2026届高考生物一轮复习讲义第11单元　微难点4　PCR相关问题分析

微难点4 PCR相关问题分析 核 心 提 炼 1. PCR的几个基础问题 (1)PCR中文名称是“聚合酶链式反应”，其最大的特点是体外大量扩增目的DNA，便于后续的基因表达载体构建或DNA电泳分析等。 (2)主要原理是DNA半保留复制(和DNA热变性)，其特异性主要取决于引物设计和扩增条件控制(如退火温度、Mg2＋浓度等)。 (3)基本程序：高温变性→低温复性(退火)→中温延伸。 (4)基本反应体系为：模板(一般为提取的总DNA或总RNA)、dNTP(原料和能量)、耐高温的DNA聚合酶、特异性引物、缓冲液(含Mg2＋)等。 (5)PCR可以用如下反应式表示： dNTP＋模板＋引物 2nDNA片段  概 念 辨 析 PCR与细胞内DNA复制的主要区别 比较项目 PCR 细胞内DNA复制 解旋方式 高温 解旋酶(ATP供能) 解旋结果 模板全部解旋 局部解旋 场所 体外(微量离心管) 细胞内(如细胞核、线粒体、叶绿体等) 酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 引物成分 DNA短链 一般为RNA短链 原料 4种脱氧核苷酸 脱氧核苷酸(实际为dCTP、dATP、dGTP、dTTP) 能量 电加热、dNTP ATP和dNTP 子链合成 连续性 两条子链均连续合成 一条链连续(先导链)，另一条链不连续 主要过程 变性→复性→延伸 解旋→引物合成→子链延伸→恢复螺旋 产物数量 a×2n(a为起始模板数) 一个DNA复制产生2个DNA 温度条件 高温→低温→中温 温和条件(生物的体温) 复制起 点的决定 引物 复制原点(≥1) 产物的 长度 两引物之间的长度 整个DNA 突变率 较高 较低(存在检验点和复杂的纠错机制等) 2. PCR过程模型 　 图形显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，大概率在第三轮循环时，会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA，即第n轮循环，合成等长的DNA分子数为2n－2n。(最终30轮循环后大部分是等长的。) 新视野 1. PCR需要引物的原因 (1)引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。 (2)原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3′－羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合(即只能催化子链的延伸，而不是让DNA链从无到有)。 (3)细胞内DNA复制一般以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的，且最终还要被去除。 (4)PCR反应一般以DNA作引物(主要因为RNA不稳定，易降解)。一般通过化学合成法获得。 2. 设计引物的主要原则 (1)引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合。 (2)引物与靶序列间的Tm(DNA熔解温度)不应过低。 (3)引物内部不应有发夹结构(局部碱基互补)，即不能有4 bp以上的回文序列，否则会失效或特异性降低。 (4)2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。 (5)引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。 (6)引物的5′端要设计合适的酶切位点或同源序列，以便构建基因表达载体。 (7)在实时荧光定量PCR时引物还要避免与探针的互补，因为探针是为了与目的DNA内部序列互补的。 3. 引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大。有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。 4. 引物的选择和互补链的判断 DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物开始由5′端向3′端延伸。 举 题 固 法 考向1　PCR的过程与引物设计 例1 (2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板、引物，扩增程序中最主要的不同是退火温度。 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用CD。 A．ATGGTG…CAACCA B．TGGTTG…CACCAT C．GACGAG…CTGCAG D．CTGCAG…CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有限制酶、DNA连接酶。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有ABC。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 　(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列。 【解析】(1)PCR反应进行的条件包括引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)等。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR过程包括变性、复性和延伸三个阶段，通过温度的变化进行控制，由于引物和模板存在差异，扩增程序中最主要的不同是退火温度。(2)据图分析可知，PCR扩增片段F1与片段F2后，需要通过重叠延伸的方式构建融合基因。引物F2－F的部分序列与引物F1－R的部分序列可互补，且引物F2－F的部分序列与F1片段(EGFP)靠近右侧(3′端)的序列一致；引物F1－R的部分序列与F2片段(AnB1)靠近左侧(5′端)的序列互补配对，因此引物F2－F和引物F1－R的序列分别与C和D对应。(3)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下发生同源重组形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(4)采用含有抗生素的培养基筛选，利用稀释涂布平板法接种，可能形成的菌落数较低，不在30～300的范围内，A错误；抗性平板上未长出菌落的原因可能是重组质粒未能成功导入大肠杆菌，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 110 bp，用引物F1－F和F2－R 进行了PCR扩增，P1、P2的扩增产物与电泳结果符合，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 变式 (2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种限制性内切核酸(或限制)酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得DNA单链；Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是②④(从引物①②③④中选择，填编号)。 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′ (4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是B。 A．5′－AACTATGCG…AGCCCTT－3′ B．5′－AATTCCATG…CTGAATT－3′ C．5′－GCAATGCGT…TCGGGAA－3′ D．5′－TTGATACGC…CGAGTAC－3′ 【解析】DNA连接酶是在相邻的核苷酸之间形成磷酸二酯键。引物与对应的模板链能够碱基互补，且方向相反，步骤Ⅲ需要扩增出片段F的完整序列，需要包括已知序列两端的未知序列，所以需要引物②(其3′端与环状DNA内链已知序列的5′端互补)和④(其3′端与环状DNA外链已知序列的5′端互补)。观察图知，片段F两侧均有EcoRⅠ切割后的末端，EcoRⅠ的识别序列是G↓AATTC，所以F片段一条链的5′端开始肯定是AATTC，只有B符合。  审 答 指 导 (1)一定要知道的原则：引物延伸的方向是不变的，子链一定从5′端向3′端延伸。 (2)具体操作：①沿着引物的方向确定模板DNA；②确定引物延伸得到的目标DNA；③找到引物与模板DNA的结合位置；④引物一定是模板链的互补链，且方向一定是从5′端→3′端。 考向2　PCR技术中的数量关系 例2 (2011·江苏卷节选)请回答基因工程方面的有关问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(见下图)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。 (2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(见下图)，请分别说明理由。 ①第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效； ②第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。 【解析】(1)由图可知，由原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第四轮循环共产生16个DNA分子，其中含有引物A的分子是15个，占 15/16。(2)在第1组引物中，引物Ⅰ的部分碱基序列是－CAGGCT－，引物Ⅱ的部分碱基序列是－AGCCTG－，若利用这两个引物进行RCR扩增，会因其中的这部分碱基发生碱基互补配对而使引物失效。在第2组引物中，引物Ⅰ′的部分碱基序列是－AACTG－和－CAGTT－，该引物一旦发生自身折叠，也将会出现部分碱基互补配对而使引物失效。(3)图中直接将两个脱氧核苷酸合成DNA单链，这不能反映DNA聚合酶的功能，因为DNA聚合酶只能在DNA模板存在的条件下，将单个脱氧核苷酸连续结合到DNA片段的引物链上。 考向3　新情境下PCR技术 例3 (2024·南通一模)重叠延伸PCR定点突变过程分为两步，如图1。内皮抑素能通过抑制血管内皮细胞的增殖和血管的生成限制肿瘤细胞的生长。研究人员利用重叠延伸PCR定点突变技术将内皮抑素基因endo改造为能进入癌细胞并有较强抑癌作用的突变基因endo(m)，并再与抗Her2(人表皮生长因子受体2)的纳米抗体基因Dim形成融合基因Dim－endo(m)，导入大肠杆菌并表达，主要过程如图2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制基因的表达，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达。请回答下列问题： (1)图1中PCR1和PCR2配制反应体系时需加入不同的引物。图2中构建重组质粒时使用的限制酶是EcoR_Ⅰ、Hind_Ⅲ。 (2)下列①～⑥是相关引物，其中突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R分别为③、④(⑥)、⑥(④)。 ①5′－GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC－3′ ②5′－CCGGAATTCCATATGCGCCGCCG- CCGCCGCCGCCGCCGCCGC－3′ ③5′－GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAG- CCACTGACGAGTCCGC－3′ ④5′－GTGGCATGGCTCGGACGCAAACG- GGCGCAGGCTG－3′ ⑤5′－ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGC- AGTCATGAAGCTG－3′ ⑥5′－CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCG- AGCCATGCCAC－3′ (3)导入重组质粒的大肠杆菌由于调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止RNA聚合酶的移动，抑制Dim－endo(m)的转录。当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入IPTG，使Dim－endo(m)持续表达。 (4)研究表明，乳腺癌常出现Her2基因的高表达(不同乳腺癌细胞的表达有差异)，因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的重要靶点。研究人员用不同浓度Dim－endo( m)融合蛋白处理乳腺癌细胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺细胞HBL100作为实验组，选取正常培养的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞作为对照组，一段时间后分别测定对照组和实验组的细胞数并计算抑制率，结果如下图所示，抑制率的计算公式是(1－实验组细胞数/对照组细胞数)×100%[或(对照组细胞数－实验组细胞数)÷对照组细胞数×100%]。Dim－endo(m)融合蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制率不同，其可能原因是不同乳腺癌细胞Her2基因的表达水平不同，进入癌细胞的Dim－endo(m)融合蛋白数量有差异(；Dim－endo(m)融合蛋白中的endo(m)对不同乳腺癌细胞的杀伤力不同)。 (5)纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，只有传统抗体的1/10，但内部存在更多的二硫键，结构更稳定。与传统抗体相比，纳米抗体的优点是穿透力强，作用持久，免疫原性弱。 【解析】本题以重叠延伸PCR定点突变技术、构建纳米抗体—药物融合蛋白为主情境，考查学生对基因工程、PCR等知识以及工程学思维。(1)据图1可知，PCR1和PCR2在不同反应体系中，模板、酶、原料均相同，但引物不同。选BamHⅠ会破坏目的基因，选XhoⅠ会破坏标记基因，又要定向插入目的基因，故选择EcoRⅠ和Hind Ⅲ。(2)引物突变1R和1F局部配对(根据引物①中存在的连续的GGGG，很快可以找到引物③，因为里面有连续的CCCC)。引物突变2F和2R完全配对。考虑引物的配对要抓住关键特征序列，还要注意5′和3′的反向，通过对剩下引物的比较，可确定为④和⑥。(3)根据抑制融合基因的转录，反推可知阻止的是RNA聚合酶的移动。初始培养时，利用操纵子关闭目的基因的表达，有利于菌株大量繁殖。当菌株数量达到一定程度(一般是对数期)后，再加入IPTG启动表达开关，持续生产融合蛋白。(诱导型启动子在基因表达中很重要，当受体细胞数量较少时就表达外源蛋白，很容易导致受体细胞自身功能严重受损，甚至致死，这种严重的副作用可能是自身细胞的物质和能量消耗太多。诱导型启动子对于基因工程非常重要，常见的考查方式就是在合适的时候加入相应的诱导物。)(4)测定的是对照组和实验组的细胞数，根据抑制率单位和数值可推测出抑制率的计算公式。融合蛋白对不同癌细胞的抑制率不同，主要是因为癌细胞高表达Her2作为Dim受体，但不同癌细胞的Her2表达水平有差异。还可能是改造后的内皮抑素对不同癌细胞的杀伤能力有所区别。[第(4)小题括号里的话其实就是答案](5)据题干信息可知，纳米抗体更小且结构稳定。所以能有效地穿透浓密的组织，到达传统抗体无法到达的地方。因相对分子质量减小，免疫原性弱，不容易发生免疫排斥，故能持久、稳定增强药物作用效果。同时给药后能迅速通过肾脏系统的过滤排出身体，减少对机体的影响。 大题考向8　结合PCR等考查基因工程 典 题 体 验 例1 (2021·江苏卷)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞RNA，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致蛋白M上不含tag标签。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是先将除TaqDNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有BC。 A．Taq酶最适催化温度范围为50～60 ℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将Sma Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进黏性末端碱基配对， 形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A－m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ 的酶切位点可能在 基因m的连接处、基因m的内部。 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落。 ②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明融合基因表达(或融合基因正确解码)，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 【解析】(1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子时多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③Taq酶在延伸阶段发挥作用，最适催化温度范围为72 ℃左右，A错误；PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在TaqDNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；Taq酶对碱基序列没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。(2)①从图上看，载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点，故被SmaⅠ切开后，载体由环状变为链状DNA，将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被SmaⅠ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理是导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或融合基因正确解码)。 例2 (2022·江苏卷)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题： (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由脂质和蛋白质组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是发出星射线，形成纺锤体(与纺锤体的形成有关)。 　(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度，将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐热/耐高温的DNA聚合酶(Taq_DNA聚合酶)催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 　(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可指示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y－M ①选择图Ⅱ引物a、b；②PCR目的产物约为1_100bp 确保M及连接处序列正确 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是Q4(填序列编号) 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部 (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的32倍。 【解析】(1)纤毛膜是由细胞膜延伸而来，故成分是一样的，主要是脂质和蛋白质。中心体与有丝分裂过程中纺锤体的形成有关，动物细胞有丝分裂前期，中心体发出星射线，形成纺锤体。(2)DNA在0.14 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度最低，而可溶于2.0 mol·L－1的NaCl溶液，故添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶(即Taq DNA聚合酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸(DNA的合成方向是从5′端到3′端)。(3)由图中限制酶切位点和引物箭头方向可知，PCR应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，则PCR目的产物长度约为300＋800＝1 100 bp。在EcoR Ⅴ位点插入片段构建Y－M重组质粒，则Y－M的连接处上游应含有Hind Ⅲ＋EcoR Ⅴ的识别序列，下游应含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别序列，根据图Ⅲ中各限制酶识别序列，表中序列Q4符合。实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部。(4)RNA经逆转录形成cDNA。Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20，说明病人基因Z表达较弱，达到同样强度时，健康人比病人多5个循环，故从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32倍。  题 型 指 津 表格型试题的考查主要以实验设计和操作步骤、结果结论的分析为主体，因此对探究性实验要整体和局部相结合，将要点和易错点相结合，分析卡点，疏通堵点，抓住增分点，建立操作要点和实验目的之间的“因果循环关系”。基因工程和PCR问题中常以此形式，或结合其他情境进行综合考查。  衍 射 训 练 由于C4途径有更高的光合作用能力，科学家正试图采用基因工程手段将C4植物的相关基因克隆到水稻(C3植物)中以提高产量。下表是相关研究中的一些步骤，请根据题意完成以下表格。 实验目的 方法步骤要点 获得目的基因 PCR扩增出目的基因片段 构建载体质粒 将目的基因克隆进Ti载体质粒 大量培养水稻细胞 ①进行植物细胞培养获得愈伤组织 转化细胞 用农杆菌转化 转基因细胞筛选 ②用含抗生素的培养基筛选(或用选择培养基筛选) 诱导植株形成 ③调控培养基中生长素与细胞分裂素的比例诱导形成完整植株 转基因植株分析 ④PCR鉴定基因、酶活力测定、测定光合作用能力 学科网（北京）股份有限公司 $$ 微难点4 PCR相关问题分析 核 心 提 炼 1. PCR的几个基础问题 (1)PCR中文名称是“聚合酶链式反应”，其最大的特点是体外大量扩增目的DNA，便于后续的基因表达载体构建或DNA电泳分析等。 (2)主要原理是DNA半保留复制(和DNA热变性)，其特异性主要取决于引物设计和扩增条件控制(如退火温度、Mg2＋浓度等)。 (3)基本程序：高温变性→低温复性(退火)→中温延伸。 (4)基本反应体系为：模板(一般为提取的总DNA或总RNA)、dNTP(原料和能量)、耐高温的DNA聚合酶、特异性引物、缓冲液(含Mg2＋)等。 (5)PCR可以用如下反应式表示： dNTP＋模板＋引物 2nDNA片段  概 念 辨 析 PCR与细胞内DNA复制的主要区别 比较项目 PCR 细胞内DNA复制 解旋方式 高温 解旋酶(ATP供能) 解旋结果 模板全部解旋 局部解旋 场所 体外(微量离心管) 细胞内(如细胞核、线粒体、叶绿体等) 酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 引物成分 DNA短链 一般为RNA短链 原料 4种脱氧核苷酸 脱氧核苷酸(实际为dCTP、dATP、dGTP、dTTP) 能量 电加热、dNTP ATP和dNTP 子链合成 连续性 两条子链均连续合成 一条链连续(先导链)，另一条链不连续 主要过程 变性→复性→延伸 解旋→引物合成→子链延伸→恢复螺旋 产物数量 a×2n(a为起始模板数) 一个DNA复制产生2个DNA 温度条件 高温→低温→中温 温和条件(生物的体温) 复制起 点的决定 引物 复制原点(≥1) 产物的 长度 两引物之间的长度 整个DNA 突变率 较高 较低(存在检验点和复杂的纠错机制等) 2. PCR过程模型 　 图形显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，大概率在第三轮循环时，会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA，即第n轮循环，合成等长的DNA分子数为2n－2n。(最终30轮循环后大部分是等长的。) 新视野 1. PCR需要引物的原因 (1)引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。 (2)原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3′－羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合(即只能催化子链的延伸，而不是让DNA链从无到有)。 (3)细胞内DNA复制一般以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的，且最终还要被去除。 (4)PCR反应一般以DNA作引物(主要因为RNA不稳定，易降解)。一般通过化学合成法获得。 2. 设计引物的主要原则 (1)引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合。 (2)引物与靶序列间的Tm(DNA熔解温度)不应过低。 (3)引物内部不应有发夹结构(局部碱基互补)，即不能有4 bp以上的回文序列，否则会失效或特异性降低。 (4)2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。 (5)引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。 (6)引物的5′端要设计合适的酶切位点或同源序列，以便构建基因表达载体。 (7)在实时荧光定量PCR时引物还要避免与探针的互补，因为探针是为了与目的DNA内部序列互补的。 3. 引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大。有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。 4. 引物的选择和互补链的判断 DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物开始由5′端向3′端延伸。 举 题 固 法 考向1　PCR的过程与引物设计 例1 (2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用 。 A．ATGGTG…CAACCA B．TGGTTG…CACCAT C．GACGAG…CTGCAG D．CTGCAG…CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有 。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 　(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 变式 (2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得 ；Taq DNA聚合酶的作用是催化 。 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择，填编号)。 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′ (4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是 。 A．5′－AACTATGCG…AGCCCTT－3′ B．5′－AATTCCATG…CTGAATT－3′ C．5′－GCAATGCGT…TCGGGAA－3′ D．5′－TTGATACGC…CGAGTAC－3′  审 答 指 导 (1)一定要知道的原则：引物延伸的方向是不变的，子链一定从5′端向3′端延伸。 (2)具体操作：①沿着引物的方向确定模板DNA；②确定引物延伸得到的目标DNA；③找到引物与模板DNA的结合位置；④引物一定是模板链的互补链，且方向一定是从5′端→3′端。 考向2　PCR技术中的数量关系 例2 (2011·江苏卷节选)请回答基因工程方面的有关问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(见下图)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。 (2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(见下图)，请分别说明理由。 ①第1组： ； ②第2组： 。 (3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。 考向3　新情境下PCR技术 例3 (2024·南通一模)重叠延伸PCR定点突变过程分为两步，如图1。内皮抑素能通过抑制血管内皮细胞的增殖和血管的生成限制肿瘤细胞的生长。研究人员利用重叠延伸PCR定点突变技术将内皮抑素基因endo改造为能进入癌细胞并有较强抑癌作用的突变基因endo(m)，并再与抗Her2(人表皮生长因子受体2)的纳米抗体基因Dim形成融合基因Dim－endo(m)，导入大肠杆菌并表达，主要过程如图2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制基因的表达，IPTG能与LacI的表达产物结合，诱导目的基因的表达。请回答下列问题： (1)图1中PCR1和PCR2配制反应体系时需加入不同的 。图2中构建重组质粒时使用的限制酶是 。 (2)下列①～⑥是相关引物，其中突变1F为引物①，则突变1R、突变2F、突变2R分别为 、 、 。 ①5′－GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC－3′ ②5′－CCGGAATTCCATATGCGCCGCCG- CCGCCGCCGCCGCCGCCGC－3′ ③5′－GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAG- CCACTGACGAGTCCGC－3′ ④5′－GTGGCATGGCTCGGACGCAAACG- GGCGCAGGCTG－3′ ⑤5′－ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGC- AGTCATGAAGCTG－3′ ⑥5′－CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCG- AGCCATGCCAC－3′ (3)导入重组质粒的大肠杆菌由于调节基因LacI的表达产物能和操纵基因LacO结合，阻止 酶的移动，抑制Dim－endo(m)的转录。当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入 ，使Dim－endo(m)持续表达。 (4)研究表明，乳腺癌常出现Her2基因的高表达(不同乳腺癌细胞的表达有差异)，因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的重要靶点。研究人员用不同浓度Dim－endo( m)融合蛋白处理乳腺癌细胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺细胞HBL100作为实验组，选取正常培养的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞作为对照组，一段时间后分别测定对照组和实验组的细胞数并计算抑制率，结果如下图所示，抑制率的计算公式是 。Dim－endo(m)融合蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制率不同，其可能原因是 。 (5)纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，只有传统抗体的1/10，但内部存在更多的二硫键，结构更稳定。与传统抗体相比，纳米抗体的优点是 。 大题考向8　结合PCR等考查基因工程 典 题 体 验 例1 (2021·江苏卷)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是先将除TaqDNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有 。 A．Taq酶最适催化温度范围为50～60 ℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将Sma Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A－m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ 的酶切位点可能在 。 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。 ②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 例2 (2022·江苏卷)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题： (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。 　(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度，将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物的 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 　(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可指示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y－M ①选择图Ⅱ引物 ；②PCR目的产物约为 bp 确保M及连接处序列正确 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 (填序列编号) 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。  题 型 指 津 表格型试题的考查主要以实验设计和操作步骤、结果结论的分析为主体，因此对探究性实验要整体和局部相结合，将要点和易错点相结合，分析卡点，疏通堵点，抓住增分点，建立操作要点和实验目的之间的“因果循环关系”。基因工程和PCR问题中常以此形式，或结合其他情境进行综合考查。  衍 射 训 练 由于C4途径有更高的光合作用能力，科学家正试图采用基因工程手段将C4植物的相关基因克隆到水稻(C3植物)中以提高产量。下表是相关研究中的一些步骤，请根据题意完成以下表格。 实验目的 方法步骤要点 获得目的基因 PCR扩增出目的基因片段 构建载体质粒 将目的基因克隆进Ti载体质粒 大量培养水稻细胞 ① 转化细胞 用农杆菌转化 转基因细胞筛选 ② 诱导植株形成 ③ 转基因植株分析 ④ 学科网（北京）股份有限公司 $$