2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

希普：首例胚胎移植成功 哈里森:首创动物组织体外培养法 张明觉：发现哺乳动物精子获能现象 格登、童第周：体细胞核移植成功 试管家兔诞生 米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术 胚胎分割移植成功 埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞 克隆羊多莉诞生 山中伸弥：获得诱导多能干细胞 单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生 我国科学家首次培育了体细胞克隆猴 1890年 1907年 1951年 1958年 1959年 1975年 1978年 1981年 1996年 2006年 2014年 2017年 人体血液中的树突状细胞是一种具有很强的抗原呈递功能的淋巴细胞。近年来的研究发现，树突状细胞与肿瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，既能表达肿瘤抗原，又能合成激活T细胞的相关刺激分子。 用此方法制成的肿瘤疫苗可以诱导机体产生较强的特异性免疫反应，这为癌症的治疗提供了新的方法。 但如何才能让两个不同的细胞融合? 细胞融合技术在生产实践中有哪些应用? 第二章 细胞工程 动物细胞融合技术与单克隆抗体 一、动物细胞融合技术 二、单克隆抗体及应用 一、动物细胞融合技术 概念：动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术 原理：动物细胞融合的原理与植物原生质体融合的原理相同。 方法：常用的诱导融合方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法 一、动物细胞融合技术 灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏其抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞融合。 细胞融合的过程 两亲本细胞的细胞核逐渐融合 病毒吸附在细胞表面并使细胞凝集 两亲本细胞膜上磷脂和蛋白质重新排布形成通道 通道扩大，病毒流入细胞质 灭活的病毒诱导细胞融合的过程示意图 形成单核细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。 意义及应用：动物细胞融合能突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能，这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育新品种的重要手段，特别是为制备单克隆抗体开辟了新途径 细胞水平上缺失的性状与丢失的染色体有关 核移植 肿瘤细胞和树突状细胞融合，可以更有效地激发免疫反应 可能的新品种 一、动物细胞融合技术 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 融合前处理 诱导融合的方法 意义和用途 克服远源杂交的障碍， 获得杂种植株 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性 植物细胞的全能性 去除细胞壁后诱导原生质体融合 使细胞分散后诱导细胞融合 物理（电融合法、离心法） 化学（聚乙二醇融合法、高Ca2+-高pH融合法） 物理（电融合法） 化学（聚乙二醇（PEG）融合法） 生物方法：灭活的病毒诱导法 制备单克隆抗体 一、动物细胞融合技术 一、动物细胞融合技术 二、单克隆抗体及应用 二、单克隆抗体及应用 1.传统抗体的获得方法 （1）分泌细胞 化学本质 分布？ 浆细胞 蛋白质 主要分布在血清中，少量分布于组织液和外分泌液中 （2） 获取方法： 向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。 （3）缺点： 产量低、纯度低、特异性差。 血清抗体 2．单克隆抗体的制备思路 （1）B淋巴细胞特点： ①哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。 ②动物体内产生的特异性抗体种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。 ③要想获得大量单一抗体，必须克隆（大量增殖）单一的B淋巴细胞，形成细胞群。 ④面临困难：在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。 如何解决这一难题？ 二、单克隆抗体及应用 （2）骨髓瘤细胞特点： 在体外培养条件下，能大量增殖。 英国：米尔斯坦 德国：科勒 由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。 一种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 （能产生抗体） （能大量增殖） 融合细胞 （既能产生抗体，又能大量增殖） （3）杂交瘤细胞特点： B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。 单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，由这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。 二、单克隆抗体及应用 注射抗原 培养骨髓瘤细胞 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 诱导融合 用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞 B淋巴细胞依靠细胞表面受体与抗原（固定在固相载体上）结合。取出固相载体，再将与抗原结合的B林巴细胞从固相载体上冲洗下来。 （由于B细胞表面受体还在，所以此处得到的并不是浆细胞） 同一种抗原可能与多种抗体与结合。因此，可能存在多种B淋巴细胞都可以依靠其细胞表面受体与同一种抗原结合。 注射抗原 培养骨髓瘤细胞 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 多种杂交细胞 诱导融合 用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞 用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长 杂交瘤细胞 HAT培养基上只有杂交瘤细胞可以生长增殖。 第一次筛选 资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞（A） 合成DNA D途径 S途径 D途径 氨基喋呤 A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3 骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合 多种杂交细胞 既能迅速大量增殖 又能产生抗体 筛选杂交瘤细胞 注射抗原 培养骨髓瘤细胞 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 多种杂交细胞 诱导融合 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞 用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长 多轮次的克隆化培养和抗体检测 杂交瘤细胞 若杂交瘤细胞混合培养，得到的是能与特定抗原结合的多种抗体。 此处将杂交瘤细胞进行有限稀释，虽然接种到细胞培养板上，每个培养孔只有一个杂交瘤细胞，这样每个孔培养得到的抗体就是单抗。 部分杂交瘤细胞在培养过程种可能失去增殖或分泌抗体的能力，因此需要多轮抗体检测和克隆化培养，以获得足够数量的稳定的既能增殖又能分泌抗体的杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞 克隆化培养、抗体检测 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 （分泌的抗体能与特定抗原结合） 能产生所需抗体的杂交瘤细胞 经多次筛选 第二次筛选 注射到腹腔 注射抗原 培养骨髓瘤细胞 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 多种杂交细胞 诱导融合 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 体外培养 用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞 用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长 多轮次的克隆化培养和抗体检测 体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖 从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体 杂交瘤细胞 单克隆抗体 第二节 注射到腹腔 注射抗原 培养骨髓瘤细胞 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 多种杂交细胞 诱导融合 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 体外培养 用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞 用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长 多轮次的克隆化培养和抗体检测 体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖 从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体 杂交瘤细胞 单克隆抗体 单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较 项目 第一次筛选 第二次筛选 筛选 原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 筛选 目的 杂交瘤细胞 筛选出能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞 筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 从已免疫小鼠的脾脏中取B淋巴细胞 小鼠腹腔 多种杂交细胞 抗体检测阳性的杂交瘤细胞 细胞融合 选择培养 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 单克隆抗体 体外细胞培养 克隆化培养与抗体检测 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 能产生所需抗体的杂交瘤细胞 注射到小鼠腹腔内 体外培养 单克隆抗体 从细胞培养液中提取 从小鼠腹水中提取 体内培养 ★杂交瘤细胞的特点？ 既能无限增殖，又能分泌抗体 具备两种细胞的遗传物质 特异性强，灵敏度高，可大量制备 资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。用于多种疾病的诊断和病原体鉴定。 (1)作为诊断试剂——最广泛应用 二、单克隆抗体及应用 甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备__________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。 抗原 抗AFP单克隆抗体 AFP 肿瘤 (2)用于疾病检测 二、单克隆抗体及应用 资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。 (3)用于治疗疾病和运载药物 二、单克隆抗体及应用 ①特异性强、灵敏度高 生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物 ②疗效高、毒副作用小 二、单克隆抗体及应用 第二章 细胞工程 动物细胞融合技术与单克隆抗体 $$