第十四单元 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题（教师用书）-【创新方案】2026年高考生物一轮复习（单选版）

第十四单元基因工程和生物技术的安全性与伦理问题 第1课时　基因工程的基本工具和操作程序 5.1.1　概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 5.1.2　阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 5.1.3　阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 5.1.4　举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 一、基础知识判断 (1)(2024·贵州卷)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 (√) (2)DNA连接酶主要有两类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。 (√) (3)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。 (√) (4)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 (×) (5)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。 (×) (6)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。 (×) (7)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 (×) (8)(2024·河北卷)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。 (×) (9)用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。 (×) 二、基本概念梳理 1.基因工程的概念 别名 重组DNA技术 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 结果 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) (2)DNA连接酶 (3)载体 3.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因的筛选与获取 ①目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。 ②筛选合适的目的基因 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ③利用PCR获取和扩增目的基因 a.原理：DNA的半保留复制。 b.条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。 c.扩增过程 过程 说明 图解 变性 当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 (2)基因表达载体的构建 ①构建基因表达载体的目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。 ②基因表达载体的组成 (3)将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、 花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA中转入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→胚胎移植→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 (4)目的基因的检测与鉴定 检测 水平 检测目的 检测方法 分子 水平 目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 PCR技术 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体 杂交 个体 水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 融通大概念建构知识体系 　 [盘点总结] (1)DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 (2)原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。原核生物中的限制酶不能切割自身DNA是因为原核生物DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 核心点(一)　基因工程的基本工具 [系统知能] 1.归纳比较与DNA有关的五种酶 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切割开 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA 片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶或耐高温的DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧 核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 2.基因工程中限制酶或质粒的选择方法 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 (3)根据限制酶的切割位点选择Ti质粒 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： [题点全练] 题点1　限制酶和DNA连接酶 1.(2024·湖南高考)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 (　 ) A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 解析：选B　限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶具有微量、高效、作用条件较温和等特性，酶切条件不合适(如高温下酶失活)可导致DNA完全不被酶切，但酶的用量不会，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 2.某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　 ) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA 连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA 连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 解析：选C　只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA 连接酶，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。 　　[微点拨] (1)限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 (3)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 题点2　基因工程中质粒的选择方法 3.(2025·张家界二模)质粒是基因工程中常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是 (　 ) 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.在质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 解析：选C　质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个，C正确；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 　　[微点拨] 限制酶的选择 (1)不破坏目的基因。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点。 (3)善用“双酶切”，注意方向性，其优点和作用是①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接。 (4)巧用“同尾酶”，同尾酶指识别序列不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。 4.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题： (1)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。  (2)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　　；质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 　。  (3)表达载体含有启动子，启动子是指 　 　。  解析：(1)DNA连接酶可以催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。(2)质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的插入；利用质粒上的标记基因(如某种抗生素抗性基因)可筛选出含质粒载体的宿主细胞，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 答案：(1)磷酸二酯键　(2)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(3)位于基因上游的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 核心点(二)　基因工程的基本操作程序和PCR技术 [系统知能] 一、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的获取 (1)利用PCR获取和扩增目的基因。 (2)人工合成目的基因 ①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： 目的基因的mRNA双链DNA(目的基因) ②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： (3)从基因文库中获取目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法 (1)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T⁃DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (2)基因表达载体导入农杆菌时，对农杆菌的处理 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒的导入。 (3)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 拼接 第一次拼接：是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上；第二次拼接：非人工操作，是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上 导入 第一次导入：是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入：非人工操作，是指含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞 (4)目的基因的表达离不开植物组织培养技术 将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。 4.目的基因的检测与鉴定 (1)载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。原理如图所示： (2)目的基因的检测 ①使用PCR等技术，检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。 ②采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 ③采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因是否成功表达的“个体生物学”水平的检测。 5.利用不同方式生产药物的区别 生产方式 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 受体与人类基因结构的差异 哺乳动物与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌与人类的基因结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 Ca2+处理法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 二、PCR技术的操作原理和过程 1.PCR技术和DNA复制的比较 2.PCR技术中的三个注意点 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 3.PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA数 2 4 8 2n 含引物A(或B) 的DNA数 1 3 7 2n-1 同时含引物A、 B的DNA数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2 [题点全练] 　　　　　　　　　　　　　　　　 题点1　基因工程的操作程序及应用 1.如图表示培育转基因抗冻番茄的流程图，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。图示各种限制酶的识别序列均不相同。下列说法错误的是 (　 ) A.①过程中应选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ对Ti质粒进行切割 B.②过程需用Ca2+处理农杆菌使其处于能吸收DNA分子的状态 C.③过程中农杆菌侵染根细胞后将Ti质粒整合到染色体上 D.④过程的不同阶段应适当调整培养基中植物激素的比例 解析：选C　目的基因两侧是限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对Ti质粒进行切割，A正确；②过程需用Ca2+处理农杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；图中过程③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T⁃DNA整合到染色体DNA上，而不是重组Ti质粒整合到染色体上，C错误；④过程不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同，应在不同阶段适当调整培养基中植物激素的比例，D正确。 　　[微点拨] (1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。 (2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。 2.(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 (　 ) A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析：选D　若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可分离大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。 题点2　PCR技术 3.下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是 (　 ) A.②链从L到R的方向为3'→5'，①②链均可作为子链合成的模板 B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D.物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 解析：选D　根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5'→3'，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度使子链沿着引物的3'端延伸，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数为23=8(个)，则需消耗引物③的数目为(8×2-2)÷2=7(个)，C错误；物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。 　　[微点拨] PCR过程的两点提醒 (1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。 (2)PCR反应的产物并不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。 4.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是 (　 ) A.引物A、B的碱基不能进行互补配对 B.复性的目的是让引物与单链DNA相结合 C.延伸时，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸 D.第二轮循环后，同时含有引物A和引物B的DNA占100% 解析：选D　如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则其不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；延伸时，在DNA聚合酶的作用下，将脱氧核苷酸连接到引物的3'端，C正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环(即DNA复制2次)后，共形成22=4(个)DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子同时含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA占50%，D错误。 　　[微点拨] PCR中设计引物的一般原则 (1)引物长度一般以20~30个核苷酸为宜，过短会降低其特异性，过长会导致复性时结合的模板数减少，降低反应效率。 (2)要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。 (3)引物5'末端的碱基可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等)，便于克隆和表达。 (4)引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。 主攻学困点强化规范表达 　 　　构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是　↓ —GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是 ↓ —GATC—，根据图示回答下列问题： 1.请用图示法写出限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。 提示： 酶Ⅰ： 酶Ⅱ： 2.切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。 提示：用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。原因：限制酶Ⅰ的识别序列包含在限制酶Ⅱ的识别序列内，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 3.利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么? 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，DNA聚合酶只能从3'端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 4.在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么? 提示：两种引物之间不能互补配对。 5.为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么? 提示：引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。 [课时跟踪检测] 一、选择题 1.(2025·青岛模拟)下图为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断下列相关叙述错误的是 (　 ) A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 解析：选D　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着它们识别序列的中心轴线切开，切割后形成平末端，A正确；由题图可知，Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部，B正确；由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端，C正确；HindⅡ能识别GTYRAC，Y为C或T，R为G或A，则一种限制酶不一定只能识别一种核苷酸序列，D错误。 2.RT⁃PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是 (　 ) A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲液中一般要添加Mg2+ B.一般情况下，引物A和B的长度越长、C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越低 C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色 D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效 解析：选B　PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活DNA聚合酶，A正确；一般情况下，引物A和B的长度越长、C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越高，B错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色，然后可在紫外灯下检测出来，C正确；实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸，D正确。 3.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是 (　 ) A.引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关 C.Taq DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到3'端 D.若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平 解析：选B　引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；模板DNA含量越高，PCR扩增过程中形成的荧光分子越多，荧光强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B错误；Taq DNA 聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端向3'端延伸，C正确；cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的，故若以cDNA为模板，题述技术便可用于检测某基因的转录水平，D正确。 4.(2025·吉林模拟)科学家研究发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是 (　 ) A.研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B.PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C.DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D.一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 PCR 的产物 解析：选C　由题意分析可知，研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A正确；PCR 反应过程中的每一轮循环一般包括变性(高温解旋)、复性(引物结合)、延伸(子链延伸)三步，B正确；DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误；一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，D正确。 5.(2025·汕头模拟)巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物扩增目的基因。下列说法错误的是 (　 ) A.两对引物的碱基序列不相同 B.第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定 C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 解析：选D　两对引物的碱基序列不相同，A正确；第二轮PCR使内引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。 6.(2025·桂林二模)基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是 (　 ) A.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T⁃DNA片段内 B.可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物 C.目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则 D.转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 解析：选C　农杆菌中Ti质粒上的T⁃DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T⁃DNA片段内，A正确；可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B正确；目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端的结合依赖碱基互补配对原则，C错误；转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D正确。 7.干扰素是一种广谱抗病毒制剂，是具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，①~④表示相关操作过程。下列分析不正确的是 (　 ) A.图中过程①③中都需用到限制性内切核酸酶 B.过程②需用耐高温的DNA聚合酶，②操作的原理是DNA半保留复制 C.过程③操作要注意干扰素基因上有启动子、终止子及标记基因等 D.过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定 解析：选C　图中①表示获取目的基因，②表示扩增目的基因，③表示构建基因表达载体，④表示导入目的基因，其中在获取目的基因、构建基因表达载体过程中均需用到限制酶，A正确；②表示通过PCR技术扩增目的基因，其原理是DNA半保留复制，该过程需用到耐高温的DNA聚合酶，B正确；过程③操作要注意最终构建的基因表达载体上有干扰素基因、启动子、终止子及标记基因等，C错误；过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定，D正确。 8.(2025·大连一模)融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。其原理如图所示，据图分析下列叙述正确的是 (　 ) A.上述过程中使用的引物P2和P3的碱基需要完全互补配对 B.可以在同一个反应体系中进行甲基因和乙基因的扩增 C.融合PCR的第一步两条链重叠部位可互为另一条链的引物，不需要另加入引物 D.设计引物的目的是能够从其5'端开始连接脱氧核苷酸 解析：选C　题中所述过程中使用的引物P2和P3的碱基不需要完全互补配对，只需要部分碱基互补配对即可，A错误；不能在同一个反应体系中进行甲基因和乙基因的扩增，B错误；结合图示可知，融合PCR的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，不需要另加入引物，C正确；引物与模板结合后，能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸，D错误。 二、非选择题 9.(8分)(2025·贵阳二模)某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图1所示，①~④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ的酶切位点唯一。其中BamHⅠ与EcoRⅠ之间的距离为20 kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25 kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切割位点如图2。请回答下列问题： (1)常用的特异性扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→　　　　”三步。(1分)  (2)步骤①应选择限制酶　　　　　切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加　　　　　，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株，原因是__________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________。(4分)  (3)经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因存在正向与反向两种连接方式。用　　　　　酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产物大小，若出现　　　　　条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。(3分)  解析：(1)利用PCR扩增目的基因，每次循环一般分为“变性→复性→延伸”三步。(2)由图1可知，目的基因用限制酶BamHⅠ、BglⅡ切割，由于BamHⅠ和BglⅡ的黏性末端相同，且质粒的T⁃DNA 中有BamHⅠ的酶切位点(质粒只有1个BamHⅠ的酶切位点)，因此步骤①应选择限制酶BamHⅠ切割农杆菌质粒。Ti质粒的T⁃DNA中含有潮霉素抗性基因，因此在步骤④的培养基中需要添加潮霉素，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。(3)由图2可知，用BamHⅠ酶和BglⅡ酶切割得到的黏性末端相同，因此剪切后的目的基因能与质粒连接在一起。在构建的重组质粒中，不再有BglⅡ酶的识别位点，但含有BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，目的基因的正向和反向连接方式如图所示。 若只选一种酶切割基因表达载体，无论目的基因正向连接还是反向连接，均只得到长度为180+25+20=225(kb)的DNA，无法区分目的基因正向连接还是反向连接。若选用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切割，目的基因正向连接的重组质粒被切成180 kb、45 kb的两种DNA片段，目的基因反向连接的重组质粒被切成205 kb、20 kb两种DNA片段，所以电泳应出现四条条带。 答案：(1)复性→延伸　(2)BamHⅠ　潮霉素　 Ti质粒的T⁃DNA中含有潮霉素抗性基因　 (3)BamHⅠ和EcoRⅠ　四 10.(10分)为分别建立具有红色荧光与绿色荧光的转基因模型小鼠，科学家进行了如下操作将红色荧光基因R插入表达载体A，构建重组表达载体A'，如图所示。其中含R基因的DNA片段内部没有限制酶的酶切位点，R基因以α链为模板链。将绿色荧光基因G插入表达载体B，构建重组表达载体B'。 (1)表达载体上的启动子是　　　　 　酶的结合位点，能决定基因转录方向，并确定其中的一条链为模板，若图中表达载体A和R基因通过酶切和拼接后能使R基因成功表达，则其启动子是　　　(填“①”或“②”)。(2分)  (2)据图分析，　　　　 　(填“可以”或“不可以”)通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'，理由是__________ _____________________________________________________________________________________。(3分)  (3)在绿色荧光基因G内部插入了一个DNA片段P，会引起G基因产生　　　　 　，但获得的上述转基因模型鼠依然能表现出绿色荧光的原因有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(回答2点即可)。为确定导入的基因是否有片段P的插入，可通过　　　　 　或　　　　 　的方法进行分析。(5分)  解析：(1)启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶的结合位点，控制着转录的开始；若图中表达载体A和R基因通过酶切和拼接后能使R基因成功表达，则其启动子是①。(2)据图分析可知，表达载体A、目的基因、重组表达载体A'的分子量不同，因此可以通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'。(3)在绿色荧光基因G内部插入了一个DNA片段P，会引起G基因结构发生改变，产生基因突变；如果片段P插入G基因的内含子或非编码序列中就不会影响绿色荧光基因G的表达，或者插入片段P的G基因表达的蛋白质结构不同，但功能与原蛋白质相同，转基因模型鼠依然能表现出绿色荧光；为确定导入的基因是否有片段P的插入，可通过基因测序或核酸杂交技术或PCR结合电泳技术进行分析。 答案：(1)RNA聚合　①　(2)可以　重组表达载体A'与其他片段的分子量不同(或重组表达载体A'的分子量与表达载体A及目的基因的分子量不同)(合理即可)　(3)基因突变　片段P插入G基因的内含子或非编码序列中；基因突变后表达的蛋白质结构不同但功能相同　基因测序(或核酸杂交技术)　PCR结合电泳技术　 第2课时　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 5.1.5　阐明DNA的提取和鉴定的方法和过程 5.1.6　阐明利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定 一、DNA的粗提取与鉴定 1.基础知识判断 (1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 (√) (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 (√) (3)DNA的粗提取时，在漏斗中垫上纱布，将研磨液过滤到烧杯中。 (√) (4)将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。 (×) 2.基本概念梳理 (1)DNA的粗提取与鉴定的基本原理 (2)DNA的粗提取与鉴定的方法步骤 (3)注意事项 ①粗提取的DNA丝状物要用滤纸吸去上面的水分或离心得到的沉淀物要晾干，然后再溶解在2 mol/L的NaCl溶液中进行鉴定。 ②DNA的溶解度与NaCl溶液浓度有关。实验中鉴定DNA通常用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA，需要不断搅拌以增加DNA的溶解量，通常要3 min以上。 ③加入预冷的酒精后，要用玻璃棒缓慢、轻轻地沿一个方向搅拌溶液，玻璃棒不能插入到烧杯的底部。 ④二苯胺试剂一般要现用现配，以保证实验的效果。 二、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.基础知识判断 (1)PCR反应体系中需加入4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料。 (√) (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (√) (3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存。 (×) (4)在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关，与凝胶的浓度无关。 (×) (5)凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 (√) (6)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。提高复性的温度可减少反应非特异性条带的产生。 (√) 2.基本概念梳理 (1)实验基础 ①PCR原理：不仅利用了DNA的热变性原理，还利用了DNA半保留复制的原理。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。  (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定 (4)特别提醒 ①线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量呈反比，分子量越大则所受阻力越大，也越难在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢，随着时间的推移，就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。 ②将待测样品电泳条带与Marker(已知长度的DNA片段)进行对比，即可知道待测样品中DNA片段的长度，其中条带的宽度反映了DNA含量的多少。 融通大概念建构知识体系 　   核心点(一)　DNA的粗提取与鉴定 [题点全练] 1.(2024·安徽高考)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是 (　 ) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 解析：选D　研磨液有利于DNA的溶解并保护DNA不被破坏，若换为蒸馏水，则DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，不能检测溶液中是否有蛋白质杂质，D错误。 2.(2024·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是 (　 ) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 解析：选A　由教材中“DNA的粗提取与鉴定”实验的方法步骤分析可知，整个提取过程中可以不使用离心机，A正确。研磨液在4 ℃冰箱中放置的目的是获得上清液，不能充分摇匀，B错误。鉴定过程中的沸水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误。该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加DNA的对照组，D错误。 3.(2023·广东高考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 (　 ) A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 解析：选D　DNA主要存在于细胞核内，而裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA、RNA、蛋白质和多糖等物质在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，通过适当的分离方法去除混合物中的多糖、蛋白质等，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度使DNA溶解或析出，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。 4.图1、图2是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是 (　 ) A.图1中溶液a是去掉上清液的研磨液 B.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显 C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶 D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色 解析：选B　图1中溶液a是研磨液静置几分钟后取的上清液，A错误；图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，C错误；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴条件下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，D错误。 [题后悟法] 1.DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理 试剂 浓度 用途 主要原理 NaCl 溶液 2 mol/L 溶解 DNA DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2 mol/L时最大 酒精 95%(体积 分数) 除去杂质、析出DNA DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可溶于酒精 二苯胺 试剂 — 鉴定 DNA DNA遇二苯胺试剂(沸水浴)会变蓝色 2.DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度 物质 溶解规律 NaCl溶液浓度 2 mol/L 0.14 mol/L DNA 溶解 析出 蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解 核心点(二)　DNA片段的扩增及电泳鉴定 [题点全练] 题点1　DNA片段的扩增中引物的设计 1.(2024·山东高考)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 (　 ) 反应管 加入的单链DNA ① 5'⁃GCCGATCTTTATA⁃3'； 3'⁃GACCGGCTAGAAA⁃5' ② 5'⁃AGAGCCAATTGGC⁃3' ③ 5'⁃ATTTCCCGATCCG⁃3'； 3'⁃AGGGCTAGGCATA⁃5' ④ 5'⁃TTCACTGGCCAGT⁃3' A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 解析：选D　分析反应管①~④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列(10个连续碱基对)，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故该条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的序列(5'⁃TCT⁃3')中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列(10个连续碱基对)，且双链DNA区之外的5'端有凸出的碱基(含碱基T)，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，结合题中信息知该条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的5'端有凸出的碱基(含碱基T)，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④，故选D。 2.图1是利用PCR技术扩增目的基因的示意图，表中是使用引物中的碱基序列。 (1)PCR中使用的DNA聚合酶与一般生物体内的DNA聚合酶相比，特点是 　， 其作用是 　。 引物对A P1　AACTGAAATGTAGCTATC P2　TTAAGTCCATTACTCTAG 引物对B S1　GTCCGACTAGTGGCTGTG S2　AGCTGGCGTTTAGCCTCG (2)图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。在第四轮循环产物中不含有引物1的DNA片段所占的比例为　　　　　，出现　　　　个两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。  (3)PCR过程中复性温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。上表为两对引物序列，　　　　可采用较高复性温度，原因是________________________________________________________________________。  (4)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(图2)，请分别说明理由：第1组：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　；第2组：　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　。  解析：(1)由于在PCR扩增技术中采用高温使DNA变性解旋，因此需要使用的DNA聚合酶具有耐高温的特点，DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，催化合成DNA子链。(2)由图1可知，由原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物1或引物2，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第四轮循环共产生16个DNA分子，其中含有引物1的DNA分子是15个，不含引物1的DNA分子是1个，占1/16。在PCR反应过程中，第三轮循环出现两个等长的DNA，经过第四次复制产生4个等长的DNA，另外有四个DNA通过第四次复制也会分别产生一个等长的DNA，即共有8个等长的DNA。(3)PCR过程中复性温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。据题表可知，表中的两对引物序列中引物对B中C、G的比例高，可采用较高的复性温度。(4)第1组：分析图2中引物可知，引物Ⅰ的部分碱基序列是CAGGCT，引物Ⅱ的部分碱基序列是AGCCTG，引物Ⅰ和引物Ⅱ的局部碱基之间存在互补配对关系，若利用这两个引物进行DNA扩增，会因其中的部分碱基发生碱基互补配对而使引物失效。第2组：引物Ⅲ的部分碱基序列是AACTG和CAGTT，两侧碱基具有碱基互补配对关系，该引物一旦发生自身折叠，也将会出现部分碱基发生碱基互补配对而使引物失效。 答案：(1)耐高温　将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上　(2)1/16　8　(3)引物对B　C、G的比例高　(4)引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　引物Ⅲ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 题点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定实验过程 3.(2024·黑吉辽卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是 (　 ) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 解析：选A　琼脂糖凝胶的浓度、待测样品中DNA分子的大小和构象等都会影响DNA分子在电泳中的迁移速率，故琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小，A正确；在电泳过程中，凝胶载样缓冲液中的指示剂不会与DNA结合，而是随着电流的通过而移动，可用于确定样品的迁移方向和距离，不能用于指示DNA分子的具体位置，B错误；在同一电场作用下，DNA片段越长，即DNA相对分子质量越大，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，D错误。 4.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是 (　 ) A.该载体最可能为环状DNA分子 B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C.限制酶R1与R2的切点最短相距约400 bp D.限制酶作用位点会导致磷酸二酯键断裂 解析：选C　当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，A、B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C错误；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，D正确。 [题后悟法] 1.PCR中使用的引物应具备的特点 (1)引物能与DNA模板碱基互补配对。 (2)2种引物之间不能有互补的碱基序列，避免引物形成双链，导致扩增失败。 (3)某一引物不能存在自身局部碱基序列互补配对，避免自身折叠出现配对，无法和模板DNA结合。 (4)多数情况需要在2种引物的5'端添加不同限制酶识别的碱基序列，扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。 (5)引物不能太短，以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。 2.DNA片段扩增及电泳鉴定实验的注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 ℃条件下储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。 (4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 (5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 3.DNA片段鉴定的原理 (1)DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 (2)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 (3)凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 主攻学困点强化规范表达 　 根据PCR反应过程示意图分析下列问题： 1.PCR技术的原理是什么? 提示：DNA半保留复制(体外DNA双链复制)。 2.由图分析可知，在PCR反应过程中需要两种引物，原因是什么? 提示：DNA由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3'端延伸DNA链。 3.DNA片段电泳鉴定的原理是什么? 提示：DNA分子在碱性条件下(pH=8.0的缓冲液)带负电，在电场力的驱动下，从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中移动；核酸染料带正电，在电场力的驱动下，从正极向负极运动，遇到DNA就嵌入其中完成染色，但这个颜色在可见光下看不到，需要紫外光激发。 4.电泳鉴定时未出现特异性条带的原因有哪些? 提示：模板DNA出现污染；Taq DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体；PCR循环次数过少等。 [课时跟踪检测] 一、选择题　　　　　　　　　　　　　　　　 1.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是 (　 ) A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B.PCR利用了DNA的热变性原理 C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 解析：选C　缓冲液和酶应分装成小份，在-20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，C错误。 2.下列有关电泳的叙述，错误的是 (　 ) A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳 解析：选C　进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。 3.(2025·保定模拟)用限制酶EcoRⅠ、NotⅠ单独或联合剪切同一个DNA分子，获得的DNA片段电泳结果如图所示，最左边为DNA Marker(1 kb=1 000碱基对)，①为用EcoRⅠ剪切，②为用NotⅠ剪切，③为用EcoRⅠ和NotⅠ剪切。下列叙述不正确的是 (　 ) A.该DNA分子的大小为10 kb B.该DNA分子上至少有3个酶切位点 C.NotⅠ单独剪切后的产物与该DNA分子电泳时的迁移速率不相同 D.可以确定该DNA分子上EcoRⅠ、NotⅠ切割位点的相对位置 解析：选D　EcoRⅠ单独切割后获得6 kb和4 kb片段，NotⅠ切割后获得10 kb的片段，假设该DNA分子是一个线状DNA分子，则其长度应为10 kb，且其上不存在Not Ⅰ的切割位点，但EcoR Ⅰ、NotⅠ联合切割后获得6 kb、3 kb、1 kb的片段，说明该DNA分子上存在NotⅠ的切割位点，故该DNA分子为环状，长度为10 kb，其上有2个EcoR Ⅰ酶切位点和1个NotⅠ酶切位点，A、B正确；NotⅠ单独剪切后的产物为10 kb的线状DNA，与10 kb的环状DNA电泳时的迁移速率不相同，C正确；该DNA分子上EcoRⅠ、NotⅠ切割位点的相对位置有两种，并不能确定相对位置，D错误。 4.(2025·齐齐哈尔模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是 (　 ) A.DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B.电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与其所带电荷相同的电极移动的原理 C.根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D.用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 解析：选D　DNA不溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA，A错误；电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与其所带电荷相反的电极移动的原理，B错误；因为质粒的本质是环状DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，C错误；用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果，D正确。 5.(2025·武汉一模)棉蚜体内有多种寄生蜂的卵。现利用PCR技术对棉蚜及其体内寄生蜂种类进行检测，为了一次鉴定出多种目标昆虫，加入同一PCR体系的引物应满足 (　 ) ①每对引物扩增的序列对应一种昆虫　②每对引物扩增的序列对应多种昆虫　③每对引物扩增的产物长度不同　④每对引物扩增的产物长度相同　⑤所有引物之间不能相互配对　⑥所有引物的长度相同 A.①③⑤ B.②④⑥ C.②③⑥ D.①④⑤ 解析：选A　要用多对引物一次鉴定出多种生物，那么每种生物要有对应的引物与其DNA特有的碱基序列配对，引物之间不能互补配对，扩增的产物长度要有所不同，以便在电泳时可以区分出不同生物的片段，①③⑤符合题意，A正确。 6.递减PCR是常规PCR技术的发展，如图表示递减PCR各阶段温度及时间控制。下列相关叙述错误的是 (　 ) A.PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物、缓冲液等物质 B.第 1 阶段的目的是使模板DNA充分解旋，减少DNA复杂结构对扩增的影响 C.第 2 阶段中复性温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板 D.第 4 阶段72 ℃下维持10 min ，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋 解析：选D　PCR 反应体系中应加入Taq DNA聚合酶(催化DNA子链的形成)、模板 DNA 、dNTP(原料)、引物、缓冲液等物质，A正确；据图可知，第1阶段是在96 ℃条件下处理4 min，该阶段的目的是使模板DNA在高温下充分解旋，得到单链DNA，以减少 DNA 复杂结构对扩增的影响，B正确；复性温度越低，能与引物中部分碱基序列发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，故第2阶段中复性温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板，C正确；72 ℃下维持10 min ，主要目的是使引物链延伸，以形成新的脱氧核苷酸链，D错误。 7.重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是 (　 ) A.过程②需要含Mg2+的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸时，不需要引物 解析：选B　过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2+的缓冲液中才能进行，需要提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故一共形成3种DNA分子，B错误；过程④获得的杂交DNA有2种，一种3'端为单链，一种5'端为单链，5'端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。 8.(2024·湖南高考改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是 (　 ) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5'⁃CTACCCGTGAT⁃3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为T 解析：选B　利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5'⁃CTACCCGTGAT⁃3'，患者的测序结果为5'⁃CTACCTGTGAT⁃3'，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D正确。 二、非选择题 9.(12分)我国研发出一种可高效特异性扩增超长DNA的抑制热交错PCR(STIPCR)技术。STIPCR通过在正/反向引物的5'端引入一段相同的短序列，抑制了较短产物链的扩增，增强了超长DNA的特异性扩增，在延伸阶段使用不同幅度(60~72 ℃)的变温嵌套热交错方法，解决了某一温度下，因超长DNA不同区域G—C碱基对含量不同而难以高效延伸的问题。回答下列问题： (1)利用STIPCR从复杂基因组中特异性地扩增超长DNA需要根据___________________________________　 来合成引物，并对引物加工处理，STIPCR扩增过程与DNA在细胞中复制过程的相同之处有____________ ____________________________________________________________________________________________ (答出3点)。(4分) (2)在正/反向引物的5'端引入一段相同的短序列，容易使较短的产物链首尾连接形成茎环结构，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，该结构不能与引物结合，从而使较短产物链停留在PCR过程的　　　阶段，抑制了非特异性产物的扩增。(3分)  (3)为提高超长DNA中G—C碱基对含量低的区域链的延伸效率，可适当　　　(填“降低”或“升高”)温度，依据是______________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________。(3分)  (4)为保证经STIPCR获得的某超长DNA与细胞内的该DNA遗传信息相同，需用限制酶处理所得DNA，其目的是去除_______________________________________________________________________________。 若要使获得的超长DNA在大肠杆菌中表达，需要　　　　　　　　　　　　　　　　才能将超长DNA导入细胞。(2分)  解析：(1)PCR扩增DNA需要根据一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物。由题干可知，STIPCR是一种PCR技术，因此STIPCR扩增过程与DNA在细胞中复制过程的相同之处有以DNA双链为模板、以脱氧核糖核苷酸为原料、需要DNA聚合酶、复制方式为半保留复制等。(2)在正/反向引物的5'端引入一段相同的短序列，则DNA片段的两个末端形成反向互补序列且较短的DNA片段两末端容易相互配对，进而容易使较短的产物链首尾连接形成茎环结构，该结构不能与引物结合，从而使较短产物链停留在PCR过程的复性阶段。(3)碱基对间以氢键相连，其中A—T碱基对间有2个氢键，G—C碱基对间有3个氢键。G—C碱基对含量低的DNA片段中氢键数目相对较少，热稳定性较差，因此为提高超长DNA中G—C碱基对含量低的区域链的延伸效率，可适当降低温度。(4)由题干可知，经STIPCR获得的某超长DNA比细胞内的该DNA多了一段插入在引物5'端的短序列，为保证经STIPCR获得的某超长DNA与细胞内的该DNA遗传信息相同，需要用限制酶去除插入在引物5'端的短序列。若要使获得的超长DNA在大肠杆菌中表达，不能直接将该DNA导入大肠杆菌中，需要将超长DNA与载体结合构建基因表达载体才能将超长DNA导入细胞。 答案：(1)一段已知目的基因的核苷酸序列　以DNA双链为模板、以脱氧核糖核苷酸为原料、需要DNA聚合酶、复制方式为半保留复制等(答出3点)　(2)DNA片段的两个末端形成反向互补序列且较短的DNA片段两末端容易相互配对　复性　(3)降低　G—C碱基对间有3个氢键，G—C碱基对含量低的DNA片段中氢键数目相对较少，热稳定性较差　(4)插入在引物5'端的短序列　将超长DNA与载体结合构建基因表达载体 10.(10分)(2024·江西高考节选)植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1(纯合体)，其颖壳蜡质合成有缺陷(本题假设完全无蜡质)。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16⁃羟基棕榈酸受阻所致(本题假设完全阻断)，符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型(WT，纯合体)。据图判断，突变体Cer1中基因的突变类型是　　　　　　。(2分)  (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交，F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道　　　和泳道　　　(从1~5中选择)中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为　　　　　。(6分)  (3)进一步研究意外发现，16⁃羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因(位于另一条染色体上)也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是　　　　　　　　　　。(2分)  解析：(1)由题意可知，泳道1是突变体Cer1，则扩增c基因时两引物间的长度为1 100 bp，泳道2是野生型(WT，纯合体)，则扩增C基因时两引物间的长度为1 960 bp，说明c基因比C基因的长度短，是碱基缺失引起的突变。(2)突变体Cer1的基因型为cc，纯合野生型的基因型为CC，则F1的基因型为Cc，F1与突变体Cer1杂交后代中Cc∶cc=1∶1，电泳检测PCR产物，可以分别得到与题图泳道3和泳道1中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1∶1。(3)编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是密码子具有简并性。 答案：(1)碱基缺失　(2)3　1　1∶1　(3)密码子具有简并性 第3课时　蛋白质工程和生物技术的安全性与伦理问题 5.2.1　概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.2.2　举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 6.1.1　举例说出日常生活中的转基因产品 6.1.2　探讨转基因技术在应用过程中带来的影响 6.2.1　举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题 6.2.2　分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 6.3.1　举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害 6.3.2　认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散 一、蛋白质工程的原理和应用 1.基础知识判断 (1)蛋白质工程是在分子水平上，对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。 (×) (2)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。 (√) (3)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 (√) (4)将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，延长保存时间，属于蛋白质工程的应用。 (√) (5)通过改造某些调控光合作用的酶，可以提高光合作用的效率。 (√) 2.基本概念梳理 (1)蛋白质工程的概念 基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 目的 获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 手段 通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 (2)蛋白质工程的基本思路 (3)蛋白质工程的应用 ①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。 ②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。 ③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；通过改造微生物蛋白质的结构，增强防治病虫害的效果。 二、生物技术的安全性与伦理问题 1.基础知识判断 (1)通过转基因技术生产药物只是转基因微生物方面的应用。 (×) (2)如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题。 (×) (3)中国政府不允许进行任何生殖性克隆人实验。 (√) (4)生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念。 (√) (5)天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。 (√) 2.基本概念梳理 (1)转基因产品的安全性 (2)关注生殖性克隆人 ①治疗性克隆和生殖性克隆的比较 项目 治疗性克隆 生殖性克隆 概念 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的 通过克隆技术产生独立生存的新个体 目的 用于医学研究或治疗疾病 用于生育，产生新个体 水平 细胞水平 个体水平 联系 都属于无性生殖，产生的新个体或新组织的遗传物质均不发生变化 ②生殖性克隆人与治疗性克隆的主要过程 (3)试管婴儿与设计试管婴儿的异同点 不同点 技术手段 设计试管婴儿在胚胎移植前需要进行遗传学诊断(如诊断血型、性别、HLA的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了d过程： 应用 试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症等疾病的治疗 相同点 都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖 (4)生物武器 ①种类：致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等。生化毒剂类：肉毒杆菌毒素等。 ②特点：致病能力强，攻击范围广。 ③散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 融通大概念建构知识体系 　 核心点(一)　蛋白质工程 [题点全练] 1.(2025·广州模拟)蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时代。下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是 (　 ) A.蛋白质工程的操作对象是蛋白质 B.蛋白质工程需要改造或合成蛋白质的编码基因 C.对干扰素的改造无需考虑其空间结构 D.蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列 解析：选B　蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，A错误，B正确；干扰素的功能与其空间结构有关，因此对干扰素进行改造需要考虑其空间结构，C错误；由题意可知，改造干扰素时，蛋白质工程不需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列，D错误。 2.某种病毒通过其表面刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用，侵入人体细胞。研究人员设计并合成了一种自然界不存在的LCB1蛋白药物，可识别并紧密结合S蛋白的RBD，以干扰该病毒的感染。下列叙述错误的是 (　 ) A.LCB1可能与ACE2受体的某些区域结构类似 B.LCB1可以依据S蛋白的RBD结构进行设计 C.LCB1是通过细胞中原有的基因表达产生的 D.LCB1设计和合成是通过蛋白质工程实现的 解析：选C　由题干信息可知，S蛋白的RBD与人体细胞表面的ACE2受体相互作用；而LCB1可识别并紧密结合S蛋白的RBD，阻止S蛋白的RBD与ACE2受体结合，这说明LCB1可能与ACE2受体的某些区域结构类似，LCB1可以依据S蛋白的RBD结构进行设计，A、B正确。LCB1是人工设计并合成的一种自然界不存在的蛋白质，故LCB1并不是通过细胞中原有的基因表达产生的，而基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，故LCB1设计和合成是通过蛋白质工程实现的，C错误，D正确。 3.(2025·南京一模)嵌合抗原受体T细胞(CAR⁃T)是癌症治疗的研究热点。其原理是将CAR基因导入T细胞获得CAR⁃T，进而表达出特异性更强的癌细胞抗原受体蛋白(CAR)。相比自然状态下的细胞毒性T细胞，CAR⁃T对肿瘤细胞的杀伤性、靶向性更强，治疗流程如下图。下列叙述正确的是 (　 ) A.步骤②属于生物工程中的细胞工程 B.CAR⁃T细胞的CAR能特异性识别并杀伤癌细胞 C.步骤④可选用动物病毒或噬菌体作为载体 D.步骤⑤需定期更换培养液以补充营养物质并清除代谢废物 解析：选D　分析题意，步骤②是根据靶抗原设计CAR结构，是从蛋白质的预期结构开始，属于蛋白质工程，A错误；CAR是受体，受体只有识别作用，没有杀伤癌细胞的功能，B错误；将CAR基因导入T细胞不能用噬菌体作为载体，C错误；步骤⑤需定期更换培养液，以补充营养物质并清除代谢废物，D正确。 4.近年来，蛋白质工程与基因工程的结合使得干扰素生物工程的研究取得了更大的进展。回答下列有关生物工程生产干扰素的问题。 (1)根据人们对干扰素结构和功能上的需求，将干扰素的第17位半胱氨酸替换成丝氨酸，这种生物工程属于　　　　　　　　。  (2)可通过点突变技术使干扰素基因中的碱基对发生改变，将改造后的基因与载体构建成　　　　　　　　　后导入大肠杆菌生产干扰素。干扰素是一种糖蛋白，在大肠杆菌内不能加糖基团，这是因为____________ ____________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________。  用家蚕来生产干扰素更为理想，生产过程中，用到了家蚕核型多角体病毒(NPV)，NPV的作用是充当基因工程的　　　　。  (3)人们设想，如果能将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，再将受精卵进行　　　　　　　　　　至桑葚胚或囊胚阶段，然后进行　　　　　　　　。可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为________________________________________________________________________________。  若该设想变为现实，则干扰素的活性及产量均会大幅提高。 答案：(1)蛋白质工程　(2)基因表达载体　糖基团是在内质网中加入的，大肠杆菌为原核生物，细胞中无内质网　载体　(3)早期胚胎培养　胚胎移植　乳腺生物反应器 [题后悟法] 蛋白质工程与基因工程的区别和联系 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新基因→获得所需要的蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 核心点(二)　生物技术的安全性与伦理问题 [题点全练] 题点1　生物技术的安全性 1.(2023·北京高考)抗虫作物对害虫的生存产生压力，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果，农业生产上会采取一系列措施。以下措施不能实现上述目标的是 (　 ) A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子 B.大面积种植转基因抗虫棉，并施用杀虫剂 C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植 D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带 解析：选B　大面积种植转基因作物并使用杀虫剂会导致不含抗性基因的害虫大量死亡，抗性基因频率会越来越高，B符合题意。在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子；转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植；转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带等措施均会减少对害虫的杀伤力，会使一部分害虫体内的非抗性基因保留下来，有利于保持抗性基因与非抗性基因的基因频率相对稳定，使转基因抗虫棉保持抗虫效果，A、C、D不符合题意。 2.下列关于生物武器的叙述，错误的是 (　 ) A.相对于常规武器、核武器和化学武器等，生物武器最大的特点是携带和投放简单 B.生物武器对人的危害不仅有身体上的，还有心理上的 C.中国坚决支持禁止生物武器的主张，奉行不发展、不生产、不储存生物武器的政策，并反对生物武器的扩散 D.现代生物武器的防护，主要包括预警体系、防控体系和疫苗库 解析：选A　相对于常规武器、核武器和化学武器，生物武器最大的特点是致病能力强、攻击范围广，A错误。 3.炭疽杆菌造成感染者死亡率极高的主要原因之一是它能产生两种成分为蛋白质的内毒素。有科学家将该菌的大型环状DNA分子破坏，该菌仍能产生内毒素。下列对炭疽杆菌的叙述，不正确的是 (　 ) A.炭疽杆菌合成的内毒素属于代谢产物 B.控制内毒素合成的基因位于炭疽杆菌的拟核中 C.如将炭疽杆菌用于军事用途或恐怖活动，则属于生物武器 D.将蜡样芽孢杆菌改造成像炭疽杆菌一样的致病菌需要通过转基因技术 解析：选B　炭疽杆菌合成的内毒素属于代谢产物，A正确；大型环状DNA位于拟核，破坏大型环状DNA分子，该菌仍能产生内毒素，说明控制内毒素合成的基因位于炭疽杆菌的质粒中，B错误；如将炭疽杆菌用于军事用途或恐怖活动，则属于生物武器，C正确；将蜡样芽孢杆菌改造成像炭疽杆菌一样的致病菌需要利用转基因技术实现，D正确。 题点2　生物技术的伦理问题 4.(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是 (　 ) A.试管婴儿技术应全面禁止 B.治疗性克隆不需要监控和审查 C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 解析：选D　试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的，A错误；治疗性克隆要在严格监管下进行，B错误；生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题，C错误。 5.世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿在某大学医学院诞生。这项研究用到了能够精确定位并修饰基因的基因编辑技术，即基因编辑时用约为头发二十分之一细的针把Cas9蛋白和特定的RNA引导序列注入受精卵中，对CCR5基因进行修改，预期婴儿出生后能天然抵抗人类免疫缺陷病毒。关于该技术的安全性问题，下列说法不正确的是 (　 ) A.基因编辑时，引导序列可能发生变异，导致剪切错误，造成不可预知的后果 B.经过基因编辑的个体，有可能影响基因选择性表达，而导致其他疾病的产生 C.将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德 D.只要加强监管、完善法律法规、完善技术手段，不需担心基因编辑技术的安全性 解析：选D　基因编辑时，引导序列可能发生变异，导致剪切错误，造成不可预知的后果，A正确；经过基因编辑的个体，其基因的序列发生改变，有可能影响基因的选择性表达，而导致其他疾病的产生，B正确；将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德，C正确；即使加强监管、完善法律法规、完善技术手段，但基因编辑技术仍存在一定的安全性问题，D错误。 6.第三代试管婴儿技术也称胚胎植入前遗传学诊断(PGD)，是在试管婴儿技术基础上出现的。精子和卵子形成受精卵发育成早期胚胎后，要在植入子宫前进行基因检测，再进行胚胎移植。目前PGD能诊断一些单基因缺陷引发的疾病，如血友病等。回答有关问题： (1)试管婴儿技术包括　　　　　　、早期胚胎培养和胚胎移植。  (2)试管婴儿技术操作时，首先要采集卵子。在采集卵子之前，需要给母体注射适量的促性腺激素，目的是　　　　　　　　　　　。从母体的卵巢中采集的卵子　　　　(填“能”或“不能”)直接参与受精作用。在精子入卵后，　　　　会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。  (3)受精卵发育成4或8细胞胚时，若要进行血友病基因检测，可采用的检测技术有___________________　 (答出2点)。 (4)随着第三代试管婴儿技术的不断发展，将为不孕及基因缺陷患者带来福音。如果滥用该技术，将会对社会产生负面影响，滥用的表现有_______________________________________________________________　 ____________________________________________________________________________(答出一点即可)。  解析：(1)试管婴儿技术包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。(2)试管婴儿技术操作时，给母体注射适量的促性腺激素，目的是促进母体超数排卵，获得更多的卵细胞。从卵巢中采集的卵子不能直接参与受精作用，需在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。在精子入卵后，卵细胞膜会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。(3)受精卵发育成4或8细胞胚时，若要进行血友病基因检测，可采用PCR技术对目标基因进行扩增，或制备分子探针进行(DNA)分子杂交。(4)滥用第三代试管婴儿技术的表现有设计婴儿的性别。 答案：(1)体外受精　(2)促进母体超数排卵　不能　卵细胞膜　(3)(DNA)分子杂交、PCR　(4)设计婴儿的性别 [题后悟法] 1.生物武器的特点 (1)致命性、传染性强：一旦发生病例，易在人群中迅速传染流行，造成人员伤亡，甚至造成社会恐慌。 (2)生物专一性：生物武器可以使人、牲畜感染得病，并能危及生命，但是不破坏无生命物体，如武器装备、建筑物等。 (3)污染面广：现代生物武器可将生物战剂分散成气溶胶状，可造成大面积污染。 (4)有潜伏期：在适当条件下，有的致命微生物可以存活相当长的时间，如炭疽杆菌芽孢在阴暗、潮湿的土壤中甚至可以存活10年。 (5)难以发现：生物战剂气溶胶无色、无味，不容易被发现，若在夜间或多雾时偷偷使用就更难及时发现。 (6)传播途径多：呼吸、饮食、皮肤接触、昆虫叮咬等。 2.试管婴儿与克隆 (1)试管婴儿与设计试管婴儿技术的主要区别是设计试管婴儿多了胚胎移植前的遗传学诊断过程。 (2)试管婴儿技术与克隆技术在技术环节上的主要差异是前者需要经过体外受精，后者需要用到细胞核移植技术。 (3)试管婴儿技术属于有性生殖，克隆技术属于无性生殖。 (4)治疗性克隆与生殖性克隆过程中胚胎的处理方式不相同。治疗性克隆获得的早期胚胎主要用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的特定的细胞、组织和器官；在生殖性克隆过程中，获得的胚胎移入母体的子宫内发育成婴儿。 主攻学困点强化规范表达 　 根据下面的材料回答下列问题 　　害虫损伤番茄的叶片后，叶片细胞的细胞壁能释放出一种类激素物质，这种物质可以扩散到番茄的其他部位，诱导细胞内蛋白酶抑制剂基因表达，合成蛋白酶抑制剂，导致害虫因不能消化食物而死亡。科学家利用转基因技术把番茄的蛋白酶抑制剂基因转移到玉米中，使玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，有效抵御了玉米螟对玉米的危害。 1.在种植了这种转基因玉米的农田中，杂草是否也会出现抗玉米螟性状?原因是什么? 提示：不会。不同物种之间存在生殖隔离，玉米的花粉不能传递给杂草(或会。蛋白酶抑制剂基因通过玉米的花粉传递给杂草，使杂草获得抗虫基因，从而表现出抗玉米螟性状)。 2.抗玉米螟玉米具有显著的生态效应。你认为种植该玉米的农田是否还需要进行防虫管理?理由是什么? 提示：需要。转基因玉米能够抵抗玉米螟，但不一定能抵抗其他玉米害虫。 3.有人对食用该玉米的安全性表示担忧，你认为这种担忧有无道理?请简要说明理由。 提示：有道理。这种玉米的籽粒可能含有蛋白酶抑制剂，人食用后可能抑制人体蛋白酶的活性，影响人体健康(或没有道理。人体蛋白酶与玉米螟蛋白酶结构不同，玉米中的蛋白酶抑制剂对人体蛋白酶无影响)。 [课时跟踪检测] 一、选择题 1.(2025·保定模拟)近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是 (　 ) A.根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构 B.根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列 C.按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列 D.按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因 解析：选A　蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。其中根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构是最难实现的，故选A。 2.蛋白质的空间结构是生命科学研究领域的热点内容。某科研团队利用人工智能AI开发的AlphaFold2程序对大部分蛋白质结构的预测极为精准。下列叙述错误的是 (　 ) A.依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列 B.蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础 C.预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程 D.结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制 解析：选A　由于一种氨基酸可能有多种密码子，因此依据新蛋白质的氨基酸序列推出的基因序列不止一种，A错误。 3.(2025·张掖模拟)下列有关转基因产品安全性的叙述错误的是 (　 ) A.转基因产品需要经过一系列的安全性评价，符合相应标准后才能推广种植 B.转基因食品可能是转基因生物本身或其加工产品 C.转基因农作物产品一定可以增进人类健康 D.生产转基因大豆加工成的食用油一定要进行标识 解析：选C　转基因农作物产品的安全性还尚未得到确定结论，故转基因农作物产品不一定可以增进人类健康，C错误。 4.生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。下列叙述错误的是 (　 ) A.高致病性微生物须在高等级生物安全实验室中开展实验活动 B.只要有证据表明产品有害，就应该禁止转基因技术的应用 C.动物饲料中的抗生素会通过食物链使人体微生物耐药性增强 D.外来入侵物种可能在增加本土食物来源的同时给自然生态造成破坏 解析：选B　转基因作为一项技术本身是中性的，如果有证据表明某转基因产品有害，就应该禁止该转基因产品的使用，而不是禁止转基因技术的应用，B错误。 5.(2025·杭州一模)当前生物技术发展非常迅猛，很多生物技术的应用已经与我们的日常生活密切相关。下列有关生物技术的说法错误的是 (　 ) A.由于技术问题，生殖性克隆可能孕育出有严重生理缺陷的克隆人 B.为避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露基因检测的结果 C.对囊胚进行分割时，必须对整个胚胎结构进行均等分割 D.消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面 解析：选C　对囊胚进行胚胎分割时，必须对内细胞团进行均等分割，C错误。 6.(2025·重庆模拟)下列有关生物技术的安全性与伦理问题的叙述正确的是 (　 ) A.生物武器只包含致病菌类和病毒类，其攻击范围广、传播途径多、传播时具有潜伏期 B.需重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，不需要对治疗性克隆进行有效监管和严格审查 C.在转基因工作中科学家会采取很多方法防止基因污染，如阻断淀粉储藏使花粉失活 D.培养过微生物的培养基必须严格消毒后才能废弃，目的是防止微生物污染环境 解析：选C　生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，A错误；需重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，也需要对治疗性克隆进行有效监管和严格审查，B错误；在转基因工作中科学家会采取很多方法防止基因污染，如阻断淀粉储藏使花粉失活，C正确；培养过微生物的培养基必须严格灭菌后才能废弃，D错误。 7.每出生5 000名婴儿就有1人患有线粒体有害突变引起的疾病，可通过如下技术培育“三亲婴儿”，实现线粒体替代疗法阻断线粒体病的遗传，但这是一个充满了争议的技术。据此推测，下列叙述正确的是 (　 ) A.该技术涉及动物细胞核移植、动物细胞培养、体外受精等技术 B.利用该技术培育“三亲婴儿”属于无性生殖 C.卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因能遗传给“三亲婴儿” D.此技术之所以存在较大争议仅仅是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲和卵母细胞捐献者的部分基因的伦理问题 解析：选A　据图分析可知，该技术涉及动物细胞核移植、动物细胞培养、体外受精、胚胎移植等技术，A正确；该技术存在精子和卵母细胞的融合过程，属于有性生殖，B错误；卵母细胞捐献者提供的是细胞质，而红绿色盲基因位于细胞核内的染色体上，因此卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给“三亲婴儿”，C错误；此技术之所以存在较大争议不仅是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲和卵母细胞捐献者的部分基因的伦理问题，还存在技术尚不完备、仍需要更充足的检验等原因，D错误。 8.(2025·长沙模拟)苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性，但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将Cry蛋白第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性提高了7倍。下列叙述正确的是 (　 ) A.对Cry蛋白改造需要重新合成新的基因 B.通过测定DNA的序列确定定点突变是否成功 C.根据Cry蛋白的氨基酸序列只能推测出一种相应的mRNA序列 D.经改造后的苏云金芽孢杆菌中的Cry蛋白毒性提高这一性状不可遗传 解析：选B　对Cry蛋白改造通过改造编码Cry蛋白的基因来实现，A错误；DNA中碱基的排列顺序代表遗传信息，因此，可通过测定DNA的序列确定定点突变是否成功，B正确；由于密码子的简并性，根据Cry蛋白的氨基酸序列可以推测出多种mRNA序列，C错误；对编码Cry蛋白的基因进行定点突变，其遗传物质发生改变，故经改造后的苏云金芽孢杆菌中的Cry蛋白毒性提高这一性状是可以遗传的，D错误。 二、非选择题 9.(7分)(2025·沧州一模)人体内的t⁃PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程t⁃PA会诱发颅内出血。研究证实，将t⁃PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t⁃PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t⁃PA突变蛋白。如图表示相关的目的基因、载体及限制酶识别序列，pCLY11为质粒，neor为新霉素抗性基因。请回答下列问题。 (1)科学家将t⁃PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t⁃PA突变蛋白的生物技术手段属于　　　　　　　　　　范畴。该工程的基础是　　　　　　　　　　。(2分)  (2)获得性能优良的t⁃PA突变蛋白的正确顺序是　　　　　　(选择正确序号并排序)。(2分)  ①t⁃PA蛋白功能分析和结构设计　②借助定点突变改造t⁃PA基因序列　③检验t⁃PA蛋白的结构和功能　④设计t⁃PA蛋白氨基酸序列和基因序列　⑤利用工程菌发酵合成t⁃PA蛋白 (3)已知t⁃PA基因第84位半胱氨酸的编码序列(即模板链的互补链序列)为TGT，而丝氨酸的密码子是UCU。因此突变基因编码该氨基酸的序列应设计为　　　　　　　　　。(1分)  (4)若获得的t⁃PA 突变基因的黏性末端如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶　　　　　　切开，才能与t⁃PA突变基因高效连接。(2分)  解析：(1)由题干信息可知，题干所述的技术手段属于蛋白质工程，该工程的基础是基因工程。(2)获得性能优良的t⁃PA突变蛋白的正确顺序是①t⁃PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t⁃PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t⁃PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t⁃PA蛋白→③检验t⁃PA蛋白的结构和功能。(3)已知t⁃PA基因第84位半胱氨酸的编码序列为TGT，则相应的模板链上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t⁃PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则突变基因编码该氨基酸的序列应设计为TCT。(4)根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和Bgl Ⅱ切割质粒，才能与目的基因(t⁃PA突变基因)高效连接。 答案：(1)蛋白质工程　基因工程　(2)①④②⑤③　(3)TCT　(4)XmaⅠ、BglⅡ 10.(15分)(2024·河北高考)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(4分)  (2)利用　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　　　　　　　，通过　　 　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。(4分)  (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是__________________________________ 　　　　　。(3分)  (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　免疫和　　　　免疫。(2分)  (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　 　　(答出两点即可)。(2分)  解析：(1)根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为在水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。由图1可知，GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos的上游和下游都含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)可用农杆菌转化法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN基因表达情况，可用PCR技术检测r2HN基因是否转录出mRNA，若要检测r2HN基因是否翻译出r2HN蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。(3)选择单一位点插入目的基因的植株进行自交一代，根据分离定律，r2HN纯合体植株占1/4。由于纯合体植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合体植株进行后续研究。(4)通过体液免疫，机体可产生较多相应抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。据题图2可知，实验组的抗体和CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)明显高于对照组，因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗，有生产成本低、产量高、生物安全性较高、提取和处理目标产物简易等优点。 答案：(1)在水稻胚乳中特异表达的基因　终止转录过程　Hind Ⅲ　EcoR Ⅰ　(2)农杆菌转化　r2HN是否转录出mRNA　抗原—抗体杂交　(3)1/4　遗传性状稳定　(4)体液　细胞　(5)成本低、生物安全性较高(答案合理即可) 51 / 52 学科网（北京）股份有限公司 $$