3.2基因工程的基本操作程序 课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，涵盖目的基因的筛选与获取、表达载体构建、导入受体细胞及检测鉴定等核心内容，通过转基因抗虫棉培育实例导入，从问题思考到过程总结，帮助学生建立知识脉络。 其特色在于融合科学思维与探究实践，通过PCR过程模型构建、限制酶选择分析等活动，结合抗虫棉检测等实例，归纳对比PCR与DNA复制、农杆菌转化法等知识，助力学生理解原理，教师可提升教学效率，学生增强解决实际问题的能力。

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探究一、目的基因的筛选与获取 3.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 4.获取目的基因的方法 (1)人工合成目的基因。 (2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 (3)通过构建基因文库来获取目的基因。 新课讲授 探究一、目的基因的筛选与获取 5.回顾：（1）DNA复制所需的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（在体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的原料 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′ 端开始连接脱氧核苷酸 （2） DNA复制所需的条件： 模板（目的基因）、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ A.变性 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链 B.复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 C.延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 6.PCR反应过程 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 新课讲授 探究一、目的基因的筛选与获取 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 目的基因 条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物 和TaqDNA聚合酶 过程：变性→复性→延伸 7.PCR扩增的过程——演示图 新课讲授 探究一、目的基因的筛选与获取 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 8.PCR的结果： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 指数 2n 9.PCR产物的鉴定： 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 新课讲授 探究一、目的基因的筛选与获取 新课讲授 阅读教材P76～79 ，结合下列资料，完成学案问题 [资料]下图是PCR扩增技术获得Bt基因部分过程，请思考完成下列问题： 探究一、目的基因的筛选与获取 新课讲授 1.利用PCR技术扩增目的基因需要提供什么条件？ 2.DNA复制时为什么需要引物？ 3.在PCR过程中，引物是什么？PCR过程引物的作用是什么？ 探究一、目的基因的筛选与获取 模板、酶、原料、引物以及特定的温度。 在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入两种引物。 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 新课讲授 4.构建模型：请根据图示，利用引物A、B画第二、三轮PCR 探究一、目的基因的筛选与获取 新课讲授 5.PCR所需引物是依据________的一段已知序列设计而成的，图中引物A与引物B________(填“相同”或“不同”)，其在PCR过程中________(填“能”或“不能”)重复利用。 6.图中所示利用PCR技术扩增目的基因，在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，出现____个这样的等长的DNA片段。一个目的基因分子在第3次扩增时，需要________种引物，需要________个引物。如果循环n次，则共需消耗________对引物。 探究一、目的基因的筛选与获取 不能 目的基因 不同 3 2 2　 8 (2 n －1) 新课讲授 探究一:基因工程的工具酶 7.用PCR技术可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 新课讲授 【归纳提升】PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 PCR技术 DNA复制 区别 解旋方式 DNA在　　　作用下变性解旋  　　　　催化  场所 细胞　　(在PCR扩增仪内)  细胞　　(主要在细胞核内)  酶 耐高温的　　　　　  　　　　、普通的　　　　等  温度条件 需控制温度,在　　　　温度下进行  细胞内　　　　条件  合成的对象 DNA片段或基因 DNA分子 联系 ①模板:均需要　　　　　　　　作为模板进行物质合成;  ②原料:均为　　　　　　　　　;  ③酶:均需要　　　　　进行催化;  ④引物:均需要引物,使DNA聚合酶从引物的　　端开始连接脱氧核苷酸  高温 解旋酶 外 内 DNA聚合酶 解旋酶 DNA聚合酶 较高 温和 脱氧核苷酸链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 3' 探究一、目的基因的筛选与获取 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 重组载体的构建是基因工程的核心，其目的是把目的基因和载体组合成一个新的DNA分子，以便将目的基因送进受体细胞。 1.重组载体的组成 载体包括：目的基因、启动子、终止子、 标记基因和复制原点 ①启动子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。 终止子 抗生素抗性基因 复制原点 启动子 插入基因 基因表达载体模式图 ③标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因，鉴别受体细胞中是否导入目的基因。 标记基因的作用：用于对重组质粒（DNA）的鉴定和筛选 ②终止子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的尾端，使转录终止。 终止子 抗生素抗性基因 复制原点 启动子 插入基因 基因表达载体模式图 一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶把两者连接。 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 阅读教材P80第1 ～ 3段，结合下列资料，完成学案问题。 【资料】下图中目的基因为Bt基因，为了让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;同时,使目的基因能够表达和发挥作用，进行基因表达载体的构建过程。请结合图示，回答下列问题： 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 1.获取Bt基因后能不能直接将它导入受体细胞？为什么？     2.构建基因表达载体的目的是什么？ 不能，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 3.目的基因插入载体时，插入位点是不是随意的？为什么？ 不是，目的基因应插入到启动子和终止子之间的部位，因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。　 4.据图分析，构建基因表达载体时，能否用限制酶SmaⅠ切割质粒？为什么？ 不能；因为Sma Ⅰ会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗生素抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 5.用同一种限制酶分别切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“单酶切法”。如使用限制酶EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，其结果如下，分析下列回答： ①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？ 能， 能。 都能，都能。 ②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？ 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 6.用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“双酶切法”。如使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别同时切割质粒和外源DNA，其结果如下，分析下列回答： ①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？ 可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接。 不能 ，不能。 能 ， 能，不能 ，不能。 ②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？ ③通过上述分析，与“单酶切法”相比，“双酶切法”有何优点？ 新课讲授 探究二、基因表达载体的构建 根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 (1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择_________。 (2)不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择_______。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 【归纳提升】限制酶的选择技巧 PstⅠ SmaⅠ 一、将目的基因导入受体细胞的方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 农杆菌转化法（常用） 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 （我国科学家独创） 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 1. 将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。（用于双子叶植物） （1）农杆菌的特点： 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的DNA上。 （一）将目的基因导入植物细胞 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 （2）农杆菌转化步骤： 构建 表达载体 导入 植物细胞 目的基因 插入 植物细胞染色体DNA上 表达 新性状 转入 农杆菌 植物组织培养 Ti质粒 目的基因 第一次导入 第二次导入 第一次拼接 第二次拼接 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 b.花粉管通道法 c.显微注射法 主要有两种做法：一是先将目的基因导入花粉，再通过受精获得导入基因的植株。二是在植物自花授粉后，将目的基因滴在剪开的柱头上，使其沿着花粉管进入胚囊，完成基因导入。目前，后一种方法已在水稻、棉花等农作物上获得了成功。 借助光学显微镜的放大作用，利用一种极细的注射器直接将目的基因注射到细胞中。利用这种方法已生产出了鼠、兔、羊、猪、牛等转基因动物。 2.其他方法 （二）将目的基因导入动物细胞 ①方法： 技术。 ②受体细胞： 。 ③过程：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物。 （三）将目的基因导入微生物细胞 常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能 周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 显微注射 受精卵 Ca2＋ 吸收 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 二、目的基因的检测与鉴定 ①检测目的基因是否导入 如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因 ——通过PCR等技术检测 转基因生物 提取DNA PCR操作 是否扩增出目的基因 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 电泳操作 1.分子水平的检测 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 ②检测目的基因是否转录 如：检测Bt基因是否翻译出mRNA ——通过PCR等技术检测 提取棉花细胞mRNA 逆转录 产生DNA 对扩增产物进行检测 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 1.分子水平的检测 ③检测目的基因是否翻译 如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白 ——通过抗原-抗体杂交检测 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 抗性鉴定、活性鉴定等 2.个体水平检测： 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 阅读教材P80～82，结合下列资料，完成学案问题。 【资料】基因工程中务必使目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达。受体细胞不同，采用的导入方法也不同。常见的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法、显微注射法以及用Ca2＋处理等。下面为利用农杆菌转化法制备转基因抗虫棉的过程图。 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 1.在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？   2.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。 新课讲授 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 3.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。     4.目的基因导入动物细胞时，常用的受体细胞是什么？ 对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵表现全能性相对容易，而高度分化的动物体细胞的全能性不易表现。 能，可从双子叶植物中提取该化学物质，再用该化学物质处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。 新课讲授 5.检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA，用_________________等方法;从转基因棉花中提取____________，用相应的________进行______________________，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过______________________来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫 PCR 蛋白质 抗体 抗原—抗体杂交 探究三、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 【归纳提升】农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的________，第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的________________。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入_____________________，第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T­DNA导入_______________________。 T-DNA上 染色体DNA上 农杆菌(Ca2＋处理法) 受体细胞(农杆菌转化法) 新课讲授 探究四、DNA片段的扩增及电泳鉴定 【实验原理】 1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理。 PCR利用了DNA的热变性和DNA半保留复制的原理。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 新课讲授 探究四、DNA片段的扩增及电泳鉴定 【实验步骤】 新课讲授 探究四、DNA片段的扩增及电泳鉴定 【资料】可通过PCR技术扩增Bt抗虫蛋白基因的数量，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，回答下列有关问题： 1．是否成功扩增出DNA片段，判断的依据是什么？   2．进行电泳鉴定的结果如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 课堂小结 谢谢大家 $$