2.2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第二节 动物细胞工程 2.2 动物细胞融合技术和单克隆抗体 1 1、概述动物细胞融合技术原理和过程 一、学习目标 二、重、难点 2、掌握单克隆抗体的制备原理、制备过程和特点以及在临床上 具体的应用。 单克隆抗体的制备原理、制备过程和特点 植物体细胞杂交 植物细胞融合 植物组织培养 温故而知新 ③ 意义： ① 植物细胞融合完成的标志： ② 植物体细胞杂交技术完成的标志： 杂种细胞再生出新的细胞壁。 形成杂种植株 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育新的作物类型。 现在学习： 什么是细胞融合？人细胞和小鼠细胞如何融合在一起的呢？ 以前学习： 这一实验以及相关的其他实验证据表明，细胞膜具有流动性。 植物体细胞杂交技术可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？ 回想下之前有没有学过类似实验 4 一、动物细胞融合技术 探究：请同学们阅读教材P48，思考下列问题： 1.动物细胞融合技术的概念、原理、结果分别是什么？ 2.动物细胞融合技术常用的诱导方法有哪些？ 4.动物细胞融合技术有何意义？在现实生活中的应用有哪些？ 3.什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理？融合实质及完成的标志？（教材P48的相关信息） 5 一、动物细胞融合技术 1. 概念 动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞遗传信息的。 细胞膜具有一定的流动性。 物理法：电融合法 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活病毒诱导法 ——动物细胞融合特有 方法 原理 结果 意义 与植物原生质体融合的方法相同 突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。 6 一、动物细胞融合技术 拓展：生物法－灭活病毒诱导法 ⑵灭活病毒诱导细胞融合的原理： ⑴灭活： 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 ⑶融合实质及完成的标志: 指用物理或化学手段使病毒失去感染能力（不感染细胞），但是并不破坏病毒的抗原结构（诱导细胞融合）。 细胞核的融合 7 一、动物细胞融合技术 [旁栏思考]19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。 病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。 8 一、动物细胞融合技术 2. 应用 ①至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间细胞融合都已获得成功。 ②研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 ③为制造单克隆抗体开辟了新途径。 （主要） 正在融合的鸡血细胞 9 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合前的处理方法 诱导细胞融合的方法 细胞融合成功的标志 主要用途 意义 细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性 用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞 电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 再生出细胞壁 细胞核的融合 获得完整的杂种植株 主要用于制造单克隆抗体 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 动物细胞融合技术与植物体细胞杂交的比较 动物细胞融合没有形成新物种，没有体现细胞的全能性 10 B 例.如图表示仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列叙述正确的是 A.细胞A和细胞B必须为同种细胞才能融合 B.细胞C同时有细胞A和细胞B的遗传物质 C.该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性 D.此过程的原理是动物细胞具有全能性 11 例.对比动物细胞融合和植物体细胞杂交技术，下列论述合理的是 A.均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合 B.两者都可以跨越种属间的生殖隔离 C.两者都可以体现细胞的全能性 D.在适宜的条件下，均可产生完整个体 B 12 二、单克隆抗体及其应用 1.传统抗体制备方法及缺陷 缺陷： 动物体内 抗原 刺激 浆细胞 从血清中获取抗体 筛选单一B细胞 增殖分化 抗原不纯 抗原不纯 产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低 如何能得到产量高、纯度高且特异性强和灵敏度高的抗体呢？ 由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体 动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种,每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 13 （１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种； （２）每个B淋巴细胞（实质是浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。 科学家发现： 遗憾： 如何解决这一难题？ 2、获得大量的单一抗体的方法： 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 单一B淋巴细胞 细胞群 选择 克隆 产生 大量纯度高的特异性强的抗体 体外培养条件下，一个B淋巴细胞不可能无限增殖 克隆单一的B淋巴细胞，形成B淋巴细胞群，由细胞群产生大量的纯度高的抗体。 动物细胞融合 杂交瘤细胞 动物细胞培养 单克隆抗体 既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体 骨髓瘤细胞（癌细胞）能在体外无限增殖 一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体） 1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案： 一个极富创造力的方案 资料: 单克隆抗体：由单一B淋巴细胞克隆（增殖）的细胞群产生的特异性抗体。 思考与讨论 单克隆抗体 分析概念中“单”和“克隆”的含义。 总结单克隆抗体的概念？ 二、单克隆抗体及其应用 制备单克隆抗体的原理: （1）每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体,在体外培养条件下,不能无限增殖。 （2）骨髓瘤细胞能无限增殖，不能产生抗体。 （3）通过动物细胞融合技术将两种细胞融合，得到的融合细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。 骨髓瘤细胞 能无限增殖 能产生抗体 B淋巴细胞 二、单克隆抗体及其应用 3.会有几种细胞融合方式？杂交瘤细胞具有什么特点？ 1.单克隆抗体制备过程中为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？ 4.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？ 2.产生特定抗体的杂交瘤细胞的获得需要几次筛选？各自筛选的方法和目的是什么？ 结合图2-16: 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图，尝试构建制备单克隆抗体的流程，并思考以下问题： 18 注射特定抗原 多种已免疫B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 诱导融合 小鼠的脾脏中获取 多种杂交细胞 二、单克隆抗体及其应用 1.单克隆抗体的制备过程 是获得产生特定抗体的B淋巴细胞 目的? 从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养 杂交瘤细胞（多种） 第一次筛选 融合的细胞 B细胞 自身融合 未融合的 B淋巴细胞 B瘤 骨髓瘤细胞 自身融合 未融合的 骨髓瘤细胞 B瘤 B瘤 二、单克隆抗体及其应用 原因： 目的: 方法： 融合后得到多种杂交细胞和未融合的细胞 得到的是多种杂交瘤细胞 用特定的选择培养基，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 二、单克隆抗体及其应用 拓展延伸：【第一次筛选】获得杂交瘤细胞 ①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。 ②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。 筛选出杂交瘤细胞方法？ B淋巴细胞及同型融合细胞 不能无限增殖，死亡 骨髓瘤细胞及同型融合细胞 不能无限增殖，死亡 杂交瘤细胞 能无限增殖，生长 培养基中加入氨基喋呤 （HAT选择培养基） 21 抗体检测 第二次筛选 能分泌专一抗体的杂交瘤细胞 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合） 杂交瘤细胞（多种） 96孔板 二、单克隆抗体及其应用 克隆化培养 既能迅速大量增殖又能产生特异性抗体 特点 是否所有的杂交瘤细胞都能产生所需的抗体？不一定。 22 多孔细胞培养板 阳性孔 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的 将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养 （克隆化培养） 一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体 上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 抗体检测板 分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞 【第二次筛选】能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 知识拓展 抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法 使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞。 23 单克隆抗体的制备小结 项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选） 筛选原因 方法 筛选结果 诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等 选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。 用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。 克隆培养、抗体检测：用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 筛选出融合的杂交瘤细胞 筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞 获取大量单克隆抗体的方法 Ⅰ. 优点： Ⅱ. 缺点：规模小，产量少 Ⅰ. 优点：可大规模培养，大量生产 ①腹腔培养 ②体外培养 不需培养基，易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低 Ⅱ. 缺点：需要人为控制培养条件，成本相对较高 二、单克隆抗体及其应用 【拓展】 抗体的人源化 利用小鼠获得的单克隆抗体，能直接用于人体吗？为什么？ 不能，单克隆抗体会被人体当做抗原，发生免疫反应。 将非人源（如鼠源）抗体的关键功能区域移植到人类抗体框架中，以降低免疫原性并提高治疗效果。 【小结】 构建单克隆抗体制备的流程图，要求用“关键文字”+箭头呈现： 单克隆抗体 第二次筛选 B细胞、B-B细胞、杂交瘤细胞、瘤细胞、瘤-瘤细胞 获得杂交瘤细胞（多种） 注射 第一次筛选 骨髓瘤细胞 诱导融合 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 体外培养 培养液 多种B淋巴细胞 动物细胞融合技术 动物细胞培养技术 既能迅速大量繁殖 又能产生抗体 小鼠 单克隆抗体制备的过程中，应用到的技术手段 细胞膜的流动性 细胞增殖 注射特定抗原 小鼠腹腔内 腹水 单克隆抗体的制备过程 单克隆抗体课堂巩固 （1）该过程中应用到的技术_______________________________________ （2）原理_______________________________________ （3）注射特定抗原的目的______________________________________________ （4）诱导融合的方法______________________________________ 动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________ 动物细胞融合、动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 灭活病毒诱导法 （5）第一次筛选的目的______________________ 第一次如何筛选___________________________ 筛选原理____________________________________________________ _____________________________ 筛选获得融合的杂交瘤细胞 用特定的选择培养基进行筛选 在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 （6）杂交瘤细胞的特点__________________________________ （7）第二次筛选的目的________________________________________________ 如何筛选_________________________________________________________ 选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_________________________________ （8）抗体检测原理_______________________________________ 获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选） 分泌的抗体能与特定的抗原结合 抗原和抗体能够特异性结合 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 （9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________ （10）如何获取单克隆抗体 ①体外培养___________________________ ②小鼠腹腔内培养_________________________ （11）单克隆抗体的优点_____________________________ _________________________________________________ 在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖 从细胞培养液中获取 从小鼠腹水中获取 能准确地识别抗原的细微差异， 与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 阳 单克隆抗体课堂巩固 例.新型冠状病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞ACE2受体结合，入侵细胞后可引起肺炎。针对此环节研发单克隆抗体是治疗新冠肺炎的研究热点之一，下列相关叙述错误的是 A.①过程需多次向小鼠体内注射S蛋白，以便 于从脾脏中获得致敏的B淋巴细胞 B.②过程可通过电融合法使两个细胞融合 C.经③过程筛出的细胞既能无限增殖又能产生 识别S蛋白的单克隆抗体 D.S蛋白的单克隆抗体能够阻断病毒入侵正常细胞以减弱对机体的毒害 C 31 例、（2020年全国统一高考生物试卷）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题： （1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是__________ ______________________________________________________________________。 （2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_______________________________________________________________________。 诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞 取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液 （3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于_____________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_________________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_____________________________________。 选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性 （4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有________________________________________（答出2点即可）。 将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖； 将杂交瘤细胞在体外培养 例、（2020年全国统一高考生物试卷）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题： 三、单克隆抗体的应用 【资料1】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 具有准确、高效、简易、快速特点 诊断优点： 作为诊断试剂——最广泛的应用 抗体 药物 接头 ADC被细胞吞噬 释放药物 溶酶体裂解 细胞凋亡 【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC ）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示 三、单克隆抗体的应用 用于治疗疾病和运载药物 三、单克隆抗体的应用 讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞； 药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 讨论2： 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ ① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗； ② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。 讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？ ① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 抗体—药物偶联物（ADC）的局限性： （1）成本高 （2）抗体与药物的连接可能分开，导致药物作用于健康细胞 （3）脱靶效应：药物不仅结合到目标靶点，还意外结合到其他非预期 的分子上，导致副作用或其他不良反应。 三、单克隆抗体的应用 37 三、单克隆抗体的应用 （1）广泛用作诊断试剂 利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 （2）运载药物： 如抗体-药物偶联物（ADC）。 生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤。 (单抗导向，药物为弹头) 优点：位置准确、疗效高、副作用小 （3）直接用于治疗疾病。 例.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列叙述不正确的是 A.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡 B.ADC可通过胞吞方式进入肿瘤细胞 C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合 D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，会产生新的蛋白质 A 39 例．将特定药物与单克隆抗体相结合制成的“生物导弹”，能够用于杀死人类某些癌细胞，其过程如图所示。“生物导弹”主要由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是杀伤性“弹头”。下列相关叙述错误的是(　 　) A．“脾脏中的细胞”是从经免疫处理的实验动物中获取的B淋巴细胞 B．杂交瘤细胞在培养瓶中培养时不会出现接触抑制的现象 C．“瞄准装置”是指能够特异性识别癌细胞的单克隆抗体 D．构成“弹头”的抗癌药物具有选择性杀伤癌细胞的功能 D 构成“弹头”的抗癌药物没有特异性，“瞄准装置”中的单克隆抗体能将药物带到特定部位，从而选择性杀伤癌细胞，×; 课堂小结 Lavf55.33.100 单克隆抗体的制备过程 jasmine $$