肉细胞的叶绿体中。叶肉细胞的细胞质基质可将CO2在PEPC的催化下生成草酰乙酸，即CO2的固定可发生于叶肉细胞的细胞质基质和维管束鞘细胞的叶绿体。 （2）图中参与卡尔文循环的CO2来自苹果酸分解和呼吸作用产生等。由图可知，丙糖磷酸在叶绿体中合成淀粉，在细胞质基质中合成蔗糖，随后运进维管束。玉米叶肉细胞包围在维管束鞘细胞四周，形成花环状结构，有助于维管束鞘细胞散失的CO2再次被叶肉细胞吸收，随后被PEPC捕获，生成草酰乙酸。 （3）常利用农杆菌转化法或花粉管通道法将目的基因导入植物细胞。常用PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞和是否转录，可利用实时荧光定量PCR（RNA检测技术）和Western-Blot（蛋白质检测技术）对转基因植株叶片作进一步检测目的基因的表达情况。经离心后，酶位于上清液中，所以取上清液进行酶活力的检测。Rubisco是暗反应中的关键酶，通过影响暗反应而影响光合作用，但不影响呼吸作用，所以最后检测光合特性时，对净光合速率进行检测。 16．(23-24高三·江苏苏州·期末)Ndrg2基因参与神经系统的发育和退行性疾病的发生和发展，并可参与血管的形成。为研究Ndrg2基因的功能，可利用染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP构建Ndrg2基因敲除小鼠（如下图1、2所示），并对其进行鉴定和表型分析。请回答下列问题：    (1)图1中LoxP序列的方向取决于序号 对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre重组酶切割后会增加 个游离的磷酸基团。 (2)当两个loxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre重组酶在此过程中的作用类似于 酶。当两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个loxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于 。 (3)构建Ndrg2基因敲除小鼠需要先构建Flox小鼠（该小鼠的Ndrg2基因两侧需插入Loxp序列）。为构建相应的基因表达载体，据图2分析，应选择限制酶 处理含有Ndrg2基因的DNA片段，而在处理质粒时应选用限制酶 。质粒中启动子的作用是 。 限制酶种类 识别序列及切割位置 BamHⅠ 5＇-G↓GATCC-3＇ BclⅠ 5＇-T↓GATCA-3＇ Sau3Ⅰ 5＇-↓GATC-3＇ HindⅢ 5＇-A↓AGCTT-3＇ EcoRⅠ 5＇-G↓AATTC-3＇ (4)将重组质粒导入小鼠 。经胚胎工程获得杂合Flox小鼠（flox/+）,之后雌雄小鼠相互交配可获得纯合Flox小鼠。 (5)构建Ndrg2基因敲除小鼠还需要构建Cre转基因小鼠（cre/+）（Cre基因上游添加有造血干细胞基因启动子EDAG）。已知Ndrg2基因与Cre重组酶基因独立遗传，现将纯合Flox小鼠（flox/flox）与Cre转基因小鼠（cre/+）交配，将F1中的双杂合小鼠雌雄交配，获得造血干细胞中Ndrg2基因完全敲除的小鼠的概率为 。 (6)以下能说明造血干细胞中Ndrg2基因完全敲除小鼠构建成功的有 。 ①小鼠不同组织中提取的DNA可检测到cre基因 ②小鼠造血干细胞中Ndrg2基因的mRNA基本为零 ③利用抗原抗体杂交技术在造血干细胞中检测不到有Ndrg2蛋白 【答案】(1) ② 2/两/二 (2) 限制酶和DNA连接 染色体结构变异（或倒位） (3) HindIⅢ与Sau3I HindⅢ与BclI （与RNA聚合酶结合，）驱动基因转录出mRNA (4)受精卵 (5)3/16 (6)②③ 【详解】（1）LoxP序列①和③是反向重复序列，因此图1中LoxP序列的方向取决于序号②对应的区域。一个LoxP序列内部经过切割后会增加两个游离的磷酸基团。 （2）Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre重组酶在此过程中的作用类似于限制酶和DNA连接酶。Cre重组酶使两个loxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于染色体结构变异（或倒位）。 （3）据图2分析，Ndrg2基因两侧需插入Loxp序列，且方向相同，且需要保证只留下一个抗性基因作为标记基因，应选择限制酶HindⅢ与Sau3I处理含有Ndrg2基因的DNA片段，质粒则需要选择HindⅢ与BclI。质粒中启动子的作用是（与RNA聚合酶结合）驱动基因转录出mRNA。 （4）动物基因工程的受体细胞一般选择受精卵。 （5）现将纯合Flox小鼠（flox/flox）与Cre转基因小鼠（cre/+）交配，将F1中的双杂合小鼠雌（flox/+、cre/+，该小鼠的一个Ndrg2基因两侧插入Loxp序列）雄（flox/+、cre/+，该小鼠的一个Ndrg2基因两侧插入Loxp序列）交配，获得造血干细胞中Ndrg2基因完全敲除的小鼠（同时获得父母各一条Ndrg2基因两侧插入Loxp序列的染色体，同时含有Cre基因）的概率为1/4×3/4=3/16。 （6）Ndrg2基因完全敲除，则该基因无法转录和表达，小鼠造血干细胞中Ndrg2基因的mRNA基本为零，利用抗原抗体杂交技术在造血干细胞中检测不到有Ndrg2蛋白。故选②③。 17．(24-25高三上·江苏苏州·期末)羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： (1)为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生 。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后， （填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是 。 (2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带 最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 (3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶 识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是 。 (4)转化时常用 处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有 的培养基筛选大肠杆菌，挑选 色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 【答案】(1) 碱基互补配对 不能 DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端） (2) 3/三 电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列（及是否产生突变） (3) EcoR I RNA聚合酶 (4) Ca2+（CaCl2溶液） 氨苄青霉素和X-gal 白 【详解】（1）引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生碱基互补配对。这是因为为了将B2L基因和F1L基因成功连接，需要通过引物设计使得两个基因的末端能够互补配对，从而在PCR扩增过程中形成融合基因。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，不能延伸获得B2L-FIL融合基因。原因是DNA聚合酶只能从3'端向5'端延伸，DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端），而链①与链⑧杂交后，链⑧的3'端无法提供合适的引物结合位点，因此无法进行延伸。 （2）条带3最可能表示B2L-F1L融合基因。在琼脂糖凝胶电泳中，条带3的大小与预期的B2L-F1L融合基因大小相符，因此最可能是融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能检测DNA片段的大小，不能确定碱基序列（及是否产生突变），进而无法确定其序列的准确性，基因测序可以精确地确定DNA序列，确保融合基因的正确性。 （3）在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶EcoRI识别序列。这是因为B2L-F1L融合基因转录的模板链是a其链，。其3'端应与启动子一侧接近。转录时，与启动子结合的酶是RNA聚合酶。RNA聚合酶能够识别启动子序列，并在启动子的指导下开始转录过程。 （4）转化时常用CaCl₂处理大肠杆菌。CaCl₂处理可以使大肠杆菌细胞壁的通透性增加，从而更容易吸收周围环境中的DNA分子。用含有氨苄青霉素和X-gal的培养基筛选大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（Ampr）是质粒上的一个标记基因，只有含有重组质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。同时，X-gal可以用于鉴定LacZ基因的存在与否，含有LacZ基因的菌落呈蓝色，而LacZ基因被破坏或缺失的菌落呈白色。挑选白色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。这是因为含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色，而含有空质粒的大肠杆菌菌落呈蓝色。 地 城 考点05 基因工程的基本工具 18．(24-25高三上·江苏扬州·期末)下列关于高中生物学实验的叙述，正确的是（    ） A．黑藻可替代紫色洋葱鳞片叶用于探究植物细胞的吸水和失水 B．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同且能溶于冷酒精 C．在观察叶绿体和细胞质的流动实验中，可观察到叶绿体中的类囊体结构 D．苯酚品红溶液能将活细胞中染色体染成深色，体现了生物膜的选择透过性 【答案】A 【详解】A、黑藻是一种水生植物，其叶片细胞具有明显的中央大液泡，可通过观察细胞质中叶绿体的聚集情况，观察植物细胞的吸水和失水现象，黑藻可替代紫色洋葱鳞片叶用于探究植物细胞的吸水和失水，A正确； B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度确实不同（通常在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低），但DNA不溶于冷酒精，B错误； C、在观察叶绿体和细胞质流动的实验中，通常只能看到叶绿体的整体形态和运动，无法观察到叶绿体内部的类囊体结构。类囊体结构需要在电子显微镜下才能观察到，C错误； D、苯酚品红溶液是一种染色剂，通常用于染色固定的细胞或组织，而不是活细胞，活细胞的生物膜具有选择透过性，会阻止苯酚品红等大分子染料进入细胞内部，不能体现了生物膜的选择透过性，D错误。 故选A。 19．(23-24高三·江苏苏州·期末)当细胞接受到凋亡信号后，位于线粒体内膜上的细胞色素c（参与电子传递）会释放进而引发细胞凋亡。研究人员用某种药物处理家蚕细胞不同时间后，用凝胶电泳法测定细胞不同结构中细胞色素c及微管蛋白的含量，结果如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．细胞色素c参与有氧呼吸第三阶段的化学反应 B．在细胞中含量比较稳定的微管蛋白可作为实验参照 C．该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质 D．凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是所带电荷性质 【答案】D 【详解】A、细胞色素c位于线粒体内膜上参与电子传递，线粒体内膜是有氧呼吸第三阶段的场所，A正确； B、实验结果中，用微管蛋白作为实验参照，是因为其在细胞中含量比较稳定，B正确； C、使用药物后，随着时间延长，线粒体中的细胞色素c逐渐减少，而细胞质基质中的细胞色素c逐渐增多，可以推测该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质，C正确； D、凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是分子大小，D错误。 故选D。 20．(24-25高三上·江苏扬州·期末)为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可充分破碎细胞，从而获得真菌粉末 B．NaOH的碱性条件可以进一步破坏细胞结构，使DNA从细胞中释放出来 C．缓冲液除了中和碱性物质外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能 D．提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性 【答案】C 【详解】A、将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末，有利于提取DNA，A正确； B、NaOH呈碱性，碱溶液可能可以破坏细胞膜和细胞壁进而可以快速提取DNA，B正确； C、缓冲液除了中和碱性物质之外，还可使DNA 酶失活、抑制微生物生长等功能，C错误； D、高温可能会使DNA变性，提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性，D正确。 故选C。 21．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)下列有关实验的方法、现象和解释的叙述合理的是（    ） A．向DNA粗提取溶液中加入二苯胺试剂不显蓝色是由于DNA含量太低 B．观察洋葱根尖有丝分裂时，分生区细胞都呈正方形 C．利用血球计数板对酵母菌进行计数时，可以观察到酵母菌的细胞膜、细胞核、线粒体等 D．利用洋葱鳞片叶外表皮进行质壁分离实验中，若发现某一细胞从紫色变成无色，可能是细胞失水过多而死亡 【答案】D 【详解】A、向DNA粗提取溶液中加入二苯胺试剂需要经过沸水浴加热，才能呈现蓝色，A错误； B、一般情况下，分生区细胞排列整齐，呈正方形，但并不是所有，B错误； C、血球计数板是对酵母菌等微生物的一种计数方法，一般不可以观察到酵母菌的细胞膜、细胞核、线粒体等，C错误； D、利用洋葱鳞片叶外表皮进行质壁分离实验中，若发现某一细胞从紫色变成无色，可能是细胞失水过多而死亡，导致原生质层失去了选择透过性，液泡内的紫色色素到达外界环境，变为无色，D正确。 故选D。 22．(23-24高三·江苏扬州·期末)以洋葱为实验材料可进行多项实验。下列叙述错误的是（    ） A．用一定浓度的尿素溶液处理洋葱鳞片叶细胞，可观察到质壁分离和自动复原现象 B．以洋葱为材料进行DNA粗提取时，加入的研磨液中往往含有洗涤剂和食盐 C．显微镜观察洋葱根尖分生区的一个视野中，往往看不到细胞周期各时期的图像 D．向洋葱根尖研磨液中加入双缩脲试剂后未出现紫色反应，表明该根尖中不含蛋白质 【答案】D 【详解】A、用一定浓度的尿素溶液处理洋葱鳞片叶细胞，由于尿素溶液可以进入细胞内，所以可观察到质壁分离和自动复原现象，A正确； B、以洋葱为材料进行DNA粗提取时，加入的研磨液中往往含有洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA，B正确； C、由于处于分裂期各时期的细胞少，显微镜观察洋葱根尖分生区的一个视野，往往看不全细胞周期各时期的图像，C正确； D、洋葱根尖研磨液中加入双缩脲试剂未出现紫色，可能是蛋白质含量少，反应不明显，而不是没有蛋白质，D错误。 故选D。 23．(23-24高三上·江苏常州教育学会·期末)下图1是QuickChange定点突变技术及副反应的示意图，其中的F和R代表引物，其上含有突变的碱基序列。请回答下列问题。 (1)图中PCR反应体系进行时，除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外，还需加入的物质有 。 (2)已知DpnI酶是一种限制酶，能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知，在原始质粒上有 （选填“0”“1”或“很多”）个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒，应对来自大肠杆菌的原始质粒进行的处理是 。 (3)图中的DH5a细胞是处于 的大肠杆菌，对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加 酶。图中副反应发生的原因是新链退火时，两条新链互补配对，互为复制的 ，扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外，还存在的不足是 。 (4)研究人员对QuickChange定点突变技术进行了改进，在两个PCR体系中分别加入单引物F或R，具体过程下图2。 ①单引物PCR1过程中，假设原始质粒有n个，每循环一次产生 个双链DNA，循环30次需要 个引物F。 ②与QuickChange定点突变技术相比，单引物PCR除了能解决第（3）问中的不足，还存在的优点是 【答案】(1)dNTP、TaqDNA聚合酶 (2)很多 使原始质粒中的GATC序列的腺嘌呤甲基化 (3)感受态 DNA连接酶 模板和引物 引物F和引物R会互补配对，导致PCR产物减少 (4)n 30n 不需要DpnⅠ酶解过程 【详解】（1）图中PCR反应体系进行时，除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外，还需加入的物质有四种脱氧核苷酸（dNTP）和耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。 （2）已知DpnI酶是一种限制酶，能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知，在原始质粒上有“很多”个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒，应对来自大肠杆菌的原始质粒进行甲基化处理，即使原始质粒中的GATC序列的腺嘌呤甲基化，这样可以避免原始质粒上相关基因的表达。 （3）图中的DH5a细胞是处于感受态的大肠杆菌，对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加DNA连接酶，这样才能获得完整的质粒。图中副反应发生的原因是新链退火时，两条新链互补配对，互为复制的模板和引物，扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外，还会因为引物F和引物R的互补配对，导致PCR产物减少。 （4）①单引物PCR1过程中，假设原始质粒有n个，每循环一次产生n个双链DNA，循环30次需要30n个引物F。 ②与QuickChange定点突变技术相比，单引物PCR除了能解决第（3）问中的不足，还具有的明显优势是能获得纯度较高的突变质粒和原始质粒，同时不需要经过DpnⅠ酶解过程。　　　　　　　 24．(24-25高三上·江苏无锡·期末)质体是植物细胞中一类常见的细胞器（如叶绿体），质体转化通常需要构建相应的质粒载体，而传统的载体构建依赖大肠杆菌感受态细胞等问题。某科研团队利用人工重组的pYY12质粒和人工合成的线性DNA片段（A、B1、B2和B3）进行烟草质体转化及转化效果比较的实验。图1是野生型烟草质体基因组中一片段（ptDNA）图谱，X为目标基因的插入位点；图2是使用pYY12质粒和线性片段A、B1Z、B2Z、B3Z产生的转基因质体中的基因组内片段图谱，其中HS1（500bp）、HS2（200bp）、HS3（50bp）为同源序列，gfp为绿色荧光蛋白基因，aadA的表达产物具有壮观霉素和链霉素的抗性。请回答下列问题：    (1)高等植物细胞中的基因组有三类：质体基因组、线粒体基因组和 基因组，其中 基因组具有半自主性。 (2)外源基因在质体DNA上的插入位点X位于基因trnfM和trnG之间的非编码序列，以基因间的序列作为插入位点的优点有 （答出一点即可）。 (3)研究人员依据质粒pYY12上的功能区段（图2中两长虚线间），设计用于质体转化的线性DNA片段（A、B1、B2、B3和Z）并进行PCR扩增，反应程序均为98℃3min，98℃10s，58℃15s，72℃3min，3个循环，72℃10min，其中98℃3min的目的是 ；图2中，Prrn为gfp的启动子，其作用是 ，与Prrn有类似功能的是 。 (4)研究人员将pYY12质粒、A、B1和Z混合物（B1Z）、B2和Z混合物（B2Z）、B3和Z混合物（B3Z）包裹的金属颗粒用基因枪轰击烟草幼叶，然后将轰击后的叶片样品切成小块，在含有壮观霉素的RMOP培养基（含BA和NAA的MS培养基）上初筛，然后在含有壮观霉素和链霉素的RMOP培养基上复筛，结果如图3。    ①在片段B（B1、B2、B3）和片段Z连接重组的过程中，HS（HS1、HS2、HS3）起 的作用。 ②复筛时，培养基中同时加入壮观霉素和链霉素是为了去除 突变体。 ③根据图3，可以得出的结论有 。 (5)为进一步检测筛选获得的烟草植株是否为稳定遗传的阳性转基因系，科研人员随机选取甲、乙、丙三个测试对象，提取叶片DNA样品用限制酶 消化，通过 分离后使用特定引物进行PCR，然后再对PCR阳性的测试对象使用特异性探针进行DNA分子杂交，发现甲、乙只显示出6301bp的杂交信号，丙显示出6301bp和3491bp的杂交信号，说明 为能稳定遗传的阳性转基因系。 【答案】(1) 细胞核 质体和线粒体 (2)（插入外源基因）既不会造成质体基因组的丢失和破坏，又不会影响原有基因的功能 (3) 预变性（增加模板DNA彻底变性的概率） RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动gfp基因转录 CrPpsbA (4) 作为引物 （未成功转化的）自发性壮观霉素抗性 （无需构建载体，）线性DNA片段可以实现质体转化、单个线性DNA片段转化质体的效率明显高于pYY12质粒、多个线性DNA片段转化质体的效率可能与HS序列长度有关 (5) BglII （琼脂糖凝胶）电泳 甲乙 【详解】（1）高等植物细胞中的基因组有三类：质体基因组、线粒体基因组和细胞核基因组，其中质体基因组和线粒体基因组具有半自主性。因为质体（如叶绿体）和线粒体含有少量的DNA，能进行部分基因的表达和调控，但又需要核基因编码的蛋白质来协助完成其功能，所以具有半自主性。 （2）外源基因在质体DNA上的插入位点X位于基因trnfM和trnG之间的非编码序列，以基因间的序列作为插入位点的优点有：（插入外源基因）既不会造成质体基因组的丢失和破坏，又不会影响原有基因的功能等。 （3）PCR扩增中，98℃3min的目的是使模板DNA预变性，（增加模板DNA彻底变性的概率），以便后续的引物结合和DNA聚合酶的作用；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，从而控制基因的表达，所以图2中Prrn作为gfp的启动子，其作用是驱动gfp基因转录；由图2可知，与Prrn有类似功能的是CrPpsbA。 （4）①在片段B（B1、B2、B3）和片段Z连接重组的过程中，HS（HS1、HS2、HS3）起作为引物的作用。 ②复筛时，培养基中同时加入壮观霉素和链霉素是为了去除（或未成功转化）自发性壮观霉素抗性突变体。因为只有成功转入了含有壮观霉素和链霉素抗性基因的转基因植株才能在这种培养基上生长，而未成功转化的植株由于没有相应抗性基因表达的产物，无法在这种培养基上存活，从而被去除。 ③根据图3，可以看出A、B1Z、B2Z的转化阳性芽数高于pYY12质粒，说明单独使用A或B1、B2与Z连接后形成的混合物的转化效果比pYY12质粒好；且由图2可以看出使用pYY12质粒和线性片段A、B1Z、B2Z产生的转基因质体中的基因组内片段中HS序列长度不同，因此可以得出的结论有（无需构建载体，）线性DNA片段可以实现质体转化、单个线性DNA片段转化质体的效率明显高于pYY12质粒、多个线性DNA片段转化质体的效率可能与HS序列长度有关。 （5）为进一步检测筛选获得的烟草植株是否为稳定遗传的阳性转基因系，科研人员随机选取甲、乙、丙三个测试对象，由图2可知，提取叶片DNA样品用限制酶BglII消化，通过（琼脂糖凝胶）电泳分离后使用特定引物进行PCR，然后再对PCR阳性的测试对象使用特异性探针进行DNA分子杂交，甲、乙只显示出6301bp的杂交信号，说明甲、乙植株的DNA中只含有一种特定的转基因片段，且该片段大小为6301bp，可能是稳定遗传的阳性转基因系；丙显示出6301bp和3491bp的杂交信号，说明丙植株的DNA中含有两种不同的转基因片段，可能是不稳定遗传的，故甲、乙为能稳定遗传的阳性转基因系。 地 城 考点06 基因工程的应用 25．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。有一对夫妇均为镰形细胞贫血致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为这对夫妇和孩子核酸分子杂交诊断的结果示意图。下列相关叙述正确的有（    ）    A．与图中正常基因模板链杂交的探针碱基对应序列为“5'—AACTCGT-3'” B．根据凝胶电泳带谱分析，基因纯合的是Ⅱ-2 C．该地区镰形细胞贫血患病率为1/10000，若Ⅱ-3与另一正常女子婚配，则生出患病孩子的概率为1/202 D．若将正常的血红蛋白基因成功导入患者的骨髓造血干细胞中，可用于治疗该病 【答案】ACD 【详解】A、据图可知，正常基因模板链的核酸序列5’-ACGAGTT-3’，按照碱基互补配对的原则，则与图中正常基因模板链杂交的探针碱基对应序列为“5'—AACTCGT-3'”，A正确； B、图中夫妇的基因型均为Bb，根据凝胶电泳带谱分析，基因纯合的是Ⅱ-2和Ⅱ-1，他们的基因型依次为bb和BB，B错误； C、该地区镰形细胞贫血患病率为1/10000，说明该地区人群中b的基因频率为1/100，则B的基因频率为99/100，则正常人群中携带者的概率为2×1/100×99/100÷（1-1/10000）=2/101，结合图示可知，Ⅱ-3 的基因型为Bb，若其与正常女子Bb或BB婚配，则生出患病孩子的概率为2/101×1/4=1/202，C正确； D、镰刀型细胞贫血症是由基因突变导致的，属于遗传病，将正常血红蛋白的基因导入患者的骨髓造血干细胞中则可产生正常的红细胞，进而可达到治疗目的，D正确。 故选ACD。 26．(23-24高三上·江苏盐城、南京·期末)透明质酸是一种应用广泛的粘性多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来协调菌体生长与产物生产之间的关系。 (1)图1中透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，由此可以推测H基因的转录是从其 （填“左侧”或“右侧”）开始的。透明质酸合成酶基因H上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该序列进行剪切的Xho识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为 。 (2)为通过外源添加诱导剂来控制基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为保证图1中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接，p质粒位点1和2的识别序列所对应的酶分别是 ，酶切后加入 酶使它们形成重组质粒。 (3)为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经 处理后的枯草芽孢杆菌（D菌），在含 的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌E（E菌）。对E菌进行工业培养时，培养基应先以蔗糖为唯一碳源，接种2小时后添加 ，以诱导E菌产生更多的透明质酸。 (4)质粒在细菌细胞中遗传不稳定、易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方法将H基因插入枯草芽孢杆菌D的基因组mpr位点，得到整合型枯草芽孢杆菌F（F菌）。请在图2方框中画出F菌的基因组 。 (5)对三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3， 最适宜工业发酵生产透明质酸，请阐明理由 。 【答案】(1) 右侧 -CTCGAG-或-GAGCTC- (2) RhoⅠ酶和BsaⅠ酶 DNA连接 (3) Ca2+/CaCl2 四环素 木糖 (4) (5) F菌 F菌比E菌生长迅速，透明质酸产量高，培养基中不需要添加四环素，H基因整合到细菌DNA上，不易丢失 【详解】（1）由于基因转录方向从模板3’到5’，，由此可以推测H基因的转录是从其右侧开始的。限制酶切割DNA ,须两条链都有识别位点（即识别片段两条链序列成倒序），选-CTCGAG-片段，则另一条链为-GAGCTC-。都有识别位点，故推测该序列进行剪切的Xho识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为-CTCGAG-或-GAGCTC-。 （2）透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′断开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中p质粒位点1和2所对应的酶分别是XhoⅠ酶和BsaⅠ酶。DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA链上。 （3）将目的基因导人微生物细胞常用Ca2+处理法，Ca2+处理受体细胞，可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子生理状态，这种细胞叫感受态细胞。由图1可知，P质粒含有四环素抗性基因，因此可在含四环素培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌E。枯草芽孢杆菌（D菌）生长需要蔗糖作为碳源和能源物质，2h后由于枯草芽孢杆菌E（E菌）存在木糖诱导型启动子，因此此时可添加木糖。 （4）由题意可知，mpr位点为改造后的重组质粒和D菌的同源区段，其间只含有，所以这一部分交叉互换，将H基因插到了枯草芽孢杆菌的基因组mpr位点，而失去了四环素抗性基因，故最终得到的F菌的基因组为。 （5）由图3可知，F菌比E菌生长迅速，透明质酸产量高，培养基中不需要添加四环素，H基因整合到细菌DNA上，不易丢失，适宜工业发酵生产。 27．(23-24高三上·江苏扬州·期末)人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题： 注1：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔 注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。 (2)当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。同源切割是一种代替 将目的基因导入基因表达载体的方法。 (3)阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (4)为了检验重组质粒是否构建成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物进行PCR扩增，则最好选择图2中的引物 。PCR反应体系中需加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等，再将扩增产物进行 来确定可用于导入酵母菌的重组质粒。 (5)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a．氨苄青霉素b．组氨酸c．无机盐d．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用 进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 (6)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 【答案】(1)有利于hCGβ进入内质网加工 (2)限制酶 (3) CaCl2 氨苄青霉素 (4) P1和P6 Taq酶 dNTP 电泳/测序 (5) a、b 抗原—抗体杂交法（hCGβ的抗体） (6)可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 【详解】（1）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。 （2）传统重组质粒构建过程需要使用限制酶和DNA连接酶，而该过程是运用同源切割的方式在hCGβ基因两端加上一组同源序列A、B，然后将hCGβ基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，该过程没有使用限制酶。所以同源切割是一种代替限制酶将目的基因导入基因表达载体的方法。 （3） 将重组质粒导入大肠杆菌时，应先用CaCl2处理大肠杆菌，使其成为感受态。由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 （4）融合基因包含了目的基因和AB序列，则进行设计引物的时候应该包括AB序列和目的基因的部分序列，所以图中的引物1和引物6是合适的引物。PCR的反应体系包括模板、引物、Taq酶、dNTP（作为合成DNAD 原料）、缓冲液等，扩增的产物可通过电泳或测序的方法进行鉴定。 （5）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。 hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。 （6）AOXⅠ为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。 试卷第1页，共3页 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $