第10单元 第47课时 基因工程的基本工具与操作程序（课件PPT）-【优化指导】2026年高考生物学一轮复习高中总复习·第1轮（云南专版）

高考总复习 生物学 第十单元　生物技术与工程 第47课时　基因工程的基本工具与操作程序 素养 目标 1. 基因结构决定其功能，掌握基因工程操作所需的基本工具及其特点。(生命观念) 2．阐明基因工程的基本操作程序，建立基因工程的操作流程模型。(科学思维) 3．进行DNA的粗提取与鉴定实验，掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法。(科学探究) 1．基因工程的概念 考点一 重组DNA技术的基本工具 2．基因工程的基本工具 (1)________________——“分子手术刀” 限制性内切核酸酶 考点一 重组DNA技术的基本工具 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” 考点一 重组DNA技术的基本工具 考点一 重组DNA技术的基本工具 (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 考点一 重组DNA技术的基本工具 1．辨析正误(正确的画“√”，错误的画“×”) (1)限制酶也可以识别和切割RNA。( 　) 提示：酶具有专一性，限制酶只能切割DNA。 (2)DNA连接酶可以连接磷酸二酯键，也可以连接氢键。( 　) 提示：DNA连接酶只能连接磷酸二酯键。 (3)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。( 　) (4)用作载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶切割位点。( 　) × × √ √ 考点一 重组DNA技术的基本工具 (5)E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率高于T4 DNA连接酶。( 　) 提示：E.coli DNA连接酶连接具有黏性末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 × 考点一 重组DNA技术的基本工具 2．教材深挖 (选择性必修3 P72～73拓展)天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？ ________________________________________________________ ________________________________________________________ 答案：不可以。具有能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以用作基因工程的载体。天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程。 考点一 重组DNA技术的基本工具 1．基因工程的理论基础 考点一 重组DNA技术的基本工具 2．与DNA有关的几种酶的比较 考点一 重组DNA技术的基本工具 考点一 重组DNA技术的基本工具 角度 基于基因工程所需工具酶，考查生命观念及科学思维 1．(2025·云南丽江模拟)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是(　　) 限制酶 名称 识别序列和 切割位点 限制酶 名称 识别序列和 切割位点 BamH Ⅰ G↓GATCC Kpn Ⅰ GGTAC↓C EcoR Ⅰ C↓AATTC Sau3A Ⅰ ↓GATC Hind Ⅱ GTY↓RAC Sma Ⅰ CCC↓GGG D 考点一 重组DNA技术的基本工具 注：Y为C或T，R为A或G。 A．Hind Ⅱ 、Sma Ⅰ 两种限制酶切割后形成平末端 B．Sau3A Ⅰ 限制酶的切割位点在识别序列的外部 C．BamH Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 考点一 重组DNA技术的基本工具 解析：Hind Ⅱ 、Sma Ⅰ 两种限制酶沿识别序列中轴线切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3A Ⅰ 限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamH Ⅰ 限制酶识别GGATCC序列，Sau3A Ⅰ 限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；Hind Ⅱ 能识别GTCAAC、GTTAAC、GTCGAC、GTTGAC，D错误。 考点一 重组DNA技术的基本工具 2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是Bgl Ⅱ 、EcoR Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 。下列分析错误的是 (　　) C 考点一 重组DNA技术的基本工具 A.构建DNA疫苗时，可用Bgl Ⅱ 和Sau3A Ⅰ 切割目的基因和质粒 B．图乙中只用EcoR Ⅰ 切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团 C．用EcoR Ⅰ 切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶 考点一 重组DNA技术的基本工具 解析：由分析可知，构建DNA疫苗时，可用Bgl Ⅱ 和Sau3A Ⅰ 切割目的基因和质粒，A正确；图乙中质粒只用EcoR Ⅰ 切割后获得的是一个链状DNA分子，含有2个游离的磷酸基团，B正确；用EcoR Ⅰ 切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，能产生多种连接产物如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向连接、目的基因与质粒反向连接等，C错误；基因表达包括转录和翻译两个过程，这两个过程都不需要解旋酶，D正确。 考点一 重组DNA技术的基本工具 限制酶的选择原则 考点一 重组DNA技术的基本工具 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst Ⅰ ，而不选择Sma Ⅰ 。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ 。 (3)确保出现相同末端原则：通常选择相同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲中Pst Ⅰ ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst Ⅰ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶。 考点一 重组DNA技术的基本工具 角度 基于载体的作用及特点，考查科学思维 3.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A．基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA分子进行筛选的标记基因 D 考点一 重组DNA技术的基本工具 解析：基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状双链DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA分子进行筛选的标记基因，D正确。 考点一 重组DNA技术的基本工具 4．(2025·河北石家庄模拟)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　　) D 考点一 重组DNA技术的基本工具 A．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ 和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C．若只用Pst Ⅰ 处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 考点一 重组DNA技术的基本工具 解析：构建重组质检时，用BamH Ⅰ 切割会破坏目的基因，只用Pst Ⅰ 切割会出现目的基因和质粒的自身环化，以及目的基因和质粒的反向连接，而用Pst Ⅰ 和Hind Ⅲ 切割，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ 切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 考点一 重组DNA技术的基本工具 根据质粒的特点确定所需限制酶 考点一 重组DNA技术的基本工具 1．目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因 ①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变____________或获得____________等的基因。主要是指__________的基因。 ②筛选目的基因的方法：从相关的已知____和____清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 结构 功能 考点二 基因工程的基本操作程序 (2)利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理：_______________。 ②条件：DNA模板、2种引物、___________________和4种脱氧核苷酸。 ③扩增过程 DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶 考点二 基因工程的基本操作程序 2．基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中________，并且可以____给下一代。 ②使目的基因能够____和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成 稳定存在 遗传 表达 考点二 基因工程的基本操作程序 考点二 基因工程的基本操作程序 考点二 基因工程的基本操作程序 项目 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、 ____________ 显微注射法 _____处理法 受体细胞 ______________ ______ 原核细胞 花粉管通道法 Ca2+ 体细胞或受精卵 受精卵 考点二 基因工程的基本操作程序 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA上 _______ 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 ____________ 个体生物学水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 PCR 抗原—抗体杂交 考点二 基因工程的基本操作程序 1．辨析正误(正确的画“√”，错误的画“×”) (1)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。( 　) (2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。( 　) (3)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射技术。( 　) (4)用PCR扩增目的基因时需要设计2种引物。( 　) √ √ √ √ 考点二 基因工程的基本操作程序 (5)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( 　) 提示：应用PCR技术，可以检测目的基因和相应mRNA的存在，但不能检测目的基因是否完全表达。 × 考点二 基因工程的基本操作程序 2．教材深挖 (1)(选择性必修3 P77拓展)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ ________________________________________________________ ________________________________________________________ (2)(选择性必修3 P80“图3-6”拓展)为什么切割含有目的基因的DNA片段和质粒要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？ ________________________________________________________ ________________________________________________________ 考点二 基因工程的基本操作程序 (3)(选择性必修3 P81“资料卡”改编)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中？ ________________________________________________________ ________________________________________________________ 考点二 基因工程的基本操作程序 答案：(1)DNA是反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3'端)开始，所以需要2种碱基序列不同的引物。 (2)选用同一种限制酶切割会产生相同的末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的不同种限制酶切割。 (3)Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA，可转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。 考点二 基因工程的基本操作程序 1．PCR技术和DNA复制的比较 考点二 基因工程的基本操作程序 2．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 项目 启动子 终止子 起始密 码子 终止密 码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基 因上游 目的基 因下游 mRNA 首端 mRNA 尾端 考点二 基因工程的基本操作程序 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下不编码氨基酸) 续表 考点二 基因工程的基本操作程序 3.筛选出含有目的基因的受体细胞 考点二 基因工程的基本操作程序 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如上图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。 (3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，即图中1、2、3、4、5菌落；再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，上图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，即图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 考点二 基因工程的基本操作程序 角度 基于PCR技术，考查科学探究 1.PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。下图为PCR技术原理示意图，下列对于图中物质和过程的说明，错误的是(　　) C 考点二 基因工程的基本操作程序 A．物质a：游离的脱氧核苷酸 B．过程①：氢键断裂 C．过程②：边解旋边复制 D．过程③：严格遵循碱基互补配对原则 考点二 基因工程的基本操作程序 解析：PCR模拟体内的DNA复制，所以物质a是DNA复制的原料——脱氧核苷酸，A正确；在94 ℃高温条件下，DNA分子双螺旋解开，形成单链，此时氢键断裂，B正确；体外模拟DNA的复制依据了DNA的热变性原理，该过程DNA分子不是边解旋边复制，C错误；DNA复制需要严格遵循碱基互补配对原则，D正确。 考点二 基因工程的基本操作程序 2．(2025·云南丽江模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如下图所示。下列有关叙述错误的是 (　　) C 考点二 基因工程的基本操作程序 A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变 C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 考点二 基因工程的基本操作程序 解析：若要使得目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时能够表达和发挥作用，需要构建基因表达载体，基因表达载体上还需要具备启动子和终止子等结构，A正确；单核苷酸的定点诱变改变了基因的碱基序列，属于基因突变，B正确；第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR产物DNA的一条链，以及侧翼引物，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用题目所述技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。 考点二 基因工程的基本操作程序 角度 基于基因工程的基本操作程序，考查科学思维及社会责任 3．戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如下图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是(　　) D 考点二 基因工程的基本操作程序 A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒 C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定 考点二 基因工程的基本操作程序 解析：戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，是获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是4种脱氧核苷酸，A错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动目的基因的转录；启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择来源于大肠杆菌细胞的启动子，B错误。将目的基因导入大肠杆菌的方法是用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。过程⑥大量制备pORF2蛋白前应进行目的基因的检测与鉴定，筛选出能表达pORF2蛋白的大肠杆菌进行培养，D正确。 考点二 基因工程的基本操作程序 4．(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是____________________________________________________________ ____________________________________________________________。 考点二 基因工程的基本操作程序 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 ________________________________________________________ ________________________________________________________。 能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是____________。 考点二 基因工程的基本操作程序 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是______________________________________ __________________________________________________________。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 考点二 基因工程的基本操作程序 答案：(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，其不含乙肝病毒的遗传物质，无法在宿主体内增殖 (2)鉴别受体细胞(酵母菌)中是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因)，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来　RNA聚合酶 (3)染色体DNA　被标记的目的基因的单链DNA片段 (4)从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应抗体进行抗原—抗体杂交。 考点二 基因工程的基本操作程序 解析：(1)重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)，其不含乙肝病毒的遗传物质，注入人体后，无法完成遗传物质的复制与蛋白质的合成，因此不会在人体中产生乙肝病毒。(2)抗生素抗性基因为标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。RNA聚合酶识别载体中的启动子并驱动目的基因的转录。(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取染色体DNA进行DNA分子杂交，以被标记的目的基因的单链DNA片段为探针， 考点二 基因工程的基本操作程序 如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，应从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 考点二 基因工程的基本操作程序 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)实验步骤 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验原理 ①PCR原理：利用了______________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷____的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__________等有关。 DNA的热变性 相反 大小和构象 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)实验步骤 ①DNA片段的扩增 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②DNA片段的电泳鉴定 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)结果分析与评价 ①成功扩增出DNA片段的判断依据是____________________________ _______。 ②进行电泳鉴定的结果应该是___条条带。如上图所示，该片段大小约为___bp。 可以在紫外灯下直接观察到D NA条带 1 750 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．DNA的粗提取与鉴定的注意事项 (1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 (2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为实验材料。 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3)鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加2 mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 (2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。 (4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 (5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 角度 基于DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究 1．(2023·广东高考)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 D 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 解析：将提取的丝状物或沉淀物溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，溶液呈现蓝色，D错误。 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 角度 基于DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究 2．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是(　　) A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 B．PCR利用了DNA的热变性原理 C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，微量移液器上的枪头都必须更换 C 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 解析：PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同时保护酶的活性不被破坏，C错误。 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 3．亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的880 kb至903 kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如下图所示，下列说法不正确的是 (　　) A 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR B．图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的 C．据图分析可知，相对分子质量较大的扩增产物与点样处的距离较小 D．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 解析：由于8号染色体的880 kb至903 kb区间与突变体的光籽表型相关，故应该提取该突变体和野生型的8号染色体上的DNA进行扩增，A错误；图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，主要依据分子量不同，采用外加电场使其分开，B正确；由图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较小，C正确；根据野生型和突变体经引物6扩增的产物不同可知，8号染色体上的第6对引物对应区间发生了基因突变是突变体光籽性状出现的根本原因，D正确。 考点三 (实验)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．(2024·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是 (　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 A 解析：研磨后，可以将研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，可以不使用离心机，A正确、B错误；鉴定过程中的沸水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误；该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置一个加二苯胺不加DNA的对照组，D错误。 2．(2024·浙江6月选考)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶Apo Ⅰ 消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是 (　　) A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 B 解析：根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，具有氯喹抗性的基因组没有Apo Ⅰ 酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶Apo Ⅰ 消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确。 3．(2024·江西高考)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A。构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 (　　) A A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代Nco Ⅰ 和Kpn Ⅰ 构建重组质粒 解析：题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coli B中能表达L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能而是作为底物，B错误；E.coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L-谷氨酸钠，而E.coli B中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸钠，生产γ-氨基丁酸，C错误；选择限制酶 时需考虑多重条件，如确保目的基因不被限制酶破坏、切割位点应精准位于启动子和终止子之间、避免对启动子和终止子造成任何损害等，同时在设计特异性引物时，还需要在其5'端设计限制酶酶切位点，以便构建重组质粒，根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代Nco Ⅰ 和Kpn Ⅰ ，D错误。 4．(2023·新课标全国卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如下图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 解析：酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，但连接效率相对较低，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，两者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 5．(2024·新课标全国卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的 Ⅰ 和 Ⅱ 、 Ⅲ 和 Ⅳ 酶切位点之间，原因是____________________ ____________________________________________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 ___________________________________________________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是___________________________________ ___________________________________________________________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是__________________________________________________________ _______________________________________________(答出2点即可)。 答案：(1)磷酸二酯键　保证片段甲含有启动子和终止子，插入B1基因组后N基因能正常表达 (2)C—G、U—A、A—T　 (3)菌株B2的基因组DNA　无扩增产物　 (4)实现废物利用，减少环境污染 解析：(1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的 Ⅰ 和 Ⅱ 、Ⅲ 和 Ⅳ 酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，从而使N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C、C—G、U—A、A—T。(3)由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2” 可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。结合题图分析可知P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。(4)焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。 ►情境素材 长期高血糖可引发血管细胞衰老。科研人员为研究S蛋白在高血糖引发的血管细胞衰老中的作用，以腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。 ►命题设计 设计1　考查信息获取与应用能力 (1)腺病毒的遗传物质为DNA，其复制需要E1、E2、E3基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，如图1所示。在构建含S基因的重组质粒时，通过______________________________的方法可检测重组质粒是否插入了S基因。将图1中含S基因的重组质粒用__________酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；将其导入A细胞(A细胞含有E3基因，可表达E3蛋白)，如图2所示。腺病毒DNA在A细胞内能够________________________________，从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。 设计2　考查理论知识的迁移与长句表达能力 (2)综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点：______________________________________________________________________________________________________________(写出两点)。 设计3　考查实验分析与长句表达能力 (3)用含S基因的重组腺病毒分别侵染正常人及糖尿病患者的血管细胞，使S蛋白在血管细胞中大量表达。对正常人、糖尿病患者及两者转入S基因后血管细胞中能促进细胞衰老的 Ⅰ 蛋白进行检测，结果如图3所示(颜色越深代表表达量越高)。可用________________方法检测 Ⅰ 蛋白的表达量，实验结果显示________________血管细胞中 Ⅰ 蛋白表达量最高，据此推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是________________________________________________ _______________________________________________。 答案：(1)设计S基因特异的引物进行PCR　Pac Ⅰ 　复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成 (2)重组腺病毒只能在A细胞中复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因 (3)抗原—抗体杂交　糖尿病患者(或2组)　S蛋白通过降低 Ⅰ 蛋白的含量，抑制高血糖引发的血管细胞衰老 解析：(1)在构建含S基因的重组质粒时，通过设计S基因特异的引物进行PCR可检测重组质粒是否插入了S基因。根据图1中限制酶切割位点可知，图1中含S基因的重组质粒用Pac Ⅰ 酶切割后，获得改造后的腺病毒DNA；腺病毒DNA在A细胞内能够复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。(2)从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点是重组腺病毒只能在A细胞中复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不 含致病基因。(3)检测 Ⅰ 蛋白的表达量可用抗原—抗体杂交的方法，图3中显示糖尿病患者血管细胞中 Ⅰ 蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是S蛋白通过降低 Ⅰ 蛋白的含量，抑制高血糖引发的血管细胞衰老。 请完成：课时跟踪练(47) 温馨提示 谢谢观看！ (3)基因表达载体的构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 $$