1.2.1微生物的基本培养技术课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

微生物 代谢类型 生物分类 发酵产品 分布 温度 对氧的需求 乳酸菌 酵母菌 醋酸菌 异养厌氧型 C6H12O6 2C3H6O3(乳酸)+能量 酶 乳制品的发酵、 泡菜的制作 异养兼性厌氧型 C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量 酶 酿酒、制作馒头和面包等 异养需氧型 C6H12O6＋2O2 2CH3COOH＋2CO2＋2H2O 酶 酶 C2H5OH ＋ O2 CH3COOH ＋ H2O 可用于制作各种风味的醋 细菌 原核生物 真菌 原核生物 细菌 原核生物 空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内 30-35℃ 28℃ 18-20℃ 前期需氧， 后期不需氧 一直需氧 密闭不需氧 发酵微生物及特点 含糖量较高的水果、蔬菜表面 空气中 微生物的发酵反应式 泡菜制作： 果酒制作： 果醋制作： C6H12O6 2C2H5OH(酒精)+2CO2+能量 酶 微生物的基本培养技术及应用 第2节 第一章 发酵工程 第1课时 微生物的基本培养技术 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以形成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是由于自制酸奶造成肠胃不适的事屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物呢？ 从社会中来 酸奶 应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。 这需要应用无菌技术和微生物的培养技术 。 相关信息＝ ＝＝＝＝＝＝＝＝ 包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。 微生物 1.概念： 难以用肉眼观察的微小生物的统称。 2.类型： 光学显微镜可见细胞(μm)； 电子显微镜可见细胞器、病毒(nm) SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒 注:本章提及的微生物主要是指用于发酵的细菌和真菌 1. 是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。 2.实验室培养微生物的条件： ①为微生物提供合适的 条件； ②要确保 ，并将需要的微生物分离出来。 防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。 营养和环境 其他微生物无法混入 培养基 无菌技术 一、培养基的配置 1.培养基的概念: 3.培养基的类型： 固体培养基 液体培养基 加入凝固剂(如琼脂) 2.培养基的作用: 人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其_________的营养基质。 营养物质 生长繁殖 用以 微生物或 。 积累其代谢物 不含凝固剂(如琼脂)，呈液态状态 注：琼脂仅作为凝固剂不为微生物生长提供能量和碳源 琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一 培养、分离、鉴定、保存 分离、计数、 鉴定等 扩大培养、 工业生产 微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落 菌落:是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。 念珠菌 霉菌 酵母菌 放线菌 菌落是鉴定菌种的重要依据 形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。 微生物生长繁殖产生的菌落 沙门氏菌 毛霉 划分 培养基种类 特点 用途 物理 性质 化学 成分 用途 不加凝固剂 加凝固剂，如琼脂 工业生产 观察微生物的运动、分类鉴定 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 培养基成分明确 分类、鉴定 在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物 选择培养基 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 天然培养基 合成培养基 鉴别培养基 补充资料：培养基的类型及用途 (1)主要营养物质：一般都含有 等营养物质。 水、碳源、氮源、无机盐 4.培养基的成分： 成分 含义 来源 功能 碳源 提供碳元素的物质 无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-等含碳无机物 ①构成细胞物质和一些代谢产物； ②有机碳既是碳源又是能源 有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、牛肉膏和蛋白胨等 氮源 提供氮元素的物质 无机氮源：N2、NH3，氨盐、硝酸盐等 将无机氮合成含氮的代谢产物 有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 合成蛋白质、核酸和含氮的代谢废物 水 生物体内含量最多的化合物 外界摄入(培养基、代谢产物) ①良好的溶剂，参与化学反应； ②维持生物大分子结构的稳定 无机盐 提供除碳、氮以外的元素，包括大量元素和微量元素 无机化合物： ①提供无机营养； ②调节培养基的pH； ③维持渗透压 牛肉膏、蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质 自养微生物 异养微生物 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 等 蛋白胨 10g 等 琼脂 20g 凝固剂 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 某种常见的细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 (1)根据培养基的物理性质，该培养基属于哪类培养基，理由是什么？ 固体培养基；该培养基的配方中含有凝固剂琼脂。 (2)该培养基中主要提供碳源和氮源的物质分别是什么？属于有机物还是无机物？ 主要提供碳源的牛肉膏，主要提供氮源的蛋白胨。二者均属于有机物。 (3)该培养基培养的微生物同化作用类型是什么？理由是什么？ 异养型微生物。该微生物的碳源和氮源是有机物。 碳源、氮源、 磷酸盐和维生素 碳源、氮源和维生素 1.为什么培养基需要氮源？ 是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。 2.培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？ 不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。 根据碳/氮源的种类判断微生物同化作用是自养还是异养 a.异养型微生物的碳源为 b.自养型微生物的碳源为 含碳有机物 含碳无机物 旁栏思考： 3.几种微生物的营养和能量来源 微生物 碳源 氮源 能源 蓝细菌 CO2 光能 硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化 根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物 大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物 自养 微生物 异养 微生物 例：下表是某微生物培养基的成分，请分析该培养基可用来培养哪种微生物？若除去①，此培养基可用来培养圆褐固氮菌吗？ 编号 ① ② ③ ④ ⑤ 成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O 含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL 圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供有机碳源，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌。 此培养基可用来培养自养型微生物。 13 (2)其他需求：还需要满足微生物生长对 的需求。 pH、特殊营养物质、O2 例如： 特殊营养物质：主要指生长因子(微生物生长所必须的、微量的、自身不能合成或合成很少的有机物) 种类：维生素、氨基酸、碱基、嘌呤、嘧啶、胺类等 来源：酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等 ④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ； ②培养霉菌时，需要将培养基调至 ； ③培养细菌时，需要将培养基调至 ； 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧 4.培养基的成分： 二、无菌技术 获得纯净的微生物培养物的关键是 。无菌技术主要包括 。 防止杂菌污染 消毒和灭菌 (1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。 注意事项： 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品 。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 。 清洁和消毒 灭菌 酒精灯火焰附近进行 相接触 1.消毒和灭菌工作主要包括两方面： 二、无菌技术 比较项目 消毒 灭菌 概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 作用强度 较为温和的理化因素 强烈的物理、化学因素 作用程度 杀死物体表面或内部的部分微生物 杀死物体内外所有的微生物 芽孢和孢子 消灭部分芽孢 能杀灭全部芽孢和孢子 适用对象 操作空间、活体生物材料、操作者的衣着和双手 操作工具、玻璃器皿、培养基等 常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 湿热灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法 消毒和灭菌的原理都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。 但两者的实质不同。消毒的结果实际上是部分灭菌。 2.消毒与灭菌的概念及区别： 知识拓展 芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水分适宜)的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。 孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。 芽 孢 和 孢 子 芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。 3.资料卡——常用的消毒与灭菌的方法 (1)消毒的主要方法及应用范围 方法 适用范围 操作方法 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒法 紫外线消毒 日常生活用品(家庭餐具) 100℃煮沸5～6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。 不耐高温的液体(牛奶、啤酒、果酒和酱油等) 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min,可以杀死绝大多数微生物，不破坏营养成分 生物活体(皮肤、伤口、动植物组织表面消毒)、水源、手术器械、塑料或玻璃器皿等 体积分数为70%-75%的酒精擦拭双手、用氯气消毒水源，碘酒皮肤伤口，石炭酸等 房间、仪器设备(接种箱、接种室、超净工作台) 紫外线照射30 min 相关信息：生物消毒法 3.资料卡——常用的消毒与灭菌的方法 (2)灭菌的主要方法及应用范围 方法 适用范围 操作方法 湿热灭菌 干热灭菌 灼烧灭菌 高压蒸汽灭菌锅:压力100kPa、温度121℃下维持15-30min 培养基、无菌水等多种器材 物品放入干热灭菌箱，160～170℃的热空气中维持2～3 h 耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿)、金属用具 (如针头、 镊子、剪刀等)等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层(外焰)灼烧，可以迅速彻底地灭菌。 适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位 高压蒸汽灭菌锅 干热灭菌箱 1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 (1)培养细菌用的培养基与培养皿 (2)玻棒、试管、烧瓶和吸管 (3)实验操作者的双手 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 旁栏思考： (1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。 培养基用高压蒸汽灭菌， 培养皿、玻璃棒、试管、烧瓶、吸管可以采用干热灭菌法，实验操作者的双手可以用酒精擦拭。 目的：①防止培养物被污染；②防止感染实验操作者。 1.相关概念 2.微生物纯培养的步骤 (1)培养物： (2)纯培养物： (3)纯培养： 获得 的过程。 配制培养基 灭菌 接种 分离 培养等 三、微生物的纯培养 在微生物学中，将接种于 内，在合适条件下形成的含 的群体。 由 所获得的微生物群体。 纯培养物 培养基 特定种类微生物 单一个体繁殖 微生物群 分散或稀释 单个细胞 繁殖 单菌落 (1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 (2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 (3)获得单菌落的方法： 1.实验原理 酵母菌的纯培养 探究 实践 将单个微生物分散在固体培养基上的方法 稀释涂布平板法、平板划线法。 4.方法步骤 配制 培养基 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。 倒平板 待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 (1)制备培养基 接种和分离 培养酵母菌 制备培养基 倒平板注意事项： ①温度：50℃左右； ②操作：在酒精灯火焰附近； ③冷凝后平板倒置。 倒平板具体操作步骤： 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 避免杂菌污染。 琼脂在90℃以上熔化，在40℃左右凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时，若不能及时操作，琼脂会凝固。 2.为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？ 防止杂菌污染培养基 1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。 3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 思考讨论 4.在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是？ 检测培养基平板灭菌是否合格。 (2)接种和分离酵母菌 平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。 连续划线法 分区划线法 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ③试管口通过火焰 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 平板划线的具体操作步骤 28 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 接种环灭菌 分区划线法 1 2 3 4 5 注意事项: ①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次②划线首尾不能相接(最后一区不要与第一区相连) ③每次划线前接种环进行灭菌(在5个区域划线，接种环灼烧灭菌共6次) ④划线后,培养皿倒置培养 1.在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，目的是什么？ 避免接种环温度过高，杀死菌种。 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 ①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； ②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落 3.为什么划线时要注意不能划破培养基？ 2.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？ 思考: 4.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 杀死接种环上原有微生物，避免污染培养物。 31 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养 24~48h。 警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 (3)培养酵母菌 划3个平板(重复实验)和1个不划线(空白对照) (1)在未接种的培养基表面是否有菌落生长?如果有,说明了什么? 5.实验结果分析与评价 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。 可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等 在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 (2)在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落?这些菌落的颜色、形状和大小是否一致?如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗? (3)你是如何记录实验结果的? 请与其他同学交流、互评。 1.配制培养基的注意事项 (1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后，灭菌之前进行操作。 (2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时温度高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。 (3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 (4)平板冷却凝固后，要将平板倒置。 (5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 核心归纳 34 2.平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作 (1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。 (2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。 (3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。 (4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。 核心归纳 35 思维训练 评估论点的可信程度 评估“水果酵素”的功效是否真实？ 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。 36 NH、NO等 $$