内容正文:
第2章 细胞工程
第2节 第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体
学习目标 1.阐明动物细胞融合技术的概念,举例说出诱导动物细胞融合的方法。
2.建构单克隆抗体的制备流程。
3.说明单克隆抗体的特点及应用,认同单克隆抗体在临床上具有重要的应用价值。
目 录 索 引
主题一 动物细胞融合技术
主题二 单克隆抗体及其应用
教考衔接 单克隆抗体的制备及应用
课堂小结
主 题 一
基础知识•落实
主题一 动物细胞融合技术
1.概念:使 动物细胞结合形成 的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的 。
细胞膜的流动性
2.诱导动物细胞融合的常用方法
(1)物理法: 等。
(2)化学法: 融合法等。
(3)生物法: 诱导法等。
动物细胞融合特有
两个或多个
一个细胞
遗传信息
电融合法
PEG
灭活病毒
3.意义:利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术,为
开辟了新途径。
结论要语 辨一辨
(1)与植物原生质体融合相比,动物细胞融合特有的诱导方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法。( )
(2)灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力,但并不破坏它们的抗原结构。( )
(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞。( )
制造单克隆抗体
×
√
×
情境探究•提升
科学家在培养动物细胞时加入失去活性的仙台病毒,发现其能使两个动物细胞融合,产生具有两个核的细胞。研究表明,很多不同种的动物细胞都能进行融合,形成杂交细胞,如鼠—兔杂交细胞、鼠—猴杂交细胞等。
请讨论回答下列相关问题。
(1)利用灭活病毒诱导动物细胞融合的原理是什么?
提示 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞互相凝聚,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。
(2)为什么利用病毒诱导细胞融合前需要对病毒进行灭活处理?
提示 避免病毒感染细胞。
(3)动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术的原理分别是什么?最终结果有什么不同?
提示 动物细胞融合技术的原理是细胞膜的流动性;植物体细胞杂交技术的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。动物细胞融合技术最终得到的是杂交细胞,而植物体细胞杂交技术最终得到的是杂种植株。
方法归纳•拓展
动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较
对点应用•突破
突破点1 动物细胞融合的原理和方法
1.科学家经过长期的探索,实现了用不同种动物的体细胞进行杂交。如图为动物细胞融合的示意图,下列叙述错误的是( )
A.通过动物细胞融合等生物技术能获得鼠首兔身的新物种
B.诱导动物细胞融合常用的方
法有PEG融合法、电融合法和
灭活病毒诱导法
C.当两个细胞核融合后形成具
有单核的杂交细胞,标志着动物细胞融合的完成
D.只考虑两两融合,两种动物细胞之间诱导融合,产生的融合细胞有3种
A
解析 两动物细胞融合成的杂交细胞无法发育成个体,A项错误。
突破点2 动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术的比较
2.对比动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术,下列叙述正确的是( )
A.均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合
B.两者都可以跨越种属间的生殖隔离
C.两者都可以体现细胞的全能性
D.在适宜的条件下,均可产生完整个体
B
解析 灭活病毒是动物细胞融合特有的诱导因素,A项错误。动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术都可以打破生殖隔离,B项正确。植物体细胞杂交技术体现了细胞的全能性,动物细胞融合技术体现了细胞膜的流动性,C项错误。动物细胞融合技术不能产生完整个体,D项错误。
主 题 二
基础知识•落实
主题二 单克隆抗体及其应用
1.传统抗体的获得
(1)方法:向动物体内反复注射某种 ,使动物产生抗体,然后从动物血清中分离所需 。
(2)缺陷: 、纯度低、 。
抗原
抗体
产量低
特异性差
2.单克隆抗体的制备
(1)大量制备单一抗体的思路
(2)存在的问题:在体外培养条件下,一个B淋巴细胞是 的。
(3)解决方案
不可能无限增殖
大量增殖
特定
(4)制备过程
B淋
巴细胞
杂交细胞
杂交瘤
能分泌所需抗体
3.单克隆抗体的优点
(1)能准确地识别 的细微差异。
(2)可以与特定抗原发生 结合。
(3)可以 制备。
4.单克隆抗体的应用
(1)用作 ,可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
(2)运载药物,如抗体—药物偶联物(ADC)。
(3)用于治疗疾病。
结论要语 辨一辨
(1)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后,得到的都是杂交瘤细胞。( )
(2)单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同。( )
(3)ADC的抗体具有靶向运输作用、药物具有治疗作用。( )
抗原
特异性
大量
诊断试剂
×
×
√
情境探究•提升
1.根据教材第48~49页制备单克隆抗体过程的示意图,回答以下问题。
(1)给小鼠注射特定抗原的目的是
。
(2)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后,培养基中共出现 种细胞。若只考虑两两融合,理论上培养基中融合的细胞有 种。体系中出现多种类型细胞的原因是 。
使小鼠产生能分泌特定抗体的B淋巴细胞
5
3
细胞融合是随机的,且融合率达不到100%
(3)资料:①细胞合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
②免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但它不能分裂增殖,其本身也不能在体外长期存活。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径,没有S途径,但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断,它会因不能合成DNA而死亡。
根据上述资料可知,第一次筛选的方法是用 进行筛选。培养基中加入 。经特定选择培养基筛选后,
和融合的 的细胞都会死亡,只有
才能生长。
(4)单克隆抗体的制备过程中,第二次筛选的目的是
。方法是 ,原理是 。
特定的选择培养基
氨基蝶呤
未融合的亲本细胞
具有同种核
融合的杂交瘤细胞
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
抗体检测
抗原—抗体的特异性结合
2.阅读教材第50页“思考·讨论:单克隆抗体的应用”,回答以下问题。
(1)ADC通常由① 、② 和③ (如细胞毒素)三部分组成,如下图所示。
抗体
接头
药物
(2)ADC的抗体主要发挥 作用,即通过
,将连接的药物输送到 ;药物发挥 ,如 。
(3)除了细胞毒素,还可以用 进行靶向放疗。一些作用于 的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长,理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行肿瘤治疗。
(4)ADC在临床上具有 等优点,原因是
。
ADC中的单克隆抗体能将细胞毒素定向带到癌细胞所在位置,在原位杀死癌细胞,不损伤正常细胞
靶向运输
特异性结合靶细胞表面的抗原
靶细胞
治疗效应
杀伤靶细胞
放射性同位素标记单克隆抗体
细胞信号转导通路
靶点清楚、毒副作用小
方法归纳•拓展
1.单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选
原因 诱导融合后会得到多种杂交细胞,另外还有未融合的细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激,所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选
方法 用特定的选择培养基筛选:在该培养基上,未融合的亲本细胞和具有同种核的细胞融合后形成的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长 用多孔板培养,在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测,经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
筛选目的 得到杂交瘤细胞 得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
2.杂交瘤细胞的抗体检测和克隆化培养
融合后的细胞经特定的选择培养基筛选培养后,能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞,通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释,用96孔板培养,使每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞,通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体,那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证来自单个细胞,挑选阳性孔中的细胞继续进行有限稀释,一般需要进行3~4次,直至确定每个孔中增殖的细胞为能产生特定抗体的杂交瘤细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
对点应用•突破
突破点1 单克隆抗体的制备过程
3.研究表明,髓系细胞触发受体-2(TREM-2)是一种免疫抑制受体,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因此,TREM-2抗体药物有望提高肿瘤免疫疗法的疗效。下图为TREM-2单克隆抗体的制备流程图,
下列说法正确的是( )
A.步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射TREM-2蛋白和分泌TREM-2抗体的杂交瘤细胞
B.经步骤②诱导后融合的细胞既能分泌TREM-2抗体又可无限增殖
C.步骤③和④的培养孔中均含有TREM-2蛋白,依据的原理都是抗原—抗体杂交
D.步骤⑥和植物组织培养均需使用CO2培养箱进行大规模培养
A
解析 步骤①向小鼠注射TREM-2蛋白,让小鼠发生免疫反应,获得能产生抗体的B淋巴细胞;步骤⑤向小鼠腹腔注射分泌TREM-2抗体的杂交瘤细胞,目的是获得单克隆抗体,A项正确。经步骤②诱导后融合的细胞有多种,需经进一步的筛选、检测才能获得既能分泌TREM-2抗体又可无限增殖的杂交瘤细胞,B项错误。步骤③是用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,培养孔中不含有TREM-2蛋白,依据的原理不是抗原—抗体杂交,C项错误。植物组织培养的过程中不需要使用CO2培养箱,D项错误。
4.有限稀释法是克隆化培养动物细胞的一种方法。将细胞悬液进行连续倍数稀释,最终调整密度为5个/mL;将稀释好的细胞悬液接种于96孔板,每孔加0.1 mL;24 h后在显微镜下挑选只含一个细胞的孔,补加培养液后继续培养获得细胞克隆。下列相关说法错误的是( )
A.培养液中需含有蔗糖、血清等物质
B.96孔板需置于CO2培养箱中培养
C.贴附型细胞获得悬液需用胰蛋白酶处理
D.该方法可用于筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞
A
解析 动物细胞培养中添加的有机碳源是葡萄糖,A项错误。动物细胞培养需要在CO2培养箱中进行,以维持培养液pH的稳定,B项正确。贴附型细胞获得悬液需用胰蛋白酶处理以获得单个细胞,C项正确。有限稀释和克隆化培养可用于筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞,D项正确。
突破点2 单克隆抗体的应用
5.抗体—药物偶联物(ADC)是将高特异性的单克隆抗体和小分子细胞毒性药物,通过接头进行高活性结合而成,用以提高肿瘤药物的靶向性,减少毒副作用。如图是ADC作用原理简图。
下列有关ADC的叙述,正确的是( )
A.接头既要在内环境中保持稳定,
又要能在细胞内被断开
B.ADC中的单克隆抗体是杀伤
肿瘤细胞的有效成分
C.ADC进入肿瘤细胞后会被溶酶体分解,从而丧失药物活性
D.ADC与肿瘤细胞识别后,被肿瘤细胞以主动运输的方式吸收进入细胞
A
解析 接头既要在内环境中保持稳定,又要能在细胞内被断开,才能在肿瘤细胞中起作用,A项正确。ADC中的单克隆抗体起靶向作用,药物是杀伤肿瘤细胞的有效成分,B项错误。ADC会在溶酶体中分解,释放出有活性的药物,从而杀伤肿瘤细胞,C项错误。ADC属于大分子与小分子结合物,ADC与肿瘤细胞识别后,被肿瘤细胞以胞吞的方式吸收进入细胞,D项错误。
6.(2025黑龙江哈尔滨二模)多特异性抗体是新兴的肿瘤治疗药物,三特异性抗体(简称三抗)可实现对小鼠多发性骨髓瘤(MM)细胞的选择性杀伤,作用机理如图所示。下列叙述错误的是( )
A.同时注射3种抗原可刺激B细
胞分化为产生三抗的浆细胞
B.筛选图示三抗时需要3种相应
的抗原蛋白
C.三抗通过与CD28结合抑制
T细胞死亡、与TCR结合促进
T细胞活化来提高T细胞的杀伤力
D.与单克隆抗体一样,三抗的制备过程中也需用到选择培养基
A
解析 同时注射3种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞,而不是分化为产生三抗的浆细胞,A项错误。三抗具有3个特异性结合位点,要筛选出图示三抗,需要用3种相应的抗原蛋白去检测,看其是否能特异性结合,B项正确。由题图可知,三抗与CD28结合能抑制T细胞死亡,与TCR结合能促进T细胞活化,进而提高T细胞的杀伤力,C项正确。在制备单克隆抗体时,需要用选择培养基筛选出杂交瘤细胞,三抗的制备过程也涉及细胞融合等过程,同样需要用到选择培养基,D项正确。
7.细胞毒素类药物能有效杀伤肿瘤细胞,但也会对健康细胞造成伤害,科学家将细胞毒素与单克隆抗体结合制成抗体—药物偶联物(ADC),ADC可选择性杀伤肿瘤细胞,其作用机制如下图所示。下列叙述错误的是( )
A.ADC中的抗体能特异性识别肿瘤细胞
B.ADC进入肿瘤细胞的过程
需要蛋白质参与并消耗能量
C.含ADC的小泡与溶酶体融
合后,溶酶体裂解释放药物引
起细胞坏死
D.利用放射性同位素或荧光
标记的单克隆抗体可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病
C
解析 由题干信息可知,抗体—药物偶联物(ADC)能借助抗体的作用特异性识别肿瘤抗原,从而将细胞毒素类药物带入肿瘤细胞,实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤,A项正确。ADC进入肿瘤细胞的方式是胞吞,该过程需要消耗肿瘤细胞代谢产生的ATP,并且需要蛋白质的参与,B项正确。含ADC的小泡与溶酶体融合后,溶酶体裂解诱导ADC解体,释放药物引起肿瘤细胞凋亡, C项错误。利用放射性同位素或荧光标记的单克隆抗体可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病,该过程利用了抗原—抗体特异性结合的原理,D项正确。
教 考 衔 接
基础知识•落实
教考衔接 单克隆抗体的制备及应用
近几年高考加强了对单克隆抗体的制备在临床医学及日常生活实际应用的考查,既突出对基础知识的考查,又关注单克隆抗体制备和应用的科学前沿,特别突出人体健康与生物科技的相关考查。题目信息贴近生活,呈现方式多种多样,或文字描述,或流程图展示,突出对单克隆抗体制备原理及过程的考查,考查学生的图文转化能力、逻辑推理能力和学以致用能力,激发学生学习生物的兴趣,培养学生的社会责任。
经典例题•剖析
【典例】 (2024广东卷)某些肿瘤细胞表面的PD-L1与细胞毒性T细胞(CTL)表面的PD-1结合能抑制CTL的免疫活性,导致肿瘤免疫逃逸。免疫检查点疗法使用单克隆抗体阻断PD-L1和PD-1的结合,可恢复CTL的活性,用于肿瘤治疗。为进一步提高疗效,研究者以黑色素瘤模型小鼠为材料,开展该疗法与化疗的联合治疗研究。部分结果见下图。
图a
图b
回答下列问题。
(1)据图分析, 疗法的治疗效果最佳,推测其原因是
。
(2)黑色素瘤细胞能分泌吸引某类细胞靠近的细胞因子CXCL1,为使CTL响应此信号,可在CTL中导入 基因后再将其回输小鼠体内,从而进一步提高治疗效果。该基因的表达产物应定位于CTL的 (答位置)且基因导入后不影响CTL 的能力。
联合
该疗法既发挥了化疗药物的作用,又增加了活化的CTL的数量
CXCL1受体(细胞因子受体)
细胞膜(或表面)
杀死肿瘤细胞
(3)某兴趣小组基于现有抗体—药物偶联物的思路提出了两种药物设计方案。方案一:将化疗药物与PD-L1单克隆抗体结合在一起。方案二:将化疗药物与PD-1单克隆抗体结合在一起。你认为方案 (填“一”或“二”)可行,理由是 。
方案一的偶联物既可阻断PD-1与PD-L1结合,恢复CTL的活性,又可使化疗药物靶向运输至肿瘤细胞
一
解析 由题干可知,肿瘤细胞表面的PD-L1通过与CTL表面的PD-1特异性结合,抑制CTL的免疫活性,从而逃避免疫系统的攻击。(1)由题图a可知,采用联合疗法治疗后肿瘤体积最小,再由题图b可知,采用联合疗法治疗时活化的CTL的数目高于免疫检查点疗法和化疗等方法,原因是该疗法既发挥了化疗药物的作用,又增加了活化的CTL的数量。(2)由于黑色素瘤细胞能分泌吸引某类细胞靠近的细胞因子CXCL1,故要进一步提高治疗效果,可以在CTL中导入CXCL1受体(细胞因子受体)基因,让CTL表达出CXCL1受体(细胞因子受体),基因的表达产物应定位于CTL的细胞膜(或表面),而且基因导入后不能影响CTL杀死肿瘤细胞的能力。(3)某些肿瘤细胞表面的PD-L1与CTL表面的PD-1结合能抑制CTL的免疫活性,将化疗药物与PD-L1单克隆抗体结合在一起(方案一),形成的偶联物既可通过阻断PD-1与PD-L1结合,恢复CTL的活性,又可使化疗药物靶向运输至肿瘤细胞。
思维导引
方法归纳•拓展
解答单克隆抗体制备类试题的关键点
技术手段 动物细胞融合和动物细胞培养
原理 细胞膜的流动性和细胞增殖
制备流程
两次筛选
的目的 第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞;第二次筛选的目的是获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细
胞的特点 既能迅速大量增殖,又能产生特异性抗体
单克隆抗
体的优点 能准确识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合,并且可大量制备
对点应用•突破
1.(2025辽宁二模)抗原表位指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,是抗原与T细胞或B细胞表面的抗原识别受体及抗体特异性结合的最小结构单位。下图为单克隆抗体的制备过程,下列叙述错误的是( )
A.可用PEG或灭活的病毒诱
导骨髓瘤细胞与B细胞融合
B.经选择培养基筛选所得的杂
交瘤细胞能够产生的抗体共3种
C.克隆化培养和抗体检测后的
每个杂交瘤细胞只能产生1种抗体
D.由图可知,利用一种抗原经杂交瘤技术可以获得多种单克隆抗体
B
解析 经选择培养基筛选后,由于B细胞有多种,故杂交瘤细胞能够产生的抗体有多种,B项错误。
2.(2025江苏无锡期中)下图为筛选、制备单克隆抗体的示意图,①~⑤代表相关过程,a~g代表相关细胞。根据图解回答问题。
(1)由图可看出,单克隆抗体制备过程运用的动物细胞工程技术有
和动物细胞融合,涉及的原理有
,动物细胞培养液中通常需要加入 等一些天然成分,培养动物细胞的气体条件是 。
动物细胞培养
细胞增殖、细胞膜的流动性
血清
95%空气+5%CO2
(2)过程①需要先给小鼠注射纯化的抗原蛋白,一段时间后,从小鼠的
(免疫器官)中获取B淋巴细胞,过程②诱导动物细胞融合特有的方法是 。
(3)图中过程③④为两次筛选过程,过程③是指把c细胞群稀释,然后在特定的 培养基中培养,只有 能够存活且增殖,因此细胞集落为单个存活细胞的克隆;过程④是进行克隆化培养和 ,经多次筛选得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞群。
脾
灭活病毒诱导法
选择
杂交瘤细胞
抗体检测
(4)已知细胞合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被氨基蝶呤阻断。B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但一般不分裂增殖。骨髓瘤细胞中没有S途径。若将这两种细胞在含氨基蝶呤的试管中混合后诱导融合,则试管中细胞的种类数和能增殖的细胞种类数分别是(不考虑三个及以上细胞融合) 。其中能增殖的细胞进行的是 途径。
A.3和1 B.5和3
C.5和1 D.3和3
C
S
解析 (1)单克隆抗体制备过程运用了动物细胞培养、动物细胞融合技术,涉及的原理有细胞增殖、细胞膜的流动性。动物细胞体外培养的培养液除包含无机盐、促生长因子、葡萄糖、氨基酸等必需的营养成分,通常还需要加入血清等一些天然成分,在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
(2)过程①先给小鼠注射纯化的抗原蛋白,让小鼠产生特异性免疫,诱导小鼠体内产生能够分泌特异性抗体的B淋巴细胞,从小鼠的脾中获取。诱导动物细胞融合特有的方法是灭活病毒诱导法。
(3)过程③是指把c细胞群稀释,然后都放在特定的选择培养基中培养,在该培养基中未融合的细胞和同种融合的细胞都死亡,只有杂交瘤细胞能存活且增殖;过程④是筛选能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,所用方法是抗原—抗体杂交法,进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞群。
(4)在筛选杂交瘤细胞时,若不考虑三个及以上细胞融合,则试管中共有5种细胞,分别是B细胞、B—B细胞、骨髓瘤细胞、瘤—瘤细胞、杂交瘤细胞。小鼠的B淋巴细胞中有D和S两条DNA的合成途径,但一般不分裂增殖,因此B细胞、B—B细胞不能在含氨基蝶呤的试管中增殖;小鼠的骨髓瘤细胞中尽管没有S途径,但能不断分裂,说明其依靠D途径增殖,但D途径能被氨基蝶呤阻断,因此在含氨基蝶呤的试管中骨髓瘤细胞、瘤—瘤细胞也不能增殖;只有B细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞可以依靠S途径在含氨基蝶呤的试管中增殖,故试管中细胞的种类数和能增殖的细胞种类数分别是5和1。其中能增殖的细胞(杂交瘤细胞)进行的是S途径。
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