第33讲 基因工程-1（知识清单）（上海专用）2026年高考生物一轮复习讲练测

原理 基因重组 主要来源 原核生物 种类{ 在细菌中已发现了上干种限制性内切核酸酶 识别双链DNA特定的序列（长度通常为4~8个碱基对） 特点 断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二 专一性 限制性内切核酸酶 酯键，从而切开DNA分子的两条链 例子：EcoRI限制酶能专一识别5'-GAATTC-3'序列，并在C和A 之间将这段序列切开 不破坏目的基因 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点 ®限制酶的选择 善用“双酶切”，注意方向性 巧用“同尾酶” 三种基本工具 连接磷酸二酯键 DNA连接酶 氢键在低温下形成 大部分DNA片段（尤其是目的基因）并不具备可遗传的自我复 使用载体的原因 制能力，因为缺少复制所必需的特定DNA序列 基因工程一概念、 质粒DNA(存在于微生物细胞内的小型双链环状DNA分子) 工具等 种类 病毒DNA(存在于大多数生物体内) 载体 大都携带抗生素抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素 的影响 特点 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高 效导入宿主细胞中 功能{ 为外源DNA提供在受体细胞中复制的能力 乙肝疫苗的生产 医学 转基因小鼠 基因治疗 应用 转基因抗虫棉 农牧业 抗除草剂大豆 食品工业 大幅提高谷氨酸的产量 揭示DNA是遗传物质 物 肩息c说药M障 理论基础 确立DNA双螺旋结构和中心法则 枫后商产 位用情值 破译遗传密码 证因T程 诞生和发展 DNA技 发现运载工具 是物 技术支撑 开发工具酶 密码 体外重组 实现DNA体外重组 第33讲 基因工程（上）（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、归纳重点 考点1 基因工程赋予生物新的遗传特性★★★☆☆ 考点2 基因工程是一种重组DNA技术★★★☆☆ （星级越高，重要程度越高） 陷阱预警台：识别高频错误，提供防错策略（1大陷阱预警） 素养加油站：前沿科研成果或热点问题分析、聚焦考点预测 真题挑战场：感知真题，检验成果，考点追溯 （附高清PDF，可打印） · 考点1 基因工程赋予生物新的遗传特性★★★☆☆ 1.基因工程的诞生是多学科综合发展的成果 （1）基因工程概念：将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。由于重组拼接的基因和运载工具都是DNA分子，因此，基因工程也称为重组DNA技术。 2.基因工程改善人类的生活品质 · 考点2 基因工程是一种重组DNA技术★★★☆☆ 人胰岛素大规模生产：首先获取人胰岛素基因（目的基因），其次将之安装在合适的载体上，然后把重组好的 DNA 分子（表达载体）导入合适的受体细胞中，并对目的基因及其表达产物进行鉴定，最后借助这种含重组DNA分子的受体细胞大量生产重组人胰岛素。 1.DNA重组需要三种基本工具 （1）限制性内切核酸酶（限制酶） （2）DNA连接酶 作用：能封闭双链DNA分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 （3）载体 条件 原因 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 大都携带抗生素抗性等基因（有特殊的标记基因） 1. 便于重组DNA分子的筛选； 2.质粒并非其宿主正常生长所必需，但大都携带抗生素抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素的影响。 对受体细胞无毒、易分离 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 病毒DNA特点：病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 补充：限制酶的选择原则 （1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 （3）确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 （4）限制酶不切割细菌本身的DNA分子含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 补充：比较以下几种酶的作用 分类 酶1：限制内切核酸酶 酶2：DNA连接酶 酶3：DNA解旋酶 酶4：DNA聚合酶 作用 切割DNA分子（切割磷酸二酯键），获得目的基因 连接目的基因与载体，形成磷酸二酯键 催化氢键断裂使DNA双链分开 以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成磷酸二酯键 作用结果 切割DNA分子 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 将双链DNA分子局部解旋为单链 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 作用时间 基因工程中获得目的基因及切割载体 基因工程中目的基因与载体的重组 DNA复制、转录 DNA复制 易错拓展 DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别。 （1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcoRⅠ）切割后所得，能再被所用的限制酶识别（如图）。 （2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，不能再被所用的限制酶识别（如图）。 DNA的提取和分离、鉴定★★★☆☆ 实验 原理 过程 DNA的提取和分离 分离DNA和蛋白质：DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精 溶解DNA：在一定浓度的乙醇或异丙醇溶液中，DNA溶解度下降，可沉淀形成纤维状絮团，飘浮其中。 实验材料准备（肝脏样品切小块放入培养皿，乙醇放冰箱冷藏）→（培养皿中放入10mL生理盐水，药匙碾压、磨碎肝脏）悬浮、过滤（漏斗+纱布=过滤装置）、收集细胞悬→加入十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，破碎细胞，释放DNA →另取试管，移取细胞悬浮液→加入已预冷的乙醇，沉淀析出DNA →转动玻璃棒→使析出的DNA缠绕在玻璃棒上（絮状白色物质） DNA的鉴定 鉴定DNA：DNA大分子的脱氧核糖在酸性条件下加热，能与二苯胺（质量体积比为1%的冰醋酸溶液）发生反应，生成蓝色化合物。 ①将上述缠绕在玻璃棒上的DNA样品放入3 mL蒸馏水中，加热15min，促进DNA溶解。 ②取上述DNA溶液1mL于另一支试管中，加入2mL二苯胺试剂，混匀。 ③上述混合液于60℃加热15min，观察并记录实验结果。 1.请观察你所提取的DNA的颜色，如果不是白色絮状物，说明了什么？ →说明提取的DNA样品中有较多的杂质。 2.可能有哪些杂质，能用什么方法鉴定这些杂质，并反思操作过程中可能影响结果的关键步骤? →可能有蛋白质、多糖等杂质；可用双缩脲试剂来鉴定蛋白质 →添加SDS的浓度、量或处理时间可能不合适，组蛋白等杂质没有完全与DNA分开 →添加乙醇的浓度或量可能不合适，杂质没有完全溶解。 3.有同学认为采用猪血提取DNA可以减少磨碎、过滤等步骤。实验后却发现没有絮状物缠绕在玻璃棒上，你知道其中的原因吗? →与鸡的红细胞不同，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA，无法用于DNA的提取 4.如果溶液不呈现蓝色，可能的原因有哪些? →说明所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误。 →或所用的二苯胺试剂变质等 5.如果提取的DNA样品中混有RNA和蛋白质杂质，这些杂质会与二苯胺反应吗?为什么? →不会；DNA鉴定的原理是DNA中的脱氧核糖与二苯胺反应，生成蓝色化合物而RNA和蛋白质分子中不存在脱氧核糖，不会与二苯胺发生反应 →正因为如此，我们可以通过这种方法来测定样品中的DNA含量。 应用：亲子关系、法医鉴定（受害人身份，嫌疑人）、考古依据 预警类别一 基因工程的基本工具 陷阱1 基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的 正确理解：基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。 陷阱2 DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DN 正确理解：DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 陷阱3 限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 正确理解：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。 陷阱4 质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因 正确理解：质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 一．基因工程 ① Luxturna （2017，治疗遗传性视网膜病变）。Luxturna通过AAV载体基因置换修复RPE65功能，为特定遗传性视网膜病变患者提供了首个病因治疗手段，但高昂成本仍是普及挑战。其临床应用标志着基因治疗在眼科领域的重大突破，推动了中国等地的特许医疗政策落地。 ② Zolgensma （2019，治疗脊髓性肌萎缩症SMA）。Zolgensma（通用名：onasemnogene abeparvovec）是全球首个获批用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的AAV基因治疗药物。 ③ Casgevy （2023，全球首个CRISPR基因编辑疗法，治疗镰状细胞贫血和β-地中海贫血）。Casgevy是一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的突破性疗法，用于治疗特定遗传性血液疾病。Casgevy代表了基因治疗领域的重大飞跃，但其普及仍面临技术复杂性与经济性挑战。随着生产流程优化及医保政策推进，未来有望惠及更多患者。 ④ CAR-T细胞治疗 结合基因编辑技术，增强癌症免疫治疗效果。CAR-T细胞治疗是一种革命性的肿瘤免疫疗法，通过基因改造患者自身的T细胞来精准识别并消灭癌细胞。 考点预测： 基因工程技术的常用工具--限制酶、DNA 连接酶和载体，为后续学习基因工程的基本环节奠定基础。以及基因工程在农牧业、医药卫生领域和食品工业方面的应用。 （2024·上海·高考真题）2．CRB1是一种膜蛋白，CRB1基因突变会导致不可逆的致盲眼病（LCA）。CRB1基因的多个位点均可能发生突变。图1显示了部分突变位点，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表突变位点。某4岁男孩因视力迅速下降就医，被诊断患有LCA。经检测，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因。 (1)据题中信息LCA的遗传方式是______。 A．常染色体隐性遗传 B．伴X染色体隐性遗传 C．常染色体显性遗传 D．伴X染色体显性遗传 (2)据图1，编号Ⅰ-Ⅳ所示的突变中，导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是______。 A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ (3)据图1，母亲CRB1突变基因编码的氨基酸序列变化位点是______。 A．652 B．1304 C．1305 D．3914 (4)若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计一对引物时应选择合理区间是______。 A．Ⅰ-Ⅱ B．Ⅰ-Ⅲ C．Ⅲ-Ⅳ D．Ⅱ-Ⅳ (5)该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型 。（编号选填） 【答案】(1)A (2)A (3)C (4)B (5)①②③④（或①②） 【分析】人类遗传病通常是指由于遗传物质改变而引起的人类疾病，主要分为单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病三大类。单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，包括常染色体隐性遗传病、常染色体显性遗传病、伴X染色体隐性遗传病、伴X染色体显性遗传病。 【详解】（1）某4岁男孩患有LCA，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因，据此可推知：LCA的遗传方式是常染色体隐性遗传，A正确，BCD错误。 故选A。 （2）编码链是指双链DNA中不能进行转录的那一条DNA链（非模板链），转录的方向是从模板链的3′到5′端，据此分析图1中四个突变位点及附近的碱基序列可知：转录时，编号Ⅰ所对应的mRNA的片段突中最先出现终止密码子，因此导致CRB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是Ⅰ，A正确，BCD错误。 故选A。 （3）翻译时，mRNA上3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基构成1个密码子。据图1，突变位点Ⅲ和Ⅳ分别为编码链的第3493位点的碱基和第3914位点的碱基，突变位点Ⅲ和Ⅳ之间的基因片段编码的氨基酸数为（3914－3493）÷3≈140.3，而突变位点Ⅲ的突变基因编码的氨基酸序列变化位点是1165，所以母亲CRB1（突变位点Ⅳ）突变基因编码的氨基酸序列变化位点是1165＋140＝1305，C正确，ABD错误。 故选C。 （4）突变位点Ⅱ是父亲CRB1基因突变的位点，若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计的一对引物应该能够与突变位点Ⅱ两侧的碱基序列进行互补配对，所以应选择的合理区间是Ⅰ-Ⅲ，B正确，ACD错误。 故选B。 （5）突变位点Ⅱ是父亲CRB1基因突变的位点，突变位点Ⅳ是母亲CRB1基因突变的位点。该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞在减数第一次分裂的前期，若四分体中的非姐妹染色单体之间没有发生交叉互换，则经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型为①②；若四分体中的非姐妹染色单体之间发生了交叉互换，则经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类型为①②③④。 （2023·上海·高考真题）图1显示了人体结缔组织中弹性纤维的形成机制。弹性蛋白借助E蛋白定位在微纤维束上，并由P蛋白协助L酶交联弹性蛋白形成弹性纤维。 弹性纤维合成受阻，对结缔组织中的血管会产生严重后果，如全身性动脉迂曲。某家庭有两男两女四个孩子，两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，双亲和两个女儿均表型正常。对全体家庭成员进行基因测序，发现所有人均含有致病E基因。图2显示了致病E基因表达的部分氨基酸序列，其中一个字母表示一种氨基酸，*表示终止。 （2）据题中信息分析，该家庭成员所含的致病E基因是___（显性/隐性）基因，该病属于___（伴X/常）染色体遗传病。 （3）不考虑分裂异常，下列关于大儿子的致病E基因的来源与分布，正确的是___（单选）。 A. 其所有次级精母细胞均含有 B. 仅源自其父亲的精子 C. 仅其部分次级精母细胞含有 D. 仅源自其母亲的卵细胞 （4）据图2分析，致病E基因所表达的蛋白功能异常，其可能原因是由于E基因___（编号选填）。 ①转录后的翻译提前终止 ②替换了一个碱基对 ③缺失了一个碱基对 ④插入了一个碱基对 （5）理论上，下列基因治疗方案中对缓解大儿子的全身性动脉迂曲最有效的是___（单选）。 A. 修复P蛋白的基因 B. 修复LOX酶的基因 C. 降低致病E基因表达量 D. 修复致病E基因 （6）大女儿与表型正常的男性结婚后，为预防患全身性动脉迂曲的孩子出生，所采取的措施中应包括___（编号选填）。 ①孕前对大女儿配偶做基因检测 ②孕后开始高蛋白饮食 ③孕前评估该疾病的再发风险率 ④孕前对大女儿配偶做血管 B 超检查 【答案】 （2） ①. 隐性 ②. 常 （3）A （4）①③④ （5）D （6）①②③④ 【解析】 【分析】遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。遗传病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也可后天发病。如先天愚型、多指（趾）、先天性聋哑、血友病等，这些遗传病完全由遗传因素决定发病，并且出生一定时间后才发病，有时要经过几年、十几年甚至几十年后才能出现明显症状。 小问2详解】 双亲和两个女儿均表型正常，两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，说明该病为隐性病，而所有人均含有致病E基因，因此为常染色体隐性，若为伴X隐性，则父亲为XBY，不含致病基因，因此致病E基因为隐性基因， 位于常染色体上。 【小问3详解】 A、两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，故基因型为EE，所有次级精母细胞均含有，A正确； B、大儿子的致病E基因一个来自于母亲，一个来自于父亲，B错误； C、所有次级精母细胞均含有E基因，C错误； D、致病E基因也来自于精子，D错误。 故选A。 【小问4详解】 ①致病E基因所表达的蛋白后面氨基酸序列全部改变，可能是转录后的翻译提前终止导致，①正确； ②如果是替换了一个碱基对，氨基酸只改变一个，后面的氨基酸序列不会变，②错误； ③基因中缺失了一个碱基对，会导致后面的氨基酸顺序全部改变，③正确； ④基因中插入了一个碱基对，也会导致后面的氨基酸顺序全部改变，④正确。 故选①②③④。 【小问5详解】 A、P蛋白只是弹性纤维的一部分，修复P蛋白的基因不一定可以有效缓解大儿子的全身性动脉迂曲，A错误； B、P蛋白协助L酶交联弹性蛋白形成弹性纤维，修复LOX酶的基因不一定可以有效缓解大儿子的全身性动脉迂曲，B错误； C、大儿子的基因型为EE，降低致病E基因表达量也可能较严重，C错误； D、大儿子的全身性动脉迂曲是致病基因E引起的，基因控制性状，修复致病E基因对缓解大儿子的全身性动脉迂曲最有效，D正确。 故选D。 【小问6详解】 ①大女儿表型正常，含致病E基因，表型正常的男性，也可能含致病E基因，因此为预防患全身性动脉迂曲（EE）的孩子出生，可以在孕前对大女儿配偶做基因检测，①正确； ②全身性动脉迂曲是由于弹性纤维合成受阻，孕后开始高蛋白饮食有助于蛋白质的合成，②正确； ③孕前评估该疾病的再发风险率，预防患全身性动脉迂曲的孩子出生，③正确； ④孕前对大女儿配偶做血管 B 超检查，看是否存在血管动脉迂曲的情况，④正确。 故选①②③④。 学科网（北京）股份有限公司1/10 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $学科网·上好课 www zxxk.com 上好每一堂课 第33讲基因工程（上） (知识清单) 什学习导航站 9知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 巴核心知识库：重难考点总结，杭理必背知识、归纳重点 考点1基因工程赋予生物新的遗传特性★★★☆☆ 考点2基因工程是一种重组DNA技术★★★☆☆ (是级越高，重要程度越高) @陷阱预警台：识别高频锴误，提供防错策略（1大陷肼预警) 回素养加油站：前沿科研成果或熟点问题分析、聚焦考点预测 9真题挑战场：感知真题，检验成果，考点追溯 (附高清PDF,可打印) 知识主脉络 原理{基因重组 主要来源原核生物 种类「在细菌中已发现了上干种限制性内切核酸酶 识别双链DNA特定的序列（长度通常为4~8个碱基对） 特点 断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二 专一性 限制性内切核酸酶 酯键，从而切开DNA分子的两条链 例子：EcoR限制酶能专一识别5'-GAATTC-3序列，并在G和A 之间将这段序列切开 不破坏目的基因 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点 Q限制酶的选择 善用“双酶切”，注意方向性 巧用“同尾酶 三种基本工具 DNA连接酶 连接磷酸二酯键 氢键在低温下形成 使用载体的原因 大部分DNA片段（尤其是目的基因）并不具备可遗传的自我复 制能力，因为缺少复制所必需的特定DNA序列 基因工程概念 ,质粒DNA(存在于微生物细胞内的小型双链环状DNA分子) 工具等 种类 病毒DNA(存在于大多数生物体内) 载体 大都携带抗生素抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素 特点 的影响 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高 效导入宿主细胞中 功能 为外源DNA提供在受体细胞中复制的能力 乙肝疫苗的生产 医学转基因小鼠 基因治疗 应用 转基因抗虫棉 农牧业 「抗除草剂大豆 食品工业大幅提高谷氨酸的产量 揭示DNA是遗传物质 理论基础 确立DNA双螺旋结构和中心法则 破译遗传密码 诞生和发展 发现运载工具 技术支撑开发工具酶 实现DNA体外重组 1/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 02 核心知识库 基因工程 蛋白质工程 突变基因 获取目的基因 目的基因 突变操作 供体细胞 载体 载体 构建表达载体 重组DNA 重组DNA 受体细胞 导入受体细胞 筛选和鉴定含目的 基因的受体细胞 基因功能探究 遗传性状改良 生物产品生产 ⊙考点1基因工程赋子生物新的遗传特性★★★☆☆ 1.基因工程的诞生是多学科综合发展的成果 (1)基因工程概念：将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另 一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。由于重组拼接的基因和 运载工具都是DNA分子，因此，基因工程也称为重组DNA技术。 打破物种间遗传 探究基因功能 改良遗传性状 信息交流的屏障 制造生物产品 科学意义 应用价值 基因工程 揭示DNA 重组DNA技术 发现 是遗传物质 运载工具 理论基础 技术支撑 确立遗传信 开发工具刷 息传递方向 破译遗传 实现DNA 密码 体外重组 2/10 学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 原理：基因重组 概念操作水平：DNA分子水平 操作对象：基因(DNA分子) 结果/本质：按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状 揭示DNA是遗传物质 理论基础确立DNA双螺旋结构和中心法则 破译遗传密码（生物共用一套遗传密码） 发现运载工具 技术支撑开发工具酶 实现DNA体外重组 打破物种之间遗传信息交流的天然屏障 意义 使跨物种间基因的定向转移成为可能 2.基因工程改善人类的生活品质 医学 乙肝疫苗 人体基因治疗临床研究计划 转基因抗虫棉 农牧业 除草剂抗性基因 鲜味剂（如味精) 食品工业 工业大规模生产谷氨酸 ⊙考点2基因工程是一种重组DNA技术★★★☆☆ 人胰岛素大规模生产：首先获取人胰岛素基因（目的基因），其次将之安装在合适的载体上，然 后把重组好的DNA分子（表达载体）导入合适的受体细胞中，并对目的基因及其表达产物进行鉴定， 最后借助这种含重组DNA分子的受体细胞大量生产重组人胰岛素。 1.DNA重组需要三种基本工具 (1)限制性内切核酸酶（限制酶） 黏性末端 5”量量本年手用9量景3 5最量 表A需图C哥量3y ”西任一 ”血自岁 黏生不物 EcoR I的识别序列及切割位点 常见聚制南举例 单链突出，末端方向不同 结性末端 子量量9果0C0量量3少 y量98器3” ”G量量3 ,I,慨 y自图8-雪正”一 ”N9图C音自5 黏性末端 PI的识别序列及切割位点 3/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 来源：主要来自原核生物 种类：细菌中发现上千种 识别双链DNA特定的序列，长度通常为48个碱基对(bp) 作用能断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间（即切割位点）的化学键 切开DNA分子的两条链 结果：切割后形成的双链DNA片段末端会呈单链突出 但两种酶切产物的单链突出方向有所不同 (2)DNA连接酶 5'是票G35 AATTC量■3 3'☐CTT AA53G自5 缺口 温度降低 5'■■G AATTC■量3 3CTTAA G5 缺口 DNA连接酶 5'量量G AA T TC■■3y 3'C T T AA G自5 EcoRI识别序列 缺口封闭 5'■是GAAT TC3 3'■CTTAA.G■s 缺口封闭 作用：能封闭双链DNA分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学 键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 (3)载体 4/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 质粒 拟核DNA 细菌残留物 [大部分DNA片段并不具备可遗传的自我复制能力 利用载体的原因（缺少复制所必需的特定DNA序列） 复制能力一般情况难以在受体细胞中正常发挥 种类 质粒DNA(广泛存在于微生物细胞内) 病毒DNA(大多数生物体内) 细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中 条件】 有一个至多个限制酶切割位点 具有特殊的标记基因（大都携带抗生素抗性等基因） 无毒害作用 条件 原因 病毒不仅能在宿主细胞中自主复 制，还能通过感染将其DNA高效 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 导入宿主细胞中 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 1. 便于重组DNA分子的筛选： 大都携带抗生素抗性等基因（有 2.质粒并非其宿主正常生长所必需，但大都携带抗生素 特殊的标记基因) 抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素的影 响。 对受体细胞无毒、易分离 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 病毒DNA特点：病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其DNA高效导入宿 主细胞中 △补充：限制酶的选择原则 5/10 丽学科网·上好课 www zxxk.com 上好每一堂课 Pst I Sma I Pst I 标记基因 PstI EcoRI SmaI 抗病 EcoR I Sma I 基因 甲 乙 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstI,而不选择Smal。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所 选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Smal。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Ps虹；为避 免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选 择PstI和EcoRI两种限制酶。 (4)限制酶不切割细菌本身的DNA分子含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的 识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 △补充：比较以下几种酶的作用 酶1：限制内切核酸 酶2：DNA连接 酶3：DNA解旋 分类 酶4：DNA聚合酶 酶 酶 酶 T 酶1一 可山 T 酶2 工 T 酶3 111 酶4 T T 酶5 游议於 酶1：限制酶 酶2：DNA连接酶 酶3：DNA解旋酶 酶4：DNA聚合酶 酶5：DNA水解酶 以单链DNA为模板， 切割DNA分子（切 连接目的基因与 催化氢键断裂 将单个脱氧核苷酸依 作用 割磷酸二酯键)，获 载体，形成磷酸 使DNA双链分 次连接到单链末端， 得目的基因 二酯键 形成磷酸二酯键 6/10 学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 将两个DNA片 将双链DNA分 将单个的脱氧核苷酸 作用 切割DNA分子 段连接成完整的 子局部解旋为 连接到DNA单链末 结果 DNA分子 单链 端 基因工程中目的 DNA复制 作用 基因工程中获得目的 基因与载体的重 DNA复制、转录 时间 基因及切割载体 组 △易错拓展 DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序 列，能否再被所用的限制酶识别。 (1)若两个相同黏性末端都是由同种限制酶(EcoRI)切割后所得，能再被所用的限制酶识别（如 一GAATTC-- -CTTAAG- 图)。 (2)若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，不能再被所用的限制酶识别（如图）。 Spe I -ACTAGT- Xba I-TCTAGA- -TGATCA- -AGATCT- 实验技能坊 DNA的提取和分离、鉴定★★★☆☆ 实验 原理 过程 DNA的提取和 分离DNA和蛋白质： 实验材料准备（肝脏样品切小块放入培养皿，乙醇放 分离 DNA不溶于酒精，蛋 冰箱冷藏)→（培养皿中放入10mL生理盐水，药匙碾压、 白质溶于酒精 磨碎肝脏)悬浮、过滤（漏斗+纱布=过滤装置）、收集细 溶解DNA:在一定浓 胞悬→加入十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，破碎细胞，释 度的乙醇或异丙醇溶 放DNA 液中，DNA溶解度下 →另取试管，移取细胞悬浮液→加入己预冷的乙醇， 降，可沉淀形成纤维状 沉淀析出DNA 絮团，飘浮其中。 →转动玻璃棒→使析出的DNA缠绕在玻璃棒上（絮状 7/10 丽学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 白色物质) DNA的鉴定 鉴定DNA:DNA大分 ①将上述缠绕在玻璃棒上的DNA样品放入3mL蒸馏 子的脱氧核糖在酸性 水中，加热15min,促进DNA溶解。 条件下加热，能与二苯 ②取上述DNA溶液lmL于另一支试管中，加入2mL 胺（质量体积比为1% 二苯胺试剂，混匀。 的冰醋酸溶液)发生反 ③上述混合液于0℃加热15mim,观察并记录实验结 应，生成蓝色化合物。 果。 1.请观察你所提取的DNA的颜色，如果不是白色絮状物，说明了什么？ →说明提取的DNA样品中有较多的杂质。 2.可能有哪些杂质，能用什么方法鉴定这些杂质，并反思操作过程中可能影响结果的关键步骤？ →可能有蛋白质、多糖等杂质；可用双缩脲试剂来鉴定蛋白质 →添加SDS的浓度、量或处理时间可能不合适，组蛋白等杂质没有完全与DNA分开 →添加乙醇的浓度或量可能不合适，杂质没有完全溶解。 3.有同学认为采用猪血提取DNA可以减少磨碎、过滤等步骤。实验后却发现没有絮状物缠绕在玻璃 棒上，你知道其中的原因吗？ →与鸡的红细胞不同，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA,无法用 于DNA的提取 4.如果溶液不呈现蓝色，可能的原因有哪些？ →说明所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误。 →或所用的二苯胺试剂变质等 5.如果提取的DNA样品中混有RNA和蛋白质杂质，这些杂质会与二苯胺反应吗？为什么？ →不会；DNA鉴定的原理是DNA中的脱氧核糖与二苯胺反应，生成蓝色化合物而RNA和蛋白 质分子中不存在脱氧核糖，不会与二苯胺发生反应 →正因为如此，我们可以通过这种方法来测定样品中的DNA含量。 应用：亲子关系、法医鉴定（受害人身份，嫌疑人）、考古依据 04 陷阱预警台 8/10 学科网·上好课 www zxxk com 上好每一堂课 预警类别一基因工程的基本工具 △陷阱1基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的 正确理解：基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。 △陷阱2DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DN 正确理解：DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 △陷阱3限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 正确理解：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶， 质粒属于载体。 △陷阱4质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因 正确理解：质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 05 素养加油站 一。基因工程 ①Luxturna(2017,治疗遗传性视网膜病变)。Luxturna通过AAV载体基因置换修复RPE65功能， 为特定遗传性视网膜病变患者提供了首个病因治疗手段，但高昂成本仍是普及挑战。其临床应用标志着基 因治疗在眼科领域的重大突破，推动了中国等地的特许医疗政策落地。 ②Zolgensma(2019,治疗脊髓性肌菱缩症SMA)。Zolgensma(通用名：onasemnogene abeparvovec) 是全球首个获批用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)的AAW基因治疗药物。 ③Casgevy(2023,全球首个CRISPR基因编辑疗法，治疗镰状细胞贫血和B-地中海贫血)。Casgevy 是一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的突破性疗法，用于治疗特定遗传性血液疾病。Casgevy代表了基因 治疗领域的重大飞跃，但其普及仍面临技术复杂性与经济性挑战。随着生产流程优化及医保政策推进，未 来有望惠及更多患者。 ④CAR-T细胞治疗结合基因编辑技术，增强癌症免疫治疗效果。CAR-T细胞治疗是一种革命性的肿瘤 免疫疗法，通过基因改造患者自身的T细胞来精准识别并消灭癌细胞。 考点预测：基因工程技术的常用工具-限制酶、DNA连接酶和载体，为后续学习基因工程的基本环节 奠定基础。以及基因工程在农牧业、医药卫生领域和食品工业方面的应用。 9/10 学科网·上好课 www.zxxk.com 上好每一堂课 06 真题挑战场 (2024·上海·高考真题)2.CRB1是一种膜蛋白，CRB1基因突变会导致不可逆的致盲眼病(LCA)。CRB1 基因的多个位点均可能发生突变。图1显示了部分突变位点，其中I、Ⅱ、Ⅲ、V代表突变位点。某4岁 男孩因视力迅速下降就医，被诊断患有LCA。经检测，该男孩表型正常的双亲均含有CRB1突变基因。 父亲的突变位点 母亲的突变位点 编号 ⑦ 核苷酸序列位点 1997 2172 3493 编码链（正常基因）S'… A TGT 编码链（突变基因）5 GCCTCA A ·TGT CA …3 氨基酸序列位点 (CRBI蛋白) 终止密码子：UGA、UAA、UAG 图1 (1)据题中信息LCA的遗传方式是」 A.常染色体隐性遗传 B.伴X染色体隐性遗传 C.常染色体显性遗传 D.伴X染色体显性遗传 (2)据图1，编号I-V所示的突变中，导致CB1突变基因编码的氨基酸序列最短的是 A.I B.Ⅱ C.Ⅲ D.IV (3)据图1，母亲CRB1突变基因编码的氨基酸序列变化位点是 A.652 B.1304 C.1305 D.3914 (4)若要利用PCR技术检测父亲CRB1基因突变点，设计一对引物时应选择合理区间是 A.I-Ⅱ B.IⅢ C.Ⅲ-V D.Ⅱ-V (5)该男孩有双亲的两种CRB1突变基因，成年后其精原细胞经减数分裂产生的所有配子中，含CRB1基因类 型 。（编号选填) ① ② ③ ④ CBRI基因 CBRI基因 CBRI基因 CBRI基因 【答案】(1)A (2)A (3)C (4)B 10