热考微专题(十) PCR技术及鉴定(Word学案)-【高考快车道】2026年高考生物大一轮专题复习总复习

该高中生物学学案聚焦PCR技术及鉴定高考核心专题，系统整合PCR原理、引物设计、目的基因检测等考点，按“基础原理—技术类型—应用场景”构建知识网络，通过典例精研的问题链设计，引导学生自主梳理关键信息，形成从技术操作到结果分析的完整认知体系。 亮点在于“精研强思维”与“精练提能力”双环节设计，含巢式PCR、荧光定量PCR等5类自测题，结合思维拓展的方法指导，培养科学思维与探究实践素养。学生可通过错题归因自主诊断，教师依学情精准指导，助力个性化复习与能力提升。

热考微专题(十)　PCR技术及鉴定 【精研　强思维】 【典例】(引物的选择及目的基因的检测)(2024·黑吉辽高考)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。 注:F1-F3、R1-R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是___________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是______________________________________。  (2)本操作中获取目的基因的方法是___________和_____________。  (3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是_____________________________,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是_____________________________________________。  (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用___________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。  (5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是_______和_______。  (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是_______。  A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C.将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 ▶解题过程 获取关键信息:图中“分离和扩增Bt基因”“人工合成1-1362基因序列”。 解决问题:(2)由图可知Bt基因的获取是通过PCR技术扩增的,1-1362基因序列的获取是通过人工合成的。   获取关键信息:细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力。 解决问题:(3)第2空:增强人工合成基因的表达,提高翻译效率,从而增强棉花的抗病虫害能力   获取关键信息:重组DNA片段位于穿梭质粒T-DNA,图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因,HygBR位于T-DNA内部。 解决问题:(4)用HygBR对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。   获取关键信息:图中拼接成的目的基因左侧引物为F3,右侧对应引物为R2。 解决问题:(5)选用的引物是F3和R2。 【解析】本题考查基因工程、蛋白质工程的应用。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是水解蛋白质,破坏细胞膜,提高DNA的数量和纯度。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是溶解蛋白质等物质,析出不溶于酒精的DNA。 (2)由题图可知,Bt基因的获取利用的是PCR技术扩增,1-1362基因序列的获取是人工合成。 (3)启动子的作用是RNA聚合酶识别并结合的部位,驱动目的基因转录;在穿梭质粒目的基因前面加上两个启动子,可以提高基因拼接序列的表达水平。 (4)穿梭质粒左边界和右边界之间的启动子、目的基因及HygBR标记基因整合到棉花的染色体DNA上,因此用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)由题图可知,穿梭质粒上的目的基因包括人工合成的1-1362基因序列和原始基因的1363-1848序列,根据引物的位置,为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是F3和R2。如果导入了目的基因就可扩增出1-1848序列,如果未导入,则没有序列。 (6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求,本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列、用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白。 答案:(1)水解蛋白质,破坏细胞膜,提高所得DNA的数量和纯度　析出不溶于酒精的DNA (2)PCR技术扩增　人工合成 (3)RNA聚合酶识别并结合的部位　提高基因拼接序列的表达水平　(4)HygBR　(5)F3　R2　(6)C、D 【思维拓展】 PCR引物设计的相关分析 (1)引物的设计通常是依据目的基因两端的核苷酸序列。需要设计两种引物,两种引物间不能局部发生碱基互补配对,否则会导致引物自连。 (2)引物的特点:引物的3'端有游离的-OH,可结合核苷酸以二酯键形式延伸子链,引物 5'端可以修饰,修饰后对扩增特异性影响不大。5'端常见修饰包括加切割位点;加标记生物素、荧光等;引入点突变序列;引入启动子序列等。 (3)体内DNA复制的引物是RNA,PCR中引物为DNA。 (4)引物的特异性: ①长度:引物过短会导致引物与非特异性DNA结合,影响PCR反应的特异性。引物过长会导致引物与目标序列结合的热力学稳定性增加,这会降低PCR扩增的效率。一般情况下,引物长度应该在18~30个核苷酸。 ②复性温度:复性温度过低会导致引物与非特异性的DNA结合,从而降低PCR反应特异性。复性温度过高则会影响PCR反应的灵敏度和扩增效率。引物的复性温度一般为50 ~65 ℃。 ③GC含量:GC含量过高或过低都会影响引物与目标DNA的互补性,从而影响PCR反应的特异性和灵敏度。引物的GC含量一般为40%~60%。 (5)PCR循环时与引物相关的计算: 经过n次循环,需要的引物总个数是2n+1-2,(2n-1对)。 【精练　提能力】 1.(巢式PCR)为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们在常规PCR技术的基础上进行了改良,发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两次PCR扩增,首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15~30个循环的扩增;第二次扩增以第一次扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物)进行15~30个循环扩增,具体过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同,但扩增产物比常规PCR特异性更强 B.两套引物需进行两次PCR,由于和两套引物都互补的靶序列较少,因此大大提高了扩增的特异性 C.内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物,第二阶段反应能否进行,也是对第一阶段反应正确性的鉴定 D.如果第一次扩增产生了错误片段,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加 【解析】选D。巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同,包括5种基本成分,依次为引物、耐高温的DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2+,但扩增产物比常规PCR特异性更强,A正确。巢式PCR通过两轮PCR反应,使用两套引物扩增特异性的DNA片段,第二对引物的功能是特异性扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一次扩增中,外引物用以产生扩增产物,此产物在内引物的存在下进行第二次扩增,从而提高反应的特异性,获得的产物特异性更强,B正确。内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物,第二阶段反应能否进行,也是对第一阶段反应正确性的鉴定:如果利用外引物扩增产生了错误片段,再利用内引物在错误片段上进行引物配对并扩增的概率减小,C正确,D错误。 借题发挥　巢式PCR技术 巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应,使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物,结合在第一次PCR产物内部,使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于,如果第一次扩增产生了错误片段,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低,巢式PCR的扩增特异性更强。 2.(鉴定目的基因的连接方式)(2023·山东高考)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是_____________。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有_____________(答出2个结构即可)。  (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物_____________。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。  (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了_____________,条带2所检出的蛋白_____________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。  【解析】本题考查基因工程的基本操作程序。 (1)基因表达载体中启动子是为了启动下游基因的表达,基因表达首先需要转录,因此启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位;作为载体必须具备的条件:①要具有限制酶的切割位点;②要有标记基因(如抗性基因),以便于重组后重组质粒的筛选;③能在宿主细胞中稳定存在并复制;④是安全的,对受体细胞无害,而且要易从供体细胞分离出来。图甲中有启动子和终止子等,因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 (2)据图甲分析,要想确定J基因是否连接到质粒中,选择引物扩增后的片段要包括J基因片段,可选择F1与R1、F1与R2、F2与R1、F2与R2,但选择F1与R1、F2与R2不能确定J基因插入方向是否正确,故为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,可选择F1与R2或F2与R1。因为J基因转录模板链位于b链,且启动子在左侧,所以F1应与b链互补,则序列与a链相同。 (3)据图乙可知,重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后,均有条带1,说明细胞内表达了J-V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后,出现条带2,而用抗V5抗体检测后,没有出现条带2,说明条带2所检出的蛋白不是J-V5融合蛋白,即不是由重组质粒上的J基因表达的,条带2可能是杂质。 答案:(1)RNA聚合酶　限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等(合理即可) (2)F1和R2(或F2和R1)　a链 (3)J-V5融合蛋白　不是 3.(重叠延伸PCR)(2024·湘豫名校联考)人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药,但大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后在大肠杆菌中表达改造后的基因,可得到性能优异的改良t-PA蛋白。如图是通过重叠延伸PCR获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中,引物a、b用来扩增含有突变位点及其上游序列的DNA片段,引物c、d用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段)。请回答: (1)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR,示意图中的点表示突变部位的碱基,引物b中该部位的碱基是_________,引物c中该部位的碱基是_____________。PCR中需要引物的原因是______________________________。 (2)重叠延伸PCR中,PCR1和PCR2分别进行,产物混合后再进行PCR3。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是______________________________。  【解析】(1)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链上的碱基序列是ACA,半胱氨酸的密码子为UGU,而丝氨酸的密码子是UCU,由此可知,若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,则t-PA基因上链第84位发生的碱基替换为C→G,题图中显示引物b与t-PA改良基因的下链互补,故其中相应部位的碱基与上链相同,即该部位的碱基是G,引物c与t-PA改良基因的上链互补,故其中相应部位的碱基与下链相同,即该部位的碱基是C。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3'端延伸DNA链,因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸。 (2)题图信息显示,引物b和引物c遵循碱基互补配对,因此,如果PCR1和PCR2同时进行,会使引物失效,无法达到预期目的。 答案:(1)G　C　DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连接到双链DNA片段的引物链上(或DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3'端延伸DNA链) (2)引物b和引物c遵循碱基互补配对,会使引物失效 借题发挥 重叠延伸PCR实现基因的定点突变要使用四条引物(如图所示),引物1和4是普通的引物,而引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,且这两条引物是互补的。 (1)图解: (2)流程: ①分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到两种DNA片段,将这两个DNA片段置于一个反应体系内,变性复性后,则会形成4种DNA分子,再在DNA聚合酶的作用下延伸,其中仅有一种完整且含有突变位点的DNA片段。 ②以得到的这种DNA片段为模板,用引物1和4再进行PCR,扩增得到大量含有突变位点的DNA片段。 ③通过测序可以检验定点突变是否成功。 4.(反向PCR)基因工程在农业方面的应用发展迅速,我国转基因作物的种植面积在世界有较高排名。请回答下列相关问题: (1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能,目的基因往往从相关的___________________________的基因中进行筛选。  (2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取,还可以利用PCR技术获取和扩增。如图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理,请分析回答下列问题: ①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和____________________原理。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程,复性的作用是_______________________________________________________________________。  ②将一个DNA分子进行扩增,理论上目的基因最早在第_________次循环后获得;第5次循环后,可扩增得到_________个目的基因。  (3)反向PCR可用于扩增未知序列,其原理如图所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列,外侧为未知序列。请回答相关问题: ①EcoRⅠ酶切后得到的—AATT称为黏性末端,“黏性”的含义是______________________________,  EcoRⅠ切割得到黏性末端的原因是______________________________。 ②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增,原因是______________________________。 ③图4中环状DNA进行PCR的过程中,沿引物A延伸子链的延伸方向是___________(填“顺时针”或“逆时针”),PCR产物_________(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的切割位点。  【解析】(1)从已知结构和功能清晰的基因中进行筛选目的基因是较为有效的方法之一。 (2)①PCR技术扩增DNA的原理是DNA半保留复制原理和DNA热变性原理。两种引物与母链的3'端通过碱基互补配对结合的过程叫复性。②一个DNA分子进行扩增,理论上目的基因最早在第3次循环后获得;第n次循环后,可扩增得到2n-2n个目的基因。 (3)①EcoRⅠ识别的序列是5'-GAATTC-3',切割位点位于中轴线两侧GA之间,切割后形成的黏性末端是—AATT。②PCR扩增DNA,必须要有引物,但图2中DNA两端序列未知,无法设计引物,不能扩增。 ③图3引物A左侧为3'端,子链的延伸方向是5'→3',所以沿引物A延伸子链方向是逆时针。图2中DNA经EcoRⅠ切割后,DNA左右两侧的黏性末端可以互补配对,经DNA连接酶连接后形成有GAATTC碱基序列的环状DNA,所以PCR产物含有EcoRⅠ的切割位点。 答案:(1)已知结构和功能清晰　(2)①DNA热变性　使引物通过碱基互补配对与两条单链结合　②3　22　(3)①两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键　切割位点在识别序列中心轴线两侧　②DNA两端序列未知,无法设计引物　③逆时针　含有 借题发挥　反向PCR测定未知DNA区域 (1)原理:反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。 (2)应用:用限制性内切核酸酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的切割产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。 5.(荧光定量PCR)人类猴痘由Yaba猴病毒(双链DNA病毒)引起,实时荧光定量PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速检测。进行qPCR 时,在反应体系加入 Taq man探针,Taq man探针两端连有荧光基团(R)和抑制荧光发出的淬灭基团(Q),完整的Taq man探针不发出荧光,当探针被水解后R基团会发出荧光(如图1所示),随循环次数的增加,荧光信号强度增加。 (1)采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的_________溶液中才能进行,反应体系中还需提供DNA模板、原料、_________、Taq man探针、Taq DNA聚合酶、Mg2+等。qPCR过程中,Taq DNA 聚合酶的两个作用是______________________________。 (2)qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点,这与反应体系中加入的_________和_________有关。但有时也可能会出现“假阴性”的结果,可能的原因有______________________________ (答出两点)。  (3)在PCR反应体系中一般都要加入Mg2+,原因是_____________________________________________________。为了探究Mg2+对PCR扩增效果的影响,科研人员在PCR反应体系中加入不同浓度的Mg2+进行了实验。结果如图2所示,据此可得出的结论有______________________________。 【解析】(1)PCR的条件:DNA模板(目的基因)、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA 聚合酶)、缓冲液,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。Taq DNA 聚合酶的两个作用是催化合成DNA子链和催化探针水解。 (2)qPCR检测病毒的核酸时,加入的引物和探针都与模板链互补配对,检测病毒灵敏度和特异性高。检测结果出现“假阴性”,可能的原因有取样不规范;取样所获样本量不足;病毒发生了基因突变等。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶(Taq DNA 聚合酶)都需要Mg2+激活;分析题图2可知,⑥为阴性对照组,其荧光强度非常弱,意味着不加 Mg2+的缓冲液中靶基因几乎无法扩增;而加了不同浓度的Mg2+的缓冲液对应的曲线①②③④⑤荧光强度均高于⑥,且③曲线(Mg2+浓度为4 mM)的峰值对应的荧光强度最高,说明在不同浓度的Mg2+缓冲液中靶基因的扩增效果不同;在实验浓度下,4 mM为最佳浓度。 答案:(1)缓冲　引物　催化合成DNA子链;催化探针水解　(2)引物　探针　取样不规范;取样所获样本量不足;病毒发生了基因突变(答出两点即可)　(3)Taq DNA聚合酶需要Mg2+激活　在不含 Mg2+的缓冲液中靶基因几乎无法扩增;在不同浓度的Mg2+缓冲液中靶基因的扩增效果不同;在实验浓度下,4 mM 为最佳浓度 借题发挥　荧光定量PCR检测目的基因浓度 与目的基因特异性结合的荧光标记探针完整时,报告基团(R)发射的荧光信号被淬灭基团(Q)吸收,不产生荧光。在PCR过程中,探针被Taq DNA聚合酶水解,R与Q分离,R发出的荧光可被检测到(如图甲),每一个DNA分子进行一次扩增,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。不同的循环轮数的荧光强度变化如图乙,荧光到达预先设定阈值的循环数越小,说明目的基因的浓度越高。 - 16 - 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