专题12 基因工程（全国通用）-2025年高考生物真题题源解密

专题12 基因工程 考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。 2025年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。 近年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。 必备知识速记：总结易错易混点。 名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。 命题解读 考向 考查统计 本部分的命题以非选择题为主，属于高考必考内容。题目内容多，难度往往较大，试题情境新颖，大多来自大学教材和最新的论文文献，核心素养侧重对科学思维和科学探究的考查。 考向一 基因工程的基本工具 2025·江苏·T19　2024·湖南·T5 2024·江西·T12 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7 考向二 基因工程的基本操作程序 2025·河南·T21　 2025·安徽·T15 2025·黑吉辽蒙·T25 2025·河北·T22 2025·山东·T25　 2024·甘肃·T21 2024·贵州·T21 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20　 考向三 基因工程的应用 2025·陕晋宁青·T21　 2025·四川·T19　 2025·云南·T21　 2025·甘肃·T21　 2025·安徽·T20 2025·湖南·T21 2025·广东·T21 2024·河北·T5 2022·河北·T24　2022·广东·T22　2022·全国乙·T38　2021·河北·T24 考向四 蛋白质工程的原理和应用 2022·湖南·T22　2021·辽宁·T14　2022·重庆·T3 考向五 DNA的粗提取与鉴定 2024·湖南·T5 2024·山东·T13 2023·广东·T11　2022·山东·T13　2021·山东·T13　 考向六 生物技术的安全性与伦理问题 2024·广东·T18 2023·浙江选考·T2　 2022·北京·T21 试题精讲 考向一 基因工程的基本工具 1．（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【分析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。 【详解】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误； B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确； C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误； D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。 故选BD。 考点解读 1．使用载体的目的 在基因工程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。 2．作为载体必需具备的条件 (1)有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。 (2)能够在受体细胞中保留下来，且载体DNA必须具备自我复制能力；或能够整合到受体DNA上，并随受体DNA同步复制。 (3)带有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选，常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 (4)对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动。 3．常用载体的种类及用途 种类 用途 质粒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 噬菌体 植物病毒 将外源基因导入植物细胞 动物病毒 将外源基因导入动物细胞 4．载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因，目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗生素抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示： 考向二 基因工程的基本操作程序 1．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确； B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确； C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。 故选C。 2．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 3．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 4．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 5．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。 【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释 (2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 (4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 考点解读 1．聚合酶链式反应(PCR) (1)PCR反应的过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 ①变性：当温度超过到90 ℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (2)PCR反应的结果 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，耐高温的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数式扩增。 2．生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 30多次 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 3．构建基因表达载体的过程 目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)(如图)。 4．目的基因导入不同受体细胞的过程 项目 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 5．目的基因的检测与鉴定的方法 类型 检测内容 方法 结果显示 分子水平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)或PCR等 是否成功 显示出杂交带 目的基因是否转录出mRNA 核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)或PCR等 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间) 个体生物 学水平 鉴定　 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗性的接种实验 是否赋予了 预期抗性或 蛋白质活性 基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性 考向三 基因工程的应用 1．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 【答案】(1)荧光 (2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。 2．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是 （答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有 （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 【答案】(1) 终止子、复制原点 P1 和 P3 782 重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解 (2) 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测 【分析】1基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminator等，这是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。 【详解】（1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。 将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生沉淀，蛋白A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。 （2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。 ②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 3．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路 。 【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌 (2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3) 设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测。 【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 【详解】（1） 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。 （2）PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。 （3）设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 4．（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 (1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过 （方法）将该质粒转入植物细胞，并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加 。 (2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是 。 (3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证抗病性。 (4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。 【答案】(1) 农杆菌转化法 Ti质粒上的T - DNA 潮霉素 (2) 外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3) PCR - 测序 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案） (4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。 【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定。植物组织培养技术是指在无菌和人工控制的环境条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实等）、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的技术。    【详解】（1）将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。 （2）在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。 5．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。 在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。 回答下列问题： (1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。 (2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。 (3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。 【答案】(1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点 (2) 稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升 (3) 高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。 【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。 【详解】（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。 （2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。 （3）从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，诱导细菌死亡，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。 6．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。 (2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。 【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制 (2) 2 验证重组质粒是否构建成功 (3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻 (4) 目的基因发生突变或变异 发酵条件优化 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。 （2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。 （3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 7．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【答案】(1) 4种脱氧核苷酸 延伸 (2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ (3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化 【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 【详解】（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 （2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 （3）T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 考点解读 1．转基因抗虫植物与转基因抗病植物的比较 项目 转基因抗虫植物 转基因抗病植物 方法 从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将其导入植物中 将抗病基因导入植物中 基因种类 Bt基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 ①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因 ②抗真菌基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因 成果 转基因抗虫棉、转基因抗虫水稻等 抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等 意义 减少化学农药的使用，降低生产成本，减轻环境污染，降低了对人体健康的损害 　 　2.关于转基因作物中目的基因的三点提醒 (1)目的基因都是来自其他生物的能表现出优良性状的外源基因，并不都是来自细菌、病毒等微生物，如抗冻蛋白基因来自鱼类。 (2)有的目的基因控制蛋白质的合成，直接控制生物的某种性状，这反映了基因与性状的直接关系。 (3)有的目的基因通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物的性状，这体现的是基因与性状的间接关系。 4．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 项目 乳腺生物反应器 工程菌 含义 将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 基因结构 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌的基因结构与人类的基因结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 考向一 基因工程的基本工具 1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【解析】限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 2.（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ） A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【答案】A 【解析】题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点，因而不可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。 3．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 【答案】B 【分析】E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A正确； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。 4．（2021·湖北·高考真题）限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（    ） A．6 B．250 C．4000 D．24000 【答案】C 【分析】限制性核酸内切酶能识别特定的DNA序列，切割特定的位点，在特定的碱基之间切割磷酸二酯键。 【详解】据图可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。 故选C。 5.（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。    回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。    【答案】(1) 不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 (2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞 (3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞 (4)④ 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 （2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。 （4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。 故选④。 考向二 基因工程的基本操作程序 1．（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ） A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 【答案】B 【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 2.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。 (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。 (3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。 (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。 (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【答案】(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关 (2)耐高温的DNA聚合酶 (3)基因表达载体的构建 限制酶、DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 能吸收周围环境中DNA分子 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同 【解析】（1）选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。 刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。 （2）扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。 （3）根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。 （4）大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 （5）不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响。 3．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 大于 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【解析】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 （2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 （3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 4.（2022·湖南·高考真题）中国是传统的水稻种植大国，有一半以上人口以稻米为主食。在培育水稻优良品种的过程中，发现某野生型水稻叶片绿色由基因C控制。回答下列问题: (1)突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死。突变型1连续自交3代，F3成年植株中黄色叶植株占 。 (2)测序结果表明，突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5＇-GAGAG-3＇变为5＇-GACAG-3＇，导致第 位氨基酸突变为 ，从基因控制性状的角度解释突变体叶片变黄的机理 。（部分密码子及对应氨基酸:GAG谷氨酸;AGA精氨酸;GAC天冬氨酸;ACA苏氨酸;CAG谷氨酰胺） (3)由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳（电泳条带表示特定长度的DNA片段），其结果为图中 （填“I”“Ⅱ”或“Ⅲ”）。   (4)突变型2叶片为黄色，由基因C的另一突变基因C2所致。用突变型2与突变型1杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。能否确定C2是显性突变还是隐性突变? （填“能”或“否”），用文字说明理由 。 【答案】(1)2/9 (2) 243 谷氨酰胺 基因突变影响与色素形成有关酶的合成，导致叶片变黄 (3)Ⅲ (4) 能 若C2是隐性突变，则突变型2为纯合子，则子代CC2表现为绿色，C1C2表现为黄色，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若突变型2为显性突变，突变型2（C2C）与突变型1（CC1）杂交，子代表型及比例应为黄∶绿=3∶1，与题意不符 【分析】（1）基因突变具有低频性，一般同一位点的两个基因同时发生基因突变的概率较低； （2）mRNA中三个相邻碱基决定一个氨基酸，称为一个密码子。 【详解】（1）突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死，说明突变型1应为杂合子，C1对C为显性，突变型1自交1代，子一代中基因型为1/3CC、2/3CC1，子二代中3/5CC、2/5CC1，F3成年植株中黄色叶植株占2/9。 （2）突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5＇-GAGAG-3＇变为5＇-GACAG-3＇，突变位点前对应氨基酸数为726/3=242，则会导致第243位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺。叶片变黄是叶绿体中色素含量变化的结果，而色素不是蛋白质，从基因控制性状的角度推测，基因突变影响与色素形成有关酶的合成，导致叶片变黄。 （3）突变型1应为杂合子，由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。Ⅰ应为C酶切、电泳结果，II应为C1酶切、电泳结果，从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳，其结果为图中Ⅲ。 （4）用突变型2（C2_）与突变型1（CC1）杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若C2是隐性突变，则突变型2为纯合子，则子代CC2表现为绿色，C1C2表现为黄色，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若突变型2为显性突变，突变型2（C2C）与突变型1（CC1）杂交，子代表型及比例应为黄∶绿=3∶1，与题意不符。故C2是隐性突变。 5．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： (1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 (2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。 (3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的 组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。 (4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。 (5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。 (6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可） 【答案】(1)溶解度 (2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME基因”） (3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”） (4) 增加 细胞数量 (5)有氧呼吸生成的ATP增多 (6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”） 【分析】1、PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、PCR原理：DNA半保留复制。 3、PCR基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。 【详解】（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。 （2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶（ME）基因。 （3）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。 （4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。 （5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。 考向三 基因工程的应用 1.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可） 【答案】(1) 在胚乳中特异性表达的 终止转录 HindIII EcoRI (2) 农杆菌转化 r2HNmRNA 抗原抗体杂交 (3) 1/4 纯合体自交后代不发现性状分离 (4) 体液 细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 【解析】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。 （4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 （5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。 考向四 DNA的粗提取与鉴定 1.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【解析】研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 2．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【解析】在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 3．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【解析】利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误；依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确；对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 考向五 蛋白质工程的原理和应用 1．（2022·重庆·高考真题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过基因工程方法生产 【答案】A 【详解】A、胰岛素作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误； B、人工长效胰岛素比人胰岛素的B链上多了两个精氨酸，氨基酸与氨基酸之间通过肽键连接，故多2个肽键，B正确； C、人工胰岛素和人胰岛素作用相同，都是降血糖的作用，故靶细胞相同，C正确； D、人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。 故选A。 2．（2021·辽宁·高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　　） A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境 【答案】D 【详解】A、在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确； B、蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确； C、N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确； D、酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。 故选D。 3.（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。 【答案】(1) 氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性 (2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制 (3) 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间 【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列； 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 （2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。 （3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。 （4）为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。 考向六 DNA的粗提取与鉴定 1．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误； C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 2．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确； B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误； C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误； D、加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 考向七 生物技术的安全性与伦理问题 1.（2024·浙江·高考真题）关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（    ） A．试管动物的培育 B．转基因食品的生产 C．治疗性克隆的研究 D．生物武器的发展和生产 【答案】D 【解析】试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A正确；我过目前不反对转基因的食品的生产，B正确； 中国政府禁止生殖性克隆，支持治疗性克隆，C正确；生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D错误。 2.（2024·广东·高考真题）遗传性牙龈纤维瘤病（HGF）是一种罕见的口腔遗传病，严重影响咀嚼、语音、美观及心理健康。2022年，我国科学家对某一典型的HGF家系（如图）进行了研究，发现ZNF862基因突变导致HGF发生。 回答下列问题： (1)据图分析，HGF最可能的遗传方式是 。假设该致病基因的频率为p，根据最可能的遗传方式，Ⅳ2生育一个患病子代的概率为 （列出算式即可）。 (2)为探究ZNF862 基因的功能，以正常人牙龈成纤维细胞为材料设计实验，简要写出设计思路： 。为从个体水平验证ZNF862基因突变导致HGF，可制备携带该突变的转基因小鼠，然后比较 的差异。 (3)针对HGF这类遗传病，通过体细胞基因组编辑等技术可能达到治疗的目的。是否也可以通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传病？作出判断并说明理由 。 【答案】(1) 常染色体显性遗传病 （1+p）/2 (2) 将正常细胞分为甲乙两组，其中甲组敲除ZNF862基因，观察甲乙两组细胞表型从而探究该基因的功能 转基因小鼠和正常小鼠牙龈 (3)不可以，违反法律和伦理，且存在安全隐患。 【解析】（1）由图可知，该病男女患者数量相当，且代代遗传，因此该病最可能的遗传方式为常染色体显性遗传病；假设该病由基因A/a控制，则致病基因A的基因频率为p，正常基因a的基因频率为1-p，Ⅳ2的基因型为Aa，产生配子基因型为1/2A和1/2a，正常人中基因型为AA的概率为p2，基因型为Aa的概率为2p（1-p），基因型为aa的概率为（1-p）2，Ⅳ2与AA生育患病子代的概率为p2，与Aa生育患病子代的概率为2p(1-p)×3/4，与aa生育患病子代的概率为（1-p）2×1/2，故Ⅳ2生育一个患病子代的概率为p2+2p(1-p)×3/4+（1-p）2×1/2=（1+p）/2。 （2）从细胞水平分析，培养该细胞，敲除ZNF862基因，观察细胞表型等变化，通过比较含有该基因时的细胞表型从而探究该基因的功能，设计思路为：将正常细胞分为甲乙两组，其中甲组敲除ZNF862基因，观察甲乙两组细胞表型从而探究该基因的功能；从个体水平分析，通过比较转基因小鼠和正常小鼠牙龈差异可得出该基因的功能。 （3）一般不通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传，该方式违反法律和伦理，且存在安全隐患。 1．对基因工程概念的理解 基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 基本过程 剪切→拼接→导入→表达 原理 基因重组 结果 获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品 优点 克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传性状 2．与DNA有关的酶的比较 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 耐高温的 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 3．DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作材料。 (2)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (3)提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。 (4)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 4．DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同 项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液 DNA 溶解 析出 蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解 总结 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。当NaCl溶液的物质的量浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度的增加而逐渐降低；NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液的物质的量浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。②选择适当的盐溶液能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的 5．PCR过程中用到的重要仪器 (1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。 (3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。 6．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。 7．基因工程和蛋白质工程的基本思路 (1)基因工程遵循中心法则，即其基本思路为：DNA→mRNA→多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。因此基因工程基本上是生产出自然界已有的蛋白质。 (2)蛋白质工程是按照以下思路进行的：预期的蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变基因应有的碱基序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 8.蛋白质工程与基因工程的区别和联系 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 9．转基因生物的优缺点分析 优点 缺点 ①解决粮食短缺问题； ①可能产生新病毒或新过敏原； ②减少农药使用，减轻环境污染； ②可能产生抗除草剂的杂草； ③增加食物营养，提高附加值； ③可能使疾病的传播跨越物种障碍； ④增加食物种类，提升食物品质； ④可能会损害生物多样性； ⑤提高生产效率，带动相关产业发展 ⑤可能干扰生态系统的多样性 10．理性看待转基因技术的原因 (1)生物技术和其他科学技术一样具有两面性，是一把双刃剑，既能推动社会发展和技术进步，也可能带来灾难。 (2)社会的发展总是和技术的发展密切联系，从促进社会发展的角度看，必须不断发展生物技术，造福人类，同时要避免灾难的发生。 11．理性看待转基因技术 (1)认识到转基因技术的应用前景是非常广阔的，以基因工程为代表的一大批生物技术成果，进入人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用。 (2)正视转基因技术带来的安全性问题，切实认识到个别有害转基因生物的危害性，要趋利避害，而不能因噎废食。 (3)完善相应的法律法规，利用法制手段确保转基因生物的安全性。 (4)我国保证转基因生物安全性的监控和预防措施。 ①立法监控是保证转基因生物安全的有力措施。 ②多环节监控。转基因农作物研究、从实验室走向大田试验各阶段，以及产品商品化都有相应法规进行严格的监控，只有在每一阶段试验获得认可证书后，才可进入下一阶段。 12．生物武器的概念 生物战剂及施放它的武器、器材总称为生物武器。生物战剂是指在战争中使人、畜致病，毁坏农作物的微生物及毒素。 13．生物武器的特点 (1)传染性强：某些生物武器只需少数病原体侵入人体，就会引起发病，如几十个热杆菌侵入人体就能致病。某些病原体，如鼠疫杆菌等，有很强的传染性，在一定条件下能在人员之间传播，长期流行。 (2)传染面积广：生物战剂致病力强，气溶胶可随风飘散，在气象、地理条件适宜时，可造成大面积污染。 (3)不易被发现：生物战剂气溶胶无色无味，加之多在黄昏、夜间、拂晓、多雾时秘密施放，不易被人发现。 (4)有一定的潜伏期：生物战剂致病需经几小时至几天的时间，在这期间相关人员不会很快减弱工作能力。 (5)传播途径多：呼吸、饮食、皮肤接触、昆虫叮咬等。 14．生物武器的传播途径 (1)吸入：生物战剂污染空气，可以通过呼吸道吸入，感染致病。 (2)误食：食用被生物战剂污染的水、食物而得病(如霍乱、痢疾等疾病)。 (3)皮肤接触：生物战剂，如炭疽杆菌等，或带菌物品上的病毒可直接或间接经皮肤、黏膜、伤口进入人体。 (4)昆虫叮咬：人被带有生物战剂的昆虫叮咬后，会使血液被感染而致病。 一、单选题 1．（2025·山东青岛·三模）药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程技术，利用大肠杆菌来生产这种药物, 流程如下图，其中lacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。下列说法正确的是（　　） 注：bp代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因。限制酶及识别序列：BamHⅠ：-G↓GATCC-，EcoRⅠ：-G↓AATTC-，Sau3AⅠ：-↓GATC-，SmaⅠ：-CCC↓GGG-，XmaⅠ：-C↓CCGGG-， A．根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于碱基互补配对原则，该方法得到的DNA片段序列是确定的 B．为将目的基因准确插入质粒中，最好选用BamH Ⅰ和Xma Ⅰ酶切割目的基因 C．利用含卡那霉素培养基进行筛选即可选出含重组质粒的受体菌 D．将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，利用琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为1960bp的条带 【答案】B 【分析】基因工程是指按照人们的原望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程的基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由于密码子具有简并性，即同一种氨基酸可以对应多种密码子，因此，根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段的方法得到的DNA片段有多种可能，A错误； B、目的基因与质粒形成重组分子要有相同的末端，且目的基因应插入启动子和终止子之间才能在受体细胞中表达。终止子与启动子之间有三种限制酶识别序列：EcoR I、Xma I和BamH I。据图可知，EcoR I会破坏目的基因，故为将目的基因准确插入质粒中，最好选用Xma I和BamH I切割目的基因，B正确； C、由图可知，质粒中含有LacZ基因和卡那霉素抗性基因，在构建基因表达载体时LacZ基因被破坏，无法使无色的X-ga1变为蓝色。因此，在培养基中应加入的物质有卡那霉素和X-gal，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌才能不被卡那霉素杀死，同时表现为无色菌落， C错误； D、根据质粒和目的基因中EcoR Ⅰ的酶切位点可知，正向连接后用EcoR Ⅰ切割，可以得到两个片段分别为400+700+600=1700bp，10+50+200=260bp，故通过琼脂糖凝胶电泳分离后，可得到长度为1700bp和260bp的条带，D错误。 故选B。 2．（2025·山东烟台·三模）双脱氧核苷酸测序法可测定DNA的碱基序列。dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种物质的统称，常在PCR中做原料。ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP 4种。在4组标准PCR反应体系中加入特定的ddNTP，ddNTP可取代相应的dNTP，终止DNA子链的延伸，反应后得到不同长度的DNA片段混合物，再进行凝胶电泳放射自显影测序。下图是利用该技术对某一单链DNA片段的测序电泳图谱。下列说法错误的是（　　） A．该PCR反应体系中可不加入ATP供能，Mg2+可激活相关酶的活性 B．4组反应体系中除加入dNTP作原料外，还应分别加入某一种双脱氧核苷三磷酸 C．加入ddCTP的反应体系中最多获得3条长短不同的子链 D．根据测序电泳图谱分析，待测DNA的碱基序列是3'-GACTGCCA -5' 【答案】D 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 【详解】A、在PCR反应体系中，dNTP（ddNTP可取代相应的dNTP）本身含有高能磷酸键，能为DNA合成提供能量，所以可不加入ATP供能，同时，Mg2+可激活DNA聚合酶等相关酶的活性，A正确； B、根据双脱氧核苷酸测序法的原理，4组反应体系中除了加入dNTP作为合成DNA的原料外，还应分别加入某一种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），以终止DNA子链的延伸，从而得到不同长度的DNA片段，B正确； C、观察电泳图谱可知，待测DNA序列中含有3个C（胞嘧啶），加入ddCTP的反应体系中，DNA子链延伸过程中在这3个C处都有可能掺入ddCTP从而终止延伸，所以最多可获得3条长短不同的子链，C正确； D、根据电泳图谱，DNA片段越短在凝胶中移动速度越快，离加样孔越远，图谱中从左往右读取碱基序列，则待测DNA的碱基序列应该是5'-GACTGCCA -3'，而不是3'-GACTGCCA -5'，D错误。 故选D。 3．（2025·河北衡水·三模）下列关于基因工程工具酶的叙述，正确的是（    ） A．大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 B．限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键 C．DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶 D．T4DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端 【答案】A 【分析】DNA连接酶：（1）根据酶的来源不同分为两类：E. coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、限制酶通常识别双链DNA的特异序列，大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，A正确； B、限制酶切割的是磷酸二酯键，而非氢键（氢键由解旋酶断开），B错误； C、DNA连接酶用于连接DNA片段间的磷酸二酯键，是构建重组DNA的关键酶；而DNA聚合酶用于将单个脱氧核苷酸连接到链上（如DNA复制），不直接参与重组DNA的连接，C错误； D、T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，D错误。 故选A。 4．（2025·河北衡水·三模）科研人员依据下图对绿色荧光蛋白进行改造和设计，下列叙述错误的是（    ） A．绿色荧光蛋白是由基因控制合成的 B．图中的a和b分别指多肽链和mRNA C．蛋白质工程能够制造自然界中不存在的蛋白质 D．蛋白质工程的操作对象是蛋白质，不需要对基因进行操作 【答案】D 【分析】蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因，从而获得所需要的蛋白质。 【详解】A、绿色荧光蛋白是由绿色荧光蛋白基因控制合成的，A正确； B、蛋白质工程需要根据预期功能设计蛋白质三维结构，推导出多肽链，进而推出mRNA序列和DNA序列，所以图中的a和b分别指多肽链和mRNA，B正确； C、蛋白质工程是指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，故蛋白质工程可合成天然不存在的蛋白质，C正确； D、蛋白质工程是通过改造或修饰基因来实现的，可见蛋白质工程是通过对基因操作实现的，D错误。 故选D。 5．（2025·山东青岛·三模）在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（    ） A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接 B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中 C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点 D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达 【答案】B 【分析】1、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。 2、基因表达载体的组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因 （1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始； （2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束； （3）标记基因便于目的基因的鉴定和筛选； （4）在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 【详解】A、同尾酶识别的核苷酸序列不同，但是产生的末端相同，因此用同尾酶切割运载体和目的基因，可以产生相同的黏性末端而进行互补再次连接，A错误； B、要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中，转录形成的两种mRNA可碱基互补配对，抑制该基因的翻译过程，从而使该基因表达量下降，B正确； C、由于DNA子链延伸时总是从5’到3’，如果目的基因没有合适的酶切位点，那么可以在引物5’端末尾设计加入酶切位点，C错误； D、表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达，D错误。 故选B。 6．（2025·山东青岛·三模）虾青素是虾体内的一种脂质，具有抗氧化等多种药理活性。研究人员将虾青素基因导入水稻中，获得转基因水稻，取转基因水稻外植体进行组培形成愈伤组织，制备水稻胚乳悬浮细胞，对虾青素进行工厂化生产。下列说法正确的是（    ） A．将虾青素基因与胚特异性启动子重组 B．在培养水稻胚乳细胞的固体培养基中添加蔗糖 C．悬浮培养前用胰蛋白酶分离胚乳细胞 D．工厂化生产的虾青素需要进行药理活性检测 【答案】D 【分析】1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 2、植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】A、为使虾青素在胚乳细胞中表达，需将虾青素基因与胚乳特异性启动子重组，这样可以使虾青素基因在水稻胚乳细胞中特异性表达，有利于在水稻胚乳悬浮细胞中生产虾青素，A错误； B、制备水稻胚乳悬浮细胞，对虾青素进行工厂化生产，需要使用液体培养基，B错误； C、胰蛋白酶是用于处理动物细胞的，植物细胞有细胞壁，应用纤维素酶和果胶酶来分离植物细胞，所以用胰蛋白酶分离胚乳细胞操作不合理，C错误； D、对分离纯化的虾青素进行活性鉴定，能够确定所生产的虾青素是否具有预期的抗氧化等药理活性，D正确。 故选D。 7．（2025·湖北武汉·三模）Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构。为筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，将编码Hv-Lv肽链的DNA片段与丝状噬菌体固有外壳蛋白pVIII的基因连接并一起表达，最后用固定化抗原筛选（过程如图）。下列叙述错误的是（    ） A．Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子 B．Hv-LvDNA片段上无需连接标记基因 C．收集不耐受冲洗的噬菌体获得目标肽链 D．实验过程须严格遵循生物防护措施 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别 与结合的位点 ，可用于驱动基因的转录，故Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子，A正确； B、Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构，而Hv-LvDNA可表达出Hv-Lv肽链，可通过是否与固定化抗原相结合进行筛选，无需连接标记基因，B正确； C、结合题意可知，该过程目的是筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，因此，需收集耐受冲洗的噬菌体的目标肽链，C错误； D、丝状噬菌体为病毒，实验过程须严格遵循生物防护措施，尽可能避免可能会带来的安全问题，D正确。 故选C。 8．（2025·江西南昌·三模）VEGF是一种可以促进血管生成的关键细胞因子，采用基因修饰的策略将具有血管发生作用的VEG基因与小鼠iPS细胞相结合（VEG基因转染），并使其产物具有VEGF的作用，实验结果如下图所示。下列说法错误的是（　　） 组别 不同时间的VEGF表达水平 3~4d 5~7d 7~14d 15~21d 空载体转染组 13.31±0.21 15.27±0.28 14.84±0.15 14.46±0.11 VECF基因转染组 66.25±0.32 120.35±0.55 118.99±0.4 119.06±0.3 A．iPS细胞是诱导多能干细胞的简称，可由成纤维细胞、T细胞诱导形成 B．VEG基因转入iPS细胞需要先构建基因表达载体，转化方法为显微注射法 C．VEGF是免疫活性物质，免疫活性物质由免疫细胞产生，可发挥免疫作用 D．由实验结果可知经VEG基因转染后的iPS细胞可持续稳定地表达VEGF 【答案】C 【分析】关于“细胞分化”： （1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态，结构和生理功能上发生稳定性差异的过程； （2）细胞分化的特点：普遍性、稳定性、不可逆性； （3）细胞分化的实质：基因的选择性表达； （4）细胞分化的意义：使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率 【详解】A、iPS细胞可由成纤维细胞和T细胞诱导分化形成，A正确； B、VEG基因转入iPS细胞需要先构建基因表达载体，这样目的基因才能正常表达，此外，导入动物细胞可以采用显微注射法，B正确； C、 根据题意，VEGF是一种可以促进血管生成的关键细胞因子，但其是由人工合成的，而免疫活性物资是由免疫细胞产生，可发挥免疫作用的物质，因此其不属于免疫活性物质，C错误； D、由实验结果可知，VECF基因转染组的VEGF表达水平随着实验时间的延迟而增长，因此，由实验结果可知经VEG基因转染后的iPS细胞可持续稳定地表达VEGF，D正确。 故选C。 9．（2025·河南·三模）某实验室为追踪蛋白A的细胞内定位，将编码蛋白A的基因与红色荧光蛋白（RFP）基因融合，构建融合基因A-RFP（如图所示），将其导入细胞后观察荧光分布情况。下列分析正确的是（    ） A．若细胞中出现红色荧光，则证明融合基因成功转录但未必翻译 B．构建A-RFP融合基因时，需要分别借助限制酶和DNA聚合酶完成剪切和拼接 C．构建A-RFP融合基因时，需要除去RFP基因中编码起始密码子的序列 D．蛋白A基因与RFP基因进行转录时均以a链作为模板 【答案】D 【分析】一个完整的基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】A、若细胞中出现红色荧光，则说明融合基因已翻译出含荧光蛋白的产物，A错误； B、构建A-RFP融合基因时，应使用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶，B错误； C、起始密码子也可编码氨基酸，所以RFP基因中编码起始密码子的序列应当保留，C错误； D、根据启动子和终止子的位置可知，融合基因的转录方向应该为从左向右，而子链延伸的方向是从5'到3'，故蛋白A基因与RFP基因进行转录时均以a链作为模板，D正确。 故选D。 10．（2025·天津·二模）生物技术与工程的发展催生了生物医药的生产。下列相关操作的叙述正确的是（    ） A．体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时，培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度 B．对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，因此需要对培养基进行消毒处理 C．将基因组文库中的胰岛素基因与大肠杆菌的DNA重组后可利用发酵工程生产胰岛素 D．将药用蛋白基因与腺病毒重组，然后侵染奶牛的乳腺细胞可得到乳腺生物反应器 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--PCR（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度，因为血浆中可能有其他的抗体，A正确； B、对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，需要对培养基进行湿热灭菌处理，B错误； C、从基因组文库中获得的胰岛素基因有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素，C错误； D、将药用蛋白基因和乳腺蛋白启动子等调控元件一起与腺病毒重组，导入受精卵中可制备乳腺生物反应器，不是导入乳腺细胞中，D错误。 故选A。 二、多选题 11．（2025·山东烟台·三模）科研人员构建了可表达 J - V5 融合蛋白的重组质粒并利用引物进行了 PCR 检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 V5 编码序列标签短肽 V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗 J 蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列说法错误的是（　　） A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点 B．为检测 J 基因是否插入图甲所示的位置，需用引物 F1和 R1进行PCR C．若 J 基因转录的模板链位于 b 链，则引物 F2与图甲中 b 链相应部分的序列相同 D．图乙中，条带 1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了 J - V5 融合蛋白 【答案】BC 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】A、作为基因表达载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确； B、据图甲可知，引物F1能与J基因左端序列配对，引物R2能与终止子序列配对，因此推测为检测J基因是否插入图甲所示的位置，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1，B错误； C、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA转录的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F2是左引物，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，C错误； D、据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白，D正确。 故选BC。 12．（2025·河北衡水·三模）dCas9蛋白能在向导RNA的作用下结合基因组DNA的特定位点，进而抑制基因表达。科研人员欲利用图中质粒调控小鼠细胞中M基因的表达，下列叙述错误的是（    ） A．使用EcoRⅠ对M基因和质粒进行切割，加入DNA连接酶后得到的都是重组质粒 B．dCas9蛋白在向导RNA的引导下与基因组DNA通过碱基互补配对方式而结合 C．在含潮霉素的培养基上存活的细胞是含有重组质粒、M基因表达量降低的受体细胞 D．可用含重组质粒的细胞为实验组、M基因正常表达的细胞为对照组探究M基因的功能 【答案】ABC 【分析】基因组编辑：使用该技术，需要向要进行编辑的细胞中加入以下组分：人工合成的短链RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA作为“向导”，它的部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA序列相结合；核酸酶Cas9也与短链RNA结合，然后切割与“向导”RNA结合的DNA，使DNA双链断裂；这种情况下，细胞内原有的负责修复DNA切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA。此时，如果向细胞中加入大量可用于修复的模板DNA(即大部分序列与被切割位点附近的序列相同，但个别位点被人工改变的DNA)细胞就会以这些片段为模板合成DNA。就这样，人类希望改变的碱基序列被引入基因组中，基因组的准确编辑由此实现。此外，如果想让某个基因失去功能，也可以利用基因组编辑来破坏目的基因。 【详解】A、使用EcoR Ⅰ对M基因和质粒进行切割，加入DNA连接酶后得到的可能是重组质粒、目的基因自连产物或质粒自连产物，A错误； B、dCas9是一种蛋白质，不能与基因组DNA进行碱基互补配对，B错误； C、在含潮霉素的培养基上存活的细胞可能是含有重组质粒或空质粒的受体细胞，C错误； D、含重组质粒的细胞中M基因的表达被抑制，可作为实验组，M基因正常表达的细胞为对照组，自变量为M基因是否正常表达，据此可探究M基因的功能，D正确。 故选ABC。 13．（2025·山东淄博·三模）研究人员将D-乳酸脱氢酶基因（D-LDH）及博来霉素抗性基因构建在质粒上，并导入毕赤酵母中表达，实现了以甲醇为原料，通过毕赤酵母的扩大繁殖、工厂化高效生产D-乳酸。下列说法正确的是（    ） A．构建D-LDH表达载体时需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．筛选高产D-乳酸毕赤酵母时，培养基应以甲醇为唯一碳源，同时添加博来霉素 C．甲醇和乳酸都可以抑制杂菌的生长，因此发酵罐中的液体培养基无需灭菌 D．为提高D-乳酸产量，在对发酵罐提供密封环境的同时，需优化发酵温度和pH 【答案】AB 【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。 【详解】A、构建基因表达载体时，需要用限制性内切核酸酶切割目的基因（D - LDH）和质粒，然后用 DNA 连接酶将它们连接起来，形成重组质粒，A正确； B、因为毕赤酵母能以甲醇为原料生产 D - 乳酸，且质粒上有博来霉素抗性基因，所以筛选高产 D - 乳酸毕赤酵母时，培养基应以甲醇为唯一碳源，同时添加博来霉素，只有成功导入重组质粒的毕赤酵母才能在该培养基上生存，B正确； C、虽然甲醇和乳酸可能对杂菌生长有一定抑制作用，但发酵罐中的液体培养基仍需灭菌，以防止杂菌的大量繁殖消耗营养物质，影响毕赤酵母的生长和 D - 乳酸的生产，C错误； D、毕赤酵母的扩大繁殖为有氧呼吸，因此应持续对发酵罐提供无菌空气，D错误。 故选AB。 14．（2025·湖南长沙·三模）图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述正确的是（    ） A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c B．构建表达载体时应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶 C．图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制得到所需目的基因的分子数为8个 D．只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 【答案】ABC 【分析】题图分析：构建表达载体时，不能选用限制酶BamHⅠ，否则会导致两种抗性基因都被破坏，因此应该选择Bc1 I和HindⅢ这两种限制酶，根据引物的延伸方向，所用的引物为图乙中引物a和引物c。 【详解】A、PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，根据引物的延伸方向，所用的引物为图乙中引物a和引物c，A正确； B、根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，同时为防止目的基因自身环化，因此只能选Bcl I和HindⅢ两种限制酶切割，B正确； C、图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制可得到16个DNA片段，其中所需目的基因的分子数为24-2×4=8个，C正确； D、由于选择Bcl I和HindⅢ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，培养基加氨苄青霉素含普通质粒的大肠杆菌能生存，而含重组质粒的不能生存，从而筛选出成功导入表达载体的受体细胞， D错误。 故选ABC。 15．（2025·山东·二模）Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA利用左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列说法错误的是（    ） A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其表达产物可将冠瘿碱分解 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 【答案】AD 【分析】农杆菌Ti质粒的基因被剪切后整合到植物的染色体上，因为其质粒上的细胞分裂素和生长素基因，诱发细胞异常生长和分裂，产生了过量的细胞分裂素和生长素，导致细胞过度增殖形成植物肿瘤。 【详解】A、Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，可以形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，A错误； B、Ti质粒上的T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，所以Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除，B正确； C、目的基因插入Ti质粒的T-DNA，可以随T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，C正确； D、Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。所以Vir基因不能替换成标记基因，D错误。 故选AD。 三、解答题 16．（2025·河北衡水·一模）甜叶菊中所含甜菊糖的甜度是蔗糖的300倍左右，下图为运用现代生物技术生产甜菊糖甙的流程图。回答下列问题： (1)植物组织培养进行①②过程培养基中的关键激素是 。 (2)某科研人员从苏云金杆菌中获取Bt毒蛋白基因，并将其导入甜叶菊叶肉细胞，培育出抗虫的甜叶菊，过程如下图。 ①通过PCR扩增Bt毒蛋白基因时，通常选择下列 组合作为引物对。 A．5'-ATCCGC-3'             B．5'-CTACTG-3'         C．5'-GCGGAT-3' D．5'-CAGTAG-3'          E.5'-GTCATC-3'         F.5'-ATGGCG-3' ②农杆菌侵染甜叶菊叶肉细胞时，可将Bt毒蛋白基因转移到叶肉细胞中的原因是 。 ③培养基A和培养基B分别添加的抗生素是 ，从筛选结果分析，含有Bt毒蛋白基因的菌落是 。 (3)农杆菌转化法可用于获取转基因植物，还可通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入位置随机，为确定T-DNA是否插入M基因，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成）。先用BP+LP或BP+RP进行PCR反应，若 （填“有”或“无”）目的片段，则确定该突变体为T-DNA插入。再用LP+RP进行PCR反应，若 （填“有”或“无”）目的片 段，则确定该突变体为纯合子。 【答案】(1)生长素和细胞分裂素 (2) B和C 农杆菌的 Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上 潮霉素、氨苄青霉素 2、4 (3) 有 无 【分析】植物组织培养技术是指在无菌和人工控制的环境条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实等）、组织（如形成层、花药组织等）、细胞（如体细胞、生殖细胞等）或原生质体，培养在人工配制的培养基上，使其生长、分裂、分化并最终发育成完整植株的技术。其核心原理是植物细胞的全能性，即已分化的细胞仍具有发育成完整植株的潜能。基因工程的基本步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）植物组织培养过程中，①是脱分化过程，②是再分化过程。在这两个过程中，培养基中的关键激素是生长素和细胞分裂素。生长素和细胞分裂素的浓度、比例等会影响外植体的脱分化和再分化过程，比如当生长素与细胞分裂素的比值较高时，有利于根的分化；比值较低时，有利于芽的分化。 （2）①在PCR扩增时，引物需要与模板链的3'端互补配对来引导子链的合成。观察Bt毒蛋白基因的两端序列，根据碱基互补配对原则，应选择与基因两端序列互补的引物。已知基因一端是5'-CTACTG-3'，其互补序列为5'-CAGTAG-3'（反向互补），另一端是5'-ATCCGC - 3'，其互补序列为5'-GCGGAT - 3'（反向互补），所以应选择B（5'-CTACTG-3'）和C（5'-GCGGAT-3' ）作为引物对。 ②农杆菌中的Ti质粒上有一段可转移的DNA，即T-DNA，当农杆菌侵染甜叶菊叶肉细胞时，由于Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，而Bt毒蛋白基因插入了Ti质粒的T-DNA中，所以可将Bt毒蛋白基因转移到叶肉细胞中。 ③观察质粒结构可知，质粒含有潮霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，而重组质粒中氨苄青霉素抗性基因被破坏。在筛选过程中，培养基A用于筛选导入了重组质粒的农杆菌，由于重组质粒含潮霉素抗性基因，所以培养基A应添加潮霉素；培养基B用于筛选含有完整重组质粒（即插入了Bt毒蛋白基因的质粒）的农杆菌，因为重组质粒中氨苄青霉素抗性基因被破坏，所以培养基B应添加氨苄青霉素。从筛选结果分析，能在培养基A上生长（含潮霉素抗性基因），但不能在培养基B上生长（氨苄青霉素抗性基因被破坏）的菌落含有Bt毒蛋白基因，即菌落2和4。 （3）通过农杆菌转化法使基因M沉默来获得mm突变体，由于T-DNA插入位置随机，所以需要用“三引物法”进行PCR扩增来确定插入情况。   LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物。并且已知T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成。如果T-DNA插入了M基因，那么用BP+LP或BP+RP进行PCR反应时，因为BP是T-DNA的特异引物，LP、RP是M基因的特异引物，所以会扩增出目的片段。对于纯合子突变体，两条染色体上的M基因都被T-DNA插入。由于T-DNA插入会阻止被插入基因两端引物（LP和RP）的扩增产物的形成，所以用LP+RP进行PCR反应时，不会有目的片段产生。 17．（2025·云南丽江·一模）脑心肌炎病毒（EMCV，RNA病毒）是引起人、猪脑炎和心肌炎的病原体。为研制疫苗，科研人员按下图流程培育转基因酵母菌，来生产BMCV的衣壳蛋白VP1。其中，受体酵母菌是组氨酸合成缺陷型，HIS4基因表达的酶催化组氨酸的合成，C418是一种抗生素。请回答下列问题： 限制酶 EcoRI NotI SalI 识别序列和切割位点 (1)过程①是通过RT-PCR获得目的基因，下列3种引物中，过程①应选择的是 。 a．5'-GGAATTCGCCACCATCCGAGTCAAACGCTGAA-3' b．5'-TCGTCGACCATCGATAGCCACTCGCCTAACGCC-3' c．5'-ATTTGCGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT-3' (2)PCR技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测DNA等。完成下列有关PCR技术和相关应用的问题： ①PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为 ，最终都会导致反应效率降低。退火温度过高则会因 导致目标产物的量减少。 ②不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50~1：100，在PCR反应的最初10~15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物 个。因为双链DNA和单链DNA的 不同，可通过 将其分离。 (3)过程③将质粒2导入大肠杆菌的目的是 。 (4)过程⑤将质粒2线性化时使用的是 （限制酶），过程⑥线性DNA需整合到酵母细胞的染色体DNA中目的基因才能 。 (5)研究人员用兔抗EMCV血清与酵母细胞生产的VP1蛋白进行抗原—抗体免疫反应试验，其目的是 。 【答案】(1)a、c (2) DNA双链不能充分解开，导致模板减少，最终都会导致反应效率降低 引物不能与模板充分配对 （211-2）a 相对分子质量（碱基数量）不同 电泳法 (3)让其在大肠杆菌中复制 (4) salⅠ 稳定遗传并表达 (5)筛选出目的基因多拷贝整合的酵母菌；检测酵母细胞生产的VP1与EMCV的VP1的抗原性（结构）是否一致 【分析】题图分析：①是通过RT-PCR获得目的基因，②是构建基因表达载体，③是将表达载体导入大肠杆菌细胞进行扩增，④是提取扩增了的表达载体，⑤是将质粒环状DNA切割形成线性DNA分子，⑥是将线性DNA分子导入酵母菌，使其整合至酵母菌的染色体DNA上，进行表达，⑦是筛选出的产VP1的酵母菌。 【详解】（1）RT-PCR过程以RNA为模板合成DNA，是逆转录过程，需要的工具酶有逆转录酶、热稳定性高的DNA聚合酶。a、b、c三个引物分别含EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ识别位点，SalⅠ会破坏质粒的启动子，所以过程②构成基因表达载体需要使用的是EcoRⅠ、NotⅠ，所以过程①选用引物a、c。 （2）①PCR过程中，温度的控制至关重要，若变性温度过低，则DNA双链不能充分解开，导致模板减少，最终都会导致反应效率降低；若退火温度过高，则会导致引物不能与模板充分配对（模板与引物结合效率低），导致目标产物的量减少。 ②不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50～1：100，在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，若只有一条模板链，则10次循环后，产生DNA数量为210，每条DNA为两条链，故10次循环后的数量为210+1，所用引物需减去模板链的数量，则a个模板DNA扩增个循环后限制性引物数量=（211-2）a个。由于双链DNA和单链DNA的相对分子质量（碱基数量）不同，故可用电泳法将其分离。 （3）过程③将质粒2导入大肠杆菌的目的是让其在大肠杆菌中复制，该过程需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。 （4）过程⑤将质粒2线性化时使用的是salⅠ，其在质粒上有2个酶切位点，可以将其切割成直链DNA，便于与酵母菌DNA整合；过程⑥线性DNA需整合到到酵母细胞的染色体DNA中目的基因才能稳定遗传并表达。 （5）研究人员用兔抗EMCV血清与酵母细胞生产的VP1蛋白进行抗原抗体免疫反应试验，其目的是检测酵母细胞生产的VP1与EMCV的VP1的抗原性（结构）是否一致。 18．（2025·辽宁盘锦·三模）临床上对人的血清白蛋白（HSA）需求量很大，科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取HSA。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为模板链。回答下列问题。 (1)PCR扩增HSA基因时，一次循环包括变性、 三步，其中消耗引物的一步是 。与水稻细胞内的相关酶相比，该技术用到的酶具有的特点是 。 (2)HSA基因两端没有限制酶BclⅠ、BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，据图分析，在利于提高HSA基因与Ti质粒之间的重组率的前提下，在PCR扩增HSA基因前，需要在设计的引物1的5'添加的碱基序列是5' -3'，引物2的5'添加的碱基序列是5'- -3'。 (3)图中②过程，需要用 处理农杆菌，以提高重组表达载体进入农杆菌的效率。 (4)经③过程处理的水稻愈伤组织细胞中，正常情况下HSA基因会插入 。为了检测HSA基因是否转化成功，应选择标记基因 的特性进行筛选。 【答案】(1) 复性（退火）、延伸 复性（退火） 耐高温 (2) GGATCC AAGCTT (3)钙离子 (4) 染色体DNA中 1 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）PCR扩增HSA基因时，一次循环包括变性、复性、延伸三步。其中复性这一步消耗引物，引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR技术用到的酶是耐高温的DNA聚合酶，与水稻细胞内的相关酶相比，该技术用到的酶具有的特点是耐高温。 （2）HSA基因两端没有限制酶BclⅠ、BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，要使目的基因插入到启动子和终止子之间且方向正确，需使用BamHI和HindⅢ两种酶，在PCR扩增HSA基因前，需在设计的引物1的5'端添加BamHI碱基序列5'-GGATCC-3'，引物2的5'端添加HindⅢ碱基序列5'-AAGCTT-3'。 （3）图中②过程将重组的质粒即目的基因导入农杆菌，需要用钙离子（CaCI2溶液）处理农杆菌，以提高重组表达载体进入农杆菌的效率。 （4）经③过程处理的水稻愈伤组织细胞中，HSA基因应插入水稻愈伤组织细胞的染色体DNA中，为了检测HSA基因是否转化成功，应选择标记基因1的特性进行筛选。标记基因1随T-DNA整合到染色体的DNA上了。 19．（2025·四川绵阳·三模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由α链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ也可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗 hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，图1为其制备的基本方案。请回答相关问题： （注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列） (1)图中 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的 。图示 hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其左右两端分别添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10 个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为 —CCTTTCAGCTCA—，同时考虑连接的方向性和引物的特异性，则设计该端对应引物的序列是 5′— —3′。 (2)阶段 Ⅱ 将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含 hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (3)为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物进行 PCR扩增，则最好选择图 2 中的引物 ，PCR反应体系中需加入模板、Taq DNA聚合酶、dNTP (4种脱氧核苷酸)、引物、Mg2 +、缓冲液等，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。 (4)图 1 阶段的 Ⅳ～Ⅴ过程，将处理后的酵母菌接种在不含 的培养基中培养，形成的酵母菌菌落即为目的菌株，将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用 法进行检测，若上清液中能检测到 hCGβ蛋白，则说明 hCGβ基因表达。 【答案】(1) 有利于 hCGβ 进入内质网加工 XhoⅠ、MumⅠ CTCGAGCCTTTCAGCT (2) CaCl₂ 氨苄青霉素 (3) P1 和 P6 条带迁移出凝胶 (4) 组氨酸和氨苄青霉素 抗原 — 抗体杂交 【分析】图1中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。 【详解】（1）甲序列能引导肽链进入内质网腔，所以 hCGβ 基因与甲序列构建融合基因，目的是让 hCGβ 进入内质网加工并分泌到细胞外。为防止目的基因与质粒自身环化及保证连接方向性选限制酶。Sma Ⅰ 会破坏目的基因，EcoR Ⅰ 会破坏质粒上氨苄青霉素抗性基因（标记基因），Sal Ⅰ 会破坏质粒上组氨酸合成酶基因，Xma Ⅰ 识别序列与 Sma Ⅰ 相似会破坏目的基因，所以选 Xho Ⅰ、Mum Ⅰ 。根据转录方向、质粒 AOX1 启动子位置确定①处插入 Xho Ⅰ 识别序列 CTCGAG ，得到①处碱基序列 5′ - CTCGAGCCTTTCAGCTCA - 3′ ，其互补链 3′ - GAGCTCGGAAAGTCGAGT - 5′ ，设计引物 5′ - CTCGAGCCTTTCAGCTCA - 3′ ，因引物 10 个核苷酸时特异性强、效率高，加上 Xho Ⅰ 识别序列共 16 个碱基，最终引物序列 5′ - CTCGAGCCTTTCAGCT - 3′ 。 （2）将环化质粒导入大肠杆菌，需先用 CaCl₂处理使其成为感受态细胞，便于吸收外源 DNA 。因线性质粒含氨苄青霉素基因，导入环化质粒的大肠杆菌有氨苄青霉素抗性，所以在含氨苄青霉素培养基中筛选含 hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌并扩增。 （3）融合基因包含目的基因和甲序列，设计引物要涵盖这两部分序列，所以 P1 和 P6 合适。PCR 反应体系包含模板、Taq DNA 聚合酶等成分。缓冲液中的溴酚蓝作电泳指示剂，防止条带迁移出凝胶。 （4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素。 hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，检测目的蛋白 hCGβ 是否表达，采用抗原 - 抗体杂交法，依据抗原与抗体特异性结合原理，若能检测到 hCGβ 蛋白，说明 hCGβ 基因表达。 20．（2025·河北沧州·三模）乳酸菌不耐酸而酿酒酵母耐酸能力强，研究人员获取乳酸菌的乳酸脱氢酶（LDH）基因并将其导入酿酒酵母，使酿酒酵母具备产乳酸能力。LDH基因片段和质粒的结构如图所示，回答下列问题： (1)在翻译时，原核生物偏好起始密码子GUG，真核生物偏好AUG。设计引物时，引物1的序列要包括 （填“GUG”或“AUG”）对应序列，目的是 。在引物1的 （填“3'”或“5'”）端加入限制酶BamHI的识别序列。 (2)PCR技术利用了DNA半保留复制原理，一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，其中复性的作用是 。若要扩增获得两条链等长的LDH基因片段，则至少需要循环 次。 (3)将重组质粒导入 型酵母细胞中，然后将受体酵母细胞涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。 【答案】(1) AUG 提高LDH基因在酿酒酵母中翻译的效率 5' (2) 使引物通过碱基互补配对与模板链结合 3 (3) URA3基因缺失 受体酵母细胞不能合成尿嘧啶，在无尿嘧啶的培养基上不能生长，导入重组质粒的受体酵母含有URA3基因，可以生长 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）要将LDH基因导入酿酒酵母细胞中，引物1的序列要包括AUG对应序列，以提高LDH基因在酿酒酵母中翻译的效率。在引物1的5′端有限制酶BamHI的识别序列，使LDH基因被酶切后能正确插入质粒。 （2）PCR循环中，复性的目的是使引物通过碱基互补配对与模板链结合。若要扩增获得两条链等长的LDH基因片段，则至少需要循环3次。 （3）将重组质粒导入URA3基因缺失型酵母细胞中，然后将受体酵母细胞涂布于无尿嘧啶的培养基上进行筛选。受体酵母细胞不能合成尿嘧啶，在无尿嘧啶的培养基上不能生长，导入重组质粒的受体酵母含有URA3基因，可以生长。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题12 基因工程 考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。 2025年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。 近年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。 必备知识速记：总结易错易混点。 名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。 命题解读 考向 考查统计 本部分的命题以非选择题为主，属于高考必考内容。题目内容多，难度往往较大，试题情境新颖，大多来自大学教材和最新的论文文献，核心素养侧重对科学思维和科学探究的考查。 考向一 基因工程的基本工具 2025·江苏·T19　2024·湖南·T5 2024·江西·T12 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7 考向二 基因工程的基本操作程序 2025·河南·T21　 2025·安徽·T15 2025·黑吉辽蒙·T25 2025·河北·T22 2025·山东·T25　 2024·甘肃·T21 2024·贵州·T21 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20　 考向三 基因工程的应用 2025·陕晋宁青·T21　 2025·四川·T19　 2025·云南·T21　 2025·甘肃·T21　 2025·安徽·T20 2025·湖南·T21 2025·广东·T21 2024·河北·T5 2022·河北·T24　2022·广东·T22　2022·全国乙·T38　2021·河北·T24 考向四 蛋白质工程的原理和应用 2022·湖南·T22　2021·辽宁·T14　2022·重庆·T3 考向五 DNA的粗提取与鉴定 2024·湖南·T5 2024·山东·T13 2023·广东·T11　2022·山东·T13　2021·山东·T13　 考向六 生物技术的安全性与伦理问题 2024·广东·T18 2023·浙江选考·T2　 2022·北京·T21 试题精讲 考向一 基因工程的基本工具 1．（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 考点解读 1．使用载体的目的 在基因工程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。 2．作为载体必需具备的条件 (1)有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。 (2)能够在受体细胞中保留下来，且载体DNA必须具备自我复制能力；或能够整合到受体DNA上，并随受体DNA同步复制。 (3)带有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选，常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 (4)对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动。 3．常用载体的种类及用途 种类 用途 质粒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 噬菌体 植物病毒 将外源基因导入植物细胞 动物病毒 将外源基因导入动物细胞 4．载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因，目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗生素抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示： 考向二 基因工程的基本操作程序 1．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 2．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 3．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 4．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 5．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。 考点解读 1．聚合酶链式反应(PCR) (1)PCR反应的过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 ①变性：当温度超过到90 ℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (2)PCR反应的结果 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，耐高温的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数式扩增。 2．生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成 过程 循环次数 受生物体自身控制 30多次 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 3．构建基因表达载体的过程 目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)(如图)。 4．目的基因导入不同受体细胞的过程 项目 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 5．目的基因的检测与鉴定的方法 类型 检测内容 方法 结果显示 分子水平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)或PCR等 是否成功 显示出杂交带 目的基因是否转录出mRNA 核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)或PCR等 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间) 个体生物 学水平 鉴定　 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗性的接种实验 是否赋予了 预期抗性或 蛋白质活性 基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性 考向三 基因工程的应用 1．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。 2．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是 （答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有 （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 3．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路 。 4．（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 (1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过 （方法）将该质粒转入植物细胞，并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加 。 (2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是 。 (3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证抗病性。 (4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。 5．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。 在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。 回答下列问题： (1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。 (2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。 (3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。 6．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。 (2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。 7．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 考点解读 1．转基因抗虫植物与转基因抗病植物的比较 项目 转基因抗虫植物 转基因抗病植物 方法 从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将其导入植物中 将抗病基因导入植物中 基因种类 Bt基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 ①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因 ②抗真菌基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因 成果 转基因抗虫棉、转基因抗虫水稻等 抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等 意义 减少化学农药的使用，降低生产成本，减轻环境污染，降低了对人体健康的损害 　 　2.关于转基因作物中目的基因的三点提醒 (1)目的基因都是来自其他生物的能表现出优良性状的外源基因，并不都是来自细菌、病毒等微生物，如抗冻蛋白基因来自鱼类。 (2)有的目的基因控制蛋白质的合成，直接控制生物的某种性状，这反映了基因与性状的直接关系。 (3)有的目的基因通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物的性状，这体现的是基因与性状的间接关系。 4．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别 项目 乳腺生物反应器 工程菌 含义 将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 基因结构 动物基因结构与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌的基因结构与人类的基因结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 考向一 基因工程的基本工具 1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 2.（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ） A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 3．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 4．（2021·湖北·高考真题）限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（    ） A．6 B．250 C．4000 D．24000 5.（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。    回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。    考向二 基因工程的基本操作程序 1．（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ） A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 2.（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。 (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。 (3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。 (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。 (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 3．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 4.（2022·湖南·高考真题）中国是传统的水稻种植大国，有一半以上人口以稻米为主食。在培育水稻优良品种的过程中，发现某野生型水稻叶片绿色由基因C控制。回答下列问题: (1)突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死。突变型1连续自交3代，F3成年植株中黄色叶植株占 。 (2)测序结果表明，突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5＇-GAGAG-3＇变为5＇-GACAG-3＇，导致第 位氨基酸突变为 ，从基因控制性状的角度解释突变体叶片变黄的机理 。（部分密码子及对应氨基酸:GAG谷氨酸;AGA精氨酸;GAC天冬氨酸;ACA苏氨酸;CAG谷氨酰胺） (3)由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳（电泳条带表示特定长度的DNA片段），其结果为图中 （填“I”“Ⅱ”或“Ⅲ”）。   (4)突变型2叶片为黄色，由基因C的另一突变基因C2所致。用突变型2与突变型1杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。能否确定C2是显性突变还是隐性突变? （填“能”或“否”），用文字说明理由 。 5．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： (1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 (2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。 (3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的 组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。 (4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。 (5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。 (6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可） 考向三 基因工程的应用 1.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可） 考向四 DNA的粗提取与鉴定 1.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 2．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 3．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 考向五 蛋白质工程的原理和应用 1．（2022·重庆·高考真题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过基因工程方法生产 2．（2021·辽宁·高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　　） A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境 3.（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。 考向六 DNA的粗提取与鉴定 1．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 2．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 考向七 生物技术的安全性与伦理问题 1.（2024·浙江·高考真题）关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（    ） A．试管动物的培育 B．转基因食品的生产 C．治疗性克隆的研究 D．生物武器的发展和生产 2.（2024·广东·高考真题）遗传性牙龈纤维瘤病（HGF）是一种罕见的口腔遗传病，严重影响咀嚼、语音、美观及心理健康。2022年，我国科学家对某一典型的HGF家系（如图）进行了研究，发现ZNF862基因突变导致HGF发生。 回答下列问题： (1)据图分析，HGF最可能的遗传方式是 。假设该致病基因的频率为p，根据最可能的遗传方式，Ⅳ2生育一个患病子代的概率为 （列出算式即可）。 (2)为探究ZNF862 基因的功能，以正常人牙龈成纤维细胞为材料设计实验，简要写出设计思路： 。为从个体水平验证ZNF862基因突变导致HGF，可制备携带该突变的转基因小鼠，然后比较 的差异。 (3)针对HGF这类遗传病，通过体细胞基因组编辑等技术可能达到治疗的目的。是否也可以通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传病？作出判断并说明理由 。 1．对基因工程概念的理解 基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 基本过程 剪切→拼接→导入→表达 原理 基因重组 结果 获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品 优点 克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传性状 2．与DNA有关的酶的比较 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 耐高温的 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 3．DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作材料。 (2)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (3)提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。 (4)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 4．DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同 项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液 DNA 溶解 析出 蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解 总结 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。当NaCl溶液的物质的量浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度的增加而逐渐降低；NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液的物质的量浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。②选择适当的盐溶液能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的 5．PCR过程中用到的重要仪器 (1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。 (3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。 6．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 (4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。 7．基因工程和蛋白质工程的基本思路 (1)基因工程遵循中心法则，即其基本思路为：DNA→mRNA→多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。因此基因工程基本上是生产出自然界已有的蛋白质。 (2)蛋白质工程是按照以下思路进行的：预期的蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变基因应有的碱基序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 8.蛋白质工程与基因工程的区别和联系 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 9．转基因生物的优缺点分析 优点 缺点 ①解决粮食短缺问题； ①可能产生新病毒或新过敏原； ②减少农药使用，减轻环境污染； ②可能产生抗除草剂的杂草； ③增加食物营养，提高附加值； ③可能使疾病的传播跨越物种障碍； ④增加食物种类，提升食物品质； ④可能会损害生物多样性； ⑤提高生产效率，带动相关产业发展 ⑤可能干扰生态系统的多样性 10．理性看待转基因技术的原因 (1)生物技术和其他科学技术一样具有两面性，是一把双刃剑，既能推动社会发展和技术进步，也可能带来灾难。 (2)社会的发展总是和技术的发展密切联系，从促进社会发展的角度看，必须不断发展生物技术，造福人类，同时要避免灾难的发生。 11．理性看待转基因技术 (1)认识到转基因技术的应用前景是非常广阔的，以基因工程为代表的一大批生物技术成果，进入人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用。 (2)正视转基因技术带来的安全性问题，切实认识到个别有害转基因生物的危害性，要趋利避害，而不能因噎废食。 (3)完善相应的法律法规，利用法制手段确保转基因生物的安全性。 (4)我国保证转基因生物安全性的监控和预防措施。 ①立法监控是保证转基因生物安全的有力措施。 ②多环节监控。转基因农作物研究、从实验室走向大田试验各阶段，以及产品商品化都有相应法规进行严格的监控，只有在每一阶段试验获得认可证书后，才可进入下一阶段。 12．生物武器的概念 生物战剂及施放它的武器、器材总称为生物武器。生物战剂是指在战争中使人、畜致病，毁坏农作物的微生物及毒素。 13．生物武器的特点 (1)传染性强：某些生物武器只需少数病原体侵入人体，就会引起发病，如几十个热杆菌侵入人体就能致病。某些病原体，如鼠疫杆菌等，有很强的传染性，在一定条件下能在人员之间传播，长期流行。 (2)传染面积广：生物战剂致病力强，气溶胶可随风飘散，在气象、地理条件适宜时，可造成大面积污染。 (3)不易被发现：生物战剂气溶胶无色无味，加之多在黄昏、夜间、拂晓、多雾时秘密施放，不易被人发现。 (4)有一定的潜伏期：生物战剂致病需经几小时至几天的时间，在这期间相关人员不会很快减弱工作能力。 (5)传播途径多：呼吸、饮食、皮肤接触、昆虫叮咬等。 14．生物武器的传播途径 (1)吸入：生物战剂污染空气，可以通过呼吸道吸入，感染致病。 (2)误食：食用被生物战剂污染的水、食物而得病(如霍乱、痢疾等疾病)。 (3)皮肤接触：生物战剂，如炭疽杆菌等，或带菌物品上的病毒可直接或间接经皮肤、黏膜、伤口进入人体。 (4)昆虫叮咬：人被带有生物战剂的昆虫叮咬后，会使血液被感染而致病。 一、单选题 1．（2025·山东青岛·三模）药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程技术，利用大肠杆菌来生产这种药物, 流程如下图，其中lacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色。下列说法正确的是（　　） 注：bp代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因。限制酶及识别序列：BamHⅠ：-G↓GATCC-，EcoRⅠ：-G↓AATTC-，Sau3AⅠ：-↓GATC-，SmaⅠ：-CCC↓GGG-，XmaⅠ：-C↓CCGGG-， A．根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于碱基互补配对原则，该方法得到的DNA片段序列是确定的 B．为将目的基因准确插入质粒中，最好选用BamH Ⅰ和Xma Ⅰ酶切割目的基因 C．利用含卡那霉素培养基进行筛选即可选出含重组质粒的受体菌 D．将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，利用琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为1960bp的条带 2．（2025·山东烟台·三模）双脱氧核苷酸测序法可测定DNA的碱基序列。dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种物质的统称，常在PCR中做原料。ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP 4种。在4组标准PCR反应体系中加入特定的ddNTP，ddNTP可取代相应的dNTP，终止DNA子链的延伸，反应后得到不同长度的DNA片段混合物，再进行凝胶电泳放射自显影测序。下图是利用该技术对某一单链DNA片段的测序电泳图谱。下列说法错误的是（　　） A．该PCR反应体系中可不加入ATP供能，Mg2+可激活相关酶的活性 B．4组反应体系中除加入dNTP作原料外，还应分别加入某一种双脱氧核苷三磷酸 C．加入ddCTP的反应体系中最多获得3条长短不同的子链 D．根据测序电泳图谱分析，待测DNA的碱基序列是3'-GACTGCCA -5' 3．（2025·河北衡水·三模）下列关于基因工程工具酶的叙述，正确的是（    ） A．大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 B．限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键 C．DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶 D．T4DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端 4．（2025·河北衡水·三模）科研人员依据下图对绿色荧光蛋白进行改造和设计，下列叙述错误的是（    ） A．绿色荧光蛋白是由基因控制合成的 B．图中的a和b分别指多肽链和mRNA C．蛋白质工程能够制造自然界中不存在的蛋白质 D．蛋白质工程的操作对象是蛋白质，不需要对基因进行操作 5．（2025·山东青岛·三模）在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（    ） A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接 B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中 C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点 D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达 6．（2025·山东青岛·三模）虾青素是虾体内的一种脂质，具有抗氧化等多种药理活性。研究人员将虾青素基因导入水稻中，获得转基因水稻，取转基因水稻外植体进行组培形成愈伤组织，制备水稻胚乳悬浮细胞，对虾青素进行工厂化生产。下列说法正确的是（    ） A．将虾青素基因与胚特异性启动子重组 B．在培养水稻胚乳细胞的固体培养基中添加蔗糖 C．悬浮培养前用胰蛋白酶分离胚乳细胞 D．工厂化生产的虾青素需要进行药理活性检测 7．（2025·湖北武汉·三模）Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构。为筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链，将编码Hv-Lv肽链的DNA片段与丝状噬菌体固有外壳蛋白pVIII的基因连接并一起表达，最后用固定化抗原筛选（过程如图）。下列叙述错误的是（    ） A．Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子 B．Hv-LvDNA片段上无需连接标记基因 C．收集不耐受冲洗的噬菌体获得目标肽链 D．实验过程须严格遵循生物防护措施 8．（2025·江西南昌·三模）VEGF是一种可以促进血管生成的关键细胞因子，采用基因修饰的策略将具有血管发生作用的VEG基因与小鼠iPS细胞相结合（VEG基因转染），并使其产物具有VEGF的作用，实验结果如下图所示。下列说法错误的是（　　） 组别 不同时间的VEGF表达水平 3~4d 5~7d 7~14d 15~21d 空载体转染组 13.31±0.21 15.27±0.28 14.84±0.15 14.46±0.11 VECF基因转染组 66.25±0.32 120.35±0.55 118.99±0.4 119.06±0.3 A．iPS细胞是诱导多能干细胞的简称，可由成纤维细胞、T细胞诱导形成 B．VEG基因转入iPS细胞需要先构建基因表达载体，转化方法为显微注射法 C．VEGF是免疫活性物质，免疫活性物质由免疫细胞产生，可发挥免疫作用 D．由实验结果可知经VEG基因转染后的iPS细胞可持续稳定地表达VEGF 9．（2025·河南·三模）某实验室为追踪蛋白A的细胞内定位，将编码蛋白A的基因与红色荧光蛋白（RFP）基因融合，构建融合基因A-RFP（如图所示），将其导入细胞后观察荧光分布情况。下列分析正确的是（    ） A．若细胞中出现红色荧光，则证明融合基因成功转录但未必翻译 B．构建A-RFP融合基因时，需要分别借助限制酶和DNA聚合酶完成剪切和拼接 C．构建A-RFP融合基因时，需要除去RFP基因中编码起始密码子的序列 D．蛋白A基因与RFP基因进行转录时均以a链作为模板 10．（2025·天津·二模）生物技术与工程的发展催生了生物医药的生产。下列相关操作的叙述正确的是（    ） A．体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时，培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度 B．对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，因此需要对培养基进行消毒处理 C．将基因组文库中的胰岛素基因与大肠杆菌的DNA重组后可利用发酵工程生产胰岛素 D．将药用蛋白基因与腺病毒重组，然后侵染奶牛的乳腺细胞可得到乳腺生物反应器 二、多选题 11．（2025·山东烟台·三模）科研人员构建了可表达 J - V5 融合蛋白的重组质粒并利用引物进行了 PCR 检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 V5 编码序列标签短肽 V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗 J 蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列说法错误的是（　　） A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点 B．为检测 J 基因是否插入图甲所示的位置，需用引物 F1和 R1进行PCR C．若 J 基因转录的模板链位于 b 链，则引物 F2与图甲中 b 链相应部分的序列相同 D．图乙中，条带 1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了 J - V5 融合蛋白 12．（2025·河北衡水·三模）dCas9蛋白能在向导RNA的作用下结合基因组DNA的特定位点，进而抑制基因表达。科研人员欲利用图中质粒调控小鼠细胞中M基因的表达，下列叙述错误的是（    ） A．使用EcoRⅠ对M基因和质粒进行切割，加入DNA连接酶后得到的都是重组质粒 B．dCas9蛋白在向导RNA的引导下与基因组DNA通过碱基互补配对方式而结合 C．在含潮霉素的培养基上存活的细胞是含有重组质粒、M基因表达量降低的受体细胞 D．可用含重组质粒的细胞为实验组、M基因正常表达的细胞为对照组探究M基因的功能 13．（2025·山东淄博·三模）研究人员将D-乳酸脱氢酶基因（D-LDH）及博来霉素抗性基因构建在质粒上，并导入毕赤酵母中表达，实现了以甲醇为原料，通过毕赤酵母的扩大繁殖、工厂化高效生产D-乳酸。下列说法正确的是（    ） A．构建D-LDH表达载体时需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．筛选高产D-乳酸毕赤酵母时，培养基应以甲醇为唯一碳源，同时添加博来霉素 C．甲醇和乳酸都可以抑制杂菌的生长，因此发酵罐中的液体培养基无需灭菌 D．为提高D-乳酸产量，在对发酵罐提供密封环境的同时，需优化发酵温度和pH 14．（2025·湖南长沙·三模）图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述正确的是（    ） A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c B．构建表达载体时应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶 C．图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制得到所需目的基因的分子数为8个 D．只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 15．（2025·山东·二模）Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA利用左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，形成瘤状组织（冠瘿），冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。下列说法错误的是（    ） A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其表达产物可将冠瘿碱分解 B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除 C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，且不能破坏左右边界序列 D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选 三、解答题 16．（2025·河北衡水·一模）甜叶菊中所含甜菊糖的甜度是蔗糖的300倍左右，下图为运用现代生物技术生产甜菊糖甙的流程图。回答下列问题： (1)植物组织培养进行①②过程培养基中的关键激素是 。 (2)某科研人员从苏云金杆菌中获取Bt毒蛋白基因，并将其导入甜叶菊叶肉细胞，培育出抗虫的甜叶菊，过程如下图。 ①通过PCR扩增Bt毒蛋白基因时，通常选择下列 组合作为引物对。 A．5'-ATCCGC-3'             B．5'-CTACTG-3'         C．5'-GCGGAT-3' D．5'-CAGTAG-3'          E.5'-GTCATC-3'         F.5'-ATGGCG-3' ②农杆菌侵染甜叶菊叶肉细胞时，可将Bt毒蛋白基因转移到叶肉细胞中的原因是 。 ③培养基A和培养基B分别添加的抗生素是 ，从筛选结果分析，含有Bt毒蛋白基因的菌落是 。 (3)农杆菌转化法可用于获取转基因植物，还可通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入位置随机，为确定T-DNA是否插入M基因，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成）。先用BP+LP或BP+RP进行PCR反应，若 （填“有”或“无”）目的片段，则确定该突变体为T-DNA插入。再用LP+RP进行PCR反应，若 （填“有”或“无”）目的片 段，则确定该突变体为纯合子。 17．（2025·云南丽江·一模）脑心肌炎病毒（EMCV，RNA病毒）是引起人、猪脑炎和心肌炎的病原体。为研制疫苗，科研人员按下图流程培育转基因酵母菌，来生产BMCV的衣壳蛋白VP1。其中，受体酵母菌是组氨酸合成缺陷型，HIS4基因表达的酶催化组氨酸的合成，C418是一种抗生素。请回答下列问题： 限制酶 EcoRI NotI SalI 识别序列和切割位点 (1)过程①是通过RT-PCR获得目的基因，下列3种引物中，过程①应选择的是 。 a．5'-GGAATTCGCCACCATCCGAGTCAAACGCTGAA-3' b．5'-TCGTCGACCATCGATAGCCACTCGCCTAACGCC-3' c．5'-ATTTGCGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT-3' (2)PCR技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测DNA等。完成下列有关PCR技术和相关应用的问题： ①PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为 ，最终都会导致反应效率降低。退火温度过高则会因 导致目标产物的量减少。 ②不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50~1：100，在PCR反应的最初10~15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA，最初10个循环扩增产生双链DNA，后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物 个。因为双链DNA和单链DNA的 不同，可通过 将其分离。 (3)过程③将质粒2导入大肠杆菌的目的是 。 (4)过程⑤将质粒2线性化时使用的是 （限制酶），过程⑥线性DNA需整合到酵母细胞的染色体DNA中目的基因才能 。 (5)研究人员用兔抗EMCV血清与酵母细胞生产的VP1蛋白进行抗原—抗体免疫反应试验，其目的是 。 18．（2025·辽宁盘锦·三模）临床上对人的血清白蛋白（HSA）需求量很大，科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取HSA。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为模板链。回答下列问题。 (1)PCR扩增HSA基因时，一次循环包括变性、 三步，其中消耗引物的一步是 。与水稻细胞内的相关酶相比，该技术用到的酶具有的特点是 。 (2)HSA基因两端没有限制酶BclⅠ、BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，据图分析，在利于提高HSA基因与Ti质粒之间的重组率的前提下，在PCR扩增HSA基因前，需要在设计的引物1的5'添加的碱基序列是5' -3'，引物2的5'添加的碱基序列是5'- -3'。 (3)图中②过程，需要用 处理农杆菌，以提高重组表达载体进入农杆菌的效率。 (4)经③过程处理的水稻愈伤组织细胞中，正常情况下HSA基因会插入 。为了检测HSA基因是否转化成功，应选择标记基因 的特性进行筛选。 19．（2025·四川绵阳·三模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由α链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ也可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗 hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，图1为其制备的基本方案。请回答相关问题： （注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列） (1)图中 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的 。图示 hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其左右两端分别添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10 个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为 —CCTTTCAGCTCA—，同时考虑连接的方向性和引物的特异性，则设计该端对应引物的序列是 5′— —3′。 (2)阶段 Ⅱ 将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含 hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (3)为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物进行 PCR扩增，则最好选择图 2 中的引物 ，PCR反应体系中需加入模板、Taq DNA聚合酶、dNTP (4种脱氧核苷酸)、引物、Mg2 +、缓冲液等，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。 (4)图 1 阶段的 Ⅳ～Ⅴ过程，将处理后的酵母菌接种在不含 的培养基中培养，形成的酵母菌菌落即为目的菌株，将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用 法进行检测，若上清液中能检测到 hCGβ蛋白，则说明 hCGβ基因表达。 20．（2025·河北沧州·三模）乳酸菌不耐酸而酿酒酵母耐酸能力强，研究人员获取乳酸菌的乳酸脱氢酶（LDH）基因并将其导入酿酒酵母，使酿酒酵母具备产乳酸能力。LDH基因片段和质粒的结构如图所示，回答下列问题： (1)在翻译时，原核生物偏好起始密码子GUG，真核生物偏好AUG。设计引物时，引物1的序列要包括 （填“GUG”或“AUG”）对应序列，目的是 。在引物1的 （填“3'”或“5'”）端加入限制酶BamHI的识别序列。 (2)PCR技术利用了DNA半保留复制原理，一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，其中复性的作用是 。若要扩增获得两条链等长的LDH基因片段，则至少需要循环 次。 (3)将重组质粒导入 型酵母细胞中，然后将受体酵母细胞涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$