第34讲 基因工程和蛋白质工程（知识清单）（上海专用）2026年高考生物一轮复习讲练测

第34讲 基因工程（下）+蛋白质工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、归纳重点 考点1 基因工程的基本操作流程★★★★☆ 考点2 蛋白质工程★★★☆☆ （星级越高，重要程度越高） 陷阱预警台：识别高频错误，提供防错策略（3大陷阱预警） 素养加油站：前沿科研成果或热点问题分析、聚焦考点预测 真题挑战场：感知真题，检验成果，考点追溯 （附高清PDF，可打印） · 考点1 基因工程的基本操作流程★★★★☆ 1.PCR是获取目的基因的主要方法（目的基因的筛选和获取） （1）目的基因：人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。 （2）分离获取目的基因方法：（目的基因是基因工程各项产业化应用的前提，也是基因工程项目实施的首要阶段。） （3）PCR（聚合酶链式反应）技术：模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术。 补充：PCR过程的注意事项 （1）引物1和引物2之间不能发生碱基互补配对，引物分子内部也不能发生碱基互补配对。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 （2）若要保证目的基因能与载体相连接，可在引物的5'端加入限制酶识别序列。 （3）退火温度的设定与引物的长度和碱基组成有关。引物长度一定时，G-C含量高时，退火温度也应升高否则容易出现非特异性结合。 （4）不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。 补充：PCR 扩增技术为什么要使用引物和耐热DNA聚合酶？ 迄今为止，在几乎所有生物体内发现的DNA聚合酶都不能以单个脱氧核苷酸为起点，将游离的脱氧核苷三磷酸从头聚合形成多核苷酸链，而只能将脱氧核苷酸掺入到一段已存在的核苷酸链（即引物）上。就大多数生物而言，引物通常为6～8个碱基长度的单链RNA分子。 由于引物是根据碱基互补配对原理（即形成氢键）“搭在”DNA模板特定区域上的（该过程称为“退火”），因此，在较低的温度下，引物可能会与不完全配对的DNA模板区域结合，造成PCR扩增产物的多样化（即非特异性）。此外，随着扩增轮数的递增，DNA扩增产物的浓度（也包括黏度）急剧上升，严重影响PCR系统中的分子扩散，直至过早终止扩增反应。因此，PCR的连续多轮循环必须在高温条件下进行，而PCR技术的核心便是耐热DNA聚合酶的发现，此类耐热酶大都来自生活在温泉中的嗜热细菌。 一般而言，衡量PCR的质量指标包含：（1）特异性：扩增产物纯净单一，引物长度和退火温度是关键影响因素。（2）准确性：扩增产物的序列忠实于模板DNA序列，与所用高温聚合酶的保真性有关。（3）有效性：扩增产物高产量，与酶量和镁离子浓度有关。 补充：PCR技术和DNA复制的比较 名称 PCR技术 DNA复制 原理 半保留复制 半保留复制 场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内（主要是细胞核中） 条件 模板 一段目的DNA片段 整个DNA分子 原料 4种脱氧核苷三磷酸 4种脱氧核苷三磷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 能量 热能（PCR仪控制温度） ATP 引物 单链DNA片段（上游、下游引物） RNA片段 解旋方式 DNA在高温下变性解旋 DNA解旋酶催化 温度条件 在较高温度下进行，需控制温度；Buffer缓冲液，Mg2+、无菌技术等 细胞内温和条件；体内环境 过程 结果 快速复制目的DNA 复制DNA分子（相对速度较慢） 补充：PCR扩增过程图解及规律 经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。 2．切割和连接是构建表达载体的主要方式 （1）表达载体的构建：将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切割出黏性末端（简称“切”），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（简称“接”），形成含目的基因且能表达的表达载体的过程。 （2）基因表达载体的组成： 注意事项：①由于目的基因两侧的黏性末端相同，因而能以正反两种方式等概率接入载体，但在基因工程大多数应用中，只有一种方式是可用的。 ②同样，由于载体片段两侧的黏性末端也相同，因而在连接时载体两个黏性末端可以自我环化，导致载体“空载”（即非重组DNA分子）。 ③根据DNA连接酶的工作原理，目的基因和载体DNA只需黏性末端相同便能有效连接，也就是说，两种DNA并不必须用同一种酶切开。 ④如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会消失，也就是说，不能用相应的限制性内切核酸酶从重组DNA分子中重新“卸下”目的基因。 补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 目的基因上游（DNA序列） 目的基因下游（DNA序列） mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸， 3．将DNA分子导入受体细胞 （1）目的/导入原因：经连接操作后的DNA分子只有导入受体细胞，才能借助细胞内的基因表达系统使目的基因所蕴含的遗传信息得以表达。 （2）受体细胞种类：微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。 （3）转化（简称“转”）：在自然条件下，DNA很难进入细胞。为了大幅度提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理的一操作。 （4）转化的方法：物理方法（如电击法）、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法） 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 氯化钙法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 （5）扩增（简称“增”）：转化成功的效率也只有10-4～10-2，因而需要高效筛选出接纳了DNA分子的受体细胞。为了做到这一点，转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 4．借助标记基因筛选和鉴定含目的基因 （1）筛选与鉴定：只有少数细胞能接纳DNA分子，而且进入受体细胞的DNA分子还有可能含有空载质粒，因此，需要借助有效的实验技术快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的受体细胞，这一过程称为筛选与鉴定。 （2）筛选含目的基因的受体细胞常用方法：抗药性筛选法和显色筛选法 ①抗药性筛选 抗药性筛选法实施的前提条件：载体DNA携带抗生素的抗性基因 标记基因：可供筛选使用的功能性基因。 第一轮筛选：筛选获得的转化成功克隆中有两种类型：含重组质粒的克隆和含空载质粒的克隆。 第二轮筛选：含重组质粒的克隆只能在Amp平板上生长；而含空载质粒的克隆可出现在同时含Amp和Tet的平板上。 ②显色筛选（主要是鉴别） 很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18/19 同时携带Ampr和lacZ'两个标记基因。将外源DNA插在lacZ'标记基因内部的任何限制性内切核酸酶切割位点处，将转化扩增的细菌涂布在同时含有Amp和X-gal的固体培养基上，再长出来的克隆中，白色克隆即为含重组质粒的克隆。 经抗药性或显色筛选获得的含目的基因的受体细胞还需进一步鉴定安装在载体上的目的基因位置是否正确以及是否能高效表达，这需要使用PCR技术和基因表达产物（蛋白质）的结构和功能分析技术。 5.构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 如果构建多细胞的转基因动植物，还需将表达载体导入可发育成动植物个体的受体细胞中。 1.动物：动物的生殖细胞（精细胞和卵细胞）、受精卵（或早期胚胎细胞）、诱导性多能干细胞等 方法：显微注射或病毒感染 （1）DNA显微注射：是动物细胞基因转移普遍采用的一种物理转化方法。 基本操作程序：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配后从其输卵管内取出受精卵，用吸管将受精卵固定在倒置显微镜上，然后借助玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液；将注射了DNA的受精卵移植到母鼠子宫中发育，继而繁殖转基因小鼠子代。 （2）病毒感染当采用动物病毒（如腺相关病毒和慢病毒）DNA作表达载体时，可以通过病毒感染的方式高效导入动物细胞中。 2.植物：植物的愈伤组织（或其他组织的原生质体）、生殖细胞或胚胎组织等 方法：农杆菌转化法或含有表达载体的植物病毒 由于植物的愈伤组织能再生出整株植物，因此转基因植物的构建要比转基因动物的构建更加简便。转基因动植物培育出来后，仍需要使用PCR等技术确认转基因是否获得成功，以及目的基因在动植物体内是否正确表达。 · 考点2 蛋白质工程★★★☆☆ 1.蛋白质工程在基因水平上设计和改造蛋白质 （1）蛋白质工程崛起的缘由 ①基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质； ②天然蛋白质的不足：天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 （2）蛋白质工程：采用重组DNA技术在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，可以对天然蛋白质进行理性改造。由人为突变或设计基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程操作流程，又称第二代基因工程。 （3）蛋白质工程 ①修饰改造天然蛋白：两大类操作策略：基因的定点突变（在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列，）和定向进化（在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列）。 一方面可实现氨基酸序列改造，优化其功能；另一方面还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋白质结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象和生物功能之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。 优点：修饰改造天然蛋白实质上是一个模拟自然界进化与适应的循序渐进过程，可将数千万年的自然进化历程缩短为数月、数周甚至数天的实验室过程（图所示的循环突变） ②设计制造全新蛋白：蛋白质工程的另一关键方面是根据我们所掌握的蛋白质结构与功能基本信息设计制造全新蛋白。设计制造全新蛋白需要根据已经掌握的蛋白质结构与功能的关系，借助特殊的电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，然后借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 假设蛋白质平均由200个氨基酸构成，那么其氨基酸序列的可能性高达20200种，但自然界中天然全新蛋白的性能是否能达到设计标准。然蛋白质的氨基酸序列大约只有1012种。数十年来，人们采用定向突变和定向进化策略修饰改造的天然蛋白种类只是沧海一粟，而设计制造全新蛋白的理念就是在更广泛的氨基酸序列海洋里开发自然界并不存在、但理论上可行的蛋白质资源。 2.蛋白质工程根据人类需要改造目标蛋白质 ①定点突变方法：化学合成或PCR法 研究表明，人胰岛素样生长因子的结构和性质与人胰岛素高度相似，但它不像人胰岛素那样容易聚合形成多分子。 举例1：人胰岛素样生长因子人胰岛素B链基因中编码第28位脯氨酸和第29位赖氨酸的序列分别为CCC和AAG。因此，只需在人胰岛素基因中将原来的“CCCAAG”序列改造成“AAGCCC”， 理论上便能在受体细胞中产生两处氨基酸序列颠倒的突变型人胰岛素。 由于人胰岛素B链基因较短，按照设计好的编码序列进行化学合成，是获取这种突变型目的基因的首选方法。另外，也可采取PCR方案获取突变型目的基因（PCR方案对较长的目的基因编码序列更经济）。 首先人工化学合成含有突变序列的突变引物和不含突变序列的正常引物，然后使用这两种引物以人胰岛素基因为模板进行PCR。研究证实，由这种突变的目的基因表达的突变型人胰岛素不再聚合成多分子形式。 举例2：L-天冬酰胺酶：L-天冬酰胺酶治疗儿童白血病的有效药物，但在临床应用中因其并非人体蛋白常常引起过敏反应，因此降低免疫原性是该药研究开发的重要内容。采用定点突变技术将细菌来源的L-天冬胺酶某位赖氨酸更换为丙氨酸，形成新型的-天冬胺酶突变蛋白，其免疫原性比天然酶蛋白下降2.5倍，且活性保持不变。 举例3：t-PA突变蛋白：心脑血管疾病引发的血栓（即血液中主要由蛋白质构成的固体颗粒》并发症严重威胁人类生命，研制高效、特异、安全的溶栓药物一直是药物开发领域的热门课题。临床上常将人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）用作溶解血栓、抢救心肌梗死（心血管被血栓堵塞）患者的特效药。然而，t-PA存在体内半衰期短和诱发颅内出血等缺陷。为了提高t-PA临床应用的可行性，科研人员采用蛋白质工程的定点突变策略，开发了一系列体内半衰期长、血栓溶解效率高、体内出血倾向大幅度降低的优质t-PA突变蛋白，如TNK型t-PA。 ②定向进化：在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因。 比如，针对某个特定的基因采用PCR技术进行扩增，在过程中通过改变反应条件（如使用低保真度的DNA聚合酶）故意让DNA复制发生随机错误，便能创建一系列随机突变的新基因序列；然后再将这些新基因序列导入合适的受体细胞中，表达出相应的一系列随机突变蛋白；最后，根据我们的需求从中筛选出具有特定优良功能或结构的目的蛋白。 补充：基因治疗 生理性T细胞受体（TCR）只有在受到抗原刺激后才能发挥免疫效应，而肿瘤表面抗原较难激活T细胞。用特异性识别特定肿瘤表面抗原的单链抗体（scFv）取代TCR的αβ链，同时对TCR复合物进行结构改造，构成所谓的嵌合型抗原受体（CAR）。与生理性T细胞受体（TCR）复合物相比，第二代嵌合型抗原受体（CAR）在结构上发生了很大改变。将这种携带工程化CAR的T细胞作为治疗用剂输回患者体内，此类疗法统称为CAR-T细胞疗法。 在体内，这种工程化CAR能指导T细胞识别并杀死表面上带有相应抗原的肿瘤细胞。然而，科学研究没有止境，人们担心这种第二代CAR-T细胞输回患者体内后是否会形成新的免疫原性。综上所述，以首例基因治疗临床试验（补充或更换ADA基因）为代表的众多策略均属于忠实于原基因编码序列的基因工程；而以CAR-T细胞疗法（修饰或改造受体蛋白）为代表的新型策略则属于第二代基因工程——蛋白质工程。 补充：蛋白质工程与基因工程的区别与联系 比较项目 蛋白质工程（第二代基因工程） 基因工程 区别 起点 预期的蛋白质功能 目的基因 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的新的生物类型和生物产品 结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已存在的蛋白质 联系 ①都在生物体外对基因进行操作；②蛋白质工程是在基因工程基础上聚合出来的第二代基因工程 判断 (1)如果仅将基因用限制酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换、增添或缺失某几个碱基，则属于蛋白质工程。 (2)如果合成的蛋白质是自然界中已存在的蛋白质(天然蛋白质)，则是基因工程；如果合成的蛋白质与天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。 PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定★★★☆☆ 1.实验原理：由于核苷酸的磷酸基团使DNA片段带负电荷，所以电泳开始前应将负电极插在凝胶板含DNA样品的一端，将正电极插在另一端。通电后，DNA片段会通过凝胶向正极方向“泳动”。凝胶电泳主要根据核酸分子的大小和结构将它们分离开来。 2.实验步骤： ①按配方配制50×TAE电泳缓冲液。 ②将上述50×TAE电泳缓冲液稀释50倍（即1×TAE），用1×TAE电泳缓冲液配制50 mL浓度为0.7%（W/V）的琼脂糖悬浮液，在微波炉中加热至琼脂糖溶解（溶液澄清）。 ③待琼脂糖溶液冷却至50℃左右，倒入已放置了电泳梳的胶模板中，凝胶厚度为3~5mm。 ④待琼脂糖凝胶完全凝固后，将凝胶连同胶模板一起放入盛有1×TAE 电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液没过凝胶约1mm，然后轻轻拔去电泳梳。 ⑤将PCR扩增产物溶液（即DNA样品）与5×上样缓冲液按4∶1比例混匀后，用移液器取3~10μL（体积视DNA浓度而定）的上述混合液，缓缓加入琼脂糖凝胶的样品槽内。 ⑥盖上电泳槽后通电，电压为80~100V，使DNA向正极泳动。 ⑦当上样缓冲液中的蓝色染料泳动至琼脂糖凝胶全长的三分之二时，切断电源，取出凝胶和胶模板，在紫外灯（或核酸蛋白检测仪）下观察DNA电泳条带。 分析： 标准样：一种分子质量的DNA样品，作为对照。用来确定待测样品中DNA的相对分子质量。 DNA荧光条带： ①条带的有无：代表是否成功扩增出待测样品中的DNA。若无条带，常见原因有：无DNA模板，引物设计不合适。 ②条带的亮度：代表扩增的DNA数量，越亮代表DNA数量越多 ③条带的位置：常代表DNA的大小。一般距离点样孔越远，说明跑得越快，DNA的分子质量越小。 预警类别一 基因工程的基本操作程序 陷阱1 目的基因一定是编码蛋白质的基因 正确理解：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 陷阱2 基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束 正确理解：启动子和终止子决定着转录的开始与结束。 陷阱3 为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 正确理解：为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。 陷阱4 检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术 正确理解：检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。 预警类别二 蛋白质工程 陷阱1 蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列 正确理解：蛋白质工程改变的是蛋白质分子的少数氨基酸。 陷阱2 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改造分子的结构 正确理解：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 一．基因工程 ① Luxturna （2017，治疗遗传性视网膜病变）。Luxturna通过AAV载体基因置换修复RPE65功能，为特定遗传性视网膜病变患者提供了首个病因治疗手段，但高昂成本仍是普及挑战。其临床应用标志着基因治疗在眼科领域的重大突破，推动了中国等地的特许医疗政策落地。 ② Zolgensma （2019，治疗脊髓性肌萎缩症SMA）。Zolgensma（通用名：onasemnogene abeparvovec）是全球首个获批用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的AAV基因治疗药物。 ③ Casgevy （2023，全球首个CRISPR基因编辑疗法，治疗镰状细胞贫血和β-地中海贫血）。Casgevy是一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的突破性疗法，用于治疗特定遗传性血液疾病。Casgevy代表了基因治疗领域的重大飞跃，但其普及仍面临技术复杂性与经济性挑战。随着生产流程优化及医保政策推进，未来有望惠及更多患者。 ④ CAR-T细胞治疗 结合基因编辑技术，增强癌症免疫治疗效果。CAR-T细胞治疗是一种革命性的肿瘤免疫疗法，通过基因改造患者自身的T细胞来精准识别并消灭癌细胞。 考点预测： 基因工程技术的常用工具--限制酶、DNA 连接酶和载体，为后续学习基因工程的基本环节奠定基础。以及基因工程在农牧业、医药卫生领域和食品工业方面的应用。 （2024·上海·高考真题）2．CRB1是一种膜蛋白，CRB1基因突变会导致不可逆的致盲眼病（LCA）。CRB1基因的多个位点均可能发生突变。图1显示了部分突变位点，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表突变位点。某4岁男孩因视力迅速下降就医，被诊断患有LCA。经检测，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因。 (1)据题中信息LCA的遗传方式是______。 A．常染色体隐性遗传 B．伴X染色体隐性遗传 C．常染色体显性遗传 D．伴X染色体显性遗传 (2)据图1，编号Ⅰ-Ⅳ所示的突变中，导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是______。 A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ (3)据图1，母亲CRB1突变基因编码的氨基酸序列变化位点是______。 A．652 B．1304 C．1305 D．3914 (4)若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计一对引物时应选择合理区间是______。 A．Ⅰ-Ⅱ B．Ⅰ-Ⅲ C．Ⅲ-Ⅳ D．Ⅱ-Ⅳ (5)该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型 。（编号选填） 【答案】(1)A (2)A (3)C (4)B (5)①②③④（或①②） 【分析】人类遗传病通常是指由于遗传物质改变而引起的人类疾病，主要分为单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病三大类。单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，包括常染色体隐性遗传病、常染色体显性遗传病、伴X染色体隐性遗传病、伴X染色体显性遗传病。 【详解】（1）某4岁男孩患有LCA，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因，据此可推知：LCA的遗传方式是常染色体隐性遗传，A正确，BCD错误。 故选A。 （2）编码链是指双链DNA中不能进行转录的那一条DNA链（非模板链），转录的方向是从模板链的3′到5′端，据此分析图1中四个突变位点及附近的碱基序列可知：转录时，编号Ⅰ所对应的mRNA的片段突中最先出现终止密码子，因此导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是Ⅰ，A正确，BCD错误。 故选A。 （3）翻译时，mRNA上3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基构成1个密码子。据图1，突变位点Ⅲ和Ⅳ分别为编码链的第3493位点的碱基和第3914位点的碱基，突变位点Ⅲ和Ⅳ之间的基因片段编码的氨基酸数为（3914－3493）÷3≈140.3，而突变位点Ⅲ的突变基因编码的氨基酸序列变化位点是1165，所以母亲CRB1（突变位点Ⅳ）突变基因编码的氨基酸序列变化位点是1165＋140＝1305，C正确，ABD错误。 故选C。 （4）突变位点Ⅱ是父亲CRB1基因突变的位点，若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计的一对引物应该能够与突变位点Ⅱ两侧的碱基序列进行互补配对，所以应选择的合理区间是Ⅰ-Ⅲ，B正确，ACD错误。 故选B。 （5）突变位点Ⅱ是父亲CRB1基因突变的位点，突变位点Ⅳ是母亲CRB1基因突变的位点。该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞在减数第一次分裂的前期，若四分体中的非姐妹染色单体之间没有发生交叉互换，则经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型为①②；若四分体中的非姐妹染色单体之间发生了交叉互换，则经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型为①②③④。 （2023·上海·高考真题）图1显示了人体结缔组织中弹性纤维的形成机制。弹性蛋白借助E蛋白定位在微纤维束上，并由P蛋白协助L酶交联弹性蛋白形成弹性纤维。 弹性纤维合成受阻，对结缔组织中的血管会产生严重后果，如全身性动脉迂曲。某家庭有两男两女四个孩子，两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，双亲和两个女儿均表型正常。对全体家庭成员进行基因测序，发现所有人均含有致病E基因。图2显示了致病E基因表达的部分氨基酸序列，其中一个字母表示一种氨基酸，*表示终止。 （2）据题中信息分析，该家庭成员所含的致病E基因是___（显性/隐性）基因，该病属于___（伴X/常）染色体遗传病。 （3）不考虑分裂异常，下列关于大儿子的致病E基因的来源与分布，正确的是___（单选）。 A. 其所有次级精母细胞均含有 B. 仅源自其父亲的精子 C. 仅其部分次级精母细胞含有 D. 仅源自其母亲的卵细胞 （4）据图2分析，致病E基因所表达的蛋白功能异常，其可能原因是由于E基因___（编号选填）。 ①转录后的翻译提前终止 ②替换了一个碱基对 ③缺失了一个碱基对 ④插入了一个碱基对 （5）理论上，下列基因治疗方案中对缓解大儿子的全身性动脉迂曲最有效的是___（单选）。 A. 修复P蛋白的基因 B. 修复LOX酶的基因 C. 降低致病E基因表达量 D. 修复致病E基因 （6）大女儿与表型正常的男性结婚后，为预防患全身性动脉迂曲的孩子出生，所采取的措施中应包括___（编号选填）。 ①孕前对大女儿配偶做基因检测 ②孕后开始高蛋白饮食 ③孕前评估该疾病的再发风险率 ④孕前对大女儿配偶做血管 B 超检查 【答案】 （2） ①. 隐性 ②. 常 （3）A （4）①③④ （5）D （6）①②③④ 【解析】 【分析】遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。遗传病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也可后天发病。如先天愚型、多指（趾）、先天性聋哑、血友病等，这些遗传病完全由遗传因素决定发病，并且出生一定时间后才发病，有时要经过几年、十几年甚至几十年后才能出现明显症状。 小问2详解】 双亲和两个女儿均表型正常，两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，说明该病为隐性病，而所有人均含有致病E基因，因此为常染色体隐性，若为伴X隐性，则父亲为XBY，不含致病基因，因此致病E基因为隐性基因， 位于常染色体上。 【小问3详解】 A、两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，故基因型为EE，所有次级精母细胞均含有，A正确； B、大儿子的致病E基因一个来自于母亲，一个来自于父亲，B错误； C、所有次级精母细胞均含有E基因，C错误； D、致病E基因也来自于精子，D错误。 故选A。 【小问4详解】 ①致病E基因所表达的蛋白后面氨基酸序列全部改变，可能是转录后的翻译提前终止导致，①正确； ②如果是替换了一个碱基对，氨基酸只改变一个，后面的氨基酸序列不会变，②错误； ③基因中缺失了一个碱基对，会导致后面的氨基酸顺序全部改变，③正确； ④基因中插入了一个碱基对，也会导致后面的氨基酸顺序全部改变，④正确。 故选①②③④。 【小问5详解】 A、P蛋白只是弹性纤维的一部分，修复P蛋白的基因不一定可以有效缓解大儿子的全身性动脉迂曲，A错误； B、P蛋白协助L酶交联弹性蛋白形成弹性纤维，修复LOX酶的基因不一定可以有效缓解大儿子的全身性动脉迂曲，B错误； C、大儿子的基因型为EE，降低致病E基因表达量也可能较严重，C错误； D、大儿子的全身性动脉迂曲是致病基因E引起的，基因控制性状，修复致病E基因对缓解大儿子的全身性动脉迂曲最有效，D正确。 故选D。 【小问6详解】 ①大女儿表型正常，含致病E基因，表型正常的男性，也可能含致病E基因，因此为预防患全身性动脉迂曲（EE）的孩子出生，可以在孕前对大女儿配偶做基因检测，①正确； ②全身性动脉迂曲是由于弹性纤维合成受阻，孕后开始高蛋白饮食有助于蛋白质的合成，②正确； ③孕前评估该疾病的再发风险率，预防患全身性动脉迂曲的孩子出生，③正确； ④孕前对大女儿配偶做血管 B 超检查，看是否存在血管动脉迂曲的情况，④正确。 故选①②③④。 学科网（北京）股份有限公司1/10 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 第34讲基因工程 （下)+蛋白质工程（知识清单） 分学习导航站 9知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 巴核心知识库：重难考点总结，杭理必背知识、归纳重点 考点1基因工程的基本操作流程★★★衡☆ 考点2蛋白质工程★★★☆☆ (是级越高，重要程度越高) @陷阱预警台：识别高频错误，提供防错策略(3大陷阱预警) 回素养加油站： 前沿科研成果或热点问题分析、聚焦考点预测 了真题挑战场：感知真题，检验成果，考点追溯 (附高清PDF,可打印) 知识主脉络 如果基因序列未知【大规模裤选的方法 如果目的基因的完整序列已知{化学合成法 前提条件目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成DN引物 0获取目的基细{方法 模板 目的基因两条链 原料{四种脱氧核苷三磷酸，即dCTP.dATP、dGTP、dTP 要求 酶耐热DNA聚合酶(Taq酶) 聚合链式反应( 引物{人工合成的与模板DNA发生碱基互补配对的两条单DNA片段 特点厂微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列 预变性95C预变性3-5min a变性 过程 循环扩增b.退火 c聚合 结束，PCR产物放置于4C保存，待电泳检测或-20C长期保存 目的基国{人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因 RNA聚合确识别和结合的部位 启动子 口构建表达载体 载体的组成 驱动转录开始 终止子{调控作用，使转录在所需要的地方停下来 标记基因{ 用于选含目的基因的受体细胞抗性基国 荧光蛋白基因 基因工程操作步 白质工程 物理方法电击法 转化的方法 化学方法{如氯化钙法 生物方法 农杆菌法 ©黔装 微生物 受体细胞种类植物 动物细胞 特点{成功率低 抗药性筛筛选 ●● 第选含目的基因的受体细胞 分子水平检测 PCR技术和基因表达产物（蛋白质）的 鉴定重组在载体上的目的基因位置 结构和功能分析技术 是否正确以及是否能高效表达 原理{基因突变 蛋白质工程 修饰改造天然蛋白{策酪 !定点突变 包括 定向进化 设计制造全新蛋白 1/10 学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 02 核心知识库 ⊙考点1基因工程的基本操作流程★★★★☆ 1.PC是获取目的基因的主要方法（目的基因的筛选和获取） (1)目的基因：人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。 (2)分离获取目的基因方法：（目的基因是基因工程各项产业化应用的前提，也是基因工程项目实 施的首要阶段。) 「①如果目的基因的部分序列已知，可采用聚合酶链式反应(PCR) ②如果目的基因的完整序列已知，可采用化学合成法 ③如果基因序列未知，采用大规模筛选的方法 (3)PCR(聚合酶链式反应)技术：模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术。 原理：DNA复制（半保留复制） 前提条件：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成DNA引物 模板：目的基因2条链 原料：4种脱氧核苷三磷酸(dCTP、dATP、dGTP、dTTP) 条件 酶：耐热DNA聚合酶(Taq酶) 缓冲液系统（保证pH合适） 引物：人工合成的与模板DNA发生碱基互补配对的2条单链DNA片段 (引物通常为6~8个碱基长度的单链RNA分子) 变性：95C,双链DNA形成单链模板 过程」 退火：55~68℃，两条引物分别与两条单链DNA模板(3'端)结合 聚合：75C,(耐热)DNA聚合酶引物的一端以相反方向合成新的DNA子链 结束反应：PCR产物放置于4℃保存，待电泳检测或-20℃长期保存 结果：1分子的双链DNA模板扩增至2m个分子 2/10 学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 待扩增的DNA区域（绿色部分） w.wwwwwwwwwwmmm ↓变性 J 3变性 5 mmmmmmmmmt 5引物二二 退火 3 引物1一5 延伸 复性 5' 多轮循环 5 3 3 5画引物2 引物1 DNA聚合酶和dNTP一聚合 引物2 313 5'5'y 5 pwwwwwwwwwwwwwwwwwwwm △补充：PCR过程的注意事项 (1)引物1和引物2之间不能发生碱基互补配对，引物分子内部也不能发生碱基互补配对。在DNA 扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链，因此复制DNA时应 加入两种引物。 (2)若要保证目的基因能与载体相连接，可在引物的5'端加入限制酶识别序列。 (3)退火温度的设定与引物的长度和碱基组成有关。引物长度一定时，G-C含量高时，退火温度 也应升高否则容易出现非特异性结合。 (4)不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较 高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。 △补充：PCR扩增技术为什么要使用引物和耐热DNA聚合酶？ 迄今为止，在几乎所有生物体内发现的DNA聚合酶都不能以单个脱氧核苷酸为起点，将游离的 脱氧核苷三磷酸从头聚合形成多核苷酸链，而只能将脱氧核苷酸掺入到一段已存在的核苷酸链（即引 物)上。就大多数生物而言，引物通常为6~8个碱基长度的单链RNA分子。 由于引物是根据碱基互补配对原理（即形成氢键）“搭在DNA模板特定区域上的（该过程称为“退 火”)，因此，在较低的温度下，引物可能会与不完全配对的DNA模板区域结合，造成PCR扩增产 物的多样化（即非特异性）。此外，随着扩增轮数的递增，DNA扩增产物的浓度（也包括黏度）急剧 上升，严重影响PCR系统中的分子扩散，直至过早终止扩增反应。因此，PCR的连续多轮循环必须 在高温条件下进行，而PCR技术的核心便是耐热DNA聚合酶的发现，此类耐热酶大都来自生活在温 泉中的嗜热细菌。 一般而言，衡量PC℉的质量指标包含：(1)特异性：扩增产物纯净单一，引物长度和退火温度 3/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 是关键影响因素。(2)准确性：扩增产物的序列忠实于模板DNA序列，与所用高温聚合酶的保真性 有关。(3)有效性：扩增产物高产量，与酶量和镁离子浓度有关。 △补充：PCR技术和DNA复制的比较 名称 PCR技术 DNA复制 原理 半保留复制 半保留复制 场所 体外(PCR扩增仪中) 细胞内（主要是细胞核中） 条 模板 一段目的DNA片段 整个DNA分子 件 原料 4种脱氧核苷三磷酸 4种脱氧核苷三磷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 能量 热能(PCR仪控制温度) ATP 引物 单链DNA片段（上游、下游引物） RNA片段 解旋方式 DNA在高温下变性解旋 DNA解旋酶催化 温度条件 在较高温度下进行，需控制温度： 细胞内温和条件；体内环境 Buffer缓冲液，Mg2+、无菌技术等 过程 变性—退火—延伸 边解旋边复制 90-95℃55-60℃70-75℃ 3 好 -5 3(皿 3 5 结果 快速复制目的DNA 复制DNA分子（相对速度较慢） △补充：PCR扩增过程图解及规律 4/10 学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 文3m吗写-3 Wmm变5 -3′31 3I吧5'3' 3- 品吧 3.5m吧 品吧 3.5品吧 Dwwwodo 3品吗53 3' 5安mmm 5'品mmmg, 3' 5m 一目标序列 5'吧5 -3 吧53 -侧翼序列 口引物A 品吗 ▣引物B 循环1： 循环2： 循环3： 变性→复性→延伸 变性→复性→延伸变性→复性→延伸 经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2个，含其中一种引物的DNA分子数(2 一1)个，同时含两种引物的DNA分子(2m一2)个，共需要消耗(2+1一2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA 分子21个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2r一2m)个。 2.切割和连接是构建表达载体的主要方式 (1)表达载体的构建：将PC℉扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切 割出黏性末端（简称“切），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（简称“接”），形成含目的基因 且能表达的表达载体的过程。 质粒 外源DNA片段 同一种限制酶或 目的基因 产生相同末端的 限制酶切割 一个切口， DNA连接酶 两个切口，获得 目的基因 两个黏性末端 基因表达载体 (2)基因表达载体的组成： 供目的基因 限制酶切位点 插入载体中 RNA聚合酶识别 和结结合的部位 启动子 终止子 具有驱动基因转 录的作用 质粒 复制原点 标记基因 便于筛选含 位于基因下游 有重组DNA 使转录停止的 分子的细胞 启动基因表达载体复 段特殊DNA序列 制的一段DNA序列 5/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 注意事项：①由于目的基因两侧的黏性末端相同，因而能以正反两种方式等概率接入载体，但在 基因工程大多数应用中，只有一种方式是可用的。 ②同样，由于载体片段两侧的黏性末端也相同，因而在连接时载体两个黏性末端可以自我环化， 导致载体“空载”（即非重组DNA分子）。 ③根据DNA连接酶的工作原理，目的基因和载体DNA只需黏性末端相同便能有效连接，也就是 说，两种DNA并不必须用同一种酶切开。 ④如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开且的基因和载体 DA,那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会消失，也就是说，不能用相应的限制性内 切核酸酶从重组DNA分子中重新“卸下”目的基因。 BamH I BgiII -GGATCC- -AGATCT- -CCTAGG- -TCTAGA- -GGATCT- CCTAGA- △补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 目的基因上游(DNA 目的基因下游 位置 mRNA首端 mRNA尾端 序列) (DNA序列) RNA聚合酶识别和 使转录在所需要 翻译的起始信号 翻译的结束信号 功能 结合的部位，驱动基 的地方停下来 (编码氨基酸) (不编码氨基酸， 因转录出mRNA 3.将DNA分子导入受体细胞 (1)目的/导入原因：经连接操作后的DNA分子只有导入受体细胞，才能借助细胞内的基因表达 系统使目的基因所蕴含的遗传信息得以表达。 (2)受体细胞种类：微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。 (3)转化（简称“转”）：在自然条件下，DNA很难进入细胞。为了大幅度提高DNA分子进入受 体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理的一操作。 (4)转化的方法：物理方法（如电击法)、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法） 6/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 生物种类 植物 动物 微生物 农杆菌转化法、花粉管 常用方法 显微注射法 氯化钙法 通道法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 将目的基因插入Ti质 将含有目的基因的表达 Ca2+处理细胞→细胞处 粒的T-DNA中→农杆 载体提纯→取卵（受精 于一种能吸收周围环境 转化过程 菌→导入植物细胞→整 卵)→显微注射→受精卵 中DNA分子的生理状态 合到受体细胞的染色体 发育→获得具有新性状 一基因表达载体导入 DNA上→表达 的动物 (5)扩增（简称“增”）：转化成功的效率也只有104102，因而需要高效筛选出接纳了DNA分 子的受体细胞。为了做到这一点，转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以 表达，这个过程称为扩增。 4.借助标记基因筛选和鉴定含目的基因 (I)筛选与鉴定：只有少数细胞能接纳DNA分子，而且进入受体细胞的DNA分子还有可能含有 空载质粒，因此，需要借助有效的实验技术快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的 受体细胞，这一过程称为筛选与鉴定。 (2)筛选含目的基因的受体细胞常用方法：抗药性筛选法和显色筛选法 ①抗药性筛选 抗药性筛选法实施的前提条件：载体DNA携带抗生素的抗性基因 标记基因：可供筛选使用的功能性基因。 第一轮筛选：筛选获得的转化成功克隆中有两种类型：含重组质粒的克隆和含空载质粒的克隆。 第二轮筛选：含重组质粒的克隆只能在Ap平板上生长；而含空载质粒的克隆可出现在同时含 Anp和Tet的平板上。 7/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 含Amp平板 BamHI 。°。。 Amp'Tet pBR322 PstI ori PstI PstI BamHI BamHI 9 插入DNA片段 d 转移单菌落 BamHI BamHI 含重组质粒的克隆 含空载质粒的克隆 BamHI PstI mp PstI 重组质粒】 PstI 重组质粒 含Amp平板 含Tet平板 ori Amp Tet Amp Tet ②显色筛选（主要是鉴别） 限制性内切核酸酶识别序列 lacZ' Amp pUC18 ori (A) (B) 很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物(X-gal)水解 成蓝色产物。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18/I9同时携带Ampr和lacZ'两个标记基因。 将外源DA插在lacZ标记基因内部的任何限制性内切核酸酶切割位点处，将转化扩增的细菌涂布在 同时含有Ap和X-gl的固体培养基上，再长出来的克隆中，白色克隆即为含重组质粒的克隆。 经抗药性或显色筛选获得的含目的基因的受体细胞还需进一步鉴定安装在载体上的目的基因位置 是否正确以及是否能高效表达，这需要使用PC技术和基因表达产物（蛋自质）的结构和功能分析技 术。 5.构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 如果构建多细胞的转基因动植物，还需将表达载体导入可发育成动植物个体的受体细胞中。 1.动物：动物的生殖细胞（精细胞和卵细胞）、受精卵（或早期胚胎细胞）、诱导性多能干细胞等 方法：显微注射或病毒感染 (1)DNA显微注射：是动物细胞基因转移普遍采用的一种物理转化方法。 8/10 丽学科网·上好课 www zxxk.com 上好每一堂课 基本操作程序：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配后从其输卵管内取出受精卵， 用吸管将受精卵固定在倒置显微镜上，然后借助玻璃注射针向受精卵注入DNA溶液；将注射了DNA 的受精卵移植到母鼠子宫中发育，继而繁殖转基因小鼠子代。 (2)病毒感染当采用动物病毒（如腺相关病毒和慢病毒)DNA作表达载体时，可以通过病毒 感染的方式高效导入动物细胞中。 2植物：植物的愈伤组织（或其他组织的原生质体)、生殖细胞或胚胎组织等 方法：农杆菌转化法或含有表达载体的植物病毒 由于植物的愈伤组织能再生出整株植物，因此转基因植物的构建要比转基因动物的构建更加简便。 转基因动植物培育出来后，仍需要使用PC℉等技术确认转基因是否获得成功，以及目的基因在动植物 体内是否正确表达。 ⊙考点2蛋白质工程★★☆☆ 1.蛋白质工程在基因水平上设计和改造蛋白质 (1)蛋白质工程崛起的缘由 ①基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质： ②天然蛋白质的不足：天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定 物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 设计 推测 改造或合成 预期功能 目的基因 行使 折叠 翻译 转录 生物功能 蛋白质 多肽链 （三维结构) (2)蛋白质工程：采用重组DNA技术在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，可以对天然蛋白 质进行理性改造。由人为突变或设计基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程操作流程，又称第二代基 因工程。 定点突变：化学合成或PCR法 修饰改造天然蛋白 (3)蛋白质工程 定向进化 设计制造全新蛋白 ①修饰改造天然蛋白：两大类操作策略：基因的定点突变（在DNA水平上改变蛋白质特定位点 的氨基酸序列，)和定向进化（在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列）。 9/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 一方面可实现氨基酸序列改造，优化其功能；另一方面还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋 白质结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象和生物功能之间的对应关系， 为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。 天然蛋白 突变基因 突变基因定点突变 随机突变 DNA重组 天然基因 循环突变 DNA重组 变基因 转化克隆、 转化克窗 性能筛选 性能筛选 实变蛋白 突变蛋自 结构和功能分析 D结构和功能分析 优点：修饰改造天然蛋白实质上是一个模拟自然界进化与适应的循序渐进过程，可将数千万年的 自然进化历程缩短为数月、数周甚至数天的实验室过程（图所示的循环突变） ②设计制造全新蛋白：蛋白质工程的另一关键方面是根据我们所掌握的蛋白质结构与功能基本信 息设计制造全新蛋白。设计制造全新蛋白需要根据已经掌握的蛋白质结构与功能的关系，借助特殊的 电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，然后借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种 全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 假设蛋白质平均由200个氨基酸构成，那么其氨基酸序列的可能性高达2020种，但自然界中天然 全新蛋白的性能是否能达到设计标准。然蛋白质的氨基酸序列大约只有1012种。数十年来，人们采用 定向突变和定向进化策略修饰改造的天然蛋白种类只是沧海一粟，而设计制造全新蛋白的理念就是在 更广泛的氨基酸序列海洋里开发自然界并不存在、但理论上可行的蛋白质资源。 2.蛋白质工程根据人类需要改造目标蛋白质 ①定点突变方法：化学合成或PCR法 研究表明，人胰岛素样生长因子的结构和性质与人胰岛素高度相似，但它不像人胰岛素那样容易 聚合形成多分子。 10如果基因序列未知大规模筛选的方法 如果目的基因的完整序列已知 化学合成法 前提条件 目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成DNA引物 ①获取目的基因 方法 模板 目的基因两条链 原料 四种脱氧核苷三磷酸，即dCTP、dATP、dGTP、dTTP 要求 酶{ 耐热DNA聚合酶(Taq酶) 目的基因的部分序 聚合酶链式反应( 列已知 引物 人工合成的与模板DNA发生碱基互补配对的两条单链DNA片段 PCR) 特点 微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列 预变性{95c预变性3-5min a.变性 过程 循环扩增 b.退火 c聚合 结束，PCR产物放置于4℃保存，待电泳检测或-20°C长期保存 目的基因 人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因 RNA聚合酶识别和结合的部位 启动子 ②构建表达载体 载体的组成 驱动转录开始 终止子 调控作用，使转录在所需要的地方停下来 抗性基因 标记基因 用于筛选含目的基因的受体细胞 荧光蛋白基因 基因工程一操作步 骤蛋白质工程 物理方法 电击法 转化的方法 化学方法 如氯化钙法 生物方法 农杆菌法 3 导入受体细胞/特定 微生物 受体细胞进行操作 受体细胞种类 植物 动物细胞 特点 成功率低 抗药性筛筛选 筛选含目的基因的受体细胞 筛选和鉴定含目的 基因的受体细胞 分子水平检测 显色筛选法 PCR技术和基因表达产物（蛋白质）的 鉴定重组在载体上的目的基因位置 结构和功能分析技术 是否正确以及是否能高效表达 原理 基因突变 蛋白质工程 定点突变 修饰改造天然蛋白 策略 包括 定向进化 设计制造全新蛋白