第9单元 第55讲 基因工程的基本工具和基本操作程序(Word学案)-【高考快车道】2026年高考生物大一轮专题复习总复习

第55讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 课程标准解读 知识网络概览 【课标要求】 1.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 3.按照实验操作步骤,进行DNA的粗提取与鉴定实验。 【能力要求】 1.理解能力:运用模型与建模的方法理解基因表达载体的结构。 2.解决问题的能力:基于对限制酶的特点和质粒的结构分析,构建合适的基因表达载体。 考点一　基因工程的基本工具 精梳　攻教材 1.基因工程概述: (1)基因工程概念: (2)理论基础: 2.重组DNA技术的基本工具: (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”): 【名师点睛】 同尾酶 切割DNA分子可以产生相同末端的两种不同的限制酶为同尾酶,由同尾酶切割产生的DNA片段末端可以连接。 (2)DNA连接酶: 常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 将双链DNA片段拼接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,形成重组DNA。 但E.coli DNA连接酶连接具有平末端DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 (3)载体: (4)五种酶比较: 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA 连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA 聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板,将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链3'端 解旋酶 DNA 分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链 DNA 水解酶 DNA 分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 【自测强化】 1.辨易错 (1)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×) 分析:限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具,前两者属于工具酶,质粒属于载体。 (2)限制性内切核酸酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大。(√) (3)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键,形成重组DNA。 (×) 分析:DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 (4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。 (×) 分析:质粒上的标记基因通常是抗生素抗性基因,而不是抗生素合成基因。 (5)质粒上常有特殊的标记基因,以便于重组DNA分子的筛选。 (√) 2.练表达 (1)(选择性必修3P71“旁栏思考”拓展)原核生物中存在限制酶的意义是:切割外源DNA以保证自身安全。 (2)(选择性必修3 P74“拓展应用”T1)限制酶来源于原核生物,不切割自己的DNA分子的原因:原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 精练　提能力 1.(2024·湖南高考)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切(切割)时,发现DNA完全没有被酶切(切割),分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【解析】选B。本题考查DNA重组技术的基本工具和基因表达。限制酶失活会使DNA完全不被酶切(切割),此时应更换新的限制酶,A正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,这与题干信息相矛盾,B错误;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,应更换为正常质粒,C正确;质粒DNA上酶切(切割)位点被甲基化修饰,会导致对 DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。 2.(2025·南昌模拟)限制酶是基因工程中必需的工具之一,下表表示五种限制酶的识别序列及切割位点。下列关于限制酶的叙述,错误的是(　　) A.EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端和平末端 B.EcoR Ⅰ和MfeⅠ切割产生的DNA片段能被E.coli DNA连接酶相连在一起 C.BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割产生的DNA片段,连接后一定能被BamH Ⅰ切割 D.以上五种限制酶均能识别双链DNA的特定序列,并切开特定部位的磷酸二酯键 【解析】选C。根椐表中切割位点可知,EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端和平末端,A正确;根据表格中EcoR Ⅰ和MfeⅠ的识别序列和切割位点可知,EcoR Ⅰ和MfeⅠ切割产生的DNA片段能被E.coli DNA连接酶相连在一起,B正确;BamH Ⅰ切割,Sau3AⅠ切割,故二者切割后产生的黏性末端是相同的,因此二者切割后产生的黏性末端能够相连,连接后仍然存在GATC的序列,能被Sau3AⅠ切割,但是BamH Ⅰ不一定能切割,C错误;限制酶具有专一性,题中五种限制酶均能识别双链DNA的特定序列,并切开特定部位的磷酸二酯键,D正确。 3.(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切(切割)后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用PυuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 【解析】选D。本题考查基因工程相关知识。若用HindⅢ酶切,目的基因的插入方向可正可反,所以转录的产物可能不同,A正确;若用PυuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),所以在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确;DNA凝胶电泳技术可以分离大小不同的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;SphⅠ的酶切(切割)位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。 【加固训练】 (2024·连云港模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a,②是c,③是b C.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 【解析】选C。质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B错误;环状质粒被一种限制酶切开形成链状DNA,被水解的磷酸二酯键有2个,C正确;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D错误。 考点二　DNA的粗提取、鉴定与凝胶电泳 精梳　攻教材 1.DNA的粗提取与鉴定: (1)实验原理: ①提取DNA的原理。 Ⅰ:DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质。 Ⅱ:DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。  ②鉴定DNA的原理。 在沸水浴的条件下,DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。 (2)实验步骤: 【名师点睛】 DNA提取的2点提醒 (1)搅拌要规范:加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,且要向同一个方向搅拌,以免DNA分子断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 (2)不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA),可选用鸡血细胞作材料。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定: (1)实验基础: (2)实验操作步骤: 【名师点睛】 PCR及凝胶电泳的3点说明 (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 (2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 (3)指示剂的作用:判断电泳进度。 核酸染料的作用:使DNA着色,便于在紫外灯下看到电泳后的DNA条带。 【自测强化】 1.辨易错 (1)DNA鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。 (×) 分析:加入二苯胺试剂后,需沸水浴加热,才能观察溶液的颜色变化。 (2)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近。 (×) 分析:哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器,不能提取到DNA,而鸡属于鸟类,能提取到DNA。 (3)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 (×) 分析:动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。 (4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。 (×) 分析:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 (5)为了节约资源,移液器上的枪头在实验过程中不必更换。 (×) 分析:移液器上的枪头在实验过程中必须更换,避免试剂的污染。 2.练表达 (1)(选择性必修3 P74“探究·实践”拓展)DNA粗提取实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是:哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。 (2)(选择性必修3 P74“探究·实践”改编)在DNA的粗提取与鉴定实验中,实验材料要充分地研磨,原因是充分研磨会使细胞核内的DNA释放出来,提取较多的DNA。 精练　提能力 1.(2024·安徽高考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【解析】选D。本题考查DNA的粗提取与鉴定。若将研磨液更换为蒸馏水,则从细胞核中释放出的DNA量会减少,从而会降低DNA提取的效率,A正确;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B正确;DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液,利用该原理可纯化DNA粗提物,C正确;二苯胺试剂可以用于鉴定DNA,但不能用于检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D错误。 2.(2024·黑吉辽高考)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫外灯下被检测出来 【解析】选A。本题考查琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移;而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切(切割)片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果,A正确。凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子, 例如,当凝胶载样缓冲液中指示剂溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带),则停止电泳,但并不染色DNA,因此无法指示DNA分子的具体位置,B错误。在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段通常是向正极迁移的,而不是向负极迁移,且DNA片段越长,迁移速率越慢,C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后,才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。 3.(2024·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【解析】选A。本题考查“DNA的粗提取与鉴定”实验。在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液,A正确;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中,B错误;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变,C错误;加入二苯胺试剂后沸水浴处理5 min,且要等到冷却后再观察结果,这样才可以观察到较为明显的显色反应,仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。 【加固训练】 下列关于凝胶电泳实验操作,叙述错误的是(　　) A.加样孔应靠近负极端,以便带负电的DNA分子向正极移动 B.接通电源后电泳一段时间,离加样孔越近的DNA分子越小 C.紫外灯照射下,凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关 D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳 【解析】选B。靠近加样孔的一端为负极,接通电源,带负电的DNA分子向正极移动而使不同DNA逐渐分离,A正确;相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率,DNA片段相对分子质量越大,迁移就越慢,相对分子质量越小,迁移速度就越快,电泳一段时间,离加样孔越近的DNA分子迁移越慢,相对分子质量越大,B错误;为了便于对分离后的DNA片段进行检测,在凝胶制备中加入核酸染料,能够与DNA分子结合发荧光,DNA含量越多,荧光强度越强,即凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关,C正确;点样时应在样品中加入指示剂,根据指示剂泳动的位置判断是否停止电泳,D正确。 考点三　基因工程的操作程序 精梳　攻教材 1.目的基因的筛选与获取: (1)目的基因:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)目的基因筛选方法: ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取: ①人工合成目的基因。 ②利用PCR获取和扩增目的基因。 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 (4)利用PCR获取和扩增目的基因: 原理 DNA半保留复制 条件 DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液 仪器 PCR扩增仪 过程 变性 当温度超过90 ℃时,碱基对之间的氢键断开,双链DNA解聚为单链 复性 到50 ℃左右时,两种引物与母链的3'端通过碱基互补配对结合 延伸 72 ℃左右,脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成DNA子链 结果 DNA分子以指数形式扩增,约为2n,n为扩增循环次数 (5)PCR扩增技术与DNA复制的比较: 比较项目 DNA复制 PCR扩增技术 不 同 点 场所 细胞核、线粒体、叶绿体等 体外复制(PCR扩增仪) 方式 半保留半不连续全链复制 半保留全连续复制 解旋 在解旋酶催化作用下,边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 RNA引物(不保留在复制的子链中) DNA引物(保留在复制的子链中) 产物 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 特点 边解旋边复制,半保留复制、多起点复制 先全部解旋后,再半保留复制,从模板链的一端开始复制 相同点 需要模板,都以4种脱氧核苷酸为原料,都需要DNA聚合酶、引物、适宜的pH等 【名师点睛】 PCR过程中的温度控制 (1)变性温度:90 ℃以上使得DNA热变性,打开双链间的氢键,而体内DNA复制靠的是解旋酶。 (2)复性温度:复性温度在50 ℃左右,温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。 (3)延伸温度:温度在72 ℃左右,在DNA聚合酶和引物的作用下形成子链,方向为5 '到3 '。  2.基因表达载体的构建——基因工程的核心: (1)构建目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用: 【名师点睛】 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下,不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞: 生物 种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 内容 农杆菌Ti质粒的T-DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【名师点睛】 农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 4.目的基因的检测与鉴定: 类型 步骤 检测内容 方法 结果显示 分子水平检测 导入 检测 目的基因是否插入受体细胞的DNA上 PCR技术 电泳结果对比 表达 检测 目的基因是否转录出mRNA PCR技术 电泳结果对比 目的基因是否翻译出相应蛋白质 抗原—抗体杂交技术 是否出现杂交带 个体生物学水平的鉴定 确定是否具有抗性及抗性程度 抗虫、抗病、抗低温等实验 是否赋予了预期抗性 【自测强化】 1.辨易错 (1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (√) (2)目的基因一定是编码蛋白质的基因。 (×) 分析:目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。 (3)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 (×) 分析:外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达。 (4)将目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。 (√) (5)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。 (×) 分析:检测目的基因是否导入受体细胞的方法有PCR等技术。 (6)若能在植物细胞中检测到相应的目的基因,则说明基因工程项目获得成功。(×) 分析:能在植物细胞中检测到相应的目的基因,只能说明目的基因已导入受体细胞,但不一定能表达。 2.练表达 (1)(选择性必修3 P77“相关信息”)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸;引物在PCR中发挥的作用是:作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (2)(选择性必修3 P83“到社会中去”)将Bt抗虫蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种,可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性,原因是混种可以降低Bt抗虫蛋白对棉铃虫的选择压力。 【精研　强思维】 【思维探究】 BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ三种限制酶识别序列和切割位点分别为、、,图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的切割位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。 (1)(生命观念)质粒和获取目的基因若都用SmaⅠ切割,在构建重组表达载体时,往往使用T4 DNA连接酶,而不用E.coli DNA连接酶。为什么? 提示:T4 DNA连接酶连接具有平末端DNA片段的效率要远远高于E.coli DNA连接酶。  (2)(科学思维)在构建重组质粒时,若只用SmaⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,会导致什么结果? 提示:除形成重组质粒外,还会导致目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接。 (3)(科学探究)在构建重组质粒时,限制酶应该选SmaⅠ和HindⅢ,原因是什么? 提示:能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因。 【思维建构】 “模型法”解读限制酶选择的四个要求 1.位置要求:限制酶的切割位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中,所选切割位点应位于启动子和终止子之间,若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,要至少保留一个,用于重组DNA的鉴定和筛选。另外,目的基因上如果有该酶的切割位点,不能选择。 2.酶切要求: (1)单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图,选用XhoⅠ),但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接,还可造成目的基因的多拷贝插入。 (2)双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如:不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外,不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。 3.数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如选择SmaⅠ进行切割,则切割重组后会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,所选限制酶在载体上最好只有一个切割位点。 4.特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。 精练　提能力 1.(2023·新课标全国卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接 【解析】选C。本题考查基因工程中基因表达载体的构建。酶3切割后得到的是平末端,E.coli DNA连接酶连接平末端,效率较低,应选T4 DNA连接酶连接,A错误;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者末端不同,不能连接,B错误;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,用T4 DNA连接酶连接后,可以防止反向连接,是效率比较高的选择,C正确;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,酶4会破坏抗生素抗性基因,也就是破坏了标记基因,且两种酶切出来的黏性末端还可能发生错误连接,所以不能使用,D 错误。 2.(2023·辽宁高考)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　) A.CD163基因中编码起始密码子的序列 B.CD163基因中编码终止密码子的序列 C.RFP基因中编码起始密码子的序列 D.RFP基因中编码终止密码子的序列 【解析】选B。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译,使其表达成一条多肽,因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子,否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译,无法合成红色荧光蛋白,因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列,B符合题意,A、C、D不符合题意。 3.(2024·新课标全国卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切(切割)位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是__________________。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将 M1与 M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切(切割)位点之间,原因是　 ______________________________　。  (2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和____________________。  (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是____________________;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是___________________。  (4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________(答出2点即可)。  【解析】本题考查基因表达载体的构建、PCR技术、碱基互补配对原则等。 (1)限制酶的作用对象是DNA的磷酸二酯键;根据题意可知,该过程是在重组质粒中接入M1和M2,再用限制酶切出新的片段甲替换区(M1+启动子+N基因+终止子+M2),再接入B1基因组中,得到菌株B2,因此在M1和M2之间,需要保证N基因的完整性,同时还需要保证N基因能够正常表达,所以,应将 M1与 M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切(切割)位点之间。 (2)向导RNA需要与对应的DNA进行结合,RNA的碱基和DNA的碱基进行互补配对,碱基配对方式有G-C、C-G、U-A和A-T。 (3)要验证片段甲是否插入了细菌B1基因组,需要用菌株B2的基因组作为模板进行PCR;如果有PCR产物,说明菌株B2中含有N基因,如果没有PCR产物,说明菌株B2中不含有N基因。因为片段甲被替换,因此在重组片段甲(M1+启动子+N基因+终止子+M2)中,没有引物4的结合位点,因此使用引物3、4进行PCR时,无法获得PCR产物。 (4)秸秆焚烧不但严重污染空气(环境),还有很大的火灾隐患,焚烧对于秸秆有机物中的能量也是极大的浪费,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可以有效地避免以上问题。 答案:(1)磷酸二酯键　保证N基因、N基因的启动子和终止子的完整性以及保证N基因插入细菌B1基因组后能够正常表达　(2)C-G、U-A、A-T　(3)菌株B2的基因组　无PCR扩增产物 (4)不污染空气(环境)、避免火灾的发生、秸秆中的能量得到充分利用 【从教材走向高考】 【体验高考　链接教材】 1.(2024·全国甲卷)→(选择性必修3 P78、P82)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是_________,引物与模板DNA链碱基之间的化学键是_________。  (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切(切割)位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在____(答出两点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是___________。  (3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是______________________________________________;若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是:　 ______________　。  (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是_______________________________。  氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 【解析】本题主要考查基因工程。 (1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性,引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。 (2)构建重组质粒时,与单一酶酶切相比,采用双酶切方法可以形成不同的黏性末端,避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端,需用T4 DNA连接酶连接。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,可利用DNA分子杂交技术,将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,用含有放射性同位素标记的目的基因探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,表明大肠杆菌中含有重组质粒。 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码链与模板链互补,模板链与mRNA互补,因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA,若第一个核苷酸G缺失,则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA,肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸,第四个密码子为终止密码子,不对应氨基酸。 答案:(1)变性　氢键 (2)可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶 (3)处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,用含有放射性同位素标记的目的基因探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,表明大肠杆菌中含有重组质粒 (4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸 【深研教材　预测高考】 2.(选择性必修3 P81“资料卡”改编)图1为生产转基因抗虫棉时使用的质粒,图2为生产转基因抗虫棉时所用目的基因侧翼涉及的限制酶的切割位点。 (1)为了高效地构建基因表达载体,最好选用____________________(填限制酶名称)同时切割质粒和目的基因。  (2)为了筛选出基因表达载体,需要将DNA连接酶处理后的溶液与大肠杆菌混合在一起进行培养,为了促使大肠杆菌吸收外源DNA,需要用_____________处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。随后再将大肠杆菌涂布在含__________________的培养基中培养,一般情况下这样培养出来的大肠杆菌有两种类型:一种是含有结合了目的基因的质粒,一种是含有未结合目的基因的质粒。可以加入____________________分别去切割两种质粒,其中结合了目的基因的质粒在切割后能产生目的基因。  (3)图示质粒在设计时插入了T-DNA序列,并且将启动子、多克隆位点和终止子序列插入T-DNA中(注:插入不会破坏T-DNA的作用),T-DNA的作用是________。  (4)有人担心基因工程中使用的抗性基因可转移至近缘生物中,本例中的质粒能否有助于降低氨苄青霉素抗性基因转移到近缘生物的风险?为什么? 【解析】(1)高效构建基因表达载体宜采用双酶切,即选用HindⅢ和BamHⅠ同时切割质粒和目的基因。(2)使用Ca2+或CaCl2处理可以使大肠杆菌处于易于吸收外源DNA的生理状态。筛选时需要用到抗性基因,在本质粒中抗性基因是氨苄青霉素抗性基因,因此在重组体筛选时需要用到含氨苄青霉素的培养基。使用DNA连接酶连接后的重组质粒中,原来切割质粒和目的基因的限制酶切割位点在重组质粒中再次出现,可以使用同样的限制酶(HindⅢ和BamHⅠ)将重组质粒再次切开。(3)T-DNA的作用是将相应的DNA序列转移并整合到受体细胞染色体DNA上。(4)因为T-DNA中插入启动子、多克隆位点和终止子之后并不影响T-DNA的作用,所以T-DNA会把T-DNA中插入的DNA片段转移到染色体DNA上,这样氨苄青霉素抗性基因将无法转移到染色体DNA上而保留在细胞质中,细胞质中的DNA无法稳定的保存和复制,将会随着个体发育过程中细胞分裂次数的增加而丢失,从而降低了抗性基因转移的风险。 答案:(1)HindⅢ和BamHⅠ (2)CaCl2(或Ca2+)　氨苄青霉素　HindⅢ和BamHⅠ (3)将插入T-DNA中的DNA序列转移并整合到受体细胞染色体DNA上 (4)能。只有T-DNA之间的DNA序列可以转移至染色体DNA上,本例中氨苄青霉素抗性基因不能转移到染色体DNA上,个体发育过程中会随着细胞分裂而逐渐丢失,因而不会转移至近缘生物中。 - 22 - 学科网（北京）股份有限公司 $