《利用PCR获取和扩增目的基因》作业设计--2025-2026学年高二生物人教版选择性必修3

《利用PCR获取和扩增目的基因》课时作业设计 【课标要求】 核心概念5基因工程赋予生物新的遗传特性 重要概念5.1基因工程是一种重组DNA技术 次位概念5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序之《利用PCR获取和扩增目的基因》（1课时） 【学业要求】完成本节学习后，学生应该能够: （１）结合生活或生产实例，举例说出PCR及其应用的基本原理（生命观念） （２）针对人类生产或生活的某一需求，在应用尝试提出初步的工程学构想，进行简单的设计和制作（生命观念、科学探究）; （３）面对日常生活或社会热点话题中与PCR有关的话题，基于证据运用生物学基本概念和原理，就生物技术与工程的安全与伦理问题表明自己的观点并展开讨论(科学思维、社会责任)。 【作业目标】 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念） 结合实例，采用文字和图示方式说明PCR技术的基本操作程序。（科学思维） 针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的PCR技术构想，完成初步设计。（科学探究、社会责任） 【作业设计思路】 1、 根据课时教学目标和学生特点，确定课时作业目标； 2、 根据单元作业目标，找出评估证据； 3、设计分层作业，增加普适性 4、设计情境作业，增加实践性 5、设计拓展作业，增加社会性 【作业设计】3+3+1+1 弧菌在全球范围内严重威胁人类健康，副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌等尤其令人关注，它们与食用生的或未煮熟的海鲜相关的胃肠道感染和败血症有关。专家建立的实时荧光定量PCR方法，可特异性、快速地实现对副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌检测，且检测效率和准确性很高。 TaqMan探针是实时荧光定量PCR技术中一种常用探针（如图1），其5末端连接荧光基团（R），3末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2），即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，通过荧光监测系统接收荧光信号。故实时荧光定量PCR技术可定量检测样本中弧菌DNA含量，进而检测海鲜食品的安全。 根据以上信息并结合图1、2完成基础性作业和综合应用性作业： 一、【基础性作业】（生命观念） 1. 关于专家建立的实时荧光定量PCR方法的叙述，不正确的是（ ） A．复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 B．PCR 技术的原理是 DNA 复制 C．PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是延伸。 D．变性过程中氢键断开使 DNA 双链解开 【答案】C 【解析】PCR 技术包括变性、复性和延伸三个步骤。 复性过程是将变性后形成的单链 DNA 分子模板冷却到 55 ~60°C后，使引物与 DNA 模板链通过碱基互补配对的方式结合，A 项正确； PCR 技术的原理是 体外DNA 复制，B 项正确； PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是复性（变性：92℃、复性：50℃、延伸：72℃），C项错误。PCR的反应过程每次循环可分为高温变性（打开DNA双链）、低温复性（便于引物与单链DNA结合）和中温延伸（在Taq酶的作用下延伸子链）三步。 变性过程是利用高温（90 ~ 95°C）使氢键断开，DNA双链解开，D 项正确； 2. 这种分子层面的实时荧光定量PCR检测时，所用的试剂盒不需加入的物质是（ ）。 ①模板（样品DNA）  ②引物    ③dNTP    ④RNA    ⑤Taq酶   ⑥解旋酶 ⑦缓冲液 ⑧Mg2+ ⑨TaqMan探针 ⑩DNA连接酶 A.  ③④⑨  B. ④⑥⑩ C.  ⑥⑧⑨  D. ⑦⑧⑩ 【答案】B 【解析】实时荧光定量PCRPCR技术的原理为DNA双链复制，所用的试剂盒中通常都应该含有：热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂系等。Mg2+可以将TaqDNA聚合酶激活。 3. 下列有关实时荧光定量PCR中引物的叙述，正确的是 A. 装置中加入引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸 B. 实时荧光定量PCR前，需要根据弧菌DNA中的特有的核苷酸序列合成引物和Taqman探针 C. 引物不可重复利用，PCR第四次循环时需要消耗15对引物 D. 扩增完毕后，检测发现扩增产物中有不同大小的DNA片段，原因可能是引物太短。 【答案】A 【解析】A、引物的作用与模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，A错误； B、实时荧光定量PCR过程中，引物、Taqman探针分别与弧菌DNA中的特有的核苷酸序列发生碱基互补配对，所以需要根据弧菌DNA中的特有的核苷酸序列合成，B正确； C、引物不可重复利用，PCR第四次循环时共产生16个DNA，32条DNA单链，只有两条最初母链不含引物，所以需要消耗30个引物（15对引物）。 D、扩增完毕后，检测发现扩增产物中有不同大小的DNA片段，原因可能是引物太短，特异性差，与模板链随机结合，产生多种不同的DNA片段。 二、【综合应用性作业】（生命观念+科学思维） 1. 关于专家建立的实时荧光定量PCR方法的叙述，不正确的是（ ） A．荧光的强度能反应PCR产物的数量，通过检测荧光信号强弱就可实现对产物的检测 B．Taq酶作用的除了能催化DNA子链的延伸，还能催化TaqMan探针的水解。 C．由于新冠病毒为RNA病毒，进行实时荧光定量PCR前，需加入逆转录酶进行逆转录获得cDNA D．TaqMan探针含一小段被设计成可以与弧菌靶DNA序列中间部位结合的单链DNA 。 【答案】D 【解析】荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当相关酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。通过检测荧光信号强弱就可实现对产物的检测，A正确； 从图中说明Taq酶作用的除了能催化DNA子链的延伸，还能催化TaqMan探针的水解，B正确； 据图得C正确 TaqMan探针中含有U，所以探针中有单链RNA。D错误 2. 这种分子层面的实时荧光定量PCR检测具有特异性、检测效率和准确性很高的特点，与试剂盒中无关的物质是（ ）。 A. dNTP B. 2种引物 C. TaqMan探针 D. Taq酶、Mg2+ 【答案】A 【解析】试剂盒中的引物和TaqMan探针决定了这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和高灵敏性 3. 关于PCR扩增时的变性温度、退火温度、延伸温度与延伸时间的问题，分析不正确的是∶ A. 变性时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，变性的时间就越长。 B. 如果PCR反应得不到任何扩增产物，可采取的改进措施是升高退火温度。 C. 理想情况下两个引物的退火温度是一样，退火温度高，扩增特异性强。 D. 延伸阶段选用72℃是综合考虑了2个因素，这2个因素是防止DNA变性和保证Taq酶所需温度条件 【答案】B 【解析】A、变性时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，形成的氢键越多，变性的时间就越长。A正确 B、如果PCR反应得不到任何扩增产物，可以是退火温度太高了，可采取的改进措施是降低退火温度，B错误。 C、若两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，所以理想情况下两个引物的退火温度是一样，退火温度高，扩增特异性强，C正确； D、设置延伸阶段选用的温度应防止DNA氢键断开变性解旋和保证Taq酶所需温度条件，D正确。 三、【探究拓展性作业】 设计ddNTP可以用做DNA测序实验（科学探究、社会责任） 双脱氧核苷三磷酸(如图甲)在人工合成DNA体系中，可脱去两个磷酸基团形成焦磷酸和双脱氧核苷酸并释放能量，双脱氧核苷酸可使DNA子链延伸终止。在PCR反应体系中，有适量待测单链模板、4种双脱氧核件三磷酸(ddNTP)和四种正常脱氧核苷三磷酸(dNTP)等，利用反应终止时合成的不同长度子链进行电泳可区分DNA大小。请设计利用ddNTP进行DNA测序实验 答案： 四、【实践活动性作业】（科学思维、科学探究、社会责任） PCR技术在生物学研究、医学研究、临床诊断、食品安全等领域有广泛的应用。请同学利用网络资源调查一种应用，小组合作（4人一组）画出原理示意图，并简要文字说明。 如实时荧光定量PCR，原理示意图如上题中的图1、2。 答案：（任选一种） PCR应用1：反向PCR测定未知DNA区域 用限制酶处理该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，获得已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。再对PCR产物进行测序、分析。 PCR应用2：巢式PCR 通常涉及两轮连续PCR反应，需要设计两对引物，第一轮PCR是用一对外引物扩增得到包含目的片段的较长产物，将其经过稀释以后作为第二轮PCR的模板，再用另一对内引物进行第二轮PCR，得到的产物为目的片段。 使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。因此，巢式PCR的扩增特异性很强。 PCR应用3：不对称PCR——制备单链DNA片段 是扩增单链 DNA的一种方法，基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA，常见的为引物浓度不对称PCR。 正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物，那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫不对称PCR，主要只扩增一条模板链。通常用于获得大量的单链模板。 实际操作时，为了增加模板量，也可以加入一对引物，只是两条引物在浓度上应存在差异。可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。 PCR应用4：PCR定点突变技术—重叠延伸PCR：指在引物中改变个别碱基，造成扩增产物发生基因突变的操作。 该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 PCR应用5：PCR定点突变技术—大引物PCR 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段； 第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 PCR应用6：融合PCR技术——构建融合基因：是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段（基因）连接起来的方法，其过程如图所示. PCR应用7：（实时）荧光定量RT-PCR PCR应用8：交错延伸PCR 基本步骤为： 1）变性模板链与引物结合 2）短暂延伸形成小片段 3）另一循环时，小片段与模板随机结合作为引物（template switching）并继续延伸 4）重复上述过程直至全长基因形成即最终得到新组合的基因 PCR其他应用： 学科网（北京）股份有限公司 $$