2026届高三生物一轮复习课件 几种常见PCR技术的原理

几种常见PCR技术的原理 1 1. 技术 （1）概念：以为模板进行的特殊的 。 （2）步骤：逆转录 （常规 ）扩增目的基因（见下图）。 （3）应用：检测目的基因的转录水平（表达）。 2 1.[2024·湖北武汉期末] 研究人员发现， 某种病毒包膜表面的 蛋白能识别人 体细胞膜表面的 受体并导致病毒入 侵人体细胞。现提出制备重组疫苗的思路： 提取该种病毒的遗传物质 通过 （逆转录聚合酶链式反应）技术 扩增筛选蛋白蛋白中真正与 结 合的关键部分基因（图甲） 构建基因表达载体 导入 细胞并 培养 提取并纯化蛋白 制成疫苗。回答下列问题： 3 （1）利用 扩增含有较多限制酶酶切 位点的 蛋白基因时，应选择的引物是 ______________。为提高目的基因和载体 的正确连接效率，应选择的限制酶是 _________________；限制酶通常是从原 核生物中分离纯化而来，限制酶存在于原 核生物中的主要作用是________________ ____________________________________ ___________________________。 引物4和引物5 Ⅰ 和Ⅲ 当外源入侵时，原核生物利用限制酶来切割外源，使之失效，以保证自身安全 4 [解析] 引物应与模板链的 端碱基互补 配对，故引物1、引物2、引物7和引物8 不合适，扩增得到的 蛋白基因也应 该含有多个限制酶的酶切位点，故引物 3和引物6不合适，所以应选择引物4和 引物5。质粒上没有 Ⅰ 酶的酶切位 点，且 Ⅰ 酶的酶切位点位于 蛋 白基因内部，所以不选 Ⅰ 进行切割；若使用 Ⅰ 进行切割， 易造成目的基因和质粒自身环化；所以选择的限制酶是 Ⅰ 和 5 Ⅲ 。原核生物容易受外源 的 入侵，所以在长期进化过程中形成了一 套完善的防御机制，限制酶是原核生物 的一种防御性工具，当外源 入侵时， 原核生物利用限制酶来切割外源 ， 使之失效，以保证自身安全，防止外来 病原物的危害。 （2） 技术的基本原理是先以病毒 为模板合成 ，这一过程需要的酶是 __________；再通过 技术扩增相应的 片段。 过程每次循环分为3步，其中 温度最高的一步是______。 逆转录酶 变性 [解析] 以病毒为模板合成 属于逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶。 每次循环分为变性、复性、延伸三步，变性温度超过，复性温度为 左右，延伸温度在 左右。 7 （3） 细胞又称中国仓鼠卵巢细胞， 可贴壁培养、经过多次传代筛选后也可悬 浮培养。 细胞属于成纤维细胞，本身 很少分泌内源蛋白，广泛应用于生物制药 中重组蛋白的生产。由此推测制备重组疫 苗的实验思路中用 细胞作为受体细胞 的原因是____________________________ _________________（答出1点即可）。 易于进行大规模培养、易于进行蛋白产物的收集 8 [解析] 细胞可贴壁培养、经过多次 传代筛选后也可悬浮培养，属于成纤维 细胞，本身很少分泌内源蛋白，由此推 测制备重组疫苗的实验思路中用 细 胞作为受体细胞的原因是该细胞易培养、 易生长、易收获蛋白产物。 9 2. 定点突变技术 （1）概念：将某基因中的一个或几个特定的碱基对替换、增加或删 除，导致基因中的部分碱基序列发生改变，实现基因的定点突变。 10 （2）两种方法 ①重叠延伸 技术：该技术要使用四条 引物。引物1和引物3的突起处代表与模板 链不能互补的突变位点，且这两条引物有 部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 因此，分别利用引物1和引物2，引物3和 引物4进行后，得到的 片段可以通 过引物1和引物3互补的碱基杂交在一起， 它们再在 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的。最后，用引物2和引物4进行扩增得到含有突变位点的 片段。通过测序可以检测定点突变是否成功。 11 ②大引物技术：需要用到三种引物进行两 次 ，这三种引物分别是突变上游引物、 常规上游引物和常规下游引物。第一次 利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增， 得到不完整的含有突变位点的片段；第 二次 利用第一次扩增产物中的一条 链 作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增 得到完整的含有突变位点的 片段。该技术的流程如图所示： （3）应用：实现基因的定点突变。 12 2.[2025·山东枣庄月考] 天然 溶菌酶由164个氨基酸构成，大多耐热 性差，不利于工业化应用。我国学者借助改造 溶菌酶基因，并 将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的 溶菌 酶。回答下列问题： 典型例题 13 （1）研究发现 溶菌酶的第3位异 亮氨酸（密码子为、 、 ）变为半胱氨酸（密码子为 ②③ 、 ），该半胱氨酸可以与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫 键，从而使溶菌酶的耐热性得到大幅度提升。科学家利用 定点 突变技术对 溶菌酶基因的编码序列进行改造（如图甲），要选择的 图中的引物组合最好是______，其中突变（含已替换碱基）引物为③， 经过轮复制之后，符合要求的 数是___________。 典型例题 14 [解析] 所选引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是② ③。溶菌酶基因的两条链分别为、，引物②与 链结合，引物③ 与链结合。每复制一次，以 链为模板复制出一条含有引物②的新 链，且复制出的含此链的不符合要求，则复制次，形成 个不 符合要求的,另外含链的 分子有1个且不符合要求，所以复 制次后，符合要求的分子有 个。 典型例题 15 （2）科学家又发现若将第78位氨基酸由脯氨酸（密码 子为）替换为天冬氨酸（密码子为 ），耐热性 提升幅度更大。可运用大引物 技术进行定点突变， 相关原理如图乙所示。进行第一次 时所用的突变上 游引物需满足的条件是____________________________ ____________________，至少需要___次循环，才能获得 相应的大引物。用所获得的大引物、模板和其他引物等 进行第二次 ，要获得带有突变位点的、适于与质粒构建基因表达载体的改良基因，引物应选用大引物两条链中的____（填“①”或“②”）。 含有定点突变的碱基并能与模板链碱基互补配对 2 ② 典型例题 16 [解析] 据图乙所示，突变上游引物对应的是 的拟突变位点，因此进行第一次 时所 用的突变上游引物的合理设计是含有定点突变 的碱基并能与 模板链碱基互补配对。经过 第一次 扩增可以获得①，下游大引物是与 ①互补配对的单链，需要再次进行 扩 增才能获得，所以至少需要2次循环，才能获 得相应的大引物。 复制的方向是从模板链 的 ，对应的下游大引物是②。 典型例题 17 （3）为了使扩增后的 溶菌酶基因能够与 丙图中的质粒A正确连接，设计引物时需要 在两种引物的___（填“”或“ ”）端连接上 限制酶________________的识别序列。 Ⅰ 和Ⅰ [解析] 对溶菌酶基因进行 扩增时， 是从引物的端到端延伸子链，因此限制酶识别序列应在引物的 端。构建重组 分子时，需要目的基因和质粒含有相同的黏性末 端，结合图丙分析，若选择 Ⅰ 切割，则会破坏质粒上的氨苄青 霉素抗性基因，导致无法进行筛选，因此选择 Ⅰ 和 Ⅰ 。 典型例题 18 3.实时荧光定量 技术 （1）概念：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针对 产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，从而精确定量计算样品的初始模 板量的方法。 （2）该技术最关键的是荧光标记方式，两种方法： Ⅰ 法：在反应体系中，加入过量 荧光染料， 荧光染料特异性地渗入 双链后，发射荧光信号，而不掺入链 中的 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加 与 产物的增加完全同步。 19 探针法：在 体系中每加入一对引物的同时，也加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当上游引物与下游引物分别与模板链复性时，荧光基团标记的探针序列也与模板链复性。由于探针序列同时具有荧光淬灭基团 ，故探针的荧光很弱。但是当子链延伸至探针时，耐高温的 聚合酶将探针端的荧光报告基团基团酶切降解，荧光报告基团基团 脱离了荧光淬灭基团基团 的抑制，发出荧光，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，实现了荧光信号的累积与 产物的形成完全同步。（如图所示） 20 .热变性 .复性/探针与模板的杂交 .延伸反应 （3）应用：实时精确测量每轮 产物的浓度。 21 3.[2024·湖南长沙二模] 对某冠状病毒进行核酸检测其实就是对病毒的 遗传物质进行检测。目前主流方法为实时荧光 （逆转录聚合酶链式反应）法。为检测某人是否感染了该冠状病毒， 需要进行以下相关操作：①分析 扩增结果；②从组织样本中提取 ；（逆转录）成 ；④采集样本（咽拭子或鼻拭子）； ⑤利用扩增 片段。回答下列问题： 典型例题 22 （1）若要得到正确的核酸检测结果，正确的操作顺序应该是_______ _____（用数字序号表示）。核酸检测样本多采集于咽、鼻，这些部 位存在多种微生物，提取物中核酸种类可能有多种，但通过 技术 可专一地对该冠状病毒的核酸序列进行扩增，原因是______________ ____________________________________________________________ _____________________________。 ④②③⑤① 引物是根据该冠状病毒的核酸的一段已知序列设计合成的（或引物能与该冠状病毒核酸对应的特异性结合） 典型例题 23 （2）操作⑤中，需设计2种引物，需要提供引物的原因是__________ ____________________________________________________________ __________________；复性时温度的设定是该步操作成败的关键，复 性的作用是_____________________________________________。 聚合酶不能从头开始合成，只能从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链 使2个引物分别与互补的单链结合，形成氢键 [解析] 聚合酶不能从头开始合成，只能从引物的 端延伸 子链，因此在体外扩增目的基因时，需要根据目的基因的核苷 酸序列人工合成两种引物。 过程中复性的作用是使2个引物分别 与互补的 单链结合，形成氢键。 典型例题 24 （3） 扩增时，在加入引物的同时还需加 入一个特异性荧光探针，其两端分别标记一 个报告基团和一个淬灭基团，如图所示： 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬 灭基团吸收；____________________在催化 子链延伸时，还具有外切酶活性，它可以沿 耐高温的聚合酶 产物 着________（填“”或“ ”）方向将探针酶切，使报告基团 和淬灭基团分离，随着 扩增次数的增加，荧光的强度会逐渐增大， 从而实现荧光信号的变化与_________的形成完全同步。 典型例题 25 [解析] 根据题干信息可知， 反应中， 耐高温的 聚合酶的作用是催化子链延 伸，同时还具有外切酶活性，可以沿着 方向将探针酶切，报告基团分离出 来后会发出荧光，随着 扩增次数的增 加，探针中的报告基团分离增多，荧光的 强度增加，荧光信号的变化与 产物的形成完全同步。 典型例题 26 $$