选必3 第11单元 第3讲 第二课时 锁定热点题型，强化迁移应用（课件）-【新高考方案】2025版高考生物一轮总复习（江苏专版）

锁定热点题型，强化迁移应用 第二课时 限制酶的选取是基因工程操作的重点也是难点，近年来与基因工程相关的较难的高考试题大都围绕限制酶的选取进行考查。PCR技术既可以用于获取目的基因，又可以用于目的基因的检测与鉴定，是基因工程中重要技术之一，在生产、医学领域得到了广泛的应用(如核酸检测)，因此也是近年高考的热点。 内容索引 题型(一) 题型(二) 基因工程操作中限制酶的选择方法 PCR技术中引物的相关问题 课时跟踪检测 题型(一)　基因工程操作中限制酶的选择方法 [典例导析] [例1]　(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　 ) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 √ [解析]　若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因不受影响，在含Tet培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； DNA凝胶电泳技术可分离大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp的培养基中能形成菌落，不能在含Tet的培养基中形成菌落，D错误。 [例2]　(2022·福建高考，节选)美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，基因工程抗原的制备： (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3′-OH与加入的脱氧核苷酸的5′-P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是____(填“ 5′→3′”或“ 3′→5′”)。 (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是_______________________。 [解析]　(1)PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3′-OH与加入的脱氧核苷酸的5′-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5′→3′。(2)可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)。 [答案]　(1)5′→3′　(2)正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) [思维建模] 1．根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类 (1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 2．根据质粒的特点确定限制酶的种类 3．根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： [应用体验] 1．(2024·扬州检测)下图是三种限制酶的识别序列及其切割位点，下列叙述正确的是(　 ) A.Sau3AⅠ的识别序列在DNA中出现的概率比另外两种酶的识别序列出现的概率大 B．限制酶催化的是水解反应，每使用一次，断开1个磷酸二酯键 C．将BamHⅠ酶切的末端与BclⅠ酶切的末端连接，连接部位的6个碱基对只有1种类型 D．将BamHⅠ酶切的末端与BclⅠ酶切的末端连接，连接部位的6个碱基对依然能被这两种限制酶切割 √ 2．(2024·南通检测)动物乳腺组织具有较强的合成蛋白的功能，如能利用转基因技术将外源基因转入动物体内，就有可能生产出大量的药用蛋白。图甲是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线，图乙是用于构建基因表达载体的质粒和目的基因示意图，箭头表示相关限制酶的酶切位点。图丙列出了几种限制酶识别序列及其切割位点。请回答下列问题： (1)如果将图乙中的质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性___________，原因是________________。 (2)图中将人乳铁蛋白基因插入质粒，如果使用单酶切法，应该选用________同时酶切质粒和人乳铁蛋白基因；如果使用双酶切法，应该使用________________两种限制酶同时酶切质粒和人乳铁蛋白基因，双酶切法的优点有_____________________________________。 (3)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了__________________________________________。 (4)如果使人乳铁蛋白基因在大肠杆菌中进行表达，表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具备生物活性，这是因为__________________________。构建乳腺生物反应器来表达外源蛋白，其优点是______________________________________。 (5)图甲过程①可采用的操作方法是________。该雌性转基因牛与普通雄性个体交配所产的雌性后代不一定能分泌含人乳铁蛋白的乳汁，原因是______________________________________________________ ________________________________________________________ _______________________________________________________。 解析：(1)质粒是环状DNA分子，其热稳定性与含有的氢键数目有关，由于G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成两个氢键，由图丙可以看出，SmaⅠ识别序列中只含G—C碱基对，所以插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。(2)将人乳铁蛋白基因插入质粒，首先确保目的基因的完整性，所以首先排除SmaⅠ，由图乙可以看出，若使用单酶切法，应该使用EcoRⅠ同时酶切质粒和人乳铁蛋白基因， 从而使质粒和目的基因两端的黏性末端相同；当使用双酶切法时，由图乙可以看出，应使用BamHⅠ和HindⅢ，这样质粒和目的基因两端所产生的黏性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会发生质粒和目的基因自身环化，保证目的基因正向接入质粒中。(3)获取重组质粒，需要将切割后的质粒与目的基因片段用DNA连接酶进行连接。质粒中的抗生素抗性基因常用作标记基因，其作用是为了便于重组DNA分子的筛选。 (4)蛋白质的翻译后修饰通常需要内质网和高尔基体的参与，而受体细胞大肠杆菌中没有内质网和高尔基体，所以无法完成修饰过程，而使人乳铁蛋白不具有生物活性。构建乳腺生物反应器来表达外源蛋白，优点是可以使产物具有较高的生物活性、表达量高、提取方便等。(5)若动物细胞是目的基因的受体细胞，通常采用显微注射将目的基因导入受体细胞。该雌性转基因牛与普通雄性个体交配所产的雌性后代不一定能分泌含人乳铁蛋白的乳汁的原因是该雌性转基因牛产生卵细胞的过程需要经过减数分裂，存在同源染色体的分离，所以所产生的卵细胞中可能含人乳铁蛋白基因，也可能不含。 答案：(1)越高　G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成两个氢键，所以插入的SmaⅠ酶切位点越多，热稳定性就越高　 (2)EcoRⅠ　BamHⅠ和HindⅢ　防止质粒和目的基因的自身环化、保证目的基因正向接入质粒中　(3)DNA连接　(便于重组DNA分子)筛选　(4)大肠杆菌中没有内质网和高尔基体　产物具有较高的生物活性、表达量高、方便提取　(5)显微注射　该雌性转基因牛通过减数分裂产生的卵细胞中可能含人乳铁蛋白基因，也可能不含 题型(二)　PCR技术中引物的相关问题 [典例导析] [例1]　(2023·天津高考，节选)基因工程：制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是________(填“细胞内”和“细胞外”) (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A—B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物________对目的基因进行PCR。 [解析]　(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。(2)根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，而酵母菌体内DNA有许多A—B序列位点，因此需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 [答案]　(1)细胞外　(2)P1和P6 [例2]　(2023·山东高考)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有__________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 [解析]　(1)与启动子结合的酶是RNA聚合酶，质粒中除含有启动子和终止子外，还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。(2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b链是模板链，而根据图甲中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′。 由于DNA复制的方向是子链的5′→3′，所以引物的延伸方向为5′→3′，引物结合的单链其方向是3′→5′，故与引物F1配对的单链是b链，与引物F1相应的部分序列相同的是a链。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检测出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 [答案]　(1)RNA聚合酶　限制酶切割位点、标记基因、复制原点等　(2)F1和R2(或F2和R1)　a链　(3)J-V5融合蛋白　不是 [思维建模] 1．与引物相关的问题归纳概括 (1)PCR技术需要引物的原因 DNA聚合酶不能单独从头开始合成DNA，只能从一段DNA序列的3′端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (2)PCR扩增中需要引物数目的计算规律 若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗引物数为2n＋1－2个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 2．PCR中使用的引物应具备的特点 (1)引物能与DNA模板的碱基进行互补配对。 (2)2种引物之间不能有互补的碱基序列，避免引物形成双链，导致扩增失败。 (3)某一引物不能存在局部碱基序列互补配对，避免自身出现折叠配对，无法和模板DNA结合。 (4)多数情况需要在2种引物的5′端添加不同限制酶识别的碱基序列，扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。 (5)引物不能太短，以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。 [应用体验] 1．(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　 ) A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 √ 解析：由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因均能正常表达出相关蛋白质，即Gata3基因的启动子可以控制GFP基因表达，A错误；由于启动子在左侧，目的基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； 利用引物1和引物2进行PCR扩增，大片段包含GFP基因编码区和非编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，只有非编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 2．(2024·常州检测)Cre/loxP重组酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定序列进行定点切割和重新连接。请回答下列问题： (1)图1是利用Cre/loxP重组酶系统敲除基因的过程。loxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成，其中决定方向的序列是________。图1中一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列，Cre酶能识别并结合到loxP序列的反向重复序列区，定点切断间隔序列的________________，从而实现目标基因的敲除，敲除的基因片段会形成________(填“线状”或“环状”)结构。若经Cre酶作用使得2个loxP位点间的序列发生反转，其原因可能是___________________________________________________。 (2)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因________(填“上游”或“下游”)插入一个带有loxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因________(填“表达”或“不表达”)。 (3)图2是利用Cre/loxP重组酶系统构建融合基因的过程。首先分别扩增Bt基因和Bar基因，以获得所需要的DNA片段，然后用Cre/loxP重组酶系统处理连接后的DNA片段，获得Bt-Bar融合基因片段。PCR1过程中，所用的2种引物的结合位置分别在____________________________；该过程中，还需添加的物质有__________________________________________(至少写2种)等。 解析：(1)loxP序列两侧的反向重复序列碱基排列顺序一致，无法确定方向，则能决定方向的是中间的间隔序列。碱基序列之间通过磷酸二酯键连接。由于敲除的基因片段会露出互补的黏性末端，则敲除的基因片段两端碱基互补配对成环状结构。如果两个loxP位点位于同一条DNA上且方向相反，Cre酶会使loxP间的序列反转。(2)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因上游插入带有loxP位点的编码终止密码子的序列，Cre酶会对loxP位点进行切割，终止密码子不发挥作用，所以目的基因表达。 (3)启动子可启动转录，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，因为要获得Bt-Bar融合基因片段，即需要Bt带上启动子(不需要终止子)、Bar带上终止子(不需要启动子)，因此在PCR1过程中，所用的2种引物的结合位置分别在启动子外侧和终止子内侧。PCR过程中除了添加引物外，还需要添加Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋的)的PCR缓冲液等。 答案：(1)间隔序列　磷酸二酯键　环状　两个loxP序列方向相反　(2)上游　表达　(3)启动子外侧和终止子内侧(启动子和终止子的左侧)　Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋的)PCR缓冲液 课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 一、选择题 1．(2024·淮阴中学检测)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(　 ) 6 7 8 A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端 D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接 1 2 3 4 5 √ 6 7 8 解析：限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有两个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平末端，形成2个游离的5′末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相同，但由于识别的位点不同，切割形成的末端不同，故不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。 1 2 3 4 5 1 5 6 7 8 2．(2024·南京金陵中学检测)下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是(　 ) A．用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个 B．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 C. 序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接 D．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒 2 3 4 1 5 6 7 8 解析：用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，又因DNA为双链结构，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和GATC—，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 3．(2024·常州检测)琼脂糖凝胶电泳常用于基因工程中不同DNA片段的检测，研究人员用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子，得到图2所示图谱，其中1号泳道是标准DNA样品，2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果；图1为EcoRⅠ切割该DNA分子后的结果。下列说法错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 A．EcoRⅠ的识别序列为GAATTC，切割位点在G和A 之间 B．该DNA分子最可能是含1 000碱基对的环状DNA C．据图2可知，该DNA分子中EcoRⅠ和SmaⅠ的酶切位点各有一个 D．EcoRⅠ和SmaⅠ共同处理后，形成2个游离的磷酸基团 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 解析：由图1可知，EcoRⅠ的识别序列为GAATTC，切割位点在G和A 之间，A正确；由图2分析可知，该DNA分子最可能是含1 000个碱基对的环状DNA，两种限制酶的酶切位点各有一个，B、C正确；图2中4号是EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶共同处理后的电泳结果，显示800 bp和200 bp两个条带，每个DNA分子有2个游离的磷酸基团，故共有4个游离的磷酸基团，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 4．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 A．引物A、B的碱基不能进行互补配对 B．复性的目的是让引物与单链DNA相结合 C．延伸时，DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸 D．第二轮循环后，同时含有引物A、B的DNA占100% 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 解析：如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；延伸时，在DNA聚合酶的作用下，将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，C正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成22＝4个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为50%，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 5．[多选](2024·徐州第一中学测评)在基因工程中，已知限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ的识别序列和切点分别是 。根据图示判断，下列操作错误的是(　 ) 1 5 6 7 8 A．质粒和目的基因都用限制酶Ⅱ切割 B．用限制酶切割获得目的基因时，需要消耗4个水分子 C．限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同 D．质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞 2 3 4 √ √ 1 5 6 7 8 解析：据题图可知，目的基因的左端是限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因右端是限制酶Ⅱ的识别序列，用限制酶Ⅱ切割能将目的基因切割下来；质粒有GeneⅠ和GeneⅡ两种标记基因，分别含有限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneⅠ和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则只破坏GeneⅡ，保留GeneⅠ，且其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，故质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割，A错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 用限制酶切割获得目的基因时，会切开两条DNA分子链，断裂四个磷酸二酯键，需要消耗4个水分子，B正确。限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同，都是—CTAG，C正确。质粒中的标记基因的作用是用来筛选含有目的基因的受体细胞，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 6．[多选](2024·常州检测)下图是通过基因工程获得转基因生物或产品的流程图，下列说法错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 A．若利用图示流程构建工程菌批量生产胰岛素，应先从垂体细胞中获取总RNA B．PCR扩增目的基因时，可在特异性引物3′端添加NcoⅠ和NheⅠ的切割位点 C．制备能分泌人胰岛素的工程菌时，酵母菌比大肠杆菌更适合作为受体细胞 D．图中m为启动子，n为终止子，m是解旋酶的识别和结合的位点 2 3 4 √ √ √ 1 5 6 7 8 解析：若利用图示流程构建工程菌批量生产胰岛素，应先从胰岛B细胞中获取总RNA，A错误；PCR扩增目的基因时，可在特异性引物5′端添加NcoⅠ和NheⅠ的切割位点，这样可以保证构建的限制酶切割位点位于目的基因的两端，B错误；制备能分泌人胰岛素的工程菌时，酵母菌比大肠杆菌更适合作为受体细胞，这是因为酵母菌细胞中含有内质网和高尔基体，能对合成的胰岛素进行加工，C正确；图中m为启动子，n为终止子，m是RNA聚合酶的识别和结合的位点，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 二、非选择题 7．烟草细胞合成的尼古丁是农业生产中比较理想的杀虫剂。研究人员在烟草细胞中发现PMT基因，欲将外源PMT基因导入烟草细胞，来研究其表达与尼古丁合成量之间的关系。据图请回答下列问题： (1)获取PMT基因的常用方法是提取烟草细胞的总RNA，通过________获得cDNA，一般通过________________来鉴定PCR产物。 2 3 4 1 5 6 7 8 (2)在构建基因表达载体时，应选择______________限制酶，这样选择的理由是____________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 (3)通过________法转化烟草细胞后，可以使用含____________的选择培养基筛选出含有目的基因T-DNA的烟草细胞。 (4)获得转基因烟草细胞后，通过植物组织培养获得转基因烟草植株，请写出能够证明“PMT基因表达量升高可使得烟草根系细胞中尼古丁合成量提高”的实验结果。__________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 解析：(1)提取烟草细胞的总RNA，通过逆转录的方法获得cDNA；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(2)NcoⅠ在目的基因(PMT)两侧均有切割位点，为避免质粒和目的基因自身环化又可以避免质粒与目的基因反向连接，在构建基因表达载体时，应选择限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ。(3)通过农杆菌转化法将目的基因转入烟草细胞后，可以使用含潮霉素的选择培养基筛选出含有目的基因T-DNA的烟草细胞。 2 3 4 1 5 6 7 8 (4)与普通烟草根系细胞相比，导入了外源PMT基因的烟草根系细胞分泌的尼古丁量增加，可说明PMT基因表达量升高可使得烟草根系细胞中尼古丁合成量提高。 答案：(1)逆转录　琼脂糖凝胶电泳　(2)BamHⅠ和EcoRⅠ　既可以避免质粒和目的基因自身环化又可以避免质粒与目的基因反向连接　(3)农杆菌转化　潮霉素　(4)与普通烟草根系细胞相比，导入了外源PMT基因的烟草细胞根系分泌的尼古丁量增加 2 3 4 1 5 6 7 8 8．巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图1所示。请回答下列问题。 2 3 4 1 5 6 7 8 (1)巢式PCR反应体系中需加入模板、__________________、____________、引物、Mg2＋、缓冲液等。 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 (2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是________。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行，可防止________在第一阶段PCR中与模板结合。 (3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会_________(填“上升”或“下降”)，不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性______(填“高”或“低”)。 1 5 6 7 8 2 3 4 (4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义，科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSNIS1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。请完成下表相关内容。 1 5 6 7 8 2 3 4 实验目的 方法步骤要点 囊胚样品DNA提取 选取________细胞提取DNA PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSNIS1基因序列设计合成4对引物 PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸 鉴定分析 __________________________________ 同期发情处理 对受体奶牛注射激素 胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内 1 5 6 7 8 2 3 4 (5)巢式PCR产物鉴定结果如图2所示，1～5号为 取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是 ________________。 奶牛胚胎性别的鉴定下列方法也可行的是__________(填序号)。 ①染色体核型分析法　②核酸探针杂交法　③差速离心法　④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上) 1 5 6 7 8 2 3 4 解析：(1)PCR反应体系需要缓冲液、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2＋等成分。(2)PCR过程包括高温变性、低温退火(复性)、中温延伸，故巢式PCR过程中反应温度最低的一步是退火(复性)。巢式PCR两个阶段反应不在同一离心管进行的主要原因是防止内引物(巢氏引物)在第一阶段PCR中与模板结合。 1 5 6 7 8 2 3 4 (3)巢式PCR第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更高。若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会上升，不易得到目标产物。(4)表格完善见答案。 1 5 6 7 8 2 3 4 (5)利用巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSNIS1)，并进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条条带，而雄性有两条条带，因此1、2、4是雌性胚胎，符合要求。X、Y染色体形态不同，因此可以利用染色体核型分析法进行性别鉴定，①可行；将Y染色体上雄性决定基因(SRY)制成探针，通过核酸探针杂交法可以鉴定性别，②可行；差速离心法是分离各种细胞器的方法，不能进行性别鉴定，③不可行；抗HY血清免疫学法利用了Y染色体上的特异基因，也可以进行性别鉴定，④可行。 1 5 6 7 8 2 3 4 答案：(1)Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)　dNTP(或4种脱氧核苷酸)　(2)退火(复性)　内引物(或巢氏引物)　(3)上升　高　(4)滋养层　采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别　(5)1号、2号、4号　①②④ 解析：BamHⅠ和BclⅠ识别的序列中包含Sau3AⅠ识别的序列，故Sau3AⅠ的识别序列在DNA中出现的概率比另外两种酶的识别序列出现的概率大，A正确；限制酶催化的是水解反应，每使用一次，断开2个磷酸二酯键，B错误；将BamHⅠ酶切的末端与BclⅠ酶切的末端连接，产生的DNA片段为或，共2种类型，BamHⅠ酶和BclⅠ酶都无法识别并切割，C、D错误。 $$