2026届高三生物一轮复习课件专题6·重组DNA技术（2）pcr实验+电泳实验

该高中生物学高考复习课件聚焦“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”核心实验考点，依据高考评价体系梳理实验原理、步骤、试剂作用及结果分析等考查要求，通过考点权重分析明确实验设计、误差处理等高频题型，构建系统备考框架。 课件亮点在于“真题训练+素养导向”，如2024山东真题解析离心机使用考点，归纳NaCl溶液三次使用目的等细节突破方法，结合无条带/非特异性扩增原因分析培养科学思维，通过实验步骤严谨性训练提升探究实践能力，助力学生掌握答题技巧，教师可据此高效开展复习教学。

专题6赋予生物新的遗传特性的基因工程 第3讲：相关实验 1. 的粗提取与鉴定 （1）实验原理 蛋白质 二苯胺 蓝 无色 实验组 空白对照组 变蓝 不变蓝 【拓展】反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ 1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质； 2、用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。 因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质，得到纯度较高的DNA 。 2 选材原则：DNA含量高、材料易得、便于提取、新鲜的材料 不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无 ）,可选用鸡血细胞作为材料 注意1：选材不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 注意2：以血液（如鸡血细胞，有细胞核）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠（抗凝剂），防止血液凝固。 注意3：久置的实验材料、DNA易被降解，实验现象不明显。 注意4：可以选择菠菜等绿色的实验材料。 （2）方法步骤（以洋葱为例） （1）制备研磨液 （2）提取上清液 （3）DNA的析出 （4）DNA的鉴定 （2）方法步骤（以洋葱为例） 防止DNA降解 离心 或 可以向上清液中加入嫩肉粉(含木瓜蛋白酶)， 并在适宜温度的水浴中加热以加快反应，促使部分蛋白水解。 （1）制备研磨液 （2）提取上清液 （3）DNA的析出 （4）DNA的鉴定 （2）方法步骤（以洋葱为例） 预冷的 95% 酒精 或 ［易错提醒］ 加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要沿着一个方向、轻缓搅拌,以免加剧 分子的断裂,导致 分子不能形成丝状物 （1）制备研磨液 （2）提取上清液 （3）DNA的析出 （4）DNA的鉴定 提示：应注意观察提取到的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多 杂质可能是核蛋白、多糖等。 析出DNA （草莓） 由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，且玻璃棒不能直插烧杯底部。 （1）制备研磨液 （2）提取上清液 （3）DNA的析出 （4）DNA的鉴定 （2）方法步骤（以洋葱为例） 二苯胺 变蓝 注意： ①需要进行对照实验 实验组：加入等量的2mol/L的NaCl并加入丝状物或沉淀物。 对照组：加入一定量的2mol/L的NaCl溶液 实验组 空白对照组 ②需要水浴加热，才会出现现象 ③冷却后观察，现象更稳定 +4ml二苯胺试剂 +4ml二苯胺试剂 变蓝 不变蓝 未冷却 冷却5分钟后 现象明显 现象不明显 现象明显 【归纳总结】 归纳法分析各步骤的原理或目的 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中 过滤 （或离心） 除去细胞膜等不溶杂质，得到与蛋白质等杂质结合在一起的溶解于滤液（或上清液）的DNA 搅拌（或离心）析出DNA 加入预冷的酒精溶液，蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，将DNA和蛋白质等杂质分离 溶解 用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，水浴加热，溶液变蓝色则证明有DNA存在 2024山东 13·关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ） A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在 4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中 DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A【解析】A、在 DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在 4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；B、研磨液在 4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在 5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 若实验材料是鸡血呢？ 防止血液凝固 第一步：制备鸡血细胞 获取鸡血 加入抗凝剂（如：柠檬酸钠） 离心 获取鸡血细胞 第二步：破碎细胞，释放核物质 使细胞吸水胀破，释放核物质。 第三步：溶解核内DNA，析出DNA 2mol/L NaCl溶液 C是蒸馏水 第四步：再次溶解核内DNA，析出DNA 【细节】此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次析出DNA?几次用到NaCl溶液？ 两次使用蒸馏水 两次析出DNA 三次用到NaCl溶液 次数 目的 第一次 使鸡血细胞吸水涨破 第二次 稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出 次数 方法 第一次 加蒸馏水，降低NaCl的浓度，从而降低DNA的溶解度，使DNA析出。 第二次 加95%的冷酒精，DNA不溶于酒精，使DNA析出。 次数 目的 第一次 溶解DNA，析出蛋白质等杂质 第二次 使DNA再溶解，为了获得含杂质较少的DNA 第三次 溶解DNA，以便DNA与二苯胺反应，用于DNA的鉴定。 2. 片段的扩增及电泳鉴定 （1）原理 原理:的热变性原理,即通过调节温度来控制 双链的解聚与结 合。 (2)PCR实验操作步骤 15 PCR实验操作步骤 微量移液器 底部 离心管 按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入耐高温的DNA聚合酶 提高反应速率 PCR实验操作步骤 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 940C，5min 30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min 最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，10min 思考：1.预变性的目的是什么？ 2.为什么最后1次变性时间延长？ 3.最后一次循环通常在72℃维持10分钟，目的是什么？ 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合 Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。 在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。 使子链充分延伸。 如何知道是否扩增出了目的基因片段？ ②电泳 带电分子 大小和构象 高凝胶浓度，孔隙小，分辨较小的DNA分子迁移速率减慢 低凝胶浓度，孔隙大，有助于迁移速率的提高，可能不足以分辨较小的DNA片段 环状、链状等 18 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳、观察 琼脂糖凝胶电泳过程： 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 作用：维持相对稳定的ph条件，并保护DNA 作用：使DNA在紫外灯照射下发光，便于观察现象 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳、观察 琼脂糖凝胶电泳过程： 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 作用：维持相对稳定的ph条件，并保护DNA 作用：使DNA在紫外灯照射下发光，便于观察现象 倒入凝胶 加入梳子形成加样孔，凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，将电泳缓冲液加入电泳槽中 ①加入PCR产物与 凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合， ②留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳、观察 琼脂糖凝胶电泳过程： 有颜色肉眼可见，可显示电泳的进程 增加样品密度，使DNA沉入加样孔底部 原理：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。 ①加入PCR产物与 凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合， ②留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳、观察 接通电源，等待电泳，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 有颜色肉眼可见，可显示电泳的进程 琼脂糖凝胶电泳过程： 【笔记】成功扩增出DNA片段的判断依据是： 紫外灯下直接观察到DNA条带的 ① (代表扩增产物的类型); ② (代表扩增产物量的多少)。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 结果 如图所示： 进行电泳鉴定的结果为 条条带，该片段大小约为 bp(碱基对)。 一 750 分布 亮度 DNA分子越大， 迁移速度越慢。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.如果扩增失败没有条带(即未出现扩增条带)，分析其可能原因： ① 失活。 ②Mg2＋浓度过 。 ③ 出现质量问题。 ④变性时的温度 ，变性时间 。 结果分析 TaqDNA聚合酶 低 引物 低 短 注：DNA聚合酶需要Mg2+激活； 注：双链DNA没有解聚为单链， 导致模板DNA失效。 模板、引物、原料、酶(反应组分)失效 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.如果不止一条条带(即出现非特异性扩增)，分析其可能原因： ①模板DNA出现 。 ② 特异性不强或形成 二聚体。 ③Mg2＋浓度过 。 ④复性时的温度 等。 结果分析 污染 引物 引物 高 过低 模板、引物、原料、酶(反应组分)特异性差 注：Mg2+浓度过高(影响酶)和复性温度过低 会过度稳定非特异性结合的引物-模板复合物。 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 $