3.2基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1944年，艾弗里（O. Avery，1877-1955)等人通过肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 1950年，埃德曼（P. V. Edman，1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F. Sanger，1918-2013）首次完成了胰岛素氨基酸序列的测定。 1958年，梅塞尔森（M. Meselson，1930-）和斯塔尔（F. W. Stahl。1929-）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。 1961年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg，1927-2010）和马太（J. H. Matthaei，1929-）破译了第一个编码氨基酸的密码子，截止1966年64个密码子均倍破译。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒具有自我复制能力，并可在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、链接及功能基因的获得创造了条件。 1972年，伯格（P. Berg，1926-）首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流，基因正式问世。 1953年，沃森（J. D. Watson，1928-）和克里克（F. Crick，1916-2004）建立了双螺旋结构模型并提出了 遗传物质自我复制的假说。 1970年，科学家在细菌中发现了第一个限 制性内切核酸酶（简称限制酶）。 1 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。 1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。 1984年，我国科学家朱作言（1941-）领导的团队培育出设计上第一条转基因鱼。 1985年，穆里斯（K. Mullis，1944-）等人发明了PCR，为获取目的基因提供了有效手段。 1990年，人类基因组计划启动。2003年该计划的测序任务顺利完成。 2013年，华人科学家张锋（1982-）及其团队首次报道了利用最新的基因编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可是实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。 2 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉需要哪步骤？ 第2节 基因工程的基本操作程序 第三章 基因工程 一、目的基因的筛选与获取 二 、基因表达载体的构建 三、 将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 1、目的基因 概念: 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。 作用: 根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。 实例: 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。 培育转基因抗虫棉用到的目的基因 Bt 抗虫蛋白基因 简称 Bt 基因 一、目的基因的筛选与获取 一、目的基因的筛选与获取 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 ①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ ②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 1、目的基因 一、目的基因的筛选与获取 2、筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关 不仅掌握了Bt 基因的序列信息 Bt基因 是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 一、目的基因的筛选与获取 2、筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程 随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 获取目的基因的具体方法：人工合成；利用PCR技术获取和扩增；构建基因文库等。 一、目的基因的筛选与获取 3、利用PCR获取和扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。 ①.PCR的含义： PCR是聚合酶链式反应的缩写。 它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ②.PCR的原理： DNA半保留复制 PCR扩增仪 一、目的基因的筛选与获取 3、利用PCR获取和扩增目的基因 【重温】DNA复制的过程 解旋 合成子链 形成新DNA C G T A T A C G G C C G T A T A G C C G A T A T C G A T C G T A T A T A T A C G T A T A C G G C T A G C C G T A 3' 5' C C G T A G T A T A C G G C T A G C C G T A T A C G G C C G T A T A G C C G A T A T C G A T C G T A T A T A T A 3' 5' ATP 解旋酶 （1）解旋 C C G T A G T A T A C G G C T A G C C G T A T A C G G C C G T A T A G C C G A T A T C G A T C G T A T A T A T A 3' 5' A C G C A A G C T A G T C A T T A T A T G C A T G A T C G A G C T T （2）合成子链 C C G T A G T A T A C G G C T A G C C G T A T A C G G C C G T A T A G C C G A T A T C G A T C G T A T A T A T A 3' 5' A C G C A A G C T A G T C A T T A T A T G C A T G A T C G A G C T T A C G C A A G C T A G T C A T T A DNA聚合酶 5' 3' T A T G C A T G A T C G A G C T T 5' 3' ATP ATP DNA聚合酶形成磷酸二酯键 子链延伸合成的方向？ 只能从5′－端→3′－端延伸 （2）合成子链 C C G T A G T A T A C G G C T A G C C G T A T A C G G C C G T A T A G C C G A T A T C G A T C G T A T A T A A 3' 5' A C G C A A G C T A G T C A T T A T A T G C A T G A T C G A G C T T 5' 3' T A G C C G T A T A G C C G A T A T 3' 5' T T A C G C G T A T A T A T A 5' 3' （3）重新螺旋形成新的DNA分子 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 (Taq酶） 人工合成的引物 （通常为小的单链DNA） 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 (Taq酶） 人工合成的引物 （通常为小的单链DNA） PCR和DNA的体内复制是否完全相同？ PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。 一、目的基因的筛选与获取 3、利用PCR获取和扩增目的基因 ③.PCR的条件： a.在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 b.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 原理： 目的： DNA复制 获得大量的目的基因 模板： 酶： 原料： 引物： 模板DNA（目的基因） 两种DNA引物 四种脱氧核苷酸 耐高温DNA聚合酶 (TaqDNA聚合酶) 有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。 ①变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA自动解聚为单链。 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ②复性 ③延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则延伸合成新的DNA链 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 95℃ 50℃ 72℃ 退火 ④.PCR的过程： 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ ④.PCR的过程： 一、目的基因的筛选与获取 3、利用PCR获取和扩增目的基因 ⑤.PCR的结果: 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 指数 2n ⑥.PCR产物的鉴定: 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 思考 获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？ 至少要三次循环。 如果循环n次，则共需消耗 个引物。 则共需消耗 对引物。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 2n－1 2n+1－2 两种引物都结合在DNA模板链的 端； 脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。 3’ 已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 3’ ①n代后，DNA分子有___个。②n代后，DNA链有_________条。③n代后，含引物的DNA分子有_____个。④n代后，共消耗了_____________个引物。⑤第n代复制，消耗了______个引物。 2n 2n＋1 2n 2n＋1－2 2n ④.PCR的过程： [例1]　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(　　) ①PCR过程需要的引物是人工合成的单链核酸　②PCR过程不需要DNA聚合酶　③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的　④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制 A．③④ B．①② C．①③ D．②④ [例2]　用PCR扩增下面的DNA片段： 5′GACCTGTGGAAGC……　CATACGGGATTG3′ 3′CTGGACACCTTCG…… GTATGCCCTAAC5′ 供选择的引物有： ①5′GACCTGTGGAAGC3′、②5′CATACGGGATTG3′、 ③5′GTATGCCCTAAC3′、④5′CAATCCCGTATG3′ 共四种，应选择(　　) A．①② B．②③ C．③④ D．①④ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 （2）基因文库的种类 基因组文库 部分基因文库 （1）什么叫基因文库？ 含有一种生物所有基因的文库 只含有一种生物部分基因的文库 （如：cDNA文库） 互补DNA 一、目的基因的筛选与获取 4、通过构建基因文库来获取目的基因 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 （1）基因文库的构建 限制酶 与载体连接 导入 基因组文库 基因组文库 一、目的基因的筛选与获取 4、通过构建基因文库来获取目的基因 某生物某个时期的mRNA cDNA（互补DNA） 逆转录 受体菌群体 与载体连接 导入 部分基因文库 （如：cDNA文库） cDNA文库 【说明】基因文库中不是直接储存相应基因，而是保存受体菌，受体菌中含有基因。 一、目的基因的筛选与获取 4、通过构建基因文库来获取目的基因 [例3]　RT－PCR是将RNA逆转录(RT) 和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技 术，可利用此技术获取目的基因，具体过 程如图所示，以下说法不正确的是(　　) A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列 B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高 C．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等 D．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 一、目的基因的筛选与获取 二 、基因表达载体的构建 三、 将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 二 、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心工作。操作目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 位置： 功能： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 基因的上游（一段有 特殊结构的DNA片段） 人们所需要的基因 位置： 功能： 基因的下游 （一段特殊的DNA片断） 终止mRNA的 转录 用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞 DNA复制所需结构 【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子， 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 【区分两组概念】 位于基因上 位于mRNA上 翻译的起始点 翻译的终点 转录的起始点 转录的终点 本身不转录 决定氨基酸 不决定氨基酸 [例4]　下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　) A．起始密码子是一段DNA序列，位于胰岛素基因的上游 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点 C．借助抗生素抗性基因可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 1.构建过程：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段；再用DNA连接酶把两者连接(如图)。 二 、基因表达载体的构建 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏末端（平末端）。 根据目的基因两端的限制性酶切位点确定限制酶的种类 二 、基因表达载体的构建 ②质粒作为载体必须具有标记基因等，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。 ③如果所选择的酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段中含有复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 1.前面说用应该同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。 而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。 根据目的基因两端的限制性酶切位点确定限制酶的种类 二 、基因表达载体的构建 ④选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 二 、基因表达载体的构建 基因表达载体构建模式图 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或 平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同一种 二 、基因表达载体的构建 题型三　限制酶的选择 [例5]　如图为某质粒限制酶酶切图谱。某 基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增 的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该 基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列 (　　) 注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。 A．NdeⅠ和BamHⅠ B．NdeⅠ和XbaⅠ C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ 一、目的基因的筛选与获取 二 、基因表达载体的构建 三、 将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 1. 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 三、将目的基因导入受体细胞 44 2. 转化的受体细胞 受体细胞 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 三、将目的基因导入受体细胞 ②在植物授粉后一定时间内，剪去 柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 花粉管通道法导入外源DNA 适用生物：开花植物 （1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法（我国独创） 三、将目的基因导入受体细胞 46 适用生物：双子叶植物、裸子植物 构建表 达载体 含目的基因的重组Ti质粒 表现出新性状的植株 导入植物 细胞 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 目的基因 Ti质粒 T-DNA 含重组Ti质粒的农杆菌 转入农杆菌 农杆菌转化法示意图 Ti质粒 目的基因 构建 基因表达载体 转入 农杆菌 导入 植物细胞 T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中 表达 新性状 植物组织培养 三、将目的基因导入受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法 47 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？ 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 三、将目的基因导入受体细胞 2. 转化的受体细胞 受体细胞 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 三、将目的基因导入受体细胞 操作程序： （2）将目的基因导入动物细胞--显微注射法 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内） 获得具有新性状的动物 ①体积大，易操作； ②全能性高，易培养成完整个体。 三、将目的基因导入受体细胞 转基因技术不仅在农业上有应用，也应用在畜牧业。将目的基因到动物细胞中不仅可以改善畜牧产品的品质，还可以利用转基因动物上产药物，从转基因羊的羊奶中提取抗凝血酶、血清白蛋白等医药产品。 拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。 如慢病毒载体、腺病毒载体等。 三、将目的基因导入受体细胞 转基因技术不仅在农业上有应用，也应用在畜牧业。将目的基因到动物细胞中不仅可以改善畜牧产品的品质，还可以利用转基因动物上产药物，从转基因羊的羊奶中提取抗凝血酶、血清白蛋白等医药产品。 2. 转化的受体细胞 受体细胞 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 三、将目的基因导入受体细胞 （常用大肠杆菌） 优点： 繁殖周期短 体积小易于培养操作 多为单细胞 遗传物质相对较少 （3）将目的基因导入微生物细胞----Ca2+处理法 使用Ca2+处理： 增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。 大肠杆菌细胞 三、将目的基因导入受体细胞 增加细胞壁的透性，与细胞膜无关 53 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 过程： Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 三、将目的基因导入受体细胞 （3）将目的基因导入微生物细胞----Ca2+处理法 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——Ca2+转化法 ——显微注射法 三、将目的基因导入受体细胞 受体细胞 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 55 一、目的基因的筛选与获取 二 、基因表达载体的构建 三、 将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 目的: 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 ② 检测目的基因是否转录出了mRNA ③ 目的基因是否翻译成蛋白质 ④ 个体的抗性及抗性程度 分子水平的检测 个体生物水平的鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测 按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？ 57 检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 四、目的基因的检测与鉴定 DNA分子杂交（可检测） 变性 原理： 碱基互补配对原则 基因探针：指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子 58 RT-PCR 方法：PCR扩增或分子杂交技术 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。 ② 检测目的基因是否转录出了mRNA 变性 探针 15N 15N 转基因生物 的mRNA 杂交分子 （可检测） 原理：碱基互补配对原则 四、目的基因的检测与鉴定 59 ③ 目的基因是否翻译成蛋白质 方法：抗原-抗体杂交技术 苏云金杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 抗原 抗体 杂交 检测 四、目的基因的检测与鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ④个体水平检测：抗性以及抗性程度 四、目的基因的检测与鉴定 [例6]　下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是(　　) A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，导入了质粒A或重组质粒的细菌能够在该培养基上生长 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1. DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2. DNA片段电泳鉴定的原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul 20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul 20umol/l 的引物I 2.5ul 20umol/l 的引物II 2.5ul H2O 28-33ul 1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U 模板DNA 5-10ul 总体积 50ul 注：模板DNA的用量为1pg-1ug 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 940C，5min 30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min 最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min 移液 离心 扩增 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳、观察 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2. 你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 第2节 基因工程的基本操作程序 第三章 基因工程 Lavf52.84.0 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $$