3.2 基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 基因工程的基本操作程序 1 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 一、学习目标 二、重点 1.基因工程基本操作程序的四个步骤。 利用PCR获取和扩增目的基因。 三、难点 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。 从社会中来 你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？ 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 非转基因抗虫棉 转基因抗虫棉 3 从社会中来 培育转基因抗虫棉的简要过程 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞(含抗虫基因） 提取 抗虫棉 （Bt抗虫蛋白） 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 抗虫基因 （Bt抗虫蛋白基因） 苏云金杆菌 4 1.什么是目的基因，请举例； 2.筛选目的基因的方法有哪些呢？ 3.为什么培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt基因？ 4.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？为什么？ 5.Bt基因的杀虫机理是怎样的？ 6.明确目的基因后，如何去获得它？ 探究：请同学们自主阅读教材P76-77，思考讨论下列问题： 一、目的基因的筛选与获取 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 (2)实例： 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 抗虫棉 产生胰岛素的基因 编码蛋白质的基因 产生果胶酶的基因 一、目的基因的筛选与获取 1.目的基因 是不是所有的基因都可以直接编码蛋白质？ 6 知识拓展：基因的结构 基因1 基因2 基因3 DNA片段 放大 基因通常是有遗传效应的DNA片段； 能编码特定的蛋白质 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？ 基因编码区 基因的结构指：基因在DNA分子上的具体组成和排列方式（碱基排列顺序） 在人类基因组中，非编码区占比超过98%，远超编码区（约2%） 7 ①不编码蛋白质，调控遗传信息表达 ：编码蛋白质 ，连续不间断 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 ②上游有启动子， 下游有终止子 编码区上游 编码区下游 非编码区 编码区 非编码区 1. 原核细胞的基因结构 启动子 终止子 与RNA聚合酶结合位点 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 ①不编码蛋白质，调控遗传信息表达 ②上游有启动子，下游有终止子 包括非编码区和内含子 内含子：不能编码蛋白质的序列 内含子 外显子 非编码序列： 2. 真核细胞的基因结构 知识补充：真核生物基因的转录过程 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶 结合位点 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 示意图 不同点 相同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 都由能够编码蛋白质的编码区和 具有调控作用的非编码区组成的 那么，如何筛选目的基因呢？ 从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 2. 筛选合适的目的基因 (1)较为有效的方法之一: 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程 12 【资料】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ 2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 13 测序技术 序列数据库 序列比对工具 随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 明确了目的基因后，该怎么获得它呢？ （1） 从生物组织中直接获取 3.获取目的基因的方法 从供体细胞直接获取目的基因常用的方法是“鸟枪法”。 缺点: 工作量大，具有一定的盲目性。 （2） 人工合成 ①前提： ②方法： 在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。 DNA合成仪 转基因抗虫棉 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体DNA上，转入各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来 15 供体生物 基因组 DNA DNA片段 限制酶 酶切 与载体重组 导入 成熟的mRNA 逆转录 cDNA 与载体重组 导入 基因组 文库 cDNA 文库 基因文库 提取 提取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 （包含一种生物的所有基因） （包含一种生物的一部分基因） 3.获取目的基因的方法 （3） 从基因文库中获取 cDNA（互补DNA） 16 部分基因文库和基因组文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子（非编码区） 基因中内含子 基因多少 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子） 17 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 DNA半保留复制 体外复制（PCR扩增仪/PCR仪）。 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。 （1）概念： （2）原理： （3）操作环境： （4）目的： （5）优点： 可以在短时间内大量扩增目的基因。 3.获取目的基因的方法 （4）利用PCR获取和扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖 DNA复制的条件: 亲代DNA的两条链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 由细胞代谢提供的ATP ③能量： ①模板： ②原料： ④酶： 碱基互补配对原则 从子链的5' 端向 3' 端延伸 原则: 方向: 特点: 边解旋边复制、半保留复制 、多起点双向复制 体外复制怎么改进 体外用高温代替 体外需用耐高温的DNA聚合酶 温故知新 （1）定义： （2) 作用： 拓展 ：引物 资料：DNA聚合酶的特点：只能从5'端向3'端延伸子链 无法从头合成DNA链 体外合成子链就需要引物 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸） 引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始拼接单个的核苷酸。 PCR进行的前提条件是：已知目的基因的DNA序列 20 解旋酶 由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。 引物结合在模板链的3’端 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 设计引物的依据是？ 已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 引物的本质： 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除） 细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物（不切除） 图中是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： 思考：图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。 第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生 而失效。 第2组：引物Ⅰ′ 后会出现局部 而失效。 碱基互补配对 自身折叠 碱基互补配对 每种引物内部不能发生局部碱基互补配对 两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对 思考讨论 两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对 22 引物设计的原则: 引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列等。 引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 （4）引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰 （1）引物长度： 20-30个核苷酸 （3）两种引物之间不能互补配对 （2）引物自身不能互补配对 23 ③分别与两条模板链结合的2种引物 一般添加Mg2+，作用是激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶。 需含有目的基因 ①一定的缓冲液： ②DNA模板： ④耐高温的DNA聚合酶： 如TaqDNA聚合酶 ⑤控制温度 ⑥4种脱氧核苷酸： 在PCR过程中，实际加入的为四种dNTP（即dATP、dTTP、dGTP、dCTP） 思考：结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 24 dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP 腺苷（A) 腺嘌呤 脱氧 核糖 P P P ~ ~ OH H 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 拓展： DNA的复制的原料—dNTP(脱氧核苷三磷酸) dNTP 是脱氧核苷三磷酸的缩写，N 是指 A、T、G、C 四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的 25 1）变性： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 第一步：变性 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 90℃ 思考2：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 思考1：变性破坏的是哪种化学键，是否需要酶？ 6、PCR反应的过程 （重点） 2）复性： 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。 第二步：复性 DNA引物 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能头开始合成子链DNA ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 6、PCR反应的过程 （重点） 长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高 CG含量越高，引物与模板之间的结合力就越强，需要更高的能量（即更高的温度）来打破这些氢键，从而实现引物的有效复性 3）延伸： 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 第三步：延伸 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 脱氧核苷酸 5’ 5’ DNA聚合酶 72℃ 3’ 3’ 3’ 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 思考3：延伸过程是否需要ATP供能 不需要，由dNTP水解供能 6、PCR反应的过程 （重点） 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 6、PCR反应的过程小结 （重点） 29 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； DNA扩增成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数） 6、PCR反应的过程 （重点） ①DNA分子有_____个 ②总链数_______条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_________ ⑤含引物1或2的链数：_______ ⑥仅含引物A的DNA数：______ ⑦仅含引物B的DNA数：______ ⑧引物A、B均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次后： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 ★ 6、PCR反应的过程 （重点） 31 7.PCR产物鉴定 PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增仪 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。 32 思考：用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不能直接扩增RNA，应先将RNA逆转录为cDNA后，再进行扩增。 ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA,即cDNA ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 （逆转录PCR，简称RT-PCR ） 一般不是；扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段； 思考：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 34 思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 35 [拓展延伸] 问题1：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ ①引物与DNA模板结合 ②解开的两条模板链重新结合 ③引物与引物结合 加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 在设计引物时，避免引物之间的碱基序列互补 问题2：怎样提高复性时引物与模板配对结合率,而不是模板链之间配对结合呢？ 问题3：如何避免引物与引物结合？ 一、目的基因的筛选与获取 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化 主要在细胞核内 解旋酶、DNA聚合酶等 细胞内温和条件 合成整个DNA分子 DNA在高温下变性解旋 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为四种脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 目的基因以指数形式在短时间内大量扩增。 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 (2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性的 温度就越高 (5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量 (6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过 程提供能量 例.判断常考语句，澄清易混易错 PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供 温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量 38 例.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（ ) A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 B 例.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是( ) A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 D 7/8 40 获得了足量的Bt基因后，能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？ （1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解； （2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂 而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 思考：要想目的基因实现以上功能，载体需要哪些结构？ 基因表达载体 抗虫基因 与载体拼接 —— 基因工程的核心步骤 二、基因表达载体的构建 1、构建的目的： 41 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 2.基因表达载体的组成： 二、基因表达载体的构建 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 比较启动子和起始密码子、终止子和终止密码子 目的基因应该插入什么位置？ 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子： 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 DNA分子 （含目的基因） 用限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒， 即基因表达载体） 载体 （质粒） 目的基因 限制酶 切割位点 标记基因 启动子 限制酶切割位点 终止子 复制原点 限制酶 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 思考：如何构建抗虫棉的基因表达载体？ ① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。 ② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 45 （1）构建基因表达载体时，能否用 Sma Ⅰ 限制酶切割质粒？为什么？ 不能；因为 SmaⅠ 切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组 DNA 分子）。 质粒 抗生素 抗性基因 Sma Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ 图1 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 目的基因 BamH Ⅰ Hind Ⅲ 外源 DNA 图2 二.基因表达载体的构建(核心步骤) （2）若只用 EcoR Ⅰ 限制酶切质粒和外源 DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？ 质粒自身环化 正向连接 反向连接 目的基因自身环化 质粒 抗生素 抗性基因 Sma Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ 图1 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 目的基因 BamH Ⅰ Hind Ⅲ 外源 DNA 图2 二.基因表达载体的构建(核心步骤) （3）为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源 DNA 进行切割？ 使用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA。 质粒 抗生素 抗性基因 Sma Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ 图1 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 目的基因 BamH Ⅰ Hind Ⅲ 外源 DNA 图2 优点：①避免质粒自身环化；②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接。 双酶切法 二.基因表达载体的构建(核心步骤) 例.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核 苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因 等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因 的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 B A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 例.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　 ) B A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反 向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 例.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是 D 被PstⅠ切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏了 51 一、常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 二、将目的基因导入受体细胞的方法 1.植物细胞： 2.动物细胞： 3.微生物细胞： 花粉管通道法、农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法（感受态细胞法） 由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同 三、将目的基因导入受体细胞 52 1.导入植物细胞—— 花粉管通道法（我国科学家独创的一种方法） 子房 花粉 柱头 花粉管 精子 卵细胞 胚囊 方法一： 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 方法二： 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 受体细胞为？ 受精卵 优点：①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。 53 2.导入植物细胞—— 农杆菌转化法 （2）特点： ①农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 （1）转化的概念： 指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 ②农杆菌细胞内含有的Ti质粒，能将Ti质粒上的T - DNA 转移至受体细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 表现出新性状的植株 植物组织培养 第一次导入 第二次导入 第一次拼接 第二次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。 (非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。 Ti质粒 T—DNA 目的基因 构建基因表达载体 重组 Ti质粒 转入农杆菌 导入植物细胞 （3）过程： 2.导入植物细胞 —— 农杆菌转化法 思考：该过程经过______次拼接、______次导入？ 两 两 方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）农杆菌转化的具体方法： 体细胞 受精卵 受体细胞为？ 受体细胞为？ 2.导入植物细胞——农杆菌转化法 表现出新性状的植株 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是， T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？ 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 三、将目的基因导入受体细胞 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 如果做转基因植物的话，受体细胞可以采用植物的体细胞，比如一个叶肉细胞，分生区细胞都是可以的，因为植物可以组培，即便一个体细胞也可以让他发育成一个完整的植株 57 （1）常用方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 ①体积大，易操作。②易表现出全能性。 （3) 过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ 3.导入动物细胞——显微注射法 如果做转基因动物，那就不能用体细胞作为受体细胞，因为我们也要保证全身上下的细胞都带有目的基因才行，如果已经是一个成熟的个体，你只往它身上的某个部位比如肝脏细胞导入基因，就不能保证身体所有细胞都带上，所以唯一的受体细胞就是受精卵， 58 将目的基因导入动物细胞 科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 知识拓展: 病毒介导法（主要用于导入动物细胞） 原理是利用天然的能力，例如肺炎双球菌的转化实验， 将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 59 (1)使用Ca2+处理法的目的： (2)受体细胞： 常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛） 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养 (3)过程： 大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态 溶于缓冲液中的重组DNA分子 转化 CaCl2(Ca2+) 4.导入微生物细胞—— Ca2+处理法 60 (4)应用实例 利用转基因大肠杆菌生产药物 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（因为原核细胞中没有高尔基体和内质网等），需要在体外进行再加工。 4.导入微生物细胞——Ca2+处理法 思考：利用转基因大肠杆菌生产的药物能否直接使用？ 61 补充: 如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 前体mRNA 成熟mRNA 多肽链 真核基因：编码区 （外显子+内含子） 蛋白质 （四级结构） 非编码区 编码区 非编码区 一般不能 原因：①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA； ②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 花粉管通道法、农杆菌转化法 受精卵或体细胞 以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 显微注射技术 受精卵 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 获得具有新性 状的个体 Ca2＋处理法 原核细胞 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞 吸收DNA分子 三、将目的基因导入受体细胞 63 例.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是( ) A.不必构建表达载体就可以直接导入 B.此方法可用于转基因动物 C.受体细胞只能是植物的卵细胞 D.有时可以取代农杆菌转化法 D 例.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是( ) A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞 B.②过程中需要进行胚胎移植操作 C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素 A A：受体细胞A一般是该种动物的受精卵 65 例.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ） ①将毒素蛋白注射到棉受精卵中； ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中； ③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。 A.①② B.③④ C.②③ D.①④ B 将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功，标记基因（如抗生素抗性基因）筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。 此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 不一定！ Bt基因 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 1. 检测方法： ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 抗原 — 抗体杂交技术 抗性检测： 抗虫、抗病接种实验； 功能活性 比较： 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 方法： 通过PCR等技术检测 （1）分子检测法 （2）个体水平的鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 以检测 Bt 基因是否导入棉花体内并表达为例： 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 提取 DNA 转基因棉花 PCR 是否扩增出目的基因 利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物 M： marker 1-6：转基因棉花 7： 非转基因棉花 8： 阴性对照 电泳 （1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因 原理： DNA半保留复制 是否扩增出目的基因 判断标准： —— PCR扩增+电泳 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 15N 15N 变性 变性 杂交DNA分子 （可检测） 探针 受体细胞的DNA 原理？ 碱基互补配对原则 基因探针：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。 （1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因 基本思路：步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。 步骤二：提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液。 步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 ——DNA分子杂交技术 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA 提取棉花细胞 mRNA 逆转录 得到 cDNA 用以 Bt 基因序列设计的 引物进行 PCR 扩增 电泳 检测 Bt M3 C0 T-9 T-2 T-51 T-5 T-23 T-11 T-20 T-21 T-34 T-10 10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录 原理： 逆转录+DNA半保留复制 判断标准： —— PCR扩增+电泳 是否扩增出目的基因cDNA 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA 15N 15N 变性 探针 受体细胞的mRNA 杂交分子（可检测） 步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。 步骤二：提取受体细胞全部RNA，与基因探针置于同一培养液。 步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。 基本思路： 原理： ——分子杂交技术 碱基互补配对原则 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原抗体的特异性结合 ①原理： ②过程： 苏云金杆菌 提取 Bt 毒蛋白 注射 抗体 标记抗体 转基因棉花 提取蛋白 电泳分离 抗原-抗体杂交 —— 抗原-抗体杂交技术 2. 个体生物学水平的鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 ——鉴定是否具有抗性以及抗性程度等 没有抗虫基因的棉花植株 有抗虫基因的棉花植株 棉铃虫没有死亡 棉铃虫死亡 饲喂 棉铃虫 转Bt基因 非转基因 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 思路： 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 其他检测方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 个体生物学水平的鉴定具体方法举例 例.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( ) A.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子杂交的方法 B. 检测目的基因是否转录用分子杂交的方法 C. 检测目的基因是否表达用抗原-抗体杂交的方法 D. 目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤 D 例.PCR在生物学实验中具有非常广泛的用途，下列不属于PCR的应用范畴的是(　　 ) A.检测受体细胞是否有目的基因 B.检测受体细胞是否有致病基因 C.检测目的基因是否转录mRNA D.检测目的基因是否翻译蛋白质 D 例．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是(　 　 ) A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质 D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测 　 C 小结：如图是从酵母菌细胞中获取某植物需要的某种酶基因的流程。结合所学知识及相关信息回答下列问题： (1)图中B过程是___________。 (2)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法，其原理是___________________。 (3)获取目的基因之后，需要进行_____________________，此步骤是基因工程的核心。该步骤得到的结构必须含有____________________________(写出三项)以及目的基因等。 (4)将目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是__________________。其能否在此植物体内稳定遗传的关键是此植物的染色体DNA中是否插入了目的基因，可以用________技术进行检测。 逆转录 PCR DNA半保留复制 基因表达载体的构建 启动子、终止子、标记基因 PCR 农杆菌转化法 练习与应用 二、拓展应用 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理（阅读书本P84-85下列问题） 1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理： ①PCR利用了 和 的原理。 ②一次PCR一般要经历 循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理： ①DNA分子具有 ，在一定的 __ 下，这些基团可以 带上 ，在_______的作用下，这些___________________会向 着___________________的电极移动，这个过程就是________。 DNA的热变性原理 DNA半保留复制 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 电场 30次 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便 向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 80 ②鉴定方法：PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 琼脂糖凝胶电泳 ③ 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小。 琼脂糖凝胶浓度越大，分离的DNA分子越小，迁移速率越快 DNA的迁移速率与其构象密切相关，超螺旋结构迁移最快，开环结构最慢。在实验中，可通过优化凝胶条件（如浓度、电压）和DNA构象（如酶切处理）来提高分辨率和分离效果。DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 81 核酸染色剂:常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 ④ 凝胶中的DNA分子通过______，可以在波长为__________的________下被检 测出来。 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 染色 300nm 紫外灯 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） ④微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ⑤一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 二、材料用具 1.仪器: 二、材料用具 2.试剂: 4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 PCR 反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2 U 模板DNA（用量为1pg-1μg） 5～10 μL 总体积 50 μL 为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。 三、方法步骤 （一）DNA片段的扩增 1．移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入 各组分。 2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。 4．反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 问题1：预变性的目的是什么？ 问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 86 1.制备凝胶 （1）融化 （2）倒模 （3）凝固 用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 （二）DNA片段的电泳鉴定 梳子孔为加样孔， 加样孔侧连电极负极 （1）加液 （2）加样 （3）电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 2.进行电泳 （二）DNA片段的电泳鉴定 3.观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 注意事项 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 （二）DNA片段的电泳鉴定 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 2.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 应该是一条条带。（目的基因片段） 3.如图所示，该片段大小约为 。 750bp （三）结果分析与评价 观察DNA条带的分布(估计DNA的大小)及粗细程度(估计DNA的数量)来评价扩增的结果 90 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 标准参照物（Marker） DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果无条带或不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ① 引物设计不合理，它们与非目的序列结合（非特异性结合）； ② 复性温度过低,引物随机连接到非目的基因片段； ③ DNA聚合酶的质量不好，模板DNA出现污染，Mg2+浓度过高等。 ①漏加了PCR的反应成分； ②耐高温的DNA聚合酶失活，Mg2＋浓度过低 ③PCR程序设置不当等。 （1）如果扩增不成功（没有条带），可能的原因有： （2）如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 例.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　 ) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 例.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析，下列表述错误的是 A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 B 例.PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种组分的优化组合，下列相关叙述错误的是(　 　) A.反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否 B.设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量 C.TaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物的增多 D.目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置 C 例．在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。下列说法错误的是(　 　) A．两种限制酶在载体上识别的序列不相同 B．两种限制酶在载体上至少各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距约为200 bp D．DNA在凝胶中迁移的速率与DNA构象无关 D 课堂小结 $$