2025届高三生物二轮复习课件基因工程步骤

大单元八 生物技术与工程 ——基因工程 【知识回顾】 【资料】 2019年底，新冠病毒在武汉被首次 发现。2020年，疫情迅速蔓延至全球， 成为世界性大流行疾病。科学家发现 病毒表面S刺突蛋白可以作为疫苗的 抗原，使人体获得相应的免疫能力。 如何利用基因工程技术生产大量的S蛋白？ 通过哪些途径获取S蛋白的相关基因？ 一、目的基因的筛选和获取 建立基因组文库 建立cDNA文库 序列未知 序列已知 获取目 的基因 化学合成 PCR扩增 依据基因工程生产S蛋白 用 切割 与载体，再用 连接，形成重组DNA分子。 二、基因表达载体的构建 限制性内切核酸酶 S蛋白基因 DNA连接酶 【任务一】选择合适的限制酶 S蛋白基因 依据基因工程生产S蛋白 【归纳拓展】 1.限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶； ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) 二、基因表达载体的构建 依据基因工程生产S蛋白 绘制产S蛋白的大肠杆菌流程图； 绘制产S蛋白的烟草流程图； 绘制产S蛋白的动物细胞流程图。 【任务二】按照基因工程步骤，选择性合适的词条，绘制产S蛋白的流程图 质粒、S蛋白基因、重组质粒、中国仓鼠卵巢细胞、Ti质粒（含T-DNA）、动物细胞培养、重组Ti质粒、农杆菌、脱分化、愈伤组织、再分化、烟草细胞、CaCl2、大肠杆菌、S蛋白前体、S蛋白、烟草植株 依据基因工程生产S蛋白 绘制产S蛋白的大肠杆菌流程图 CaCl2 处理 质粒 胰岛素基因 重组质粒 大肠杆菌 S蛋白前体 思考2.为什么通过大肠杆菌生产的S蛋白的生物活性较低？ 大肠杆菌中没有内质网、高尔基体，无法对S蛋白进一步加工修饰。 思考1.使用CaCl2处理大肠杆菌的目的是什么？ 使大肠杆菌处于易于吸收周围DNA分子的生理状态。 依据基因工程生产S蛋白 重组Ti质粒 S蛋白基因 Ti质粒（含T-DNA） 农杆菌 烟草细胞 CaCl2 侵染 愈伤组织 脱分化 再分化 烟草植株 S蛋白 绘制产S蛋白的烟草流程图 依据基因工程生产S蛋白 绘制产S蛋白的动物细胞流程图。 思考：动物细胞培养需要提供哪些条件？ ①营养物质： ②适宜的生长环境 细胞生存的营养物质，还要添加一些天然成分，如动物血清等 无菌、无毒环境；适宜的温度和PH、渗透压；95%的空气和5%CO2气体环境。 中国仓鼠卵巢细胞 S蛋白基因 质粒 重组质粒 动物细胞培养 S蛋白 显微注射 依据基因工程生产S蛋白 四、目的基因的检测与鉴定 依据基因工程生产S蛋白 四、目的基因的检测与鉴定 如何对S蛋白的各个水平进行检测与鉴定 PCR技术检测S蛋白基因是否导入 PCR技术检测S蛋白基因是否转录出mRNA 设计引物 PCR扩增S蛋白基因 琼脂糖凝胶电泳 观察条带有无及大小判断 提取S蛋白基因 依据基因工程生产S蛋白 逆转录得到cDNA 设计引物 PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳 观察条带有无及大小判断 提取S蛋白的mRNA 四、目的基因的检测与鉴定 如何对S蛋白的各个水平进行检测与鉴定 抗原-抗体杂交技术检测S蛋白是否成功表达 在S蛋白特异性抗体酶标板中加入待测的S蛋白样品，如果出现阳性，则S蛋白成功表达。 动物模拟实验检测S蛋白是否具有抗原效应 将提取的S蛋白注射到实验动物体内，培养一段时间后，检测实验动物体内的抗体水平。 依据基因工程生产S蛋白 1.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) 【链真题 明方向】 A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 层级二 突破3 聚焦1 1.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) 【链真题 明方向】 C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D 突破点1 突破点2 突破点3 3.(2024·黑龙江齐齐哈尔三模)人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中,在初乳中含量较高,对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中Tetr表示四环素抗性基因,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因),五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题。 突破点1 突破点2 突破点3 突破点1 突破点2 突破点3 (1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中,若只允许使用一种限制酶,应选择的限制酶是　　　　　。基因工程技术中通常选择　　　　　种限制酶进行酶切。 (2)人乳铁蛋白基因可利用PCR技术进行扩增,扩增需要引物_________(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择),连续扩增5次后至少需要引物　　　　个。 (3)据图分析,成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要在含有 　　　　　　(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选,然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵,再利用　　　　工程技术获得转基因小牛。 Sau3AⅠ 2 Ⅱ、Ⅲ 62 氨苄青霉素 胚胎 大单元八 生物技术与工程 突破3 聚焦2 基因编辑技术及其应用 P133 CRISPR/Cas9基因编辑技术 ①构建CRISPR/Cas9重组质粒 ②导入受体细胞 ③转录出sgRNA与Cas9蛋白形成复合体 ④复合体中的sgRNA引导识别目标DNA序列，Cas9蛋白将双链剪切。 复合体作用类似于限制酶，切割磷酸二酯键，一般产生平末端。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 ⑤激活细胞自身修复机制 相应的酶会将切口连接起来，由于Cas9 蛋白剪切时会导致碱基的损伤或修饰，相应的酶会将损伤的碱基切除，最终可能发生移码突变或终止密码子提前，导致基因的功能缺失达到敲除基因的目的。 ......AGC TCC GAT CGA...... ......TCG AGG CTA GCT...... CRISPR/Cas9基因编辑技术 ⑥检测基因敲除是否成功 DNA分子杂交技术：利用碱基互补配对原理，通过标记的探针（一小段单链DNA或RNA）与目标DNA结合，从而检测或定位特定基因序列的技术。 探针只与完全或高度相同的序列结合，才能出现杂交带。 突破点1 突破点2 突破点3 【命题设计】 (2)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而“脱靶”的现象,sgRNA的识别序列越短,基因编辑的脱靶率就越高。请分析原因。 _____________________________________________________________。 sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他DNA片段结合造成编辑出错 突破点1 突破点2 突破点3 【练模拟 拓角度】 5.(2024·广东佛山二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应,研究者提出了如下思路:剔除猪的某些基因,用猪的器官作为供体。借助CRISPR/Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因,下图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列相关叙述错误的是(　　) 突破点1 突破点2 突破点3 A.上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因 B.上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与 C.上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA D.可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵 答案 B 大单元八 生物技术与工程 层级三 PCR技术及应用 P137 【知识回顾】 PCR扩增DNA的过程 变性 复性 延伸 50°C左右 72°C左右、耐高温DNA聚合酶 2种引物设计的原则： ①能与目标序列的3'端碱基互补配对； ②引物不能自身环化或相互配对； ③引物长度适中，过短特异性差。 1.重叠延伸PCR技术 （定点突变，如碱基对A-T突变为C-G） 1.重叠延伸PCR技术 （基因拼接） 引物2与引物3可以碱基互补配对。 3' 3' 5' 5' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 【归纳总结】 (1)基因定点突变,该技术要使用四种引物。考查内容可涉及与突变位点配对的引物设计情况、两个阶段引物的选择、扩增体系及产物等。解答此技术相关问题时可结合题图依据以下原则:引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 (2)构建融合基因,重叠延伸PCR还可以用于两个或两个以上异源基因DNA片段的拼接。引物上含 有末端互补序列,通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进行剪接和扩增,从而获得重组体,与定点突变不同的是待融合基因的PCR产物来自两个不同的基因,通过引物在两种PCR产物中产生互相重叠的链而获得融合基因。 【归纳总结】 2.反向PCR技术 原理是:用限制性内切核酸酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。 已知序列 【例2】反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是(　　) 注:引物分别与临近的DNA链互补配对。 A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B.设计的引物中G、C碱基含量越高,复性的温度越低 C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶 答案 A 实时荧光定量RT-PCR 逆转录、DNA复制 Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则Ct值越小,起始模板量越大，从而实现对起始模板的相对定量分析。 实时荧光定量RT-PCR 逆转录、DNA复制 荧光信号强度不再增加原因最可能是试剂盒中原料、引物和探针数量、Taq酶活性等有限。 $$