2026届高考生物一轮复习讲义第57讲　基因工程的基本工具与操作程序

第57讲　基因工程的基本工具与操作程序 【课标要求】 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的； 2.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具； 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 考点1　基因工程的基本工具 考 点 透 析 知识1　基因工程概述 基因工程又叫作重组DNA技术。 项目 内容 主要技术 转基因技术 操作环境 体外 操作水平 DNA分子水平 理论依据 基因重组 供体 提供目的基因 受体 复制或表达目的基因 基本过程 切割→改造和拼接→导入→表达 优点 克服远缘杂交不亲和的障碍， 定向改造生物的遗传性状 知识2　基因工程的基本工具 1. 限制性内切核酸酶(限制酶) 图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开产生的是平末端。 2. DNA连接酶 (1)作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两个DNA片段。 (2)主要类型：①E.coli DNA连接酶：从大肠杆菌中分离；②T4_DNA连接酶：从T4噬菌体中分离。两者都能连接黏性末端和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。  归 纳 总 结 与DNA有关的酶 酶 作用 作用相关“键” 限制酶 切割DNA片段，产生两个(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段 破坏磷酸二酯键 DNA 连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链(ATP 水解供能) 破坏氢键(氢键非化学键) DNA 聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键 DNA (水解)酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 形成磷酸二酯键 3. 载体 (1)作用：将基因送入细胞。 (2)种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 (3)重要的载体之一——质粒 ①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②质粒适于作基因载体的特点(载体须具备的条件) 特点(条件) 作用 有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段插入其中 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制 便于目的 DNA 在受体细胞中稳定存在 带有标记基因(常是人工改造后具有)，一般为抗生素抗性基因或荧光基因等 便于重组DNA分子的筛选(鉴定目的基因是否导入成功)  深 度 指 津 最常见的标记基因——抗生素抗性基因 目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示(以氨苄青霉素抗性基因为例)： 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)目前使用的限制酶都是从原核生物中得到的。(×) 提示：限制酶主要是从原核生物中得到的，目前许多已商业化生产。 (2)质粒是存在于细菌细胞中的一种细胞器。(×) 提示：质粒不是细胞器。 (3)重组DNA技术所用的工具酶包括限制酶、DNA连接酶和载体。(×) 提示：重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶。 (4)不同的限制酶切割DNA，可能得到相同的黏性末端。(√) (5)用DNA连接酶可连接两种来源不同的DNA。(√) (6)用同一种限制酶切割目的基因和质粒，是为了获得相同的黏性末端，以便连接。(√) (7)限制酶的识别序列都由6个核苷酸组成。(×) 提示：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 2. 限制酶在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？请解释。 提示：原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，是因为酶具有专一性(细胞自身不含相应碱基序列)或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。 典 题 说 法 考向1　基因工程中工具酶的选择和利用 例1 (2023·重庆卷)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(B) A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 【解析】由于引物只能引导子链从5′到3′延伸，题干假设引物长度为8个碱基，由题图DNA片段中序列可知，其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′，另一个引物序列为5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；步骤①用到两种限制酶切割，这两种限制酶的识别序列不同，载体一般为环状，且载体中至少含有1个限制酶NheⅠ的识别序列，至少有1个CfoⅠ的识别序列，因此用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都可以连接黏性末端，D正确。 变式 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题： 限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ Sma Ⅰ 识别序 列及切 割位点 GATCC CCTA G AGCTT TTCG A AATTC CTTA G CC GGG GG CCC (1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有0、2个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。 (3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因。 (4)与只使用EcoR Ⅰ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。 (6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的细胞。 【解析】(1)质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。(2)由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成两个氢键，所以SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性就越高。(3)质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位点，都可以被SmaⅠ破坏，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA。(4)只使用EcoR Ⅰ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用DNA连接酶连接时，会产生质粒和目的基因的自身连接物，而利用BamHⅠ和Hind Ⅲ剪切时，质粒和目的基因两端的黏性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。(5)质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要DNA连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。(6)质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。  深 度 指 津 限制酶选择的常见考查方向 (1)载体上的标记基因至少保留一个(选择培养基中加对应的抗生素，且受体细胞不能有该标记基因)。 (2)只能切割目的基因两侧的序列，不能切割内部，否则导致目的基因插入失活。 (3)目的基因应插在启动子和终止子之间。 (4)合理选择单酶切或者双酶切，即注意区分正向插入正常表达和反向插入异常表达。 (5)不能破坏载体上的有用序列，如启动子、终止子和复制原点等。 (6)要破坏对受体细胞不利的DNA片段，如ccdB片段，其表达产物抑制DNA复制，导入细胞后阻碍受体细胞存活，难以形成单菌落。 (7)农杆菌转化法中最关键的是T－DNA序列，目的基因必须插在T－DNA上启动子和终止子之间，最终转化到植物染色体的标记基因也是T－DNA上的。 (8)注意长序列里面是否含有短序列的酶切位点，比如能被A酶(GGATCC)识别的DNA序列，也可被B酶(GATC)识别。 (9)注意同尾酶拼接产物不一定还能被原先酶识别(限制酶的特征是识别特定核苷酸序列，切割特定位点，对碱基序列有严格要求)。 (10)双酶切不一定能实现目的基因定向插入正常表达，比如同尾酶，比如双平末端。能实现目的基因定向插入的可能是“一平一黏”或“双黏不同”。 提醒：如果对限制酶的选择仍有困难，建议考虑“排除法”。 考向2　基因载体和标记基因 例2 (多选)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是(AC) A．克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子 B．两种载体都要具有一个或多个限制酶切点，以便目的基因的插入 C．表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点 D．质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体 【解析】克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，故克隆载体必须具备的元件是复制原点、标记基因，而启动子和终止子是参与转录过程的，A错误；表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达，包括转录和翻译，因此表达载体的元件中必须含有标记基因(用来筛选表达载体)，也需要复制原点，保证表达载体能在受体细胞中自我复制，C错误。 考点2　基因工程的操作程序 考 点 透 析 知识1　基因工程的基本操作程序 1. 目的基因的筛选与获取 2. 基因表达载体的构建(核心工作) (1)过程 (2)基因表达载体的组成  深 度 指 津 复制原点≠启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 (1)启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，基本组成单位是脱氧核苷酸，其位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，其自身不转录。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游。一个DNA上有多个启动子。启动子靠近模板链的3′端。 (2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。起始密码子靠近mRNA的5′端。 (3)复制原点是DNA上的一段序列，富含A—T，是DNA复制开始的地方，一个DNA有一个或多个复制原点。 3. 将目的基因导入受体细胞 受体细胞 常用方法 操作过程 植物细胞(常用体细胞或受精卵) 花粉管通道法(我国独创) 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房； 方法二：将DNA溶液滴加在授粉后一定时间内的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→感染植物细胞→T－DNA整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 动物细胞(常用受精卵) 显微注射法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞 Ca2＋处理法 (感受态 细胞法) Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收周围环境中的DNA分子  解 疑 释 惑 (1)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。 (2)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其 Ti质粒上的T－DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。 4. 目的基因的检测与鉴定 (1)通过PCR等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 (2)利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。 (3)进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 注：若用报告基因，如绿色荧光蛋白基因与目的基因构建融合基因，可根据荧光情况进行定性、定量和定位的研究分析。 知识2　PCR技术 1. 原理：DNA半保留复制和DNA的热变性。 2. 特点：可在短时间内大量扩增目的基因。 3. PCR反应所需的条件及作用 条件 作用 有一段已知目的基因的核苷酸序列 便于合成引物 在一定的缓冲液中进行 提供相对稳定的pH环境 4种脱氧核苷酸(实际上用脱氧核苷三磷酸，即dNTP) 作为合成DNA子链的原料，同时提供能量 DNA母链 作为DNA复制的模板 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 催化合成DNA子链 引物(是一小段短单链核酸，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 4. 过程及图解 　 循环重复上述过程，n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍。 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)利用PCR技术扩增目的基因时，两种引物的碱基序列应互补。(×) 提示：利用PCR技术扩增目的基因时，两种引物间的碱基序列一般不能互补。除非是重叠延伸 PCR 和多片段的无缝克隆。 (2)体内DNA复制和PCR技术都需要解旋酶打开DNA双螺旋。(×) (3)体内DNA复制和PCR过程中，都是一条链连续复制(前导链)，一条链不连续(后随链)。(×) 提示：PCR中，两条子链都是连续合成的。 (4)构建基因表达载体时，须将目的基因插入启动子与终止子之间。(√) (5)农杆菌转化法常用的受体细胞是花粉细胞。(×) 提示：农杆菌转化法的受体细胞常见的是双子叶植物和裸子植物体细胞，目前该方法在某些单子叶植物中获得了成功。 (6)目的基因必须整合到受体细胞的DNA中才能复制。(×) 提示：目的基因没有整合到受体细胞前可随质粒复制而复制。 (7)农杆菌转化法实质是将Ti质粒转移到宿主细胞的染色体上。(×) 提示：农杆菌转化法实质是将Ti质粒上的T－DNA(含目的基因)转移到宿主细胞的染色体上。 2. 要合成有生物活性的胰岛素，为什么受体细胞最好用单细胞真核生物？ 提示：胰岛素是分泌蛋白，形成成熟的胰岛素需要内质网、高尔基体的加工、分泌，故最好选用真核生物如酵母菌作受体细胞。从另一个角度分析，也便于从培养液中分离目的基因的表达产物。 3. 自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有片段的3′端来合成子链(延伸方向是5′→3′)。 典 题 说 法 考向1　基因表达载体的构建 例1 (2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(D) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 【解析】若只用HindⅢ一种酶切割质粒和目的基因，则产生相同的黏性末端，可能导致目的基因正向连接或反向连接，故目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，则会破坏氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，而重组质粒和空质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，则目的基因插入四环素抗性基因(TetR)中，重组质粒的大小与空质粒不同，故可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因(TetR)，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响，则重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 变式 我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T－DNA的加工和转移。下列叙述错误的是(C) A．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶Ⅲ B．利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 C．用含卡那霉素的选择培养基筛选成功导入抗冻基因的受体细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量 【解析】限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因，影响后续的筛选，限制酶Ⅱ有两个识别位点，会影响目的基因连接在正确的位置，且会破坏Vir区，因此应选择限制酶Ⅲ，A正确；利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物，目的是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B正确；由于四环素抗性基因在T－DNA片段中，该基因会随着目的基因进入受体细胞，因此，要用含四环素的选择培养基筛选含抗冻基因表达载体的受体细胞，C错误；基因的表达产物是蛋白质，故可用抗原—抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量，D正确。 考向2　基因工程的操作过程 例2 (2024·淮安调研)乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术(原理见图1)，可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点，图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义表达载体的结构示意图。 (1)从番茄体内提取RNA作为模板，通过逆转录(或反转录)合成ACC氧化酶和ACC合成酶基因，合成的基因中不含(填“含”或“不含”)启动子区域。 (2)该技术首先需要合成ACC氧化酶和ACC合成酶的融合基因，通过PCR合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶XbaⅠ对上述两个基因进行酶切，再用DNA连接酶处理形成融合基因，相应的表达载体应用限制酶BamHⅠ和SacⅠ进行切割，确保融合基因能够插入载体中。 (3)图2中的启动子2A11为特异性启动子，为了达到目的，启动子2A11应在番茄的果实(器官)中特异性启动基因转录。将融合基因反向(填“正向”或“反向”)插入启动子下游即可构成反义融合基因。将图中表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。2A11启动子和反义融合基因都应该位于T－DNA片段内，原因是T－DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上。 (4)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，不能(填“能”或“不能”)用放射性标记的ACC氧化酶基因片段做探针进行检测，理由是番茄细胞内本来就存在ACC氧化酶基因。 (5)研究人员尝试从个体水平鉴定转基因是否成功，请设计实验方案并预测实验结果： 取转基因番茄和非转基因番茄，检测其乙烯含量(或同等条件下成熟程度)，若转基因番茄乙烯含量低(或成熟程度低)，说明转基因成功。 【解析】(1)由RNA合成DNA的过程是逆转录过程；由于mRNA中没有启动子、终止子的对应碱基序列，且转录后内含子对应的碱基序列被切除，从部分基因文库中获取的DNA没有启动子、内含子和终止子等。(2)因为合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，所以都可以用XbaⅠ对上述两个基因进行酶切，再将得到的两个基因用DNA连接酶连接形成融合基因，最后对相应的Ti质粒应用限制酶BamHⅠ和SacⅠ切割，把融合基因插入载体中。(3)分析题意可知，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶，本技术是为了使番茄具有耐储存、宜运输的优点，故为了达到目的，启动子2A11应在番茄的果实中特异性启动基因转录；为了实现图1中反义基因的效果，将融合基因反向插入启动子2A11的下游即可构成反义融合基因。将图中表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有卡那霉素的培养基中，能够存活的农杆菌含有反义融合基因，将筛选出含有反义融合基因的农杆菌再利用农杆菌转化法获得转基因番茄；由于T－DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上，故2A11启动子和反义融合基因都应该位于T－DNA片段内。(4)由于番茄细胞内本来就存在ACC氧化酶基因，故在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，不能用放射性标记的ACC氧化酶基因片段做探针进行检测。 配套精练 第57讲　基因工程的基本工具与操作程序 一、 单项选择题 1. 下列有关重组DNA技术的基本工具的叙述，正确的是(B) A．限制酶能够识别RNA分子的特定核苷酸序列 B．携带外源DNA片段的质粒可在受体细胞中进行复制 C．DNA连接酶不能连接双链DNA片段的平末端 D．DNA连接酶能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 【解析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开磷酸二酯键，A错误；携带外源DNA片段的质粒可在受体细胞中进行复制，质粒可以作为目的基因的载体，B正确；E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接双链DNA片段的平末端，C错误；DNA连接酶能够连接双链DNA片段，形成磷酸二酯键，氢键自动生成，D错误。 2. (2025·扬州期初)目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA克隆和DNA分子杂交，如图所示。下列有关叙述错误的是(B) A．方法①需要限制酶和DNA连接酶 B．方法②需要解旋酶和DNA聚合酶 C．方法③需要对探针进行特殊标记 D．方法①②③都遵循碱基互补配对原则 【解析】方法①中需要构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞，要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；方法②体外扩增技术中通过高温使DNA解旋，不需要解旋酶，B错误；方法③需要对探针进行特殊标记，这样才能特异性检测，C正确。 3. (2024·湖南卷)某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(B) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【解析】限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对 DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 4. (2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(C) 　 　 　 A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【解析】酶3切割后得到的是平末端，E.coli DNA连接酶连接平末端效率低，应该用T4 DNA连接酶连接；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选。 5. 如表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是(C) 限制酶种类 序列及切点 ①EcoRⅠ ②BamHⅠ ③BglⅡ ④NotⅠ 　 A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端 B．①切出的DNA片段，只有用E.coli DNA连接酶才能连接起来 C．②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割 D．构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接 【解析】①②③④均为限制酶，它们可催化磷酸二酯键断裂，但不能催化氢键断裂，且均形成黏性末端，A错误；①切出的DNA片段带有黏性末端，用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来，B错误；②③切出的黏性末端相同，用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为，不能再被②或③识别切割，C正确；构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。 6. 重组质粒可以携带目的基因进入受体细胞，则下列不一定可以说明目的基因成功导入受体细胞的是(B) A．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA B．水稻细胞中检测到氨苄青霉素抗性基因 C．棉花细胞中检测到抗棉铃虫基因 D．鲤鱼细胞中检测到人的生长激素 【解析】氨苄青霉素抗性基因属于标记基因，水稻细胞中检测到氨苄青霉素抗性基因不能说明目的基因成功导入受体细胞，也可能导入了空载体。 7. (2025·如皋期初)科研人员将四种酶的基因(EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR)与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图)，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法正确的是(C) A．限制酶需要识别特定的序列，具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 B．含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 D．利用PCR等技术检测OsGLO1基因是否转录时，需要的酶是Taq DNA聚合酶 【解析】限制酶需要识别特定的序列，具有专一性，DNA连接酶具有专一性，但对碱基序列无专一性，A错误；卡那霉素抗性基因不在T－DNA上，不能进入植物细胞，成功导入四种目的基因的植物受体细胞在含潮霉素的培养基上能够存活，导入或者未导入目的基因的植物细胞在含卡那霉素的培养基上都不能存活，B错误；利用PCR等技术检测OsGLO1基因是否转录时，需要逆转录酶和Taq DNA聚合酶，D错误。 8. 如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(D) A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得含该序列的双链产物 【解析】根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，再调节温度使子链沿着引物的3′端延伸，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，则需消耗引物③的数目为7个，C错误。9. 在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。如图为花粉管通道法的一般原理示意图。相关叙述正确的是(C) A．外源DNA进入胚囊最终获得的种子均含有目的基因 B．植物生长各个时期均可通过花粉管通道导入外源DNA C．花粉管通道法最大的优点是无需植物组织培养，技术简单 D．含外源DNA的种子发育成植株后均具有相应性状 【解析】外源DNA进入胚囊，不一定能整合到染色体上，故最终获得的种子不一定含有目的基因，A错误；图示花粉管通道法应在雌蕊成熟时进行操作，B错误；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，无需经过植物组织培养这一过程，C正确；含外源DNA的种子发育成的植株不一定具有相应性状，还需进行个体生物学水平等的检测，D错误。 二、 多项选择题 10. (2024·海安中学)反向PCR是一种通过已知序列设计反向引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如下图所示。相关叙述正确的有(AD) A．过程①可用同一种限制酶对未知序列两端进行切割 B．过程③和①获得的DNA片段长度相同，序列不同 C．过程②需使用DNA连接酶，形成氢键和磷酸二酯键 D．该技术可检测T－DNA整合到植物细胞染色体DNA上的位置 【解析】反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，即这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。过程③为PCR扩增，过程③和①获得的DNA片段长度不同，B错误；DNA连接酶只作用于磷酸二酯键，C错误。 11. (2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是在PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入 ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(AC) A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【解析】利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3 ′ 终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，患者的测序结果为5′-CTACCTGTGAT-3′，C正确。对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 三、 非选择题 12. (2024·重庆卷节选)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ中。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断，构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是EcoRⅠ。此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大。 【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏。根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时容易出现自我环化，也无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切，酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。(4)根据题目信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测，品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 13. (2025·南通如东期初)铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。某科研团队研究发现，铝胁迫可诱导铝耐受型大豆根尖SGF14a基因(简称S基因)的表达。为了验证SGF14a基因在植物应答铝胁迫中的作用，研究人员构建含SGF14a基因的表达载体，将其转化到烟草细胞，进而获得转基因烟草，并对转基因烟草进行铝耐受性的研究，具体操作流程如图1所示。请回答下列问题： 图1 (1)提取铝耐受型大豆根总RNA，在逆转录酶的催化下合成cDNA，最终获得S基因。根据S基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，两条引物设计时常加入不同的限制性内切核酸酶切割位点，主要目的是使S基因能定向插入表达载体，防止反向连接和自身环化。已知图中大豆S基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，选用的引物组合应为引物1和引物4。 (2)PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能是AD(2分)。 A．引物特异性不高 B．热变性时间过长 C．延伸时间过长 D．复性温度过低 (3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含卡那霉素(填抗生素)的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株，生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是生芽培养基中细胞分裂素与生长素比值较高。 (4)为了探究转基因烟草对铝胁迫的耐受性，用50 μmol·L－1 AlCl3处理含有SGF14a基因的两个转基因烟草株系(S1和S2)和野生型烟草(WT)的无菌苗的根，24 h后分析烟草根相对生长量，结果显示转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，请结合图2分析，其原因可能是烟草细胞中S基因的表达能增加可溶性蛋白含量，增强烟草对铝胁迫的耐受性(2分)。 图2 (5)为确定转S基因的烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株是否增强，实验小组设计实验进行个体生物学水平的鉴定，将等量的转S基因的烟草植株和野生型的烟草植株(2分)栽培到酸性土壤中，其他条件均适宜，培养适宜时间后，观察植株的生长情况。 【解析】(1)提取铝耐受型大豆根总RNA，在逆转录酶的催化下合成cDNA，最终获得S基因。根据S基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，两条引物设计时常加入不同的限制性内切核酸酶切割位点，主要目的是使S基因能定向插入表达载体，防止反向连接和自身环化。已知图中大豆S基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，PCR扩增时要扩增A位点和B位点之间的片段，DNA聚合酶从引物的3′端开始沿着模板链合成新的DNA链，因此选用的引物组合应为引物1和引物4。(2)PCR中产生非特异性产物的原因可能是引物特异性不高、复性温度过低。(3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含卡那霉素的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株。生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是生芽培养基中细胞分裂素与生长素比值较高。(4)转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，原因可能是烟草细胞中S基因的表达能增加可溶性蛋白含量，增强烟草对铝胁迫的耐受性。(5)个体生物学水平鉴定转S基因的烟草植株的抗铝毒能力，可以将等量的转S基因的烟草植株和野生型的烟草植株栽培到酸性土壤中，其他条件均适宜，培养适宜时间后，观察植株的生长情况。 14. (2025·海安期初)Mst1是一种蛋白激酶，高脂饮食会持续激活Mst1基因导致心肌损伤。为探究上述机制，科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠的Mst1基因，过程如图1所示，请回答下列问题： 图1 (1)科研人员分别设计sgRNA基因的正向序列与反向序列，使二者退火形成sgRNA基因，其中sgRNA1基因正向序列为5′－ACCGCACC……GGCC－3′，其设计依据有载体上一端的黏性末端和Mst1基因的部分序列(2分)，sgRNA1基因反向序列为5′AAACGGCC……GGTG3′。 (2)与sgRNA基因相比，sgRNA特有的化学成分有核糖和尿嘧啶。应将sgRNA基因序列插入载体启动子和终止子之间，有利于其表达。 (3)过程①需要DNA连接酶，过程②通过显微注射(技术)将两个载体导入野生型小鼠的受精卵中，表达出sgRNA和Cas9核酸酶，组装后切割Mst1基因。 (4)有研究人员优化了实验方法：在体外合成sgRNA和Cas9 mRNA，利用脂质体包裹导入受精卵，该过程sgRNA和Cas9 mRNA进入细胞的方式为胞吞。与上图相比，该方法能较快启动基因敲除，原因是无需转录。 (5)科研人员利用野生型小鼠和Mst1基因敲除小鼠进行了下列各组实验，培养一段时间后，分别检测各组小鼠的Drp1(促进线粒体进行碎片化分裂的蛋白)和β－actin(细胞中含量稳定，作为对照)表达水平，结果如图2。 图2 由图可知，高脂饮食条件下，Mst1通过促进Drp1基因的表达，导致线粒体碎片化分裂(2分)，从而引起心肌的损伤。 【解析】(1)据图可知，设计sgRNA基因序列的依据是载体一端的黏性末端和Mst1基因的部分核苷酸序列。已知sgRNA1基因正向序列为5′－ACCGCACC……GGCC－3′，根据图示信息和题干信息可知，sgRNA1基因反向序列为5′－AAACGGCC……GGTG－3′。(2)sgRNA基因是DNA，与DNA相比，sgRNA特有的化学成分是核糖和尿嘧啶。在构建表达载体时，需要将目的基因插入在载体的启动子和终止子之间。(3)根据图示可知，①过程属于载体的构建，在构建载体时需要用到限制酶和DNA连接酶。过程②是将载体导入小鼠的受精卵中，通常采用显微注射技术。(4)利用脂质体包裹进入受精卵中的方式属于胞吞。因为注入的是RNA，不需要经过转录过程，所以能够更加快速地启动基因敲除。(5)根据题干信息可知，Drp1是能够促进线粒体进行碎片化分裂的蛋白。根据图示结果显示可知，高脂饮食中的小鼠Drp1的表达量强于正常饮食中的小鼠，且在正常饮食条件下，野生型小鼠与Mst1基因敲除小鼠的Drp1的表达量基本相同；但是在高脂饮食条件下，与野生型小鼠相比，Mst1基因敲除小鼠的Drp1的表达量低，因此可知，在高脂饮食条件下，Mst1通过促进Drp1基因的表达，使线粒体过度碎片化分裂，从而引起心肌的损伤。 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第57讲　基因工程的基本工具与操作程序 【课标要求】 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的； 2.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具； 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 考点1　基因工程的基本工具 考 点 透 析 知识1　基因工程概述 基因工程又叫作重组DNA技术。 项目 内容 主要技术 转基因技术 操作环境 操作水平 理论依据 基因重组 供体 提供 受体 复制或表达目的基因 基本过程 切割→改造和拼接→导入→表达 优点 克服 的障碍， 定向改造生物的 知识2　基因工程的基本工具 1. 限制性内切核酸酶(限制酶) 图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是 ，在识别序列中心轴线处切开产生的是 。 2. DNA连接酶 (1)作用：在两个核苷酸之间形成 以连接两个DNA片段。 (2)主要类型：①E.coli DNA连接酶：从 中分离；② ：从T4噬菌体中分离。两者都能连接 和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。  归 纳 总 结 与DNA有关的酶 酶 作用 作用相关“键” 限制酶 切割DNA片段，产生两个(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段 破坏磷酸二酯键 DNA 连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链(ATP 水解供能) 破坏氢键(氢键非化学键) DNA 聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键 DNA (水解)酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 形成磷酸二酯键 3. 载体 (1)作用：将基因送入细胞。 (2)种类：质粒、 、动植物病毒等。 (3)重要的载体之一——质粒 ①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的 。 ②质粒适于作基因载体的特点(载体须具备的条件) 特点(条件) 作用 有一个至多个 供外源DNA片段插入其中 能在细胞中进行 ，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制 便于目的 DNA 在受体细胞中稳定存在 带有 (常是人工改造后具有)，一般为抗生素抗性基因或荧光基因等 便于重组DNA分子的筛选(鉴定目的基因是否导入成功)  深 度 指 津 最常见的标记基因——抗生素抗性基因 目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示(以氨苄青霉素抗性基因为例)： 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)目前使用的限制酶都是从原核生物中得到的。( ) (2)质粒是存在于细菌细胞中的一种细胞器。( ) (3)重组DNA技术所用的工具酶包括限制酶、DNA连接酶和载体。( ) (4)不同的限制酶切割DNA，可能得到相同的黏性末端。( ) (5)用DNA连接酶可连接两种来源不同的DNA。( ) (6)用同一种限制酶切割目的基因和质粒，是为了获得相同的黏性末端，以便连接。( ) (7)限制酶的识别序列都由6个核苷酸组成。( ) 2. 限制酶在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？请解释。 典 题 说 法 考向1　基因工程中工具酶的选择和利用 例1 (2023·重庆卷)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( ) A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 变式 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题： 限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ Sma Ⅰ 识别序 列及切 割位点 GATCC CCTA G AGCTT TTCG A AATTC CTTA G CC GGG GG CCC (1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。 (3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。 (4)与只使用EcoR Ⅰ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。 (6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是 。  深 度 指 津 限制酶选择的常见考查方向 (1)载体上的标记基因至少保留一个(选择培养基中加对应的抗生素，且受体细胞不能有该标记基因)。 (2)只能切割目的基因两侧的序列，不能切割内部，否则导致目的基因插入失活。 (3)目的基因应插在启动子和终止子之间。 (4)合理选择单酶切或者双酶切，即注意区分正向插入正常表达和反向插入异常表达。 (5)不能破坏载体上的有用序列，如启动子、终止子和复制原点等。 (6)要破坏对受体细胞不利的DNA片段，如ccdB片段，其表达产物抑制DNA复制，导入细胞后阻碍受体细胞存活，难以形成单菌落。 (7)农杆菌转化法中最关键的是T－DNA序列，目的基因必须插在T－DNA上启动子和终止子之间，最终转化到植物染色体的标记基因也是T－DNA上的。 (8)注意长序列里面是否含有短序列的酶切位点，比如能被A酶(GGATCC)识别的DNA序列，也可被B酶(GATC)识别。 (9)注意同尾酶拼接产物不一定还能被原先酶识别(限制酶的特征是识别特定核苷酸序列，切割特定位点，对碱基序列有严格要求)。 (10)双酶切不一定能实现目的基因定向插入正常表达，比如同尾酶，比如双平末端。能实现目的基因定向插入的可能是“一平一黏”或“双黏不同”。 提醒：如果对限制酶的选择仍有困难，建议考虑“排除法”。 考向2　基因载体和标记基因 例2 (多选)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是( ) A．克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子 B．两种载体都要具有一个或多个限制酶切点，以便目的基因的插入 C．表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点 D．质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体或表达载体 考点2　基因工程的操作程序 考 点 透 析 知识1　基因工程的基本操作程序 1. 目的基因的筛选与获取 2. 基因表达载体的构建(核心工作) (1)过程 (2)基因表达载体的组成  深 度 指 津 复制原点≠启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 (1)启动子：一段有特殊序列结构的 ，基本组成单位是脱氧核苷酸，其位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，其自身不转录。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游。一个DNA上有多个启动子。启动子靠近模板链的3′端。 (2)起始密码子和终止密码子位于 上，分别控制翻译过程的启动和终止。起始密码子靠近mRNA的5′端。 (3)复制原点是DNA上的一段序列，富含A—T，是DNA复制开始的地方，一个DNA有一个或多个复制原点。 3. 将目的基因导入受体细胞 受体细胞 常用方法 操作过程 植物细胞(常用体细胞或受精卵) (我国独创) 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房； 方法二：将DNA溶液滴加在授粉后一定时间内的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→感染植物细胞→T－DNA整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 动物细胞(常用受精卵) 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞 (感受态 细胞法) Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收周围环境中的DNA分子  解 疑 释 惑 (1)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为 。实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。 (2)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其 Ti质粒上的 转移并整合到受体细胞染色体DNA上。 4. 目的基因的检测与鉴定 (1)通过 等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 (2)利用 技术检测目的基因是否翻译。 (3)进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 注：若用报告基因，如绿色荧光蛋白基因与目的基因构建融合基因，可根据荧光情况进行定性、定量和定位的研究分析。 知识2　PCR技术 1. 原理： 和DNA的热变性。 2. 特点：可在短时间内 目的基因。 3. PCR反应所需的条件及作用 条件 作用 有一段已知目的基因的核苷酸序列 便于合成 在一定的 中进行 提供相对稳定的pH环境 4种脱氧核苷酸(实际上用脱氧核苷三磷酸，即dNTP) 作为合成DNA子链的 ，同时提供 DNA母链 作为DNA复制的模板 的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 催化合成DNA子链 引物(是一小段 ，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对) 使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸 4. 过程及图解 　 循环重复上述过程，n次循环后，目的基因的量将被扩增 倍。 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)利用PCR技术扩增目的基因时，两种引物的碱基序列应互补。( ) (2)体内DNA复制和PCR技术都需要解旋酶打开DNA双螺旋。( ) (3)体内DNA复制和PCR过程中，都是一条链连续复制(前导链)，一条链不连续(后随链)。( ) (4)构建基因表达载体时，须将目的基因插入启动子与终止子之间。( ) (5)农杆菌转化法常用的受体细胞是花粉细胞。( ) (6)目的基因必须整合到受体细胞的DNA中才能复制。( ) (7)农杆菌转化法实质是将Ti质粒转移到宿主细胞的染色体上。( ) 2. 要合成有生物活性的胰岛素，为什么受体细胞最好用单细胞真核生物？ 3. 自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能 来合成子链(延伸方向是5′→3′)。 典 题 说 法 考向1　基因表达载体的构建 例1 (2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( ) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 变式 我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T－DNA的加工和转移。下列叙述错误的是( ) A．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶Ⅲ B．利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 C．用含卡那霉素的选择培养基筛选成功导入抗冻基因的受体细胞 D．可用抗原—抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量 考向2　基因工程的操作过程 例2 (2024·淮安调研)乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术(原理见图1)，可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点，图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义表达载体的结构示意图。 (1)从番茄体内提取RNA作为模板，通过 合成ACC氧化酶和ACC合成酶基因，合成的基因中 (填“含”或“不含”)启动子区域。 (2)该技术首先需要合成ACC氧化酶和ACC合成酶的融合基因，通过PCR合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶 对上述两个基因进行酶切，再用DNA连接酶处理形成融合基因，相应的表达载体应用限制酶 进行切割，确保融合基因能够插入载体中。 (3)图2中的启动子2A11为特异性启动子，为了达到目的，启动子2A11应在番茄的果实(器官)中特异性启动基因转录。将融合基因 (填“正向”或“反向”)插入启动子下游即可构成反义融合基因。将图中表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有 的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。2A11启动子和反义融合基因都应该位于T－DNA片段内，原因是 。 (4)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时， (填“能”或“不能”)用放射性标记的ACC氧化酶基因片段做探针进行检测，理由是 。 (5)研究人员尝试从个体水平鉴定转基因是否成功，请设计实验方案并预测实验结果： 。 配套精练 第57讲　基因工程的基本工具与操作程序 一、 单项选择题 1. 下列有关重组DNA技术的基本工具的叙述，正确的是( ) A．限制酶能够识别RNA分子的特定核苷酸序列 B．携带外源DNA片段的质粒可在受体细胞中进行复制 C．DNA连接酶不能连接双链DNA片段的平末端 D．DNA连接酶能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 2. (2025·扬州期初)目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA克隆和DNA分子杂交，如图所示。下列有关叙述错误的是( ) A．方法①需要限制酶和DNA连接酶 B．方法②需要解旋酶和DNA聚合酶 C．方法③需要对探针进行特殊标记 D．方法①②③都遵循碱基互补配对原则 3. (2024·湖南卷)某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( ) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 4. (2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( ) 　 　 　 A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 5. 如表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是( ) 限制酶种类 序列及切点 ①EcoRⅠ ②BamHⅠ ③BglⅡ ④NotⅠ 　 A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端 B．①切出的DNA片段，只有用E.coli DNA连接酶才能连接起来 C．②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割 D．构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接 6. 重组质粒可以携带目的基因进入受体细胞，则下列不一定可以说明目的基因成功导入受体细胞的是( ) A．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA B．水稻细胞中检测到氨苄青霉素抗性基因 C．棉花细胞中检测到抗棉铃虫基因 D．鲤鱼细胞中检测到人的生长激素 7. (2025·如皋期初)科研人员将四种酶的基因(EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR)与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图)，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法正确的是( ) A．限制酶需要识别特定的序列，具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 B．含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 D．利用PCR等技术检测OsGLO1基因是否转录时，需要的酶是Taq DNA聚合酶 8. 如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是( ) A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得含该序列的双链产物 9. 在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。如图为花粉管通道法的一般原理示意图。相关叙述正确的是( ) A．外源DNA进入胚囊最终获得的种子均含有目的基因 B．植物生长各个时期均可通过花粉管通道导入外源DNA C．花粉管通道法最大的优点是无需植物组织培养，技术简单 D．含外源DNA的种子发育成植株后均具有相应性状 二、 多项选择题 10. (2024·海安中学)反向PCR是一种通过已知序列设计反向引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如下图所示。相关叙述正确的有( ) A．过程①可用同一种限制酶对未知序列两端进行切割 B．过程③和①获得的DNA片段长度相同，序列不同 C．过程②需使用DNA连接酶，形成氢键和磷酸二酯键 D．该技术可检测T－DNA整合到植物细胞染色体DNA上的位置 11. (2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是在PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入 ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是( ) A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 三、 非选择题 12. (2024·重庆卷节选)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ中。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断，构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 。此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是 。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 13. (2025·南通如东期初)铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。某科研团队研究发现，铝胁迫可诱导铝耐受型大豆根尖SGF14a基因(简称S基因)的表达。为了验证SGF14a基因在植物应答铝胁迫中的作用，研究人员构建含SGF14a基因的表达载体，将其转化到烟草细胞，进而获得转基因烟草，并对转基因烟草进行铝耐受性的研究，具体操作流程如图1所示。请回答下列问题： 图1 (1)提取铝耐受型大豆根总RNA，在 的催化下合成cDNA，最终获得S基因。根据S基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，两条引物设计时常加入不同的限制性内切核酸酶切割位点，主要目的是 。已知图中大豆S基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，选用的引物组合应为 。 (2)PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能是 (2分)。 A．引物特异性不高 B．热变性时间过长 C．延伸时间过长 D．复性温度过低 (3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含 (填抗生素)的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株，生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是 。 (4)为了探究转基因烟草对铝胁迫的耐受性，用50 μmol·L－1 AlCl3处理含有SGF14a基因的两个转基因烟草株系(S1和S2)和野生型烟草(WT)的无菌苗的根，24 h后分析烟草根相对生长量，结果显示转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，请结合图2分析，其原因可能是 (2分)。 图2 (5)为确定转S基因的烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株是否增强，实验小组设计实验进行个体生物学水平的鉴定，将 (2分)栽培到酸性土壤中，其他条件均适宜，培养适宜时间后，观察植株的生长情况。 14. (2025·海安期初)Mst1是一种蛋白激酶，高脂饮食会持续激活Mst1基因导致心肌损伤。为探究上述机制，科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠的Mst1基因，过程如图1所示，请回答下列问题： 图1 (1)科研人员分别设计sgRNA基因的正向序列与反向序列，使二者退火形成sgRNA基因，其中sgRNA1基因正向序列为5′－ACCGCACC……GGCC－3′，其设计依据有 (2分)，sgRNA1基因反向序列为5′ 3′。 (2)与sgRNA基因相比，sgRNA特有的化学成分有 。应将sgRNA基因序列插入载体 之间，有利于其表达。 (3)过程①需要 酶，过程②通过 (技术)将两个载体导入野生型小鼠的受精卵中，表达出sgRNA和Cas9核酸酶，组装后切割Mst1基因。 (4)有研究人员优化了实验方法：在体外合成sgRNA和Cas9 mRNA，利用脂质体包裹导入受精卵，该过程sgRNA和Cas9 mRNA进入细胞的方式为 。与上图相比，该方法能较快启动基因敲除，原因是 。 (5)科研人员利用野生型小鼠和Mst1基因敲除小鼠进行了下列各组实验，培养一段时间后，分别检测各组小鼠的Drp1(促进线粒体进行碎片化分裂的蛋白)和β－actin(细胞中含量稳定，作为对照)表达水平，结果如图2。 图2 由图可知，高脂饮食条件下，Mst1通过 (2分)，从而引起心肌的损伤。 学科网（北京）股份有限公司 $$